枯草芽孢杆菌PTS-394的发酵培养方法
阅读：0发布：2022-05-29
专利汇可以提供枯草芽孢杆菌PTS-394的发酵培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种枯草芽孢杆菌PTS-394的 发酵 培养方法，包括在发酵培养基中接种枯草芽孢杆菌PTS-394 种子 液，在摇床上发酵培养2d，其特征在于：发酵培养基中的 碳 源为玉米 淀粉 ，氮源为 大豆粉 ，影响菌含量预测值的三个关键因子为玉米淀粉、大豆粉和 酵母 粉，在发酵培养基中的三个关键因子含量依次为11.48g/L、13.35g/L和0.90g/L，发酵培养条件中影响菌含量和抑菌圈直径的三个关键因子为 温度 、初始PH值和装液量，它们在发酵培养过程中选择：温度30.84℃，初始PH6.93，装液量65.15mL/250mL。，下面是枯草芽孢杆菌PTS-394的发酵培养方法专利的具体信息内容。
1.枯草芽孢杆菌PTS-394的发酵培养方法，包括在发酵培养基中接种枯草芽孢杆菌PTS-394种子液，在摇床上发酵培养2d，其特征在于：发酵培养基中的碳源为玉米淀粉，氮源为大豆粉，影响菌含量预测值的三个关键因子为玉米淀粉、大豆粉和酵母粉，在发酵培养基中的三个关键因子含量依次为11.48 g/L、13.35 g/L和0.90 g/L，发酵培养条件中影响菌含量和抑菌圈直径的三个关键因子为温度、初始PH值和装液量，它们在发酵培养过程中选择：温度30.84℃，初始PH 6.93，装液量65.15 mL/250 mL。
2.根据权利要求1所述的枯草芽孢杆菌PTS-394的发酵培养方法，其特征在于：发酵培养基的组分为：玉米淀粉11.48 g/L、大豆粉13.35 g/L和酵母粉0.90 g/L、CaCO3 3 g，NaCl 0.5 g，鱼粉10 g；发酵培养基的装液量为65.15 mL/250 mL，发酵培养基中接种枯草芽孢杆菌PTS-394的种子液后，初始pH 6.93，置于30.84℃，摇床发酵培养。
3.根据权利要求1或2所述的枯草芽孢杆菌PTS-394的发酵培养方法，其特征在于：
发酵培养2d，发酵液中的菌含量为（6.38±0.16）E+10 cfu/mL，对青枯病菌抑菌圈直径为
32.12±0.08 mm。
枯草芽孢杆菌PTS-394的发酵培养方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种枯草芽孢杆菌PTS-394的发酵培养方法，尤其是一种利用Plackett-Burman法和响应曲面法优化发酵培养基及培养条件后实现对枯草芽孢杆菌PTS-394的培养方法。
背景技术
[0002] 随着种植业结构的调整，设施蔬菜种植面积逐年增加，高产、连作的设施蔬菜种植布局为病虫害提供了充裕的营养和繁殖条件。近年来设施茄果类蔬菜土传病害（青枯病、疫病、根结线虫等）频繁暴发。青枯病是一种毁灭性土传细菌病害，发病初期地上部分虽表现为萎垂但叶片仍保持绿色，故名“青枯”。青枯病是世界上危害最大、分布最广、造成损失最严重的植物病害之一，被称为植物的“癌症”。在我国主要农作物中以番茄、辣椒等茄科植物受青枯病的危害最为严重。一般田块的发病率为10%-15%，重病田的发病率高达80%-100%。
[0003] 目前，生产上防治设施茄果类蔬菜青枯病主要依靠化学农药。这不仅造成生态环境严重污染，而且直接增加蔬菜中有毒化学物质的残留，对人类健康带来严重危害。为了解决蔬菜产量和质量之间矛盾，达到防治植物病害、减少化学农药的使用量的目的，使用生物防治控制植物病害的方法越来越受到各国政府和人民的关注。
[0004] 江苏省农科院植保所筛选获得的、对茄果类蔬菜青枯病有很好防效的枯草芽孢杆菌PTS-394，并于2011年11月1日申请了专利，公开号为CN102550607A。其中公开的形态特征记载为：菌株营养体为杆状，两端椭圆，周生鞭毛。大小为( 0.7-0.8)微米×(2.0-3.0)微米。无荚膜。芽孢中生，椭圆形，大小为( 0.6-0.9)微米×(1.0-1.5)微米。枯草芽孢杆菌PTS-394在牛肉汁蛋白胨琼脂平板上培养时，菌落边缘波浪形，米色，表面有皱褶。质地为不透明状，不产生色素。革兰氏反应阳性。H2O2酶反应阳性，V.P. 反应阳性。L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、D-木糖、D-甘露醇利用为阳性。淀粉水解、明胶液化、柠檬酸钠利用、二羟基丙酮形成反应也均为阳性。此外，枯草芽孢杆菌PTS-394还具有许多优良性能，如：有较广的抑菌谱，对多种植物病原菌有很强的抑制作用；生长速度快，适应环境能力强，能在土壤和植物表面定殖，并形成优势种群；诱导寄主产生抗病性；分泌产生多种抗菌物质。目前，江苏省扬州市绿源生物有限公司已生产了200亿枯草芽孢杆菌PTS-394活菌水剂。
[0005] 枯草芽孢杆菌PTS-394活菌制剂中的菌含量是产品的一个重要技术和经济指标。要提高发酵液中菌含量，就必须对其发酵培养基成分及配比、培养条件各个参数进行优化。
[0006] 近年来，研究人员利用Plackett-Burman(PB)实验设计方法可以快速从影响因素中筛选出对目标值影响最大的关键因子，并能为爬坡实验指出方向和变化步长，已广泛应用于微生物发酵培养基成分和工艺参数的筛选。响应曲面法（Response Surface Method，RSM）是一种适用性强且简易可靠的统计学实验设计优化方法，是一种优化生物过程的综合技术。国内已有许多关于采用响应曲面法对微生物发酵过程进行优化的报道。
[0007] 目前，利用Plackett-Burman法和响应曲面法优化获得的以提高枯草芽孢杆菌PTS-394发酵菌液中活菌量为目的的发酵培养基和培养条件，未见诸报道。
发明内容
[0008] 本发明的目的在于：针对目前枯草芽孢杆菌PTS-394活菌制剂中的菌含量较低的实际问题，提供一种基于传统的枯草芽孢杆菌PTS-394发酵培养方法，对其中的发酵培养基和培养条件进行优化，提高发酵液中菌含量。
[0009] 本发明的目的是这样实现的：一种枯草芽孢杆菌PTS-394的发酵培养方法，包括在发酵培养基中接种枯草芽孢杆菌PTS-394种子液，在摇床上发酵培养2d，其特征在于：发酵培养基中的碳源为玉米淀粉，氮源为大豆粉，影响菌含量预测值的三个关键因子为玉米淀粉、大豆粉和酵母粉，在发酵培养基中的三个关键因子含量依次为11.48 g/L、13.35 g/L和0.90 g/L，发酵培养条件中影响菌含量和抑菌圈直径的三个关键因子为温度、初始PH值和装液量，它们在发酵培养过程中选择：温度30.84℃，初始PH 6.93，装液量65.15 mL/250 mL。。
[0010] 在本发明中：发酵培养基的组分为：玉米淀粉11.48 g/L、大豆粉13.35 g/L和酵母粉0.90 g/L、CaCO3 3 g，NaCl 0.5 g，鱼粉10 g；发酵培养基的装液量为65.15 mL/250 mL，发酵培养基中接种枯草芽孢杆菌PTS-394的种子液后，初始pH 6.93，置于30.84℃，摇床发酵培养。
[0011] 在本发明中：发酵培养2d，发酵液中的菌含量为（6.38±0.16）E+10 cfu/mL，对青枯病菌抑菌圈直径为32.12±0.08 mm。
[0012] 本发明的优点在于： 由于枯草芽孢杆菌PTS-394活菌制剂中的有效菌含量是产品的一个重要技术和经济指标。本发明利用改良后的优化培养基组分及配比和培养条件，提高枯草芽孢杆菌PTS-394发酵菌液中菌含量，为枯草芽孢杆菌PTS-394高效防治青枯病提供理论依据。
具体实施方式
[0013] 实施例1 确定培养基碳源、氮源枯草芽孢杆菌PTS-394的基础发酵培养基（由公开号为CN102550607A的专利申请中实施例3公开）：玉米粉20 g，豆饼粉10 g，大豆粉5 g，酵母粉1.5 g，CaCO3 3 g，NaCl 0.5 g，鱼粉10 g，补水至1000 mL，pH 7.5。
[0014] 将上述基础发酵培养基的20 g/L玉米粉以蔗糖，可溶性淀粉，玉米淀粉，麦芽糖，乳糖，木糖6种不同碳源等量（20 g/L）替换，配成不同碳源的培养基。将基础发酵培养基的10 g/L豆饼粉以大豆粉，胰蛋白胨，酵母浸粉，牛肉膏，蛋白胨，鱼粉6种不同氮源等量（10 g/L）替换，配成不同氮源的培养基。
[0015] 将不同碳、氮源的培养基pH调中性后分装，装液量为100 mL/250 mL三角瓶，灭菌。以2%的接种量接种枯草芽孢杆菌PTS-394种子液（菌含量为2.11E+10 cfu/mL）后，置于28℃，150 rpm的摇床中摇培48 h，采用平板稀释法检测发酵液菌含量，每个处理设3个重复，取平均值。碳源、氮源筛选试验结果见表1。
[0016] 表1 不同碳源、氮源对PTS-394发酵液菌含量的影响结果显示：使用玉米淀粉为碳源，发酵液菌含量最多，所以玉米淀粉是枯草芽孢杆菌PTS-394发酵培养的最佳碳源。使用大豆粉为唯一氮源，发酵液菌含量最多，所以大豆粉是枯草芽孢杆菌PTS-394发酵培养的最佳氮源。
[0017] 将PTS-394的基础发酵培养基调整为玉米淀粉20g，大豆粉15g，酵母粉1.5g，CaCO33 g，NaCl 0.5g，鱼粉10g，补水至1000mL，pH7.5，定义为初始发酵培养基（简称初始培养基）。
[0018] 实施例2 确定发酵培养基成分的关键因子采用Plackett-Burman实验设计，从实施例1中枯草芽孢杆菌PTS-394培养基成分（玉米淀粉，大豆粉，酵母粉，CaCO3，NaCl，鱼粉）6个因子中筛选出关键因子。PB实验设计如表
2所示：
表2 培养基成分因子Plackett-Burman实验设计及结果
注：实验中每个因素取两个水平，高水平“1”表示该成分含量是初始发酵培养基的1.5倍；低水平“-1”表示该成分含量是初始发酵培养基的0.5倍。
2所示：
表2 培养基成分因子Plackett-Burman实验设计及结果
注：实验中每个因素取两个水平，高水平“1”表示该成分含量是初始发酵培养基的1.5倍；低水平“-1”表示该成分含量是初始发酵培养基的0.5倍。
[0019] 对表2数据进行回归分析，所得主要因子编码的方程为：Y0=9.47+0.12A+0.055B-0.032C+0.020D+9.095E-003E-0.012F
2
式中：Y0为菌含量的预测值（cfu/mL）（下同），该方程的相关性为R0=0.9440。
2
式中：Y0为菌含量的预测值（cfu/mL）（下同），该方程的相关性为R0=0.9440。
[0020] 对培养基因子进行Plackett-Burman方差分析，结果见表3。培养基成分6个因子在α=0.05水平上显著的有玉米淀粉（A），大豆粉（B），显著水平分别为99.95%和98.34%。说明这2个因子的变化显著影响枯草芽孢杆菌PTS-394发酵液菌含量。酵母粉的显著水平为90.70%，对发酵液菌含量也有较显著的影响。因此确定玉米淀粉、大豆粉、酵母粉3个因子为培养基成分中影响菌含量的关键因子。
[0021] 表3 培养基各因子Plackett-Burman实验设计的方差分析实施例3发酵培养基关键因子的最优配比
分析PB实验结果可知，玉米淀粉，大豆粉和酵母粉3个因子为影响枯草芽孢杆菌PTS-394菌含量的关键因子，根据拟合方程Y0各变量系数确定关键因子的爬坡方向和步长，进行最陡爬坡实验。爬坡实验设计和结果见表4：
表4 培养基成分关键因子最陡爬坡实验设计及结果
由表4中可以看出，3个因子的变化组合中，编号4的组合下菌含量为最大，因此选择此组合作为响应曲面实验的中心值，进行下一步RSM实验设计。
分析PB实验结果可知，玉米淀粉，大豆粉和酵母粉3个因子为影响枯草芽孢杆菌PTS-394菌含量的关键因子，根据拟合方程Y0各变量系数确定关键因子的爬坡方向和步长，进行最陡爬坡实验。爬坡实验设计和结果见表4：
表4 培养基成分关键因子最陡爬坡实验设计及结果
由表4中可以看出，3个因子的变化组合中，编号4的组合下菌含量为最大，因此选择此组合作为响应曲面实验的中心值，进行下一步RSM实验设计。
[0022] 根据最陡爬坡实验结果（表4）确定了响应曲面法实验设计的各水平取值，响应曲面法实验设计结果见表5：表5 响应曲面法确定培养基成分关键因子的最佳配比
注：实验中每个因素取两个水平，高水平“1”表示该成分含量是表4中4号组合（响应曲面实验的中心值）的1.5倍；低水平“-1”表示该成分含量是表4中4号组合（响应曲面实验的中心值）的0.5倍。
注：实验中每个因素取两个水平，高水平“1”表示该成分含量是表4中4号组合（响应曲面实验的中心值）的1.5倍；低水平“-1”表示该成分含量是表4中4号组合（响应曲面实验的中心值）的0.5倍。
[0023] 采用Design-Expert 8.0软件进行方差分析，进行二次多项回归拟合，得出菌含量和抑菌圈直径的动态响应模型分别为：Y1=9.61+0.13A+0.046B-0.025C-0.007AB+0.013AC+0.011BC-0.16A2-0.044B2-0.084C2该方程的相关性为R12=0.9709。
[0024] Y2=8.18+0.45A-0.092B-0.22C-0.16AB+0.30AC+0.065BC-1.06A2-0.39B2-0.48C2该方程的相关性为R22=0.9786。
[0025] 式中，Y1为菌含量cfu/mL（下同），Y2为抑菌圈直径mm（下同）。
[0026] 响应曲面规范分析可知，回归模型存在最大值：当玉米淀粉11.48 g/L、大豆粉13.35 g/L和酵母粉0.90 g/L。此时菌含量预测值为4.43 E+10 cfu/mL，抑菌圈直径为
26.20 mm。因此，枯草芽孢杆菌PTS-394的优化发酵培养基（简称优化培养基）最优配比为：
玉米淀粉11.48 g/L、大豆粉13.35g/L和酵母粉0.90g/L、CaCO3 3g，NaCl 0.5g，鱼粉10g。
26.20 mm。因此，枯草芽孢杆菌PTS-394的优化发酵培养基（简称优化培养基）最优配比为：
玉米淀粉11.48 g/L、大豆粉13.35g/L和酵母粉0.90g/L、CaCO3 3g，NaCl 0.5g，鱼粉10g。
[0027] 实施例4 优化培养基的效果验证以实施例1获得的初始培养基和实施例3模型预测的优化培养基分别进行摇瓶发酵实验，方法步骤均参照公开号为CN102550607A的专利申请中实施例1的部分，结果为表6，由表6表明，初始培养基和优化培养基发酵液菌含量和抑菌圈直径实测值与模型预测值在α=0.05水平上均无显著差异，验证了该模型具有较高的拟合度；优化培养基与初始培养基相比，其菌含量和抑菌活性分别提高了104.7%和29.2%，显示了较好的优化效果。
[0028] 表6 优化培养基的验证实验注：每行数据后不同字母表示在0.05水平上差异显著。
[0029] 实施例5 确定枯草芽孢杆菌PTS-394发酵培养条件的关键因子根据常规发酵条件，设定了培养条件因子的取值范围：温度（28℃-35℃），pH（6.5-8.0），接种量（0.1%-3%），装液量（30-100mL/250mL），培养时间（24-60h），转速（130-180rpm），菌龄（12-36h）。采用PB实验设计从上述7个因素中筛选对菌株PTS-394生长具有显著影响的条件因子。实验中每个因素取两个水平，即高水平“1”和低水平“-1”。
实验设计及结果如表7所示，对表7数据进行回归分析，所得方程为：
2
Y0=9.68+0.054A-0.020B-0.015E，该方程的相关性为R0=0.9755。
实验设计及结果如表7所示，对表7数据进行回归分析，所得方程为：
2
Y0=9.68+0.054A-0.020B-0.015E，该方程的相关性为R0=0.9755。
[0030] 方差分析结果（表8）显示：7个因素中在α=0.05水平上显著的因子有培养温度（A），初始pH（B）和装液量（E），其显著水平分别为0.0003，0.0141和0.0328，说明这3个因子的变化显著影响发酵菌含量。
[0031] 表7 培养条件因子Plackett-Burman实验设计及结果注：实验中每个因素取两个水平，高水平“1”表示该因子取值范围内的最高值；低水平“-1”表示该因子取值范围内的最低值。
[0032] 表8 培养条件因子Plackett-Burman实验设计的方差分析实施例6 确定枯草芽孢杆菌PTS-394最佳培养条件
以PB实验分析结果为依据，进行爬坡实验，爬坡实验设计及结果见表9，由表中可以看出，编号3处理的条件组合时的菌含量最大，因此选择此为响应曲面实验的中心值，进行下一步实验。
以PB实验分析结果为依据，进行爬坡实验，爬坡实验设计及结果见表9，由表中可以看出，编号3处理的条件组合时的菌含量最大，因此选择此为响应曲面实验的中心值，进行下一步实验。
[0033] 表9 培养条件关键因子最陡爬坡实验设计及结果根据最陡爬坡实验结果确定了响应曲面法实验设计的各水平取值，响应曲面法实验设计结果见表10。采用Design-Expert 8.0软件进行方差分析，进行二次多项回归拟合，得出菌含量和抑菌圈直径的动态响应模型分别为：
Y1（菌含量）=9.79+0.040A-0.021B-0.016C+0.011AB+5.87E-003AC-4.45E-003BC-
2 2 2
0.058A-0.029B-6.84E-003C
2
该方程的相关性为R1 =0.9853。
Y1（菌含量）=9.79+0.040A-0.021B-0.016C+0.011AB+5.87E-003AC-4.45E-003BC-
2 2 2
0.058A-0.029B-6.84E-003C
2
该方程的相关性为R1 =0.9853。
[0034] Y2（抑菌圈直径）=8.18+0.45A-0.092B-0.22C-0.16AB+0.30AC+0.065BC-1.06A2-02 2
.39B-0.48C
2
该方程的相关性为R2 =0.9691。
.39B-0.48C
2
该方程的相关性为R2 =0.9691。
[0035] 经响应曲面规范分析可知，回归模型存在最大值。3个关键因子分别为温度30.84℃、pH 6.93和装液量65.15 mL/250mL时，其他因子为：2%接种量，150 rpm，培养时间为48 h时发酵液菌含量和抑菌圈直径的预测值为6.32 E+10 cfu/mL和32.24 mm。
[0036] 表10 响应曲面法确定培养条件关键因子的数值实施例7 优化培养基在优化发酵培养条件下的摇瓶发酵验证
以实施例3提供的模型预测的优化培养基进行分组实验，一组采用初始发酵培养条件，其方法步骤参照公开号为CN102550607A的专利申请中实施例1的部分，另一组为优化发酵培养条件，其方法步骤以公开号为CN102550607A的专利申请中实施例1部分为基础，仅改变其中的3个关键因子温度、pH值和装液量，即温度30.84℃，pH 6.93，装液量65.15 mL/250mL，两组分别进行摇瓶发酵实验，结果为表11，由表11表明，初始发酵培养条件和优化发酵培养条件两种方式发酵液菌含量和抑菌活性实测值与模型预测值在α=0.05水平上均无显著差异，验证了该模型具有较高的拟合度；优化后的发酵培养条件与初始发酵培养条件相比，其菌含量和抑菌圈直径分别提高了39.2%和20.9%，显示了较好的优化效果。
以实施例3提供的模型预测的优化培养基进行分组实验，一组采用初始发酵培养条件，其方法步骤参照公开号为CN102550607A的专利申请中实施例1的部分，另一组为优化发酵培养条件，其方法步骤以公开号为CN102550607A的专利申请中实施例1部分为基础，仅改变其中的3个关键因子温度、pH值和装液量，即温度30.84℃，pH 6.93，装液量65.15 mL/250mL，两组分别进行摇瓶发酵实验，结果为表11，由表11表明，初始发酵培养条件和优化发酵培养条件两种方式发酵液菌含量和抑菌活性实测值与模型预测值在α=0.05水平上均无显著差异，验证了该模型具有较高的拟合度；优化后的发酵培养条件与初始发酵培养条件相比，其菌含量和抑菌圈直径分别提高了39.2%和20.9%，显示了较好的优化效果。
[0037] 表11 优化培养条件的验证实验注：每行数据后不同字母表示在0.05水平上差异显著。
[0038] 以上各实施例不是对本发明的具体限制，只要在枯草芽孢杆菌PTS-394的发酵培养过程中，发酵培养基采用权利要求中涉及的影响菌含量预测值的三个关键因子限定的范围，以及在发酵培养条件中采用权利要求中涉及的影响菌含量和抑菌圈直径的三个关键因
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