技术领域
[0001] 本
发明属于
微生物发酵及酶转化技术领域，具体涉及一种高密度培养D-泛解酸内酯水解酶产生菌的方法，并进一步公开利用所述D-泛解酸内酯水解酶产生菌进行酶转化制备D-泛解酸的方法。
背景技术
[0002] 泛酸，又称遍
多酸、维生素B5，广泛存在于生物界中，是动物体内合成辅酶A的主要原料，其主要作用是参与糖、脂肪和
蛋白质的代谢。人体缺乏泛酸会引起肌肉酸痛或痉挛、肾上腺机能不足和减退、注意
力不集中、手脚麻木、便秘、精力缺乏、轻微锻炼后即筋疲力尽、忧虑、紧张以及磨牙等症状。泛酸以其特有的生化功能广泛应用于医药、
饲料和食品等领域。而D-泛解酸内酯(D-PL)则是合成D-泛酸系列产品最重要的手型中间体。
[0003]
现有技术中通常只能由化学合成的方法制得DL-泛解酸内酯，在进行DL-泛解酸内酯的拆分。DL-泛解酸内酯的拆分方法大都是采用化学方法，其缺点是拆分剂昂贵，成本高，且分离困难。生物拆分方法中，采用微生物酶法拆分DL-泛解酸内酯，因具有环境污染和毒性少等特点而成为研究的一个重要方向。
[0004] 微生物酶法拆分DL-泛解酸内酯的一种方式是利用产L-泛解酸内酯酶的微生物，分解DL-泛解酸内酯中的L-泛解酸内酯，得到未分解的D-构型泛解酸内酯；此方法的缺点只有L-构型的内酯被水解得非常彻底才能得到高光学纯度的D-泛解酸内酯，并且反应时间长，而且长时间的水解过程会导致一部分D-泛解酸内酯水解，导致得到的产物D-泛解酸内酯收率不高；另一种方式是利用产D-泛解酸内酯酶的微生物，选择性水解DL-泛解酸内酯中的D-泛解酸内酯，进而得到D-泛解酸，再将D-泛解酸进行内酯化生成D-泛解酸内酯；该方法水解时间短，虽然水解率不高(30％左右)，但未水解的L-泛解酸内酯可消旋后再利用，产物的总体收率较高，因此，成为现有技术中制备D-泛解酸和D-泛解酸内酯的主流方法。
[0005] 现有技术中已知报道的能产生D-泛解酸内酯水解酶的菌株包括尖镰孢霉菌、串珠镰孢霉菌等，但通常野生型菌株的发酵密度和酶活力都较低，影响了后续酶转化步骤对DL-泛解酸内酯的酶转化率，这也成为了限制微生物转化生产D-泛解酸工艺的技术难题。而如何有效提高发酵菌株的发酵密度并进一步提高DL-泛解酸内酯底物的酶转化率成为亟待解决的问题。
发明内容
[0006] 为此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种高密度培养D-泛解酸内酯水解酶产生菌的方法，以解决现有技术中产D-泛解酸内酯水解酶菌株发酵密度及酶活力较低导致D-泛解酸酶转化率较低的问题；
[0007] 本发明所要解决的第二个技术问题在于提供一种微生物转化法制备D-泛解酸的方法，以解决现有技术中微生物转化法制备D-泛解酸的转化率较低的问题。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明所述的一种高密度培养D-泛解酸内酯水解酶产生菌的方法，包括如下步骤：
[0009] (1)将斜面保存的串珠镰孢菌接种入
种子培养基中进行种子活化；所述种子培养基包括：甘油5-10g/L、荸荠浆20-30g/L、蛋白胨6-10g/L、天冬酰胺3-8g/L、
硫酸铵2-4g/L，调pH7.0-8.0；
[0010] (2)将活化后的种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养，得到发酵菌液；所述发酵培养基包括：
葡萄糖20-30g/L、甘油5-10g/L、荸荠浆30-40g/L、无
氨基氮源8-12g/L、
酵母膏8-12g/L、
柠檬酸钠3-8g/L、缬氨酸
硝酸盐4-8g/L、蜂胶8-12g/L、赤藓糖醇10-15g/L、MgSO4.7H2O 0.4-0.8g/L，K2HPO40.8-1.2g/L，调pH7.0-8.0。
[0011] 所述步骤(1)中，所述种子培养基包括：甘油8g/L、荸荠浆25g/L、蛋白胨8g/L、天冬酰胺5g/L、硫酸铵3g/L。
[0012] 所述步骤(1)中，所述种子活化步骤的培养
温度为25-30℃，控制摇床转速140-160rpm，培养时间为8-12h。
[0013] 所述步骤(2)中，所述发酵培养基包括：葡萄糖25g/L、甘油8g/L、荸荠浆35g/L、无氨基氮源10g/L、酵母膏10g/L、柠檬酸钠5g/L、缬氨酸硝酸盐6g/L、蜂胶10g/L、赤藓糖醇12g/L、MgSO4.7H2O 0.6g/L，K2HPO41.0g/L。
[0014] 所述步骤(2)中，所述发酵培养步骤的培养温度为25-30℃，搅拌速度为140-160rpm，通气量为1.2-1.8vvm，培养时间为36-48h。
[0015] 所述荸荠浆为以去皮荸荠为原料，加入等量水经制浆所得。
[0016] 本发明还公开了所述的高密度培养D-泛解酸内酯水解酶产生菌的方法在酶转化制备D-泛解酸领域的应用。
[0017] 本发明还公开了一种酶转化法制备D-泛解酸的方法，包括按照所述方法培养D-泛解酸内酯水解酶产生菌的步骤，以及，利用所得菌体为粗酶，对含DL-泛解酸内酯的底物选择性进行酶转化拆分的步骤，将其中的D-泛解酸内酯酶转化为D-泛解酸。
[0018] 所述底物中含DL-泛解酸内酯的浓度为10-70％，所述菌体的加入量为1-2g湿菌体/100mL底物溶液。
[0019] 所述底物中还含有占所述DL-泛解酸内酯添加量1-2％的
醋酸钙。。
[0020] 本发明所述高密度培养D-泛解酸内酯产生菌的方法，仅利用现有技术中常规的串珠镰孢菌为产酶菌株，并通过对种子培养基以及发酵培养基的优化，有效提高了产酶菌株的生物量，同时有效提高了同时有效提高了粗酶液的酶，以及单位菌量的相对酶活。
[0021] 本发明所述方法在现有种子培养基的
基础上，添加天冬酰胺进行种子液培养，有助于提高产酶菌株的酶活力，使得产酶菌株在后续酶转化过程中获得更高的生物量及酶活力，有效提高了D-泛解酸的酶解率。
[0022] 本发明所述方法在现有发酵培养基的基础上，通过添加缬氨酸硝酸盐和赤藓糖醇，能有效提高菌体的酶活性能；而以荸荠浆作为产酶培养基原料，能有效提高菌体的生物量，使得产酶菌株在后续酶转化过程中获得更高的生物量及酶活力，有效提高了D-泛解酸的酶解率。
[0023] 本发明所述酶解D-泛解酸的方法，通过在底物中以醋酸钙替代现有无机钙离子的方式，进一步提高了酶解的效率。
具体实施方式
[0024] 本发明下述
实施例1-4中，以野生型串珠镰孢菌为发酵菌株进行产D-泛解酸内酯水解酶菌株的高密度培养，并将
选定菌株保存于LB斜面培养基中，4℃保存；并在进行种子活化步骤前，将保存的所述菌株划线至LB平板培养基中进行培养10h。
[0025] 所述LB斜面培养基和LB平板培养基包括：胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、
氯化钠10g/L、硫酸卡那霉素50mg/L，琼脂20g/L。
[0027] 本实施例所述高密度培养D-泛解酸内酯水解酶产生菌的方法，包括如下步骤：
[0028] (1)将经过所述LB平板培养及活化培养的串珠镰孢菌用接种环接种一环至种子培养基中进行种子活化，控制培养温度为30℃，控制摇床转速140rpm，培养时间为10h，得到种子液；
[0029] 所述种子培养基包括：甘油5g/L、荸荠浆30g/L、蛋白胨6g/L、天冬酰胺8g/L、硫酸铵2g/L，调pH7.0-8.0；所述荸荠浆为以洗净去皮的荸荠为原料，加入等量水经制浆所得；
[0030] (2)将活化后的种子液按照10％的接种量接种至装有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，控制培养温度为30℃，搅拌速度为140rpm，通气量为1.8vvm，培养时间为40h，得到发酵菌液；
[0031] 所述发酵培养基包括：葡萄糖20g/L、甘油10g/L、荸荠浆30g/L、无氨基氮源12g/L、酵母膏8g/L、柠檬酸钠8g/L、缬氨酸硝酸盐4g/L、蜂胶12g/L、赤藓糖醇10g/L、MgSO4.7H2O 0.8g/L，K2HPO4 0.8g/L，调pH7.0-8.0；
[0032] 发酵过程中，当发酵反应12h后开始进行150g/L的葡萄糖补料，控制补料速度为10L/h。
[0033] 实施例2 5L发酵罐发酵
[0034] 本实施例所述高密度培养D-泛解酸内酯水解酶产生菌的方法，包括如下步骤：
[0035] (1)将经过所述LB平板培养及活化培养的串珠镰孢菌用接种环接种一环至种子培养基中进行种子活化，控制培养温度为25℃，控制摇床转速160rpm，培养时间为10h，得到种子液；
[0036] 所述种子培养基包括：甘油10g/L、荸荠浆20g/L、蛋白胨10g/L、天冬酰胺3g/L、硫酸铵4g/L，调pH7.0-8.0；所述荸荠浆为以洗净去皮的荸荠为原料，加入等量水经制浆所得；
[0037] (2)将活化后的种子液按照10％的接种量接种至装有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，控制培养温度为25℃，搅拌速度为160rpm，通气量为1.2vvm，培养时间为40h，得到发酵菌液；
[0038] 所述发酵培养基包括：葡萄糖30g/L、甘油5g/L、荸荠浆40g/L、无氨基氮源8g/L、酵母膏12g/L、柠檬酸钠3g/L、缬氨酸硝酸盐8g/L、蜂胶8g/L、赤藓糖醇15g/L、MgSO4.7H2O 0.4g/L，K2HPO4 1.2g/L，调pH7.0-8.0；
[0039] 发酵过程中，当发酵反应12h后开始进行150g/L的葡萄糖补料，控制补料速度为10L/h。
[0040] 实施例3 5L发酵罐发酵
[0041] 本实施例所述高密度培养D-泛解酸内酯水解酶产生菌的方法，包括如下步骤：
[0042] (1)将经过所述LB平板培养及活化培养的串珠镰孢菌用接种环接种一环至种子培养基中进行种子活化，控制培养温度为28℃，控制摇床转速150rpm，培养时间为10h，得到种子液；
[0043] 所述种子培养基包括：甘油8g/L、荸荠浆25g/L、蛋白胨8g/L、天冬酰胺5g/L、硫酸铵3g/L，调pH7.0-8.0；所述荸荠浆为以洗净去皮的荸荠为原料，加入等量水经制浆所得；
[0044] (2)将活化后的种子液按照10％的接种量接种至装有2.5L发酵培养基的5L发酵罐中进行发酵培养，控制培养温度为28℃，搅拌速度为150rpm，通气量为1.5vvm，培养时间为40h，得到发酵菌液；
[0045] 所述发酵培养基包括：葡萄糖25g/L、甘油8g/L、荸荠浆35g/L、无氨基氮源10g/L、酵母膏10g/L、柠檬酸钠5g/L、缬氨酸硝酸盐6g/L、蜂胶10g/L、赤藓糖醇12g/L、MgSO4.7H2O 0.6g/L，K2HPO4 1.0g/L，调pH7.0-8.0；
[0046] 发酵过程中，当发酵反应12h后开始进行150g/L的葡萄糖补料，控制补料速度为10L/h。
[0047] 对比例1
[0048] 本对比例所述高密度培养D-泛解酸内酯水解酶产生菌的方法同实施例3，其区别仅在于，所述种子培养基中不含有天冬酰胺。
[0049] 对比例2
[0050] 本对比例所述高密度培养D-泛解酸内酯水解酶产生菌的方法同实施例3，其区别仅在于，所述发酵培养基中不含有缬氨酸硝酸盐。
[0051] 对比例3
[0052] 本对比例所述高密度培养D-泛解酸内酯水解酶产生菌的方法同实施例3，其区别仅在于，所述发酵培养基中不含有赤藓糖醇。
[0053] 对比例4
[0054] 本对比例所述高密度培养D-泛解酸内酯水解酶产生菌的方法同实施例3，其区别仅在于，所述发酵培养基中不含有蜂胶。
[0055] 对比例5
[0056] 本对比例所述高密度培养D-泛解酸内酯水解酶产生菌的方法同实施例3，其区别仅在于，所述发酵培养基中以等量的玉米浆代替荸荠浆。
[0057] 对比例6
[0058] 本对比例所述培养D-泛解酸内酯水解酶产生菌的方法为现有技术的常规方法，即种子液培养基包括甘油20g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏10g/L、玉米浆10g/L，pH6.0；发酵培养基包括：甘油10g/L、蛋白胨10g/L、酵母膏8g/L、玉米浆4g/L，pH6.0。
[0060] 取化学合成的DL-泛解酸内酯配制成10％的水溶液，并加入占所述DL-泛解酸内酯添加量1％的醋酸钙，用NaOH或HCl溶液调pH为7.0，作为酶催化反应底物。
[0061] 取实施例3中制得发酵液经布氏漏斗
滤纸抽滤，得到湿菌体；按照1g湿菌体/100mL底物溶液的添加量加入所述湿菌体，并控制pH为7.0，于28℃，控制摇床160r/min，进行酶转化反应8小时。
[0062] 应用例2
[0063] 取化学合成的DL-泛解酸内酯配制成70％的水溶液，并加入占所述DL-泛解酸内酯添加量2％的醋酸钙，用NaOH或HCl溶液调pH为7.0，作为酶催化反应底物。
[0064] 取实施例3中制得发酵液经布氏漏斗滤纸抽滤，得到湿菌体；按照1g湿菌体/100mL底物溶液的添加量加入所述湿菌体，并控制pH为7.0，于28℃，控制摇床160r/min，进行酶转化反应8小时。
[0065] 应用例3
[0066] 取化学合成的DL-泛解酸内酯配制成40％的水溶液，并加入占所述DL-泛解酸内酯添加量1.5％的醋酸钙，用NaOH或HCl溶液调pH为7.0，作为酶催化反应底物。
[0067] 取实施例3中制得发酵液经布氏漏斗滤纸抽滤，得到湿菌体；按照1g湿菌体/100mL底物溶液的添加量加入所述湿菌体，并控制pH为7.0，于28℃，控制摇床160r/min，进行酶转化反应8小时。
[0068] 应用对照例1
[0069] 本对比例所述酶转化制备D-泛解酸的方法与应用例3相同，其区别仅在于，所述底物中以等量的CaCL2替代所述醋酸钙。
[0070] 应用对照例2
[0071] 本对比例所述酶转化制备D-泛解酸的方法与应用例3相同，其区别仅在于，所述底物中不含有所述醋酸钙。
[0072] 实验例
[0073] 1、发酵液性能检测
[0074] 分别取上述实施例1-3及对比例1-6中制得发酵液，对其培养菌体进行生物量测定(以100mL发酵液测定)。具体测定方法参见江南大学汤一新硕士论文《微生物酶法拆分制备D-泛解酸内酯》中记载的方法。测定及计算结果记录于下表1。
[0075] 分别取对上述实施例1-3及对比例1-6中制得发酵液中的湿菌丝体进行DL-泛解酸内酯的酶转化，以测定各实施例中发酵菌液中菌株的酶活力(以100mL发酵液测定)。具体测定方法参见江南大学汤一新硕士论文《微生物酶法拆分制备D-泛解酸内酯》中记载的方法。测定及计算结果记录于下表1。
[0076] 表1发酵液生物量及酶活测定
[0077]
[0078]
[0079] 从上表数据可知，本发明所述高密度培养D-泛解酸内酯酶产生菌的方法，利用常规的串珠镰孢菌为产酶菌株，通过对种子培养基以及发酵培养基的优化，有效提高了串珠镰孢菌的生物量，同时有效提高了粗酶液的酶活，而且，由于本发明上述对生物量及酶活的测定，均是基于相同的100mL发酵液获得，可见，本发明所述种子液培养基和发酵培养基能有效提高单位菌量的酶活，有利于后续D-泛解酸的酶解转化。
[0080] 2、酶解液性能测定
[0081] 分别取应用例1-3及应用对照例1-2中反应后的酶解液进行测定，测定酶解液中D-泛解酸的含量，并计算D-泛解酸的酶解率，具体测定方法参见江南大学汤一新硕士论文《微生物酶法拆分制备D-泛解酸内酯》中记载的方法，结果记录于下表2。
[0082] 表2酶解液性能测定
[0083]
[0084]
[0085] 从上表数据可知，本发明所述方法培养的菌体，其酶解D-泛解酸内酯制得D-泛解酸的活性较高，能有效提高D-泛解酸的酶解率；并且，本发明所述酶解D-泛解酸的方法，通过在底物中以醋酸钙替代现有无机钙离子的方式，进一步提高了酶解的效率。
[0086] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
