一种纳豆激酶固体发酵方法
阅读：0发布：2023-10-25
专利汇可以提供一种纳豆激酶固体发酵方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种纳豆激酶固体 发酵 方法。本发明采用自选纳豆激酶生产菌株加入鲜豆渣或干豆渣进行固体发酵，经灭菌-接种-发酵-干燥而成。发酵产物的纳豆激酶活性高，所用原料来源丰富、易取，提取工艺简便易行，节能环保。，下面是一种纳豆激酶固体发酵方法专利的具体信息内容。
一种纳豆激酶固体发酵方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及纳豆激酶高产菌株和纳豆激酶的 固体发酵方:法。 背景技术
纳豆激酶属于丝氨酸蛋白酶类，1987年日本学者须见洋行在纳豆 中发现了这种与血栓溶解酶相类似的酶，将其命名为纳豆激酶 (Nattokinase， NK)。纳豆激酶通过直接溶解人体内的血纤维蛋白，刺激 静脉内皮细胞产生纤溶酶原，促进内源性t-PA的产生，从而有效地发 挥溶栓效果。须见洋行后来证实,纳豆激酶经食用到血液内后在5-8小时 的长时间内也很稳定，是一种安全、高效的具有纤溶活性的酶制剂。之 后的很多研究相继证明了纳豆激酶可以用作针剂、口服用的溶栓治疗， 亦可用于保健品，是很有潜力的溶栓制品。
纳豆激酶的生产方法主要以发酵为主，现行的发酵工艺有液体发酵 和固体发酵，其中液体发酵使用的较多。最早的纳豆激酶液体发酵是用 野生的纳豆菌，发酵产物中纳豆激酶的产量极低，提取工艺复杂，并且 野生纳豆菌的性能很不稳定，对纳豆激酶的生产产量和成品质量影响很 大。近些年来，不同的液体发酵方法多见报道，比如申请号为02116667 的发明专利申请、申请号为02121352.6的发明专利申请、申请号为 200610129353.7的发明专利申请、以及《纳豆激酶液态发酵工艺优化》 和《纳豆菌B-12产纳豆激酶条件及酶学性质研究》等文章，分别介绍 了不同的液体发酵制备纳豆激酶的方法，所用主要原料有大豆、玉米粉、 酵母膏、大豆蛋白胨、多糖类物质、蛋白胨查氏琼脂、桑塔斯琼脂、牛 肉浸汁琼脂、黄豆粉琼脂或葡萄糖酵母精琼脂等有机培养基，有些研究 中还加入某些无机离子甚至中药。这些方法所用原料成本较高，酶活也 都不很理想，现有报道液体发酵单位产纳豆激酶活性最高的实验室结 果，其单位发酵酶活可以达到4300IU/mL。而现有固体发酵生产纳豆激 酶的方法酶活在几百到两千IU/g不等，因此纳豆激酶实现大规模产业化生产受到一定的限制。
本发明的目的是针对上述纳豆激酶制备上的不足，提出一种采用自 己筛选的纳豆激酶高产菌株，进行纳豆激酶固体发酵的方法。 发明内容
本发明的目的在于提供一种纳豆激酶的固体发酵方法，采用自选纳
豆激酶生产菌株dcfuOOl，以豆渣为培养基进行固体发酵，经灭菌一接 种一发酵一干燥而成，所用豆渣可以是鲜豆渣或干豆渣。
本发明所用纳豆激酶生产菌株为从市售豆豉中筛选得到的高产菌 株，经生理生化分析和16sRNA鉴定，确定为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis)，属于益生菌菌株，定名为dcfu001。该菌株于2008年9月9 曰保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心 (CGMCC)，保藏号为2663。
本发明的目的通过以下技术方案达到：
1. dcfu001的分离和鉴定
1) 分离：
选取市售豆豉为原料，按如下方法分离出不同产品中的纳豆激酶产
生菌：取待分离样品10克，加入100mL灭菌水中，振荡，IO(TC沸水 浴5分钟，静置片刻后取上层混浊液100PL，加入卯0PL灭菌水为10"， 依次稀释到10—3;同时制作LB平板。分别取不同稀释度的溶液加 到LB分离平板上，用玻璃刮铲涂布均匀，37。C倒置培养24小时，挑取 单菌落进行两次划线培养。挑取LB平板上的单菌落点种在血纤维蛋白 平板上，37。C培养18小时，测量溶解圈大小。最后取从5种产品中分 离出的单菌落进行纤溶活性检测，获得2号菌株纤溶活性最高。
2) 鉴定： 形态观察
在37"C培养24小时的LB平板上，2号菌株的菌落呈规则的圆形， 边缘微有叶状齿，不透明。挑取单菌落，置载玻片上的生理盐水中，涂 匀，风干后进行固定，经革兰氏染色后观察菌体形态。观察结果表明菌体呈短小杆状，长3.0-4.0ixm，宽0.8-1.0pm，革兰氏阳性，染色均匀， 可以形成芽孢，芽孢中生，椭圆形。 3)生理生化性质鉴定
参照伯杰氏细菌学鉴定手册对2号菌株的生理生化性质进行鉴定，
结果如表1所示
表l. 2号菌株的生理生化特征table see original document page 5
纳豆激酶属于丝氨酸蛋白酶类，1987年日本学者须见洋行在纳豆 中发现了这种与血栓溶解酶相类似的酶，将其命名为纳豆激酶 (Nattokinase， NK)。纳豆激酶通过直接溶解人体内的血纤维蛋白，刺激 静脉内皮细胞产生纤溶酶原，促进内源性t-PA的产生，从而有效地发 挥溶栓效果。须见洋行后来证实,纳豆激酶经食用到血液内后在5-8小时 的长时间内也很稳定，是一种安全、高效的具有纤溶活性的酶制剂。之 后的很多研究相继证明了纳豆激酶可以用作针剂、口服用的溶栓治疗， 亦可用于保健品，是很有潜力的溶栓制品。
纳豆激酶的生产方法主要以发酵为主，现行的发酵工艺有液体发酵 和固体发酵，其中液体发酵使用的较多。最早的纳豆激酶液体发酵是用 野生的纳豆菌，发酵产物中纳豆激酶的产量极低，提取工艺复杂，并且 野生纳豆菌的性能很不稳定，对纳豆激酶的生产产量和成品质量影响很 大。近些年来，不同的液体发酵方法多见报道，比如申请号为02116667 的发明专利申请、申请号为02121352.6的发明专利申请、申请号为 200610129353.7的发明专利申请、以及《纳豆激酶液态发酵工艺优化》 和《纳豆菌B-12产纳豆激酶条件及酶学性质研究》等文章，分别介绍 了不同的液体发酵制备纳豆激酶的方法，所用主要原料有大豆、玉米粉、 酵母膏、大豆蛋白胨、多糖类物质、蛋白胨查氏琼脂、桑塔斯琼脂、牛 肉浸汁琼脂、黄豆粉琼脂或葡萄糖酵母精琼脂等有机培养基，有些研究 中还加入某些无机离子甚至中药。这些方法所用原料成本较高，酶活也 都不很理想，现有报道液体发酵单位产纳豆激酶活性最高的实验室结 果，其单位发酵酶活可以达到4300IU/mL。而现有固体发酵生产纳豆激 酶的方法酶活在几百到两千IU/g不等，因此纳豆激酶实现大规模产业化生产受到一定的限制。
本发明的目的是针对上述纳豆激酶制备上的不足，提出一种采用自 己筛选的纳豆激酶高产菌株，进行纳豆激酶固体发酵的方法。 发明内容
本发明的目的在于提供一种纳豆激酶的固体发酵方法，采用自选纳
豆激酶生产菌株dcfuOOl，以豆渣为培养基进行固体发酵，经灭菌一接 种一发酵一干燥而成，所用豆渣可以是鲜豆渣或干豆渣。
本发明所用纳豆激酶生产菌株为从市售豆豉中筛选得到的高产菌 株，经生理生化分析和16sRNA鉴定，确定为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis)，属于益生菌菌株，定名为dcfu001。该菌株于2008年9月9 曰保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会的普通微生物中心 (CGMCC)，保藏号为2663。
本发明的目的通过以下技术方案达到：
1. dcfu001的分离和鉴定
1) 分离：
选取市售豆豉为原料，按如下方法分离出不同产品中的纳豆激酶产
生菌：取待分离样品10克，加入100mL灭菌水中，振荡，IO(TC沸水 浴5分钟，静置片刻后取上层混浊液100PL，加入卯0PL灭菌水为10"， 依次稀释到10—3;同时制作LB平板。分别取不同稀释度的溶液加 到LB分离平板上，用玻璃刮铲涂布均匀，37。C倒置培养24小时，挑取 单菌落进行两次划线培养。挑取LB平板上的单菌落点种在血纤维蛋白 平板上，37。C培养18小时，测量溶解圈大小。最后取从5种产品中分 离出的单菌落进行纤溶活性检测，获得2号菌株纤溶活性最高。
2) 鉴定： 形态观察
在37"C培养24小时的LB平板上，2号菌株的菌落呈规则的圆形， 边缘微有叶状齿，不透明。挑取单菌落，置载玻片上的生理盐水中，涂 匀，风干后进行固定，经革兰氏染色后观察菌体形态。观察结果表明菌体呈短小杆状，长3.0-4.0ixm，宽0.8-1.0pm，革兰氏阳性，染色均匀， 可以形成芽孢，芽孢中生，椭圆形。 3)生理生化性质鉴定
参照伯杰氏细菌学鉴定手册对2号菌株的生理生化性质进行鉴定，
结果如表1所示
表l. 2号菌株的生理生化特征
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