土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途
阅读：1024发布：2020-07-02
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1.土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，其特征在于，包括式I所示丁内酯I，
其中，
2.根据权利要求1所述的土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，其特征在于：所述丁内酯I按照以下方法提取而得：
1)将接种于发酵液中的土曲霉OUCMDZ-2739在20-30℃下发酵25-35天；
2)将发酵结束后的发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝，分别用乙酸乙酯萃取，将所得乙酸乙酯萃取液合并，浓缩，得到乙酸乙酯溶液提取物；
3)将所述乙酸乙酯提取物利用减压硅胶柱色谱、Sephadex LH-20、HPLC进一步纯化，得到丁内酯I。
3.根据权利要求2所述的土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，其特征在于：所述步骤3)中发酵液包括如下成分：8-15g/L葡萄糖、17-22g/L麦芽糖、18-
23g/L甘露醇、9-12g/L谷氨酸单钠、0.4-0.6g/L KH2PO4、0.2-0.5g/L MgSO4·7H2O、2-4g/L酵母抽提物、30-35g/L SEA盐和1L自来水。
4.根据权利要求2所述的土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，其特征在于：所述步骤3)中HPLC用含65％MeOH-H2O和0.25-0.30‰苯基膦酸的溶液洗脱。
5.根据权利要求1所述的土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，其特征在于，所述治疗糖尿病药物还包括式II所示丁内酯II和/或式III所示丁内酯IV，其中，R＝H(式II)；
6.根据权利要求1或5所述的土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，其特征在于，所述丁内酯II和丁内酯IV来源于土曲霉次级代谢物。
7.根据权利要求1或5所述的土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，其特征在于，所述治疗糖尿病药物还包括药学上可接受的辅料。
8.根据权利要求7所述的土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，其特征在于，所述辅料包括别嘌醇和绿原酸。
9.根据权利要求1所述的土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，其特征在于，所述治疗糖尿病药物为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。
10.根据权利要求1或9所述的土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，其特征在于：所述糖尿病为1型糖尿病或2型糖尿病。
土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途
技术领域
背景技术
[0002] 对陆生微生物近百年的研究历史，发现了大量的化学结构多样性和生物活性显著的天然产物，极大的推动了生物素药物的发展，如：青霉素、万古霉素、链霉素等。对微生物越来越多的关注，自然导致微生物的重复研究和已知化合物重复开发、新化合物发现的机率降低。因此人们开始关注微生物蕴藏量更大、种类多样性更多的海洋来源微生物。海洋微生物由于其独特的生存环境(高压、高盐、低温、寡营养)导致其具有与陆生微生物截然不同的代谢途径，因而更易产生不同于陆生微生物的次生代谢产物，进而表现出良好的生物活性如：抑制群体感应活性、抑菌活性、抗病毒活性、蛋白激酶抑制活性、细胞毒活性、肿瘤细胞周期抑制活性等，因而日渐成为海洋药物研究工作者青睐的重要天然产物化学资源。海6 9
水中微生物的丰度达到10/mL，海底沉积物微生物丰度更是达到了10/mL。然而海洋样品采集难度高，常规实验室条件下仅有低于5％的海洋微生物被分离得到，即便获得的微生物在实验室培养条件下也不能完全表达其在海洋环境下的所有生物合成途径的代谢产物。因此如何最大程度的开发这些来之不易的海洋微生物资源，使其能最大限度的被人类利用，成为科学工作者的一个重要任务和课题。曲霉属真菌一直以来都是天然产物界研究的重要菌种，其次级代谢产物结构新颖骨架多变，除了常规的甾体、倍半萜、蒽醌等常见结构类型以外，往往还含有：生物碱类、肽类、聚酮类、二倍半萜等多种的骨架。这些结构新颖的化合物往往还含有细胞毒，抗菌，抗病毒等多种活性，成为海洋药物先导化合物的重要来源之一，引起了业内学者的广泛关注。
水中微生物的丰度达到10/mL，海底沉积物微生物丰度更是达到了10/mL。然而海洋样品采集难度高，常规实验室条件下仅有低于5％的海洋微生物被分离得到，即便获得的微生物在实验室培养条件下也不能完全表达其在海洋环境下的所有生物合成途径的代谢产物。因此如何最大程度的开发这些来之不易的海洋微生物资源，使其能最大限度的被人类利用，成为科学工作者的一个重要任务和课题。曲霉属真菌一直以来都是天然产物界研究的重要菌种，其次级代谢产物结构新颖骨架多变，除了常规的甾体、倍半萜、蒽醌等常见结构类型以外，往往还含有：生物碱类、肽类、聚酮类、二倍半萜等多种的骨架。这些结构新颖的化合物往往还含有细胞毒，抗菌，抗病毒等多种活性，成为海洋药物先导化合物的重要来源之一，引起了业内学者的广泛关注。
[0003] 糖尿病是一种慢性疾病，其特征是血糖过度，在世界范围内，糖尿病己经影响了大约有3.66亿人，而且这一数字在逐年攀升，到2030年预计将达到5.52亿。糖尿病有三个主要类型：1型糖尿病也称为胰岛素依赖型糖尿病，2型糖尿病被称为非胰岛素依赖糖尿病和妊娠期糖尿病。2型糖尿病是最常见的形式，处于这种情况的病人超过90％。除了通过饮食和运动来控制血糖水平以外，目前还有一些治疗措施可将血糖水平控制在一定范围内，主要是己经批准上市的6大类药物，包括胰岛素及其类似物、磺脲类、氯茴苯酸类、双胍类、噻唑烷二酮类(TZDs)和α-糖苷酶抑制剂。而α-糖苷酶抑制剂作为一类降糖药具有往降糖药所不具有的优势，且目前临床使用的此类药物只有为数不多的几个，因此α-糖苷酶抑制剂的开发具有非常广阔的前景，同时也是关系人类健康的重要方向。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，制得的药物能够抑制机体α-葡萄糖苷酶活性，调节肠道菌群的组成，代谢出更多的短链脂肪酸，降低尿酸水平，维持胰岛素的合成，避免血糖水平升高，达到缓解2型糖尿病的目的。
[0005] 本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
[0006] 土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，包括式I所示丁内酯I，
[0007]
[0008] 其中， (式I)。丁内酯I对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)值为61.6μM，脱氧野尻霉素和阿卡波糖的IC50值分别为191.7μM和555.1μM，说明化合物17对α-葡萄糖苷酶的抑制效果好于脱氧野尻霉素和阿卡波糖，能够抑制机体α-葡萄糖苷酶活性，减缓葡萄糖的生成和吸收，防止出现餐后高血糖，对预防和治疗糖尿病具较好的作用，尤其是2型糖尿病。
[0009] 优选的，丁内酯I按照以下方法提取而得：
[0011] 2)将发酵结束后的发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝，分别用乙酸乙酯萃取，将所得乙酸乙酯萃取液合并，浓缩，得到乙酸乙酯溶液提取物；
[0013] 更优选的，步骤1)中发酵液包括如下成分：8-15g/L葡萄糖、17-22g/L麦芽糖、18-23g/L甘露醇、9-12g/L谷氨酸单钠、0.4-0.6g/L KH2PO4、0.2-0.5g/LMgSO4·7H2O、2-4g/L酵母抽提物、30-35g/L SEA盐和1L自来水。
[0014] 更优选的，步骤3)中HPLC用含65％MeOH-H2O和0.25-0.30‰苯基膦酸的溶液洗脱。MeOH(甲醇)作为强极性溶剂，能够溶于正己烧/芒醇或正己烧/异丙醇溶液，极性大且质子性强，价格便宜，提纯容易，丁内酯I中可以质子化，上述溶液中的MeOH和苯基膦酸能够发挥增益作用，可以提供充足的质子，使得目标化合物和固定相进行更充分的吸附和解吸交换，可以缩短色谱图中目标化合物的出峰时间，出现独立的色谱峰，同时造成固定相与目标化合物之间的氢键作用增大，使得分离度和分离因子增大，相对而言，在添加0.25-0.30‰苯基膦酸的条件下，各个色谱峰的分离度最好，出峰时间最短，所以选择0.25-0.30‰苯基膦酸作为最适的添加量。
[0015] 优选的，治疗糖尿病药物还包括式II所示丁内酯II和/或式III所示丁内酯IV，[0016]
[0017] 其中，R＝H(式II)；
[0018] (式III)。丁内酯II和丁内酯IV对α-葡萄糖苷酶没有抑制作用，但是丁内酯II和/或丁内酯IV能够与丁内酯I发挥增益作用，制得的治疗糖尿病药物一方面能够通过降低α-葡萄糖苷酶活性，减少低聚糖在消化道内分解，延缓肠道对葡萄糖的吸收，从而降低餐后高血糖风险，对治疗糖尿病的效果要好于单独的丁内酯I；另一方面能够调节肠道菌群的组成，代谢出更多的短链脂肪酸，更好地调节肠道pH和保护肠道微生态平衡，从而降低血清葡萄糖水平，改善胰岛素抵抗和炎症状态，增加肽YY和胰高血糖素样肽-1的分泌，进而改善糖尿病炎症状态，增强抗氧化能力，调节血脂平衡，而达到缓解2型糖尿病的目的。
[0019] 优选的，丁内酯II和丁内酯IV来源于土曲霉次级代谢物。
[0020] 优选的，治疗糖尿病药物还包括药学上可接受的辅料。
[0021] 更优选的，辅料包括别嘌醇和绿原酸。别嘌醇和绿原酸的存在能够促进丁内酯I与α-葡萄糖苷酶的共价结合而形成稳定的复合物，不易解离，提高丁内酯I与游离α-葡萄糖苷酶结合的牢固度，增强丁内酯I对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，进而强化所制备治疗糖尿病药物的疗效。此外还能阻止了次黄嘌呤和黄嘌呤通过黄嘌呤氧化酶氧化成尿酸，减少了尿酸的合成，从而降低尿酸水平，维持胰岛素的合成，避免血糖水平升高，降低2型糖尿病患者的病发风险。
[0022] 优选的，治疗糖尿病药物为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。
[0023] 优选的，糖尿病为1型糖尿病或2型糖尿病。
[0024] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0025] 本发明治疗糖尿病药物能够抑制机体α-葡萄糖苷酶活性，减缓葡萄糖的生成和吸收，防止出现餐后高血糖，对预防和治疗糖尿病具较好的作用，尤其是2型糖尿病；本发明治疗糖尿病药物能改善糖尿病炎症状态，增强抗氧化能力，调节血脂平衡，而达到缓解2型糖尿病的目的；本发明治疗糖尿病药物降低尿酸水平，维持胰岛素的合成，避免血糖水平升高，降低2型糖尿病患者的病发风险；本发明丁内酯I的制备方法能使得目标化合物和固定相进行更充分的吸附和解吸交换，可以缩短色谱图中目标化合物的出峰时间，出现独立的色谱峰，同时造成固定相与目标化合物之间的氢键作用增大，使得分离度和分离因子增大。
[0026] 本发明采用了上述技术方案提供土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，弥补了现有技术的不足，设计合理，操作方便。
具体实施方式
[0027] 下面，结合具体实施例对本发明实施方式作进一步说明。
[0028] 本申请公开一种土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，包括式I所示丁内酯I，
[0029]
[0030] 其中， (式I)。丁内酯I对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)值为61.6μM，脱氧野尻霉素和阿卡波糖的IC50值分别为191.7μM和555.1μM，说明化合物17对α-葡萄糖苷酶的抑制效果好于脱氧野尻霉素和阿卡波糖，能够抑制机体α-葡萄糖苷酶活性，减缓葡萄糖的生成和吸收，防止出现餐后高血糖，对预防和治疗糖尿病具较好的作用，尤其是2型糖尿病。
[0031] 上述治疗糖尿病药物还包括式II所示丁内酯II和/或式III所示丁内酯IV，[0032]
[0033] 其中，R＝H(式II)；
[0034] (式III)。丁内酯II和丁内酯IV对α-葡萄糖苷酶没有抑制作用，但是丁内酯II和/或丁内酯IV能够与丁内酯I发挥增益作用，制得的治疗糖尿病药物一方面能够通过降低α-葡萄糖苷酶活性，减少低聚糖在消化道内分解，延缓肠道对葡萄糖的吸收，从而降低餐后高血糖风险，对治疗糖尿病的效果要好于单独的丁内酯I；另一方面能够调节肠道菌群的组成，代谢出更多的短链脂肪酸，更好地调节肠道pH和保护肠道微生态平衡，从而降低血清葡萄糖水平，改善胰岛素抵抗和炎症状态，增加肽YY和胰高血糖素样肽-1的分泌，进而改善糖尿病炎症状态，增强抗氧化能力，调节血脂平衡，而达到缓解2型糖尿病的目的。丁内酯II和丁内酯IV来源于土曲霉次级代谢物。
[0035] 上述丁内酯I、丁内酯II和丁内酯IV按照以下方法提取而得：
[0036] 1)真菌材料：从来自青岛石老人海水浴场浒苔样品中分离出真菌菌株土曲霉OUCMDZ-2739，浒苔样品依次用无菌海水、75％乙醇和无菌水洗涤。然后，用研钵捣碎样品，然后存放于含有100mg/mL氯霉素的PDA培养基(每升含马铃薯提取物200克，葡萄糖20克，琼脂15克，和海水1L)中，在28℃下培养至出现单一菌种，将该菌种转移到另一PDA培养基并储存于4℃，通过多相分类学研究、菌落形态及18S rRNA序列分析、菌株发育树的建立，鉴定其为土曲霉OUCMDZ-2739；
[0037] 2)发酵：将接种于发酵液中的土曲霉OUCMDZ-2739在20-30℃下发酵25-35天，发酵液包括如下成分：8-15g/L葡萄糖、17-22g/L麦芽糖、18-23g/L甘露醇、9-12g/L谷氨酸单钠、0.4-0.6g/L KH2PO4、0.2-0.5g/L MgSO4·7H2O、2-4g/L酵母抽提物、30-35g/L SEA盐和1L自来水，发酵液的pH为7；
[0038] 3)提取：将30L发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝，滤液用等效体积的乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液。菌丝用80％丙酮萃取三次，丙酮溶液经减压浓缩，然后以乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，两个乙酸乙酯溶液组合在一起。并在减压下浓缩，得到18.6g乙酸乙酯溶液提取物；
[0039] 3)分离纯化：将乙酸乙酯提取物利用减压硅胶柱色谱进行逐步洗脱，洗脱液为石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100％～0％)的屈服梯度6个主要馏分(馏分1～6)，5.2g的馏分4通过Sephadex LH-20(MeOH)进一步纯化，得到540mg馏分3.2，80mg馏分3.3，
73mg馏分3.4和120mg馏分3.5，其中馏分3.2继续用HPLC纯化，洗脱液为70％MeOH-H2O，获得
30.4mg丁内酯IV(tR＝18.5min)；馏分3.3继续用HPLC纯化，洗脱液为60％MeOH-H2O，获得
9.2mg丁内酯II(tR＝6.3min)；馏分3.5继续用HPLC纯化，洗脱液为含65％MeOH-H2O和0.25-
0.30‰苯基膦酸的溶液(例如0.26‰、0.27‰、0.28‰、0.29‰等)，获得14.9-15.6mg丁内酯I(tR＝8.6min)。MeOH(甲醇)作为强极性溶剂，能够溶于正己烧/芒醇或正己烧/异丙醇溶液，极性大且质子性强，价格便宜，提纯容易，丁内酯I中可以质子化，上述溶液中的MeOH和苯基膦酸能够发挥增益作用，可以提供充足的质子，使得目标化合物和固定相进行更充分的吸附和解吸交换，可以缩短色谱图中目标化合物的出峰时间，出现独立的色谱峰，同时造成固定相与目标化合物之间的氢键作用增大，使得分离度和分离因子增大，相对而言，在添加0.25-0.30‰苯基膦酸的条件下，各个色谱峰的分离度最好，出峰时间最短，所以选择
0.25-0.30‰苯基膦酸作为最适的添加量。
73mg馏分3.4和120mg馏分3.5，其中馏分3.2继续用HPLC纯化，洗脱液为70％MeOH-H2O，获得
30.4mg丁内酯IV(tR＝18.5min)；馏分3.3继续用HPLC纯化，洗脱液为60％MeOH-H2O，获得
9.2mg丁内酯II(tR＝6.3min)；馏分3.5继续用HPLC纯化，洗脱液为含65％MeOH-H2O和0.25-
0.30‰苯基膦酸的溶液(例如0.26‰、0.27‰、0.28‰、0.29‰等)，获得14.9-15.6mg丁内酯I(tR＝8.6min)。MeOH(甲醇)作为强极性溶剂，能够溶于正己烧/芒醇或正己烧/异丙醇溶液，极性大且质子性强，价格便宜，提纯容易，丁内酯I中可以质子化，上述溶液中的MeOH和苯基膦酸能够发挥增益作用，可以提供充足的质子，使得目标化合物和固定相进行更充分的吸附和解吸交换，可以缩短色谱图中目标化合物的出峰时间，出现独立的色谱峰，同时造成固定相与目标化合物之间的氢键作用增大，使得分离度和分离因子增大，相对而言，在添加0.25-0.30‰苯基膦酸的条件下，各个色谱峰的分离度最好，出峰时间最短，所以选择
0.25-0.30‰苯基膦酸作为最适的添加量。
[0040] 上述治疗糖尿病药物还包括药学上可接受的辅料。其中，辅料包括别嘌醇和绿原酸。其中嘌醇和绿原酸的重量比为1:1.2-1.5。别嘌醇和绿原酸的存在能够促进丁内酯I与α-葡萄糖苷酶的共价结合而形成稳定的复合物，不易解离，提高丁内酯I与游离α-葡萄糖苷酶结合的牢固度，增强丁内酯I对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，进而强化所制备治疗糖尿病药物的疗效。此外还能阻止了次黄嘌呤和黄嘌呤通过黄嘌呤氧化酶氧化成尿酸，减少了尿酸的合成，从而降低尿酸水平，维持胰岛素的合成，避免血糖水平升高，降低2型糖尿病患者的病发风险。
[0041] 上述治疗糖尿病药物为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂或糖浆剂。
[0042] 上述糖尿病为1型糖尿病或2型糖尿病。
[0043] 下面，结合具体实施例对本发明实施方式作进一步说明。
[0044] 实施例1：
[0045] 丁内酯I、丁内酯II和丁内酯IV的制备方法：
[0046] 1)真菌材料：从来自青岛石老人海水浴场浒苔样品中分离出真菌菌株土曲霉OUCMDZ-2739，浒苔样品依次用无菌海水、75％乙醇和无菌水洗涤。然后，用研钵捣碎样品，然后存放于含有100mg/mL氯霉素的PDA培养基(每升含马铃薯提取物200克，葡萄糖20克，琼脂15克，和海水1L)中，在28℃下培养至出现单一菌种，将该菌种转移到另一PDA培养基并储存于4℃，通过多相分类学研究、菌落形态及18S rRNA序列分析、菌株发育树的建立，鉴定其为土曲霉OUCMDZ-2739；
[0047] 2)发酵：将接种于发酵液中的土曲霉OUCMDZ-2739在20℃下发酵25天，发酵液包括如下成分：8g/L葡萄糖、17g/L麦芽糖、18g/L甘露醇、9g/L谷氨酸单钠、0.4g/L KH2PO4、0.2g/L MgSO4·7H2O、2g/L酵母抽提物、30g/L SEA盐和1L自来水，发酵液的pH为7；
[0048] 3)提取：将30L发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝，滤液用等效体积的乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液。菌丝用80％丙酮萃取三次，丙酮溶液经减压浓缩，然后以乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，两个乙酸乙酯溶液组合在一起。并在减压下浓缩，得到18.6g乙酸乙酯溶液提取物；
[0049] 4)分离纯化：将乙酸乙酯提取物利用减压硅胶柱色谱进行逐步洗脱，洗脱液为石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100％～0％)的屈服梯度6个主要馏分(馏分1～6)，5.2g的馏分4通过Sephadex LH-20(MeOH)进一步纯化，得到540mg馏分3.2，80mg馏分3.3，
73mg馏分3.4和120mg馏分3.5，其中馏分3.2继续用HPLC纯化，洗脱液为70％MeOH-H2O，获得
30.4mg丁内酯IV(tR＝18.5min)；馏分3.3继续用HPLC纯化，洗脱液为60％MeOH-H2O，获得
9.2mg丁内酯II(tR＝6.3min)；馏分3.5继续用HPLC纯化，洗脱液为含65％MeOH-H2O和0.25-
0.30‰苯基膦酸的溶液(例如0.26‰、0.27‰、0.28‰、0.29‰等)，获得15.0mg丁内酯I(tR＝8.6min)。
73mg馏分3.4和120mg馏分3.5，其中馏分3.2继续用HPLC纯化，洗脱液为70％MeOH-H2O，获得
30.4mg丁内酯IV(tR＝18.5min)；馏分3.3继续用HPLC纯化，洗脱液为60％MeOH-H2O，获得
9.2mg丁内酯II(tR＝6.3min)；馏分3.5继续用HPLC纯化，洗脱液为含65％MeOH-H2O和0.25-
0.30‰苯基膦酸的溶液(例如0.26‰、0.27‰、0.28‰、0.29‰等)，获得15.0mg丁内酯I(tR＝8.6min)。
[0050] 实施例2：
[0051] 丁内酯I、丁内酯II和丁内酯IV的制备方法：
[0052] 1)真菌材料：从来自青岛石老人海水浴场浒苔样品中分离出真菌菌株土曲霉OUCMDZ-2739，浒苔样品依次用无菌海水、75％乙醇和无菌水洗涤。然后，用研钵捣碎样品，然后存放于含有100mg/mL氯霉素的PDA培养基(每升含马铃薯提取物200克，葡萄糖20克，琼脂15克，和海水1L)中，在28℃下培养至出现单一菌种，将该菌种转移到另一PDA培养基并储存于4℃，通过多相分类学研究、菌落形态及18S rRNA序列分析、菌株发育树的建立，鉴定其为土曲霉OUCMDZ-2739；
[0053] 2)发酵：将接种于发酵液中的土曲霉OUCMDZ-2739在25℃下发酵30天，发酵液包括如下成分：10g/L葡萄糖、20g/L麦芽糖、20g/L甘露醇、10g/L谷氨酸单钠、0.5g/L KH2PO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、3g/L酵母抽提物、32g/L SEA盐和1L自来水，发酵液的pH为7；
[0054] 3)提取：将30L发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝，滤液用等效体积的乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液。菌丝用80％丙酮萃取三次，丙酮溶液经减压浓缩，然后以乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，两个乙酸乙酯溶液组合在一起。并在减压下浓缩，得到18.6g乙酸乙酯溶液提取物；
[0055] 4)分离纯化：将乙酸乙酯提取物利用减压硅胶柱色谱进行逐步洗脱，洗脱液为石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100％～0％)的屈服梯度6个主要馏分(馏分1～6)，5.2g的馏分4通过Sephadex LH-20(MeOH)进一步纯化，得到540mg馏分3.2，80mg馏分3.3，
73mg馏分3.4和120mg馏分3.5，其中馏分3.2继续用HPLC纯化，洗脱液为70％MeOH-H2O，获得
30.4mg丁内酯IV(tR＝18.5min)；馏分3.3继续用HPLC纯化，洗脱液为60％MeOH-H2O，获得
9.2mg丁内酯II(tR＝6.3min)；馏分3.5继续用HPLC纯化，洗脱液为含65％MeOH-H2O和0.28‰苯基膦酸的溶液(例如0.26‰、0.27‰、0.28‰、0.29‰等)，获得15.6mg丁内酯I(tR＝
8.6min)。
73mg馏分3.4和120mg馏分3.5，其中馏分3.2继续用HPLC纯化，洗脱液为70％MeOH-H2O，获得
30.4mg丁内酯IV(tR＝18.5min)；馏分3.3继续用HPLC纯化，洗脱液为60％MeOH-H2O，获得
9.2mg丁内酯II(tR＝6.3min)；馏分3.5继续用HPLC纯化，洗脱液为含65％MeOH-H2O和0.28‰苯基膦酸的溶液(例如0.26‰、0.27‰、0.28‰、0.29‰等)，获得15.6mg丁内酯I(tR＝
8.6min)。
[0056] 实施例3：
[0057] 丁内酯I、丁内酯II和丁内酯IV的制备方法：
[0058] 1)真菌材料：从来自青岛石老人海水浴场浒苔样品中分离出真菌菌株土曲霉OUCMDZ-2739，浒苔样品依次用无菌海水、75％乙醇和无菌水洗涤。然后，用研钵捣碎样品，然后存放于含有100mg/mL氯霉素的PDA培养基(每升含马铃薯提取物200克，葡萄糖20克，琼脂15克，和海水1L)中，在28℃下培养至出现单一菌种，将该菌种转移到另一PDA培养基并储存于4℃，通过多相分类学研究、菌落形态及18S rRNA序列分析、菌株发育树的建立，鉴定其为土曲霉OUCMDZ-2739；
[0059] 2)发酵：将接种于发酵液中的土曲霉OUCMDZ-2739在30℃下发酵35天，发酵液包括如下成分：15g/L葡萄糖、22g/L麦芽糖、23g/L甘露醇、12g/L谷氨酸单钠、0.6g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、4g/L酵母抽提物、35g/L SEA盐和1L自来水，发酵液的pH为7；
[0060] 3)提取：将30L发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝，滤液用等效体积的乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液。菌丝用80％丙酮萃取三次，丙酮溶液经减压浓缩，然后以乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，两个乙酸乙酯溶液组合在一起。并在减压下浓缩，得到18.6g乙酸乙酯溶液提取物；
[0061] 4)分离纯化：将乙酸乙酯提取物利用减压硅胶柱色谱进行逐步洗脱，洗脱液为石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100％～0％)的屈服梯度6个主要馏分(馏分1～6)，5.2g的馏分4通过Sephadex LH-20(MeOH)进一步纯化，得到540mg馏分3.2，80mg馏分3.3，
73mg馏分3.4和120mg馏分3.5，其中馏分3.2继续用HPLC纯化，洗脱液为70％MeOH-H2O，获得
30.4mg丁内酯IV(tR＝18.5min)；馏分3.3继续用HPLC纯化，洗脱液为60％MeOH-H2O，获得
9.2mg丁内酯II(tR＝6.3min)；馏分3.5继续用HPLC纯化，洗脱液为含65％MeOH-H2O和0.30‰苯基膦酸的溶液(例如0.26‰、0.27‰、0.28‰、0.29‰等)，获得15.3mg丁内酯I(tR＝
8.6min)。
73mg馏分3.4和120mg馏分3.5，其中馏分3.2继续用HPLC纯化，洗脱液为70％MeOH-H2O，获得
30.4mg丁内酯IV(tR＝18.5min)；馏分3.3继续用HPLC纯化，洗脱液为60％MeOH-H2O，获得
9.2mg丁内酯II(tR＝6.3min)；馏分3.5继续用HPLC纯化，洗脱液为含65％MeOH-H2O和0.30‰苯基膦酸的溶液(例如0.26‰、0.27‰、0.28‰、0.29‰等)，获得15.3mg丁内酯I(tR＝
8.6min)。
[0062] 实施例4：
[0063] 土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，片剂的制备：取40g丁内酯I、1.2丁内酯II、37g食用纤维素、0.1g别嘌醇、0.12g绿原酸、17g乳糖、0.1g柠檬酸钠、1.2g硬脂酸镁以及适量片剂辅料，混合均匀，按公知的片剂制作技术和装备制成片剂，产品规格为0.5g/片。
[0064] 实施例5：
[0065] 土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，颗粒剂的制备：取36g丁内酯I、0.7g丁内酯II、0.5g丁内酯IV、食用纤维素67g、0.2g别嘌醇、0.24g绿原酸以及适量颗粒剂辅料混合均匀，使用喷雾干燥工艺进行制粒。
[0066] 实施例6：
[0067] 土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，胶囊剂的制备：取33g丁内酯I、0.9g丁内酯IV、45g微晶纤维素、0.3g别嘌醇、0.45g绿原酸及适量胶囊剂辅料，混合均匀，填充胶囊，填充规格为0.45g/粒。
[0068] 实施例7：
[0069] 土曲霉次级代谢物-丁内酯在制备治疗糖尿病药物中的用途，口服液制剂的制备：称取18g丁内酯I、0.3g丁内酯II、0.2g丁内酯IV、8g蜂蜜、0.3g别嘌醇、0.38g绿原酸以及适量口服液剂辅料，用纯化水配制成100ml的溶液，过滤、灌装，高温瞬时灭菌即得。
[0070] 对比例1：
[0071] 本实施例与实施例2的技术方案的区别在于：本实施例馏分3.5HPLC纯化用洗脱液为含65％MeOH-H2O的溶液，获得13.1mg丁内酯I。对比实施例2和对比例1可知，溶液中的MeOH和苯基膦酸能够发挥增益作用，目标化合物的分离度最好、得率最高。
[0072] 对比例2：
[0073] 本实施例与实施例5的技术方案的区别在于：胶囊剂中不含丁内酯II和丁内酯IV。
[0074] 对比例3：
[0075] 本实施例与实施例5的技术方案的区别在于：胶囊剂中不含别嘌醇和绿原酸。
[0076] 对比例4：
[0077] 本实施例与实施例5的技术方案的区别在于：胶囊剂中不含别丁内酯II、丁内酯IV、嘌醇和绿原酸。
[0078] 试验例1：
[0079] 丁内酯I、丁内酯II和丁内酯IV对α-葡萄糖苷酶的抑制性测试：
[0080] α-葡萄糖苷酶溶液的配制：将酶冻干粉用0.1％BSA溶液溶解，配成100U/mL的酶液，置于-20℃的冰箱中冻存。实验前，将100U/mL酶液用移液枪吸取少量，先用0.1％BSA溶液稀释到20U/mL，再用0.1％BSA溶液稀释到0.2U/mL备用。
[0081] PNPG溶液配制：称取一定量的PNPG固体，用0.1mol/L pH为6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，配成浓度为10mmol/L，然后用1.5mL的离心管分装备用。
[0082] 采用比色法测定α-葡萄糖苷酶的活性。用二甲基亚砜(DMSO)溶解待测活性化合物，配制质量浓度为10mg/mL的备用溶液。再用PBS稀释备用溶液，配置成所需浓度的待测溶液。在96孔板每孔中加入活性化合物溶液(实验组)、阿卡波糖溶液(阳性对照组)或PBS(阴性对照组)10μL，PBS 50μL，酶溶液20μL，摇匀，置于37℃水浴恒温10min，然后加入PNPG溶液20μL，摇匀，37℃反应10min，再加入Na2CO3终止液30μL终止反应，立即于405nm处测定吸光度值。样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率按下式计算：抑制率(％)＝[(阴性对照组吸光度－实验组吸光度)/阴性对照组吸光度]×100％。当样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率为50％时，将样品质量浓度定为半数抑制浓度(IC50)值。测得目标次级代谢物对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)值为61.6μM。脱氧野尻霉素和阿卡波糖的IC50值分别为191.7μM和555.1μM，说明丁内酯I对α-葡萄糖苷酶的抑制效果好于脱氧野尻霉素和阿卡波糖，抑制机体α-葡萄糖苷酶活性，减缓葡萄糖的生成和吸收，防止出现餐后高血糖，对预防和治疗糖尿病具较好的作用，尤其是2型糖尿病。丁内酯II和丁内酯IV对α-葡萄糖苷酶没有抑制作用。
[0083] 试验例2：
[0084] 实施例5、对比例2、对比例3和对比例4所得药物的治疗效果
[0085] 2型糖尿病大鼠模型的构建：选取120只SD大鼠(雄性、150-180g)，随机分为2组：其中20只为正常对照组，采用普通饲料喂养；100只为高脂高糖组，采用高脂高糖饲料(含10％猪油、20％蔗糖、2.5％胆固醇)饲养。每天记录摄食量，每周记录一次体重变化。1个月后，高脂高糖组腹腔注射链脲佐菌素(STZ，sigma)40mg/Kg，注射前取鼠尾静脉血监测血糖并记录。注射3天后连续监测血糖2天，两次血糖值均高于16.7mmol/L即为造模成功，为2型糖尿病模型组。
[0086] 日常摄食量和体重监测结果显示：高脂高糖组的平均24h摄食量为22.14±2.77g/只，高于正常组(19.24±2.34g/只)；高脂高糖组的体重也比正常组高，但空腹血糖值仍属于正常值范围内。注射STZ三天后，糖尿病模型组的体重开始下降，空腹血糖达到20.8±1.1mmol/L，高于糖尿病标准值16.7mmol/L，与正常组相比差异具有显著性意义(P<0.05)。
且在行为学上具有典型的糖尿病病症：皮毛枯燥、倦怠、多饮、多食、多尿、尿液混浊、消瘦。
表明2型糖尿病大鼠模型制作成功。
且在行为学上具有典型的糖尿病病症：皮毛枯燥、倦怠、多饮、多食、多尿、尿液混浊、消瘦。
表明2型糖尿病大鼠模型制作成功。
[0087] 给药：2型糖尿病模型组被别给实施例5、对比例2、对比例3和对比例4所得药物，即为给药1组、给药2组、给药3组和给药4组，给药量分别为活性化合物50mg/kg。
[0088] 血液指标测定：动物给药48天后，禁食12小时，断尾取全血于EDTA-K2抗凝采血管中(购自BD)，取10μL抗凝全血测定糖化血红蛋白浓度和血红蛋白浓度，二者比值作为糖化血红蛋白含量(试剂盒购自RNADOX)。
[0089] 给药50天后，小鼠摘眼球取血，室温静置2小时后，于15℃，3000rpm，离心10min，分离血清，用全自动生化仪(日立7100)和生化检测试剂盒(购自中生北控)测定谷丙转氨酶(ALT)，谷草转氨酶(AST)，甘油三酯(TG)，总胆固醇(CHO)，低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，尿素(UREA)。肌酐(CRE)利用全波长酶标仪进行手工测定，利用全波长酶标仪测定总胆汁酸(TBA)，总胆红素(T-Bil)，直接胆红素(D-Bil)，手工测定所用试剂盒购自北京九强生物。血清胰岛素含量利用ELISA试剂盒(购自Merck Millipore)测定。血清晚期糖基化终末产物AGEs含量利用ELISA试剂盒(购自cell biolabs)。
[0090] 给药50天后，对照组动物血清胰岛素含量为0.05ng/ml、模型组动物血清胰岛素含量为13.56ng/ml、给药1组动物血清胰岛素含量为1.95ng/ml、给药2组动物血清胰岛素含量为2.36ng/ml、给药3组动物血清胰岛素含量为2.11ng/ml、给药4组动物血清胰岛素含量为3.85ng/ml。这说明在2型糖尿病小鼠动物模型中，给药50天后，模型组动物与正常组动物相比胰岛素含量显著升高，各给药组与模型组相比均有不同程度的降低，这说明实施例5所制得的药物能够改善动物体内高胰岛素状态，能够用于治疗2型糖尿病。给药1组降低的程度优于给药2组、给药3组和给药4组，这说明实施例5的药物对治疗糖尿病的效果要好于对比例2、对比例3和对比例4的药物，进而说明丁内酯II和/或丁内酯IV能够与丁内酯I发挥增益作用，对治疗糖尿病的效果要好于单独的丁内酯I；别嘌醇和绿原酸的存在能够增强丁内酯I对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，进而强化所制备治疗糖尿病药物的疗效。
[0091] 上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
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