抗VISTA抗体和使用方法
阅读：112发布：2020-05-08
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1.一种与VISTA结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括：
(i)重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:3-5、11-13、19-21、2-29、35-37或43-
45的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3；以及
(ii)轻链可变区，所述轻链可变区分别包括SEQ ID NO:6-8、14-16、22-24、30-32、38-
40或46-48的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3；或
所述抗体的变体或其抗原结合片段，其包括除所述CDR区中最多8个氨基酸取代之外与(i)和(ii)的所述重链可变区和所述轻链可变区相同的重链可变区和轻链可变区。
2.根据权利要求0所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述重链可变区包括SEQ ID NO:1、9、17、25、33或41中分别所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求0或2所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述轻链可变区包括SEQ ID NO:2、10、18、26、34或42中分别所示的氨基酸序列。
4.一种与人VISTA结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:1、9、17、25、33或41中所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求0所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括轻链可变区，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:2、10、18、26、34或42中分别所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求0所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:2、10、18、26、34或42中分别所示的氨基酸序列。
7.一种与人VISTA结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:2、10、18、26、34或42中分别所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求0所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括：重链可变区，所述重链可变区包括与SEQ ID NO:1、9、17、25、33或41中分别所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求0到8中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是人源化的。
10.根据权利要求0所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述VH区包括SEQ ID NO:86、88、90、92、94、96或98，并且所述VL区分别包括SEQ ID NO:87、89、91、93、95、97或99。
11.根据权利要求0到10中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体选自由以下组成的组：单链抗体、scFv、缺乏铰链区的单价抗体以及微抗体。
12.根据权利要求0到10中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是Fab或Fab'片段。
13.根据权利要求0到10中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是F(ab')2片段。
14.根据权利要求0到10中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体是完整抗体。
15.根据权利要求0到14中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括人IgG恒定结构域。
16.根据权利要求0所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述IgG恒定结构域包括IgG1 CH1结构域。
17.根据权利要求0所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述IgG恒定结构域包括IgG1 Fc区。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括修饰的Fc区，其中所述修饰的Fc区具有改变的针对特异性FcγR的结合亲和力、增加的血清半衰期和/或改变的选自以下中的一种或多种的效应子功能：补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)，任选地其中所述抗体被交联以改变其效应子功能。
19.根据权利要求18所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述修饰的Fc区具有增强的针对特异性FcγR的结合亲和力和/或其中所述修饰的Fc区具有增强的效应子功能。
20.根据权利要求18所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述修饰的Fc区具有降低的针对特异性FcγR的结合亲和力和/或其中所述修饰的Fc区具有降低的效应子功能。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其以2.2nM或更低的KD结合VISTA。
22.根据权利要求1到21中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段：
(a)增加T细胞活化；
(b)增加T细胞增殖；
(c)增加MHC II表达；
(d)活化自然杀伤(NK)细胞；
(e)活化单核细胞/巨噬细胞；
(f)增加细胞因子产生，任选地其中所述细胞因子选自以下中的一种或多种：
IFN-γ、IL-6、IL-1ra、IL-1a、IL-8、MIP-1a、MIP-1b IP-10、TNF-α和MCP-1；或(g)(a)-(f)中任一项或多项的组合。
23.根据权利要求1到22中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其是VISTA拮抗剂。
24.根据权利要求1到22中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其是VISTA激动剂。
25.一种与VISTA结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括：(i)重链可变区，所述重链可变区包括图1中所示的VH区中的任一个的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3；以及(ii)轻链可变区，所述轻链可变区包括图1中所示的抗体中的任一抗体的对应VL区的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3区；或所述抗体的变体或其抗原结合片段，其包括除所述CDR区中最多8个氨基酸取代之外与(i)和(ii)的所述重链可变区和所述轻链可变区相同的重链可变区和轻链可变区。
26.一种与VISTA结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区，所述重链可变区包括图1中所示的VH区中的任一个。
27.根据权利要求0所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括轻链可变区，所述轻链可变区包括与如图1中所示的对应VL区具有至少90％同一性的氨基酸序列。
28.根据权利要求26所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括如图1中所示的对应轻链可变区。
29.一种与VISTA结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括轻链可变区，所述轻链可变区包括图1中所示的VL区中的任一个。
30.根据权利要求29所述的分离的抗体或其抗原结合片段，其进一步包括重链可变区，所述重链可变区包括与如图1中所示的对应VH区具有至少90％同一性的氨基酸序列。
31.一种分离的多核苷酸，其对根据权利要求1到30中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段进行编码。
32.一种表达载体，其包括根据权利要求31所述的分离的多核苷酸。
33.一种分离的宿主细胞，其包括根据权利要求32所述的载体。
34.一种组合物，其包括生理上可接受的载剂和治疗有效量的根据权利要求1到30中任一项所述的分离的抗体或其抗原结合片段。
35.一种用于治疗患有与异常VISTA表达相关的癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求34所述的组合物，由此治疗所述与异常VISTA表达相关的癌症。
36.一种用于治疗患有与VISTA介导的免疫抑制相关的癌症的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求34所述的组合物，由此治疗所述与VISTA介导的免疫抑制相关的癌症。
37.根据权利要求35或36所述的方法，其中所述癌症选自以下中的一种或多种：非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性成淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、肠胃癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌以及恶性黑素瘤。
38.根据权利要求35到37中任一项所述的方法，其包括向所述患者施用至少一种癌症免疫治疗剂。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述至少一种癌症免疫治疗剂选自以下中的一种或多种：免疫检查点调节剂、癌症疫苗、溶瘤病毒、细胞因子和基于细胞的免疫疗法。
40.根据权利要求39所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂是多肽，任选地抗体或其抗原结合片段或配体或小分子。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中所述免疫检查点调节剂包括：
(a)抑制性免疫检查点分子的拮抗剂；或
(b)刺激性免疫检查点分子的激动剂，
任选地，其中所述免疫检查点调节剂与所述免疫检查点分子特异性结合。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述抑制性免疫检查点分子选自以下中的一种或多种：程序性死亡-配体1(PD-L1)、程序性死亡1(PD-1)、程序性死亡-配体2(PD-L2)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)、色氨酸2,3-加双氧酶(TDO)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、CD160、疱疹病毒进入介体(HVEM)以及具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。
43.根据权利要求42所述的方法，其中：
所述拮抗剂是PD-L1和/或PD-L2拮抗剂，其任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、阿特朱单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)、阿维单抗(avelumab)(MSB0010718C)和度伐鲁单抗(durvalumab)(MEDI4736)，任选地其中所述癌症选自以下中的一种或多种：结肠直肠癌、黑素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌和肾细胞癌；
所述拮抗剂是PD-1拮抗剂，其任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、MK-3475、AMP-224、AMP-514PDR001和皮地利珠单抗(pidilizumab)，任选地其中所述PD-1拮抗剂是纳武单抗，并且所述癌症任选地选自以下中的一种或多种：霍奇金淋巴瘤、黑素瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌、肾细胞癌和卵巢癌；
所述PD-1拮抗剂是派姆单抗，并且所述癌症任选地选自以下中的一种或多种：黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌和尿路上皮癌；
所述拮抗剂是CTLA-4拮抗剂，其任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、伊匹单抗(ipilimumab)和曲美木单抗(tremelimumab)，任选地其中所述癌症选自以下中的一种或多种：黑素瘤、前列腺癌、肺癌和膀胱癌；
所述拮抗剂是IDO拮抗剂，其任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、吲哚莫德(indoximod)(NLG-8189)、1-甲基-色氨酸(1MT)、β-咔啉(去甲哈尔满(norharmane)；9H-吡啶并[3,4-b]吲哚)、迷迭香酸和依帕卡朵丝坦(epacadostat)，其中所述癌症任选地选自以下中的一种或多种：转移性乳腺癌和脑癌，任选地多形性成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、神经胶质肉瘤或恶性脑瘤；
所述拮抗剂是TDO拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、680C91和LM10中的一种或多种；
所述拮抗剂是TIM-3拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子中的一种或多种；
所述拮抗剂是LAG-3拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子和BMS-986016中的一种或多种；
所述拮抗剂是BTLA、CD160和/或HVEM拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子中的一种或多种；和/或
所述拮抗剂是TIGIT拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子中的一种或多种。
44.根据权利要求41所述的方法，其中所述刺激性免疫检查点分子选自以下中的一种或多种：CD40、OX40、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)、CD137(4-1BB)、CD27、CD28、CD226和疱疹病毒进入介体(HVEM)。
45.根据权利要求44所述的方法，其中：
所述激动剂是CD40激动剂，其任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、APX005、APX005M、CP-870,893、达西珠单抗(dacetuzumab)、Chi Lob 7/4、ADC-1013和rhCD40L，并且其中所述癌症任选地选自以下中的一种或多种：黑素瘤、胰腺癌、间皮瘤和血液癌，任选地淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤；
所述激动剂是OX40激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、OX86、Fc-OX40L和GSK3174998中的一种或多种；
所述激动剂是GITR激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、INCAGN01876、DTA-1和MEDI1873中的一种或多种；
所述激动剂是CD137激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、乌托米单抗(utomilumab)和4-1BB配体中的一种或多种；
所述激动剂是CD27激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、瓦利路单抗(varlilumab)和CDX-1127(1F5)中的一种或多种；
所述激动剂是CD28激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体和TAB08中的一种或多种；和/或
所述激动剂是HVEM激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体中的一种或多种。
46.根据权利要求39所述的方法，其中所述癌症疫苗选自以下中的一种或多种：
Oncophage；人乳头瘤病毒HPV疫苗，任选地Gardasil或Cervarix；乙型肝炎疫苗，任选地Engerix-B、Recombivax HB或Twinrix；以及sipuleucel-T(普罗文奇(Provenge))，或者包括选自以下中的一种或多种的癌抗原：人Her2/neu、Her1/EGF受体(EGFR)、Her3、A33抗原、B7H3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、MAGE-3、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF(例如，VEGF-A)、VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、鸟苷酸环化酶C、NY-ESO-1、p53、生存素、整合素αvβ3、整合素α5β1、叶酸受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40泛癌抗原、B细胞活化因子(BAFF)、血小板衍生的生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-1、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷酸酶3(PRL-3)、前列腺酸性磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(在神经外胚层来源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷脂)、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)以及间皮素，任选地其中受试者患有包括对应癌症抗原的癌症或具有患有所述癌症的风险。
47.根据权利要求39所述的方法，其中所述溶瘤病毒选自以下中的一种或多种：拉他莫基(talimogene laherparepvec，T-VEC)、柯萨基病毒A21(CAVATAKTM)、安柯瑞(Oncorine)(H101)、佩拉雷奥雷派(pelareorep) 塞内卡谷病毒(Seneca Valley
virus)(NTX-010)、塞内卡病毒(Senecavirus)SVV-001、ColoAd1、SEPREHVIR(HSV-1716)、CGTG-102(Ad5/3-D24-GMCSF)、GL-ONC1、MV-NIS和DNX-2401。
48.根据权利要求39所述的方法，其中所述细胞因子选自以下中的一种或多种：干扰素(IFN)-α、IL-2、IL-12、IL-7、IL-21和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
49.根据权利要求39所述的方法，其中所述基于细胞的免疫治疗剂包括癌抗原特异性T细胞，任选地离体来源的T细胞。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述癌抗原特异性T细胞选自以下中的一种或多种：嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞和T细胞受体(TCR)修饰的T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)以及肽诱导的T细胞。
51.根据权利要求35到50中任一项所述的方法，其中所述抗VISTA抗体或其抗原结合片段以及至少一种癌症免疫治疗剂作为单独的组合物分开施用。
52.根据权利要求35到50中任一项所述的方法，其中所述抗VISTA抗体或其抗原结合片段以及至少一种癌症免疫治疗剂作为同一组合物的一部分一起施用。
53.一种用于治疗患有感染性疾病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用根据权利要求34所述的组合物，由此治疗所述感染性疾病。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述感染性疾病是病毒、细菌、真菌，任选地酵母菌或原生动物感染。
55.一种治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括：
(a)将从所述患者获得的离体来源的自体免疫细胞与根据权利要求1到30中任一项所述的抗VISTA抗体或其抗原结合片段一起温育；以及
(b)向所述患者施用所述自体免疫细胞。
56.根据权利要求55所述的方法，其中所述自体免疫细胞包括淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和/或树突细胞。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述淋巴细胞包括T细胞，任选地细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述T细胞包括癌抗原特异性T细胞。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述癌抗原特异性T细胞选自以下中的一种或多种：嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞、T细胞受体(TCR)修饰的T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)以及肽诱导的T细胞。
抗VISTA抗体和使用方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2017年6月22日提交的美国申请第62/523,649号的优先权，所述美国申请以全文引用的方式并入本文中。
[0004] 与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本并且在此通过引用并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称是APEX-019_01WO_ST25.txt。文本文件为114KB，创建于2018年6月22日并且通过EFS-Web以电子方式提交。
技术领域
背景技术
[0006] 负性检查点调节因子或抑制性免疫检查点在调节免疫应答中起着重要作用；然而，如程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)、程序性死亡-配体1(PD-L1)和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)等负性检查点调节因子可以提供肿瘤能够生长的环境。包含对PD-1、PD-L1和CTLA-4具特异性的阻断性抗体的免疫检查点抑制剂已被确定为癌症疗法的有前景的治疗剂，以试图逆转由这些负性检查点调节因子诱导的免疫抑制。
[0007] 最近，也被称为PD-1H、Dies1、血小板受体Gi24、SISP1、C10orf54和B7-H5的T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)已成为免疫疗法的有前景的靶标(Wang等人《,实验医学杂志(J Exp Med)》,2011 208(3):577-592)。抗VISTA抗体被描述为用于阻断免疫抑制并增强T细胞应答的拮抗作用(US 8,426,563；WO 2015/097536和WO 2016/207717)和用于增强免疫抑制并治疗自身免疫性疾病、移植排斥和炎性疾病的激动作用(US 2016/0096891和Flies等人《, 免疫学杂志(J Immunology)》,2011 187:1537-1541)。还提出了利用VISTA拮抗剂与PD-1和PD-L1抑制剂的组合的组合治疗来调节T细胞应答(US 2016/0083472；Lines等人《, 癌症免疫学研究(Cancer Immunol Res)》,2014 2(6):510-517；和Liu等人,PNAS
2015 112(21):6682-6687；Nowak等人《, 免疫学评论(Immunological Reviews)》,2017
276:66-79)。迄今为止，仅一种抗VISTA抗体(即JNJ-61610588(NCT02671955))已进入临床试验。
2015 112(21):6682-6687；Nowak等人《, 免疫学评论(Immunological Reviews)》,2017
276:66-79)。迄今为止，仅一种抗VISTA抗体(即JNJ-61610588(NCT02671955))已进入临床试验。
[0009] 本公开涉及与T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)特异性结合的抗体和其抗原结合片段以及其使用方法。本公开的一方面提供了一种与VISTA结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括：(i)重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:3-5、11-13、19-21、2-29、35-37或43-45的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3；以及(ii)轻链可变区，所述轻链可变区分别包括SEQ ID NO:6-8、14-16、22-24、30-32、38-40或46-48的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3；或所述抗体的变体或其抗原结合片段，其包括除所述CDR区中最多8个氨基酸取代之外与(i)和(ii)的所述重链可变区和所述轻链可变区相同的重链可变区和轻链可变区。
[0010] 在所述分离的抗体或其抗原结合片段的一个实施例中，所述重链可变区包括SEQ ID NO:1、9、17、25、33或41中分别所示的氨基酸序列。在所述分离的抗体或其抗原结合片段的一个实施例中，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:2、10、18、26、34或42中分别所示的氨基酸序列。
[0011] 本公开的另一方面提供了一种与人VISTA结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO:1、9、17、25、33或41中所示的氨基酸序列。在一个实施例中，所述轻链可变区包括与SEQ ID NO:2、10、18、26、34或42中分别所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一个实施例中，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:2、10、18、26、34或42中分别所示的氨基酸序列。
[0012] 本公开的一方面提供了一种与人VISTA结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括轻链可变区，所述轻链可变区包括SEQ ID NO:2、10、18、26、34或42中分别所示的氨基酸序列。在一个实施例中，所述重链可变区包括与SEQ ID NO:1、9、17、25、33或41中分别所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0013] 在本公开的一方面中，所述抗体是人源化的。在一个实施例中，所述VH区包括SEQ ID NO:86、88、90、92、94、96或98，并且所述VL区分别包括SEQ ID NO:87、89、91、93、95、97或99。
[0014] 在一个实施例中，所述抗体选自由以下组成的组：单链抗体、scFv、缺乏铰链区的单价抗体以及微抗体。在另一个实施例中，所述抗体是Fab或Fab'片段。在一个实施例中，所述抗体是F(ab')2片段。在一个实施例中，所述抗体是完整抗体。
[0015] 在某些实施例中，所述抗体包括人IgG恒定结构域。在一个实施例中，所述IgG恒定结构域包括IgG1 CH1结构域。在另一个实施例中，所述IgG恒定结构域包括IgG1 Fc区。
[0016] 在一些实施例中，所述抗体包括修饰的Fc区，例如，其中所述修饰的Fc区具有改变的(例如，增强的、降低的)针对特异性FcγR的结合亲和力、增加的血清半衰期和/或改变的选自以下中的一种或多种的效应子功能：补体依赖性细胞毒性(CDC)、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)。
[0017] 在一个实施例中，根据权利要求1所述的分离的抗体或其抗原结合片段以2.2nM或更低的KD结合VISTA。在一个实施例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段：(a)增加T细胞活化；(b)增加T细胞增殖；(c)增加MHC II表达；(d)活化自然杀伤(NK)细胞；(e)活化单核细胞/巨噬细胞；(f)增加细胞因子产生，例如，其中所述细胞因子选自以下中的一种或多种：IFN-γ、IL-6、IL-1ra、IL-1a、IL-8、MIP-1a、MIP-1b IP-10、TNF-α和MCP-1；或(g)(a)-(f)中任一项或多项的组合。
[0018] 在某些实施例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段是VISTA拮抗剂。在某些实施例中，所述分离的抗体或其抗原结合片段是VISTA激动剂。
[0019] 本公开的一方面提供了一种与VISTA结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括：(i)重链可变区，所述重链可变区包括图1中所示的VH区中的任一个的VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3；以及(ii)轻链可变区，所述轻链可变区包括图1中所示的抗体中的任一抗体的对应VL区的VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3区；或所述抗体的变体或其抗原结合片段，其包括除所述CDR区中最多8个氨基酸取代之外与(i)和(ii)的所述重链可变区和所述轻链可变区相同的重链可变区和轻链可变区。
[0020] 本公开的另一方面提供了一种与VISTA结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变区，所述重链可变区包括图1中所示的VH区中的任一个。在一个实施例中，轻链可变区包括与如图1中所示的对应VL区具有至少90％同一性的氨基酸序列。在另一个实施例中，所述VL包括如图1中所示的对应轻链可变区。
[0021] 本公开的一方面提供了一种与VISTA结合的分离的抗体或其抗原结合片段，其包括轻链可变区，所述轻链可变区包括图1中所示的VL区中的任一个。在一个实施例中，所述重链可变区包括与如图1中所示的对应VH区具有至少90％同一性的氨基酸序列。
[0022] 本公开的另一方面提供了一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸对分离的抗体或其抗原结合片段进行编码。本公开的一方面提供了一种包括分离的多核苷酸的表达载体。本公开的相关方面提供了一种包括载体的分离的宿主细胞。
[0023] 本公开的一方面提供了一种组合物，其包括生理上可接受的载剂和治疗有效量的分离的抗体或其抗原结合片段。在一个实施例中，一种用于治疗患有与异常VISTA表达相关的癌症的患者的方法包括向所述患者施用所述组合物，由此治疗所述与异常VISTA表达相关的癌症。在另一个实施例中，一种用于治疗患有与VISTA介导的免疫抑制相关的癌症的患者的方法包括向所述患者施用所述组合物，由此治疗所述与VISTA介导的免疫抑制相关的癌症。
[0024] 某些实施例包含向所述患者施用至少一种癌症免疫治疗剂。在一些实施例中，所述至少一种癌症免疫治疗剂选自以下中的一种或多种：免疫检查点调节剂、癌症疫苗、溶瘤病毒、细胞因子和基于细胞的免疫疗法。
[0025] 在一些实施例中，所述免疫检查点调节剂是多肽，任选地抗体或其抗原结合片段或配体或小分子。在一些实施例中，所述免疫检查点调节剂包括：
[0026] (a)抑制性免疫检查点分子的拮抗剂；或
[0027] (b)刺激性免疫检查点分子的激动剂，
[0028] 任选地，其中所述免疫检查点调节剂与所述免疫检查点分子特异性结合。
[0029] 在一些实施例中，所述抑制性免疫检查点分子选自以下中的一种或多种：程序性死亡-配体1(PD-L1)、程序性死亡1(PD-1)、程序性死亡-配体2(PD-L2)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)、色氨酸2,3-加双氧酶(TDO)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、CD160、疱疹病毒进入介体(HVEM)以及具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。
[0030] 在一些实施例中，所述拮抗剂是PD-L1和/或PD-L2拮抗剂，其任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、阿特朱单抗(atezolizumab)(MPDL3280A)、阿维单抗(avelumab)(MSB0010718C)和度伐鲁单抗
(durvalumab)(MEDI4736)，任选地其中所述癌症选自以下中的一种或多种：结肠直肠癌、黑素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌和肾细胞癌；
(durvalumab)(MEDI4736)，任选地其中所述癌症选自以下中的一种或多种：结肠直肠癌、黑素瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌和肾细胞癌；
[0031] 所述拮抗剂是PD-1拮抗剂，其任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、MK-3475、AMP-224、AMP-514PDR001和皮地利珠单抗(pidilizumab)，任选地其中所述PD-1拮抗剂是纳武单抗，并且所述癌症任选地选自以下中的一种或多种：霍奇金淋巴瘤、黑素瘤、非小细胞肺癌、肝细胞癌、肾细胞癌和卵巢癌；
[0032] 所述PD-1拮抗剂是派姆单抗，并且所述癌症任选地选自以下中的一种或多种：黑素瘤、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、头颈癌和尿路上皮癌；
[0033] 所述拮抗剂是CTLA-4拮抗剂，其任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、伊匹单抗(ipilimumab)和曲美木单抗(tremelimumab)，任选地其中所述癌症选自以下中的一种或多种：黑素瘤、前列腺癌、肺癌和膀胱癌；
[0034] 所述拮抗剂是IDO拮抗剂，其任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、吲哚莫德(indoximod)(NLG-8189)、1-甲基-色氨酸(1MT)、β-咔啉(去甲哈尔满(norharmane)；9H-吡啶并[3,4-b]吲哚)、迷迭香酸和依帕卡朵丝坦(epacadostat)，其中所述癌症任选地选自以下中的一种或多种：转移性乳腺癌和脑癌，任选地多形性成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、神经胶质肉瘤或恶性脑瘤；
[0035] 所述拮抗剂是TDO拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子、680C91和LM10中的一种或多种；
[0036] 所述拮抗剂是TIM-3拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子中的一种或多种；
[0037] 所述拮抗剂是LAG-3拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子和BMS-986016中的一种或多种；
[0038] 所述拮抗剂是BTLA、CD160和/或HVEM拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子中的一种或多种；和/或
[0039] 所述拮抗剂是TIGIT拮抗剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子中的一种或多种。
[0040] 在一些实施例中，所述刺激性免疫检查点分子选自以下中的一种或多种：CD40、OX40、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)、CD137(4-1BB)、CD27、CD28、CD226和疱疹病毒进入介体(HVEM)。
[0041] 在一些实施例中，所述激动剂是CD40激动剂，其任选地选自以下中的一种或多种：与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、APX005、APX005M、CP-870,893、达西珠单抗(dacetuzumab)、Chi Lob 7/4、ADC-1013和rhCD40L，并且其中所述癌症任选地选自以下中的一种或多种：黑素瘤、胰腺癌、间皮瘤和血液癌，任选地淋巴瘤，如非霍奇金淋巴瘤；
[0042] 所述激动剂是OX40激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、OX86、Fc-OX40L和GSK3174998中的一种或多种；
[0043] 所述激动剂是GITR激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、INCAGN01876、DTA-1和MEDI1873中的一种或多种；
[0044] 所述激动剂是CD137激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、乌托米单抗(utomilumab)和4-1BB配体中的一种或多种；
[0045] 所述激动剂是CD27激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体、瓦利路单抗(varlilumab)和CDX-1127(1F5)中的一种或多种；
[0046] 所述激动剂是CD28激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体和TAB08中的一种或多种；和/或
[0047] 所述激动剂是HVEM激动剂，其任选地选自与其特异性结合的抗体或抗原结合片段或小分子或配体中的一种或多种。
[0048] 在一些实施例中，所述癌症疫苗选自以下中的一种或多种：Oncophage；人乳头瘤病毒HPV疫苗，任选地Gardasil或Cervarix；乙型肝炎疫苗，任选地Engerix-B、Recombivax HB或Twinrix；以及sipuleucel-T(普罗文奇(Provenge))，或者包括选自以下中的一种或多种的癌抗原：人Her2/neu、Her1/EGF受体(EGFR)、Her3、A33抗原、B7H3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、MAGE-3、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF(例如，VEGF-A)、VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、鸟苷酸环化酶C、NY-ESO-1、p53、生存素、整合素αvβ3、整合素α5β1、叶酸受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40泛癌抗原、B细胞活化因子(BAFF)、血小板衍生的生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-1、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷酸酶3(PRL-3)、前列腺酸性磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(在神经外胚层来源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷脂)、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)以及间皮素，任选地其中受试者患有包括对应癌症抗原的癌症或具有患有所述癌症的风险。
[0049] 在一些实施例中，所述溶瘤病毒选自以下中的一种或多种：拉他莫基(talimogene laherparepvec，T-VEC)、柯萨基病毒A21(CAVATAKTM)、安柯瑞(Oncorine)(H101)、佩拉雷奥雷派(pelareorep) 塞内卡谷病毒(Seneca Valley virus)(NTX-010)、塞内卡病毒(Senecavirus)SVV-001、ColoAd1、SEPREHVIR(HSV-1716)、CGTG-102(Ad5/3-D24-GMCSF)、GL-ONC1、MV-NIS和DNX-2401。
[0050] 在一些实施例中，所述细胞因子选自以下中的一种或多种：干扰素(IFN)-α、IL-2、IL-12、IL-7、IL-21和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
[0051] 在一些实施例中，所述基于细胞的免疫治疗剂包括癌抗原特异性T细胞，任选地离体来源的T细胞。
[0052] 在一些实施例中，所述癌抗原特异性T细胞选自以下中的一种或多种：嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞和T细胞受体(TCR)修饰的T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)以及肽诱导的T细胞。
[0053] 在一些实施例中，所述抗VISTA抗体或其抗原结合片段以及至少一种癌症免疫治疗剂作为单独的组合物分开施用。在一些实施例中，所述抗VISTA抗体或其抗原结合片段以及至少一种癌症免疫治疗剂作为同一组合物的一部分一起施用。
[0054] 还包含用于治疗患有感染性疾病的患者的方法，所述方法包括向所述患者施用包括如本文所述的抗VISTA抗体或其抗原结合片段的组合物，由此治疗所述感染性疾病。在一些实施例中，所述感染性疾病是病毒、细菌、真菌(任选地，酵母菌)或原生动物感染。
[0055] 还包含治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括：(a)将从所述患者获得的离体来源的自体免疫细胞与本文所描述的抗VISTA抗体或其抗原结合片段一起温育；以及(b)向所述患者施用所述自体免疫细胞。在一些实施例中，所述自体免疫细胞包括淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和/或树突细胞。在一些实施例中，所述淋巴细胞包括T细胞，任选地细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。在一些实施例中，所述T细胞包括癌抗原特异性T细胞。在一些实施例中，所述癌抗原特异性T细胞选自以下中的一种或多种：嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞、T细胞受体(TCR)修饰的T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)以及肽诱导的T细胞。附图说明
[0056] 图1A-1F示出了兔抗VISTA VH区(图1A-1C)和VL区(图1D-1F)的氨基酸序列比对。重链和轻链CDR 1-3是加下划线的。
[0057] 图2是示出了与人抗VISTA抗体VSTB112相比的兔-人嵌合抗VISTA抗体的表位结合的线图。
[0058] 图3是示出了与人抗VISTA抗体VSTB112相比通过嵌合抗VISTA抗体对人单核细胞进行的活化的线图。
[0059] 图4是示出了如通过ELISA所测量的人源化抗VISTA抗体与可溶性VISTA的结合的线图。
[0060] 图5是示出了如通过流式细胞术所测量的人源化抗VISTA抗体与转染的HEK293细胞表面上的VISTA结合的线图。
[0061] 图6A-6G是示出了通过人源化抗VISTA抗体增强葡萄球菌肠毒素B(SEB)对T细胞的刺激的一系列线图。
[0062] 图7A-7F是示出了通过人源化抗VISTA抗体在混合淋巴细胞反应中增强CD4 T细胞增殖的一系列线图。
[0063] 图8A-8C示出了抗VISTA单克隆抗体活化人NK细胞的能力。
[0064] 图9A-9I示出了人源化抗VISTA抗体在全血测定中诱导细胞因子释放的能力。
[0065] 序列简要说明
[0066] 下表1中提供了兔抗VISTA抗体克隆2D12、3A5、14D8、14F1、29G7和41A11的VH区、VL区和CDR的氨基酸序列标识符。
[0067]
[0068] 下表2中提供了示例性兔抗VISTA抗体克隆的VH区和VL区的氨基酸序列标识符。
[0069]
[0070]
[0071] 下表3中提供了示例性人源化抗VISTA抗体2D12-HZD3、3A5-HZD、14D8-HZD2、14F1-HZD2、29G7-HZD2、29G7-HZD4以及41A11-HZD2的VH区、VL区、CDR、重链和轻链的氨基酸序列标识符。
[0072]
[0073]
[0074]
[0075]
[0076]
[0077]
[0078]
[0079]
具体实施方式
[0080] 本公开涉及与T细胞活化的V结构域Ig抑制剂(VISTA)特异性结合的抗体和其抗原结合片段，具体地涉及具有特异性表位特异性和功能特性的抗体。本公开的一个实施例涵盖能够与VISTA结合、阻断VISTA与配体和/或反受体结合并抑制诱导的下游细胞信号传导和生物学效应的特异性人源化抗体和其片段。在一些实施例中，抗VISTA抗体或其抗原结合片段是VISTA拮抗剂或抑制剂。VISTA的拮抗剂通过阻断或以其它方式减弱VISTA的免疫抑制作用来增强免疫应答。本公开的VISTA拮抗剂抗体可用于治疗和预防例如癌症(特别是VISTA表达性癌症)和感染性疾病。在一些实施例中，抗VISTA抗体或其抗原结合片段是VISTA激动剂或活化剂。VISTA激动剂通过增加VISTA的免疫抑制作用来抑制免疫应答。本公开的VISTA激动剂抗体可用于治疗和预防例如自身免疫性疾病和病症、移植(例如，移植物抗宿主疾病和移植排斥)和炎性疾病和病症。
[0081] 本公开的实施例涉及抗VISTA抗体或其抗原结合片段的用途，其用于诊断、评估和治疗与VISTA相关的疾病和病症或其异常表达。除其它疾病外，本发明的抗体用于治疗或预防癌症。本公开的其它实施例涉及抗VISTA抗体或其抗原结合片段的用途，其用于诊断、评估和治疗与异常或不想要的炎性T细胞应答相关的疾病和病症。
[0082] 除非特别相反地指出，否则本公开的实践将采用本领域技术范围内的病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学和重组DNA技术的常规方法，出于说明的目的，以下描述了所述方法中的许多方法。此类技术在文献中得到充分解释。参见例如《当前分子生物学方案(Current Protocols in Molecular Biology)》或《当前免疫学方案(Current Protocols in Immunology)》,约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons),纽约,(2009)；Ausubel等人,《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)》,第3版,约翰·威利父子公司,1995；Sambrook和Russell《, 分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》(第3版,2001)；Maniatis等人《, 分子克隆：实验室手册》,(1982)；《DNA克隆：实践方法(DNACloning:A Practical Approach)》,第I和II卷(D.Glover编辑)；
《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(N.Gait编辑,1984)；《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》(B.Hames和S.Higgins编辑,1985)；《转录和转译(Transcription and Translation)》(B.Hames和S.Higgins编辑,1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.Freshney编辑,1986)；Perbal《, 分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》(1984)以及其它相似参考文献。
《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(N.Gait编辑,1984)；《核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)》(B.Hames和S.Higgins编辑,1985)；《转录和转译(Transcription and Translation)》(B.Hames和S.Higgins编辑,1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.Freshney编辑,1986)；Perbal《, 分子克隆实用指南(A Practical Guide to Molecular Cloning)》(1984)以及其它相似参考文献。
[0083] 如在本说明书和所附权利要求中所使用的，除非文中另外明确指明，否则单数形式“一个/一种(a/an)”以及“所述(the)”包含复数指代。
[0084] “拮抗剂”是指干扰或以其它方式减弱另一种药剂或分子的生理作用的药剂(例如，抗体)。在一些情况下，拮抗剂与其它药剂或分子特异性结合。包含全部和部分拮抗剂。
[0085] “激动剂”是指增加或增强另一种药剂或分子的生理作用的药剂(例如，抗体)。在一些情况下，激动剂与其它药剂或分子特异性结合。包含全部和部分激动剂。
[0086] 术语“调节”和“改变”包含通常相对于对照“增加”、“增强”或“刺激”以及“降低”或“减少”统计学上显著或生理学上显著的量或程度。“增加的”、“刺激的”或“增强的”量通常是“统计学上显著的”量，并且可以包含1.1、1.2、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多倍(例如，500倍、1000倍)(包含所有整数和其间范围，例如，
1.5、1.6、1.7、1.8等)的由非组合物(例如，无药剂)或对照组合物产生的量的增加。“降低的”或“减少的”量通常是“统计学上显著的”量，并且可以包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、
7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、
35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(包含所有整数和其间的范围)的由非组合物(例如，无药剂)或对照组合物产生的量的减少。本文描述了比较和“统计学上显著的”量的实例。
1.5、1.6、1.7、1.8等)的由非组合物(例如，无药剂)或对照组合物产生的量的增加。“降低的”或“减少的”量通常是“统计学上显著的”量，并且可以包含1％、2％、3％、4％、5％、6％、
7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、
35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％(包含所有整数和其间的范围)的由非组合物(例如，无药剂)或对照组合物产生的量的减少。本文描述了比较和“统计学上显著的”量的实例。
[0087] “基本上”或“实质上”意指几乎完全或完全，例如，某些给定量的95％、96％、97％、98％、99％或更高。
[0088] “统计学上显著的”意指结果不太可能偶然发生。统计学显著性可以通过本领域已知的任何方法来确定。常用的显著性度量包含p值，如果零假设为真，则p值是所观察的事件将发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则零假设被否定。在简单的情况下，显著性水平以0.05或更小的p值限定。
[0089] 在整个说明书中，除非上下文另外要求，否则词语“包括(comprise)”或如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”等变型将被理解为暗示包含所陈述的要素或整数或要素或整数组，但不排除任何其它要素或整数或要素或整数组。
[0090] “由……组成”意指包含并限于短语“由……组成”之后的任何内容。因此，短语“由……组成”指示所列出的要素是必需的或强制性的并且可以不存在其它要素。“基本上由……组成”意指包含在所述短语之后列出的任何要素，并且限于不干扰或促进本公开中针对所列要素指定的活性或作用的其它要素。因此，短语“基本上由……组成”表示所列要素是必需的或强制性的，但是其它要素是任选的并且可以存在或不存在，这取决于其是否实质上影响所列要素的活性或作用。
[0092] 标准技术可以用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂转染)。酶促反应和纯化技术可以根据制造商的说明或如本领域通常实现的或如本文所描述的来执行。这些和相关技术和程序通常可以根据本领域熟知的常规方法进行，并且如在本说明书通篇引用和讨论的各种通用和更具体的参考文献中所描述的来进行。除非提供具体定义，否则与本文所述的分子生物学、分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学结合使用的命名和实验室程序和技术是本领域公知和常用的那些。标准技术可以用于重组技术、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、药物制备、调配和递送以及患者的治疗。
[0093] 本公开的实施例涉及与VISTA结合的抗体。具体地，本文所描述的抗体与具有出乎意料高的亲和力的VISTA特异性结合，阻断VISTA与抗原呈递细胞(APC)和/或T细胞结合，阻断VISTA活性并且具有治疗与VISTA的异常表达相关的疾病的治疗效用。本文所描述的抗体还具有有利的特性，如抑制各种VISTA介导的生物学效应的能力(例如，对T细胞增殖的抑制、对T细胞活化的抑制和技术人员已知的其它VISTA介导的效应)。VISTA的配体和/或反受体仍然未知。然而，本文所描述的抗VISTA抗体可以阻断VISTA与其配体和/或反受体结合。在一个实施例中，使用抗VISTA抗体导致T细胞增殖。在一个实施例中，使用抗VISTA抗体导致T细胞活化。在一个实施例中，使用抗VISTA抗体导致IFN-γ分泌增加。在一个实施例中，使用抗VISTA抗体导致IL-2分泌增加。在一个实施例中，使用抗VISTA抗体导致MHC II表达增加。在一些实施例中，使用抗VISTA抗体导致自然杀伤(NK)细胞活化增加。在一些实施例中，使用抗VISTA抗体导致单核细胞/巨噬细胞活化增加。在一些实施例中，使用抗VISTA抗体导致增加的细胞因子产生，例如增加的细胞因子产生选自以下中的一种或多种：IFN-γ、IL-6、IL-1ra、IL-1a、IL-8、MIP-1a、MIP-1b IP-10、TNF-α和MCP-1。
[0094] 说明性抗体或其抗原结合片段或其互补决定区(CDR)的序列在SEQ ID NO:1-113中示出。
[0095] 如本领域众所周知的，抗体是能够通过至少一个表位识别位点与位于免疫球蛋白分子的可变区中的如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等靶标特异性结合的免疫球蛋白分子。如本文所使用的，所述术语不仅涵盖完整多克隆或单克隆抗体，而且还涵盖其片段(如dAb、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其合成变体、天然存在的变体、包括具有拥有所需特异性的抗原结合片段的抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体以及包括具有所需特异性的抗原结合位点或片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它经过修饰的配置。“双抗体”(通过基因融合构建的多价或多特异性片段(WO94/13804；P.Holliger等人《, 美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》90 6444-6448,1993))也是本文所设想的抗体的特定形式。本文还包含包括与CH3结构域连接的scFv的迷你抗体(S.Hu等人,《癌症研究(Cancer Res.)》,56,3055-3061,1996)。参见例如Ward,E.S.等人《, 自然(Nature)》341,544-546(1989)；Bird等人《, 科学(Science)》242,423-426,1988；Huston等人《, 美国国家科学院院刊(PNAS USA)》,85,5879-5883,1988)；PCT/US 92/09965；WO 94/13804；P.Holliger等人《, 美国国家科学院院刊》90 6444-6448,1993；Y.Reiter等人《,自然生物技术(Nature Biotech)》,14,1239-1245,1996；S.Hu等人《, 癌症研究》,56,3055-3061,
1996。
1996。
[0096] 如本文所使用的，术语“抗原结合片段”是指含有与所关注的抗原(具体地VISTA)结合的免疫球蛋白重链和/或轻链的至少一个CDR的多肽片段。在这方面，本文所描述的抗体的抗原结合片段可以包括来自结合VISTA的抗体的本文列出的VH和VL序列的1个、2个、3个、4个、5个或全部6个CDR。本文所描述的VISTA特异性抗体的抗原结合片段能够结合VISTA。在某些实施例中，抗原结合片段或包括抗原结合片段的抗体防止或抑制VISTA与T细胞和/或APC结合以及随后的信号传导事件。在某些实施例中，抗原结合片段特异性结合和/或抑制或调节人VISTA的生物学活性。在某些实施例中，抗原结合片段特异性结合和/或增强或上调人VISTA的生物学活性。
[0097] 术语“抗原”是指能够由如抗体等选择性结合剂结合并且另外能够在动物中使用以产生能够结合所述抗原的表位的抗体的分子或分子的一部分。抗原可以具有一个或多个表位。
[0098] 术语“表位”包含能够特异性结合免疫球蛋白或T细胞受体的任何决定簇，优选地多肽决定簇。表位是由抗体结合的抗原区。在某些实施例中，表位决定簇包含分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，并且在某些实施例中可以具有特定三维结构特性和/或特定电荷特性。在某些实施例中，当抗体在蛋白质和/或大分子的复杂混合物中优先识别其靶抗原时，据说所述抗体特异性结合抗原。当平衡解离常数≤10-7或10-8M时，据说抗体特异性结合抗原。在一些实施例中，平衡解离常数可以≤10-9M或≤10-10M。
[0099] 在某些实施例中，如本文所描述的抗体和其抗原结合片段包含分别插置在重链与轻链框架区(FR)组之间的重链和轻链CDR组，所述FR组提供对CDR的支持并且限定CDR相对于彼此的空间关系。如本文所使用的，术语“CDR组”是指重链或轻链V区的三个超变区。从重链或轻链的N端出发，这些区分别表示为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包含六个CDR，其包括来自重链V区和轻链V区中的每一个V区的CDR组。包括单个CDR(例如，CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在本文中被称为“分子识别单元”。对多种抗原-抗体复合物的晶体学分析已经证明CDR的氨基酸残基形成与结合的抗原的广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3的抗原接触。因此，分子识别单元主要负责抗原结合位点的特异性。
[0100] 如本文所使用的，术语“FR组”是指框住重链或轻链V区的CDR组中的CDR的四个侧翼氨基酸序列。一些FR残基可以接触结合的抗原；然而，FR主要负责将V区折叠成抗原结合位点，尤其是与CDR直接相邻的FR残基。在FR内，某些氨基酸残基和某些结构特征是非常高度保守的。在这方面，所有V区序列含有具有大约90个氨基酸残基的内部二硫键环。当V区折叠成结合位点时，CDR被展示为形成抗原结合表面的突出的环基序。通常认为存在FR的保守结构区，所述保守结构区影响折叠到某些“典型”结构中的CDR环的形状——无论精确的CDR氨基酸序列如何。进一步地，已知某些FR残基参与非共价结构域间接触，所述非共价结构域间接触使抗体重链和轻链的相互作用稳定。
[0101] 免疫球蛋 白可变 结构域的结 构和位置 可以 参见目 前在互联网(immuno.bme.nwu.edu)上可获得的Kabat,E.A.等人,《免疫学关注的蛋白质的序列
(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第4版,美国健康与人类服务部,1987以及其更新来确定。
(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第4版,美国健康与人类服务部,1987以及其更新来确定。
[0102] “单克隆抗体”是指均质抗体群，其中所述单克隆抗体包含表位的选择性结合中涉及的氨基酸(天然存在的和非天然存在的)。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一表位。术语“单克隆抗体”不仅涵盖完整单克隆抗体和全长单克隆抗体，而且涵盖其片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(scFv)、其变体、包括抗原结合部分的融合蛋白、人源化单克隆抗体、嵌合单克隆抗体以及包括具有所需特异性和结合表位的能力的抗原结合片段(表位识别位点)的免疫球蛋白分子的任何其它经过修饰的配置。不旨在限制关于抗体的来源或其形成的方式(例如，通过杂交瘤、噬菌体选择、重组表达、转基因动物等)。所述术语包含整个免疫球蛋白以及以上在“抗体”定义下描述的片段等。
[0103] 蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子以产生若干个片段，所述片段中的两个片段(F(ab)片段)各自包括包含完整抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能够切割IgG分子以提供若干个片段，包含包括两个抗原结合位点的F(ab')2片段。可以通过对IgM以及很少的IgG或IgA免疫球蛋白分子进行优先蛋白水解切割来产生用于根据本公开的某些实施例使用的Fv片段。然而，Fv片段更一般地使用本领域已知的重组技术衍生。Fv片段包含非共价VH::VL异二聚体，其包含保留天然抗体分子的许多抗原识别和结合能力的抗原结合位点。Inbar等人(1972)《美国国家科学院院刊》69:2659-2662；Hochman等人(1976)《生物化学(Biochem)》15:2706-2710；以及Ehrlich等人(1980)《生物化学》19:4091-4096。
[0104] 在某些实施例中，设想了单链Fv或scFv抗体。例如，可以按照本申请的关于选择具有所需特异性的抗体的教导使用标准的分子生物学技术来制备Kappa体(Ill等人《,蛋白质工程(Prot.Eng.)》10:949-57(1997)；迷你抗体(Martin等人《, 欧洲分子生物学组织杂志(EMBO J)》13:5305-9(1994)；双抗体(Holliger等人《, 美国国家科学院院刊》90:6444-8(1993)；或Janusins(Traunecker等人《,欧洲分子生物学组织杂志》10:3655-59(1991)以及Traunecker等人《, 国际癌症杂志增刊(Int.J.Cancer Suppl.)》7:51-52(1992)。在仍其它实施例中，可以制备涵盖本公开的配体的双特异性或嵌合抗体。例如，嵌合抗体可以包括来自不同抗体的CDR和框架区，同时可以产生通过一个结合结构域与VISTA特异性结合并通过第二结合结构域与第二分子特异性结合的双特异性抗体。这些抗体可以通过重组分子生物学技术产生或可以物理地缀合在一起。
[0105] 单链Fv(scFv)多肽是共价连接的VH::VL异二聚体，其由包含通过肽编码连接子连接的VH-和VL-编码基因的基因融合表达。Huston等人(1988)《美国国家科学院院刊》85(16):5879-5883。已经描述了多种方法来辨别用于将天然聚合但化学分离的轻多肽链和重多肽链从抗体V区转换成scFv分子的化学结构，所述scFv分子将折叠成基本上与抗原结合位点的结构类似的三维结构。参见授予Huston等人的美国专利第5,091,513号和第5,132,405号；以及授予Ladner等人的美国专利第4,946,778号。
[0106] 在某些实施例中，如本文所描述的VISTA结合抗体采用“双抗体”的形式。双抗体是多肽的多聚体，每个多肽包括第一结构域和第二结构域，所述第一结构域包括免疫球蛋白轻链的结合结构域，所述第二结构域包括免疫球蛋白重链的结合结构域，两个结构域被(例如，通过肽连接子)连接但不能彼此缔合以形成抗原结合位点：通过将多聚体内的一个多肽的第一结构域与多聚体内的另一个多肽的第二结构域缔合来形成抗原结合位点(WO 94/13804)。
[0107] 抗体的dAb片段由VH结构域组成(Ward,E.S.等人《, 自然》,341,544-546(1989))。
[0108] 在使用双特异性抗体的情况下，这些双特异性抗体可以是常规的双特异性抗体，所述常规的双特异性抗体可以以多种方式制造(Holliger,P.和Winter G《. 生物技术新见(Current Opinion Biotechnol.)》4,446-449(1993))，例如，用化学方法制备或由杂交杂交瘤制备，或者可以是以上提及的双特异性抗体片段中的任何双特异性抗体片段。可以仅使用可变结构域来构建没有Fc区的双抗体和scFv，从而潜在地减少抗独特型反应的影响。
[0109] 与双特异性完整抗体相反，双特异性双抗体也可以是特别有用的，因为这些双特异性双抗体可以容易地构建并且表达于大肠杆菌中。可以使用噬菌体展示(WO 94/13804)来从库中容易地选择具有合适结合特异性的双抗体(和许多其它多肽，如抗体片段)。如果双抗体的一个臂保持恒定，例如，具有针对抗原X的特异性，则可以产生其中另一个臂变化并且选择具有合适特异性的抗体的库。双特异性完整抗体可以通过杵臼结构(knobs-into-holes)工程(J.B.B.Ridgeway等人《,蛋白质工程(Protein Eng.)》,9,616-621,1996)来产生。
[0110] 在某些实施例中，本文所描述的抗体可以以 形式提供。 是移除铰链区的IgG4抗体(参见GenMab Utrecht,荷兰；还参见例如，US 20090226421)。这种专有抗体技术产生具有比当前小抗体形式预期更长的治疗窗的稳定的更小抗体形式。IgG4抗体被认为是惰性的，并且因此不与免疫系统相互作用。完全人IgG4抗体可以通过消除抗体的铰链区进行修饰以获得相对于对应的完整IgG4具有不同的稳定特性的半分子片段
(GenMab、Utrecht)。二等分IgG4分子使得仅将一个区域留在可以与同源抗原(例如，疾病靶标)结合的 上，并且 因此与靶细胞上的仅一个位点单价地结合。对于
某些癌细胞表面抗原，此单价结合可能不刺激癌细胞像可以使用具有相同抗原特异性的二价抗体看到的那样生长，并且因此 技术可以向可能难治的一些类型的癌症提供
用常规抗体治疗的治疗选项。当治疗一些形式的癌症时， 的小尺寸可能有很大
益处，从而允许分子在较大实体瘤上更好分布并且潜在地增加功效。
(GenMab、Utrecht)。二等分IgG4分子使得仅将一个区域留在可以与同源抗原(例如，疾病靶标)结合的 上，并且 因此与靶细胞上的仅一个位点单价地结合。对于
某些癌细胞表面抗原，此单价结合可能不刺激癌细胞像可以使用具有相同抗原特异性的二价抗体看到的那样生长，并且因此 技术可以向可能难治的一些类型的癌症提供
用常规抗体治疗的治疗选项。当治疗一些形式的癌症时， 的小尺寸可能有很大
益处，从而允许分子在较大实体瘤上更好分布并且潜在地增加功效。
[0111] 在某些实施例中，本公开的抗体可以采取 的形式。 由单个基因编码并且在几乎所有原核和真核宿主中有效地产生，例如，大肠杆菌(参见美国专利第
6,765,087号)、霉菌(例如，曲霉菌或木霉菌)和酵母菌(例如，酵母属、克鲁维酵母、汉逊酵母或毕赤酵母(参见例如美国专利第6,838,254号)。生产工艺是可放大的，并且已经产生多个千克量的 可以将纳米抗体调配为具有长保质期的即用型溶液。 方
法(参见例如，WO 06/079372)是一种基于B细胞的自动化高吞吐量选择产生针对期望靶标的纳米抗体的专有方法。
6,765,087号)、霉菌(例如，曲霉菌或木霉菌)和酵母菌(例如，酵母属、克鲁维酵母、汉逊酵母或毕赤酵母(参见例如美国专利第6,838,254号)。生产工艺是可放大的，并且已经产生多个千克量的 可以将纳米抗体调配为具有长保质期的即用型溶液。 方
法(参见例如，WO 06/079372)是一种基于B细胞的自动化高吞吐量选择产生针对期望靶标的纳米抗体的专有方法。
[0112] 在某些实施例中，如本文公开的抗VISTA抗体或其抗原结合片段是人源化的。这是指通常使用重组技术制备的嵌合分子，所述嵌合分子具有衍生自来自非人类物种的免疫球蛋白的抗原结合位点以及分子的基于人类免疫球蛋白的结构和/或序列的剩余免疫球蛋白结构。抗原结合位点可以包括融合到恒定结构域上的完整可变结构域或仅接枝到可变结构域中的适当框架区上的CDR。表位结合位点可以是野生型的或由一个或多个氨基酸取代修饰。这消除了作为人类个体中的免疫原的恒定区，但是仍然存在对外来可变区的免疫应答的可能性(LoBuglio,A.F.等人,(1989)《美国国家科学院院刊》,86:4220-4224；Queen等人,《美国国家科学院院刊》(1988)86:10029-10033；Riechmann等人《, 自然》,(1988)332:323-327)。本文公开的用于抗VISTA抗体的人源化的说明性方法包含美国专利第7,462,697号中描述的方法。根据某些实施例的说明性人源化抗体包括SEQ ID NO:86-113中提供的人源化序列。
[0113] 另一种方法不仅着重于提供人类衍生的恒定区，而且还着重于修饰可变区以便将其重塑成尽可能接近人类形式。已知重链和轻链的可变区含有三个互补决定区(CDR)，所述CDR响应于讨论的表位而变化并且确定结合能力、被四个框架区(FR)侧接，所述FR在给定物种中相对保守并且推定地向CDR提供支架。当关于特定表位制备非人类抗体时，可以通过将衍生自非人类抗体的CDR接枝于存在于待修饰的人类抗体中的FR上来对可变区进行“重塑”或“人源化”。以下报道了各种抗体的这种方法的应用：Sato,K.等人,(1993)《癌症研究》53:851-856；Riechmann,L.等人,(1988)《自然》332:323-327；Verhoeyen,M.等人,(1988)《科学》239:1534-1536；Kettleborough,C.A.等人,(1991)《蛋白质工程》4:773-3783；Maeda,H.等人,(1991)《人类抗体杂交瘤(Human Antibodies Hybridoma)》2:124-134；Gorman,S.D.等人,(1991)《美国国家科学院院刊》88:4181-4185；Tempest,P.R.等人,(1991)《生物技术(Bio/Technology)》9:266-271；Co,M.S.等人,(1991)《美国国家科学院院刊》88:2869-
2873；Carter,P.等人,(1992)《美国国家科学院院刊》89:4285-4289；以及Co,M.S等人,(1992)《免疫学杂志》148:1149-1154。在一些实施例中，人源化抗体保留所有CDR序列(例如，含有来自兔抗体的所有六个CDR的人源化兔抗体)。在其它实施例中，人源化抗体具有相对于原始抗体改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，所述一个或多个CDR也称为“衍生自”来自原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。
2873；Carter,P.等人,(1992)《美国国家科学院院刊》89:4285-4289；以及Co,M.S等人,(1992)《免疫学杂志》148:1149-1154。在一些实施例中，人源化抗体保留所有CDR序列(例如，含有来自兔抗体的所有六个CDR的人源化兔抗体)。在其它实施例中，人源化抗体具有相对于原始抗体改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个、六个)，所述一个或多个CDR也称为“衍生自”来自原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。
[0114] 在某些实施例中，本公开的抗体可以是嵌合抗体。在这方面，嵌合抗体包含可操作地连接或以其它方式融合到不同抗体的异源Fc部分的抗VISTA抗体的抗原结合片段。在某些实施例中，异源Fc结构域是人源的。在其它实施例中，异源Fc结构域可以来自来源于亲本抗体的不同Ig类别，包含IgA(包含子类别IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(包含子类别IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)以及IgM。在另外的实施例中，异源Fc结构域可以包含来自不同Ig类别中的一种或多种的CH2和CH3结构域。如以上关于人源化抗体所述，人源化抗体的抗VISTA抗原结合片段可以仅包括本文所描述的抗体的CDR中的一个或多个CDR(例如，本文所描述的抗体的1个、2个、3个、4个、5个或6个CDR)或可以包括整个可变结构域(VL、VH或两者)。
[0115] 在某些实施例中，VISTA结合抗体包括本文所描述的抗体的CDR中的一个或多个CDR。在这方面，已经表明，在一些情况下，可以仅转移抗体的VHCDR3，同时仍保留所期望的特异性结合(Barbas等人《, 美国国家科学院院刊》(1995)92:2529-2533)。还参见McLane等人,《美国国家科学院院刊》(1995)92:5214-5218、Barbas等人,《美国化学会志(J.Am.Chem.Soc.)》(1994)116:2161-2162。
[0116] Marks等人(《生物技术》1992,10:779-783)描述了产生抗体可变结构域的库的方法，其中将指向或邻近可变结构域区域的5'端的共有引物与人类VH基因的第三框架区的共有引物结合使用以提供缺少CDR3的VH可变结构域的库。Marks等人进一步描述了这个库如何可以与特定抗体的CDR3组合。使用类似技术，可以用缺少CDR3的VH或VL结构域的库改组当前描述的抗体的CDR3衍生序列，并且将改组的完整VH或VL结构域与同源VL或VH结构域组合以提供抗体或结合VISTA的其抗体结合片段。然后可以在合适的如WO 92/01047的噬菌体展示系统等宿主系统中展示所述库，以便可以选择合适的抗体或其抗原结合片段。库可以由至少约104个并且向上增加若干个数量级的单独成员组成，例如约106个到108个或1010个或更多个成员。Stemmer(《自然》,1994,370:389-391)还公开了类似的改组或组合技术，Stemmer描述了与β-内酰胺酶基因有关的技术，但观察到所述方法可以用于产生抗体。
[0117] 另外的替代方案是使用一个或多个选择的VH和/或VL基因的随机诱变产生携带本文所描述的一个或多个CDR衍生序列的新颖VH或VL区以在整个可变结构域内产生突变。此类技术由Gram等人(1992《, 美国国家科学院院刊》,89:3576-3580)使用易错PCR描述。可以使用的另一种方法是将诱变引导到VH或VL基因的CDR区。此类技术由Barbas等人(1994《, 美国国家科学院院刊》,91:3809-3813)以及Schier等人(1996,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》263:551-567)公开。
[0118] 在某些实施例中，本文描述的抗体的特异性VH和/或VL可以用于筛选互补可变结构域的库，以识别具有所期望的特性(如提高的VISTA的亲和力)的抗体。此类方法描述于例如Portolano等人《, 免疫学杂志》(1993)150:880-887；以及Clarkson等人《,自然》,(1991)352:624-628。
[0119] 还可以使用其它方法来混合和匹配CDR，以识别具有所期望的结合活性(如与VISTA结合)的抗体。例如：Klimka等人《, 英国癌症杂志(British Journal of Cancer)》(2000)83:252-260描述了使用小鼠VL和具有从小鼠VH中保留的CDR3和FR4的人类VH库的筛选过程。获得抗体后，针对人类VL库筛选VH，以获得结合抗原的抗体。Beiboer等人《,分子生物学杂志》(2000)296:833-849描述了使用整个小鼠重链和人类轻链库的筛选过程。获得抗体后，将一个VL与保留小鼠的CDR3的人类VH库组合。获得了能够结合抗原的抗体。Rader等人《, 美国国家科学院院刊》(1998)95:8910-8915描述了与上述Beiboer等人描述的过程类似的过程。
[0120] 这些刚才描述的技术本身在本领域中是已知的。然而，使用本领域常规方法，技术人员将能够根据本文描述的若干个实施例使用此类技术获得抗体或其抗原结合片段。
[0121] 本文还公开了一种用于获得对VISTA抗原具有特异性的抗体抗原结合结构域的方法，所述方法包括：通过添加、缺失、取代或插入本文所述的VH结构域的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸来提供作为VH结构域的氨基酸序列变体的VH结构域，任选地将因此提供的VH结构域与一个或多个VL结构域组合；以及测试VH结构域或一个或多个VH/VL组合，以识别对VISTA具有特异性并且任选地具有一种或多种期望特性的特异性结合成员或抗体抗原结合结构域。VL结构域可以具有基本上如本文所述的氨基酸序列。可以采用类似方法，在所述方法中，将本文公开的VL结构域的一个或多个序列变体与一个或多个VH结构域组合。
[0122] 与抗体或多肽“特异性结合”或“优先结合”(本文可互换使用)的表位是本领域众所周知的术语，并且用于确定这种特异性或优先结合的方法也是本领域众所周知的。如果分子与特定细胞或物质比其与替代性细胞或物质更频繁地、更快速地、持续时间更长地和/或亲和力更大地反应或缔合，则所述分子被称为展现出“特异性结合”或“优先结合”。如果抗体比其与其它物质亲和力更大地、亲合性更高地、更容易地和/或持续时间更长地结合，则所述抗体与靶标“特异性地结合”或“优先地结合”。例如，与VISTA表位特异性地或优先地结合的抗体是比其结合其它VISTA表位或非VISTA表位亲和力更大地、亲合性更高地、更容易和/或持续时间更长地结合一个VISTA表位的抗体。通过阅读此定义还应理解，例如，与第一靶标特异性地或优先地结合的抗体(或部分或表位)可以或可以不与第二靶标特异性地或优先地结合。如此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管其可以包含)排他结合。通常，但不是必然地，提及结合意指优先结合。
[0123] 免疫结合通常是指在免疫球蛋白分子与抗原之间发生的类型的非共价相互作用，例如通过说明而非限制的方式，由于静电的、离子的、亲水的和/或疏水的吸引力或排斥力、空间力、氢键结合、范德华力和其它相互作用，免疫球蛋白对所述抗原具有特异性。可以在相互作用的解离常数(Kd)方面表达免疫结合相互作用的强度或亲和力，其中更小的Kd表示更大的亲和力。可以使用本领域众所周知的方法对所选多肽的免疫结合性质进行定量。一个这种方法需要测量抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中那些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力并且取决于同样在两个方向上影响速率的几何参数。因此，可以通过计算缔合和解离的浓度和实际速率来确定“缔合速率常数”(Kon)和“解离速率常数”(Koff)。Koff/Kon的比率实现消除与亲和力无关的所有参数，并且因此等于解离常数Kd。通常参见Davies等人(1990)《生物化学年评(Annual Rev.Biochem.)》59:439-473。
[0124] 在某些实施例中，本文所描述的抗VISTA抗体的亲和力为约100、150、155、160、170、175、180、185、190、191、192、193、194、195、196、197、198或199皮摩尔，并且在一些实施例中，抗体对VISTA的亲和力可能甚至更高。
[0125] 关于表位是或“保持免疫活性”，术语“免疫活性的”是指抗体(例如，抗VISTA抗体)在不同条件下(例如，在表位已经受还原和变性条件之后)与表位结合的能力。
[0126] 根据本申请的某些优选实施例的抗体或其抗原结合片段可以是与本文所述的任何抗体竞争结合VISTA的抗体，所述抗体(i)与抗原特异性结合并且(ii)包括本文公开的VH和/或VL结构域，或包括本文公开的VH CDR3或这些中任何一个的变体。抗体之间的竞争可以容易地在体外测定，例如使用ELISA和/或通过将特异性报告分子标记到一种在存在其它未标记的抗体时可以检测到的抗体上，从而能够识别结合相同表位或重叠的表位的特异性抗体。因此，本文提供了特异性抗体或其抗原结合片段，其包括与本文所述的结合VISTA的抗体竞争的人抗体抗原结合位点。
[0127] 在这方面，如本文所使用的，术语“与……竞争”，“抑制结合”和“阻断结合”(例如，是指抑制/阻断配体和/或反受体与VISTA结合或是指抑制/阻断抗VISTA抗体与VISTA结合)可互换使用，并且涵盖部分和完全抑制/阻断。VISTA的配体和/或反受体仍不明确(Nowak等人《, 免疫学评论》2017 276:66-79)。抑制/阻断配体和/或反受体与VISTA结合优选地降低或改变了当配体和/或反受体结合VISTA而未抑制或阻断时发生的细胞信号传导的正常水平或类型。与不与抗VISTA抗体接触的配体相比，当配体与本文所公开的抗VISTA抗体接触时，抑制和阻断还旨在包含配体和/或反受体与VISTA结合的任何可测量的降低，例如阻断配体和/或反受体与VISTA结合的至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。
[0128] 免疫球蛋白的恒定区示出比可变区少的序列多样性，并负责结合许多天然蛋白以引发重要的生物化学事件。在人体中，存在五种不同类别的抗体，包含IgA(包含子类别IgA1和IgA2)、IgD、IgE、IgG(包含子类别IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)以及IgM。这些抗体类别之间的区别特征是这些抗体类别的恒定区，即使V区中可能存在更细微的差异。
[0129] 抗体的Fc区与许多Fc受体和配体相互作用，从而赋予称为效应子功能的一系列重要的功能能力。在一个实施例中，抗VISTA抗体包括Fc区。对于IgG，Fc区包括Ig结构域CH2和CH3以及通向CH2的N端铰链。IgG类别的Fc受体的重要家族是Fcγ受体(FcγR)。这些受体介导抗体与免疫系统的细胞臂之间的通信(Raghavan等人,1996《, 细胞与发育生物学年度回顾(Annu Rev Cell Dev Biol)》12:181-220；Ravetch等人,2001《, 免疫学年度评论(Annu Rev Immunol)》,19:275-290)。在人体中，这种蛋白家族包含：FcγRI(CD64)，其包含同种型FcγRIa、FcγRIb和FcγRIc；FcγRII(CD32)，其包含同种型FcγRIIa(包含同种异型H131和R131)、FcγRIIb(包含FcγRIIb-1和FcγRIIb-2)和FcγRIIc；以及FcγRIII(CD16)，其包含同种型FcγRIIIa(包含同种异型V158和F158)和FcγRIIIb(包含同种异型FcγRIIIb-NA1和FcγRIIIb-NA2)(Jefferis等人,2002《,免疫学快报(Immunol Lett)》82:57-65)。这些受体通常具有介导结合Fc的细胞外结构域、跨膜区和可能介导细胞内一些信号传导事件的细胞内结构域。这些受体在各种免疫细胞中表达，包含单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、B细胞、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞、自然杀伤(NK)细胞和T细胞。Fc/FcγR复合物的形成将这些效应子细胞募集到结合抗原的位点，从而典型地导致细胞内的信号传导事件和重要的后续免疫应答，如炎症介体的释放、B细胞活化、内吞作用、吞噬作用和细胞毒性攻击。
[0130] 介导细胞毒性和吞噬效应子功能的能力是抗体破坏靶细胞的潜在机制。其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体并随后引起靶细胞裂解的细胞介导的反应被称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)(Raghavan等人,1996《, 细胞与发育生物学年度回顾》12:181-220；Ghetie等人,2000,《免疫学年度评论》,18:739-766；Ravetch等人,2001《,免疫学年度评论》,19:275-290)。其中表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上结合的抗体并随后引起靶细胞的吞噬作用的细胞介导的反应被称为抗体依赖性细胞介导的细胞吞噬作用(ADCP)。所有FcγR在Cg2(CH2)结构域的N端和之前的铰链处结合Fc上的相同区。这种相互作用在结构上很好表征(Sondermann等人,2001《,分子生物学杂志》309:737-749)，并且已经解决了与人FcγRIIIb的细胞外结构域结合的人Fc的若干种结构(pdb登录代码1E4K)(Sondermann等人,2000《, 自然》406:267-273)(pdb登陆代码
1IIS和1IIX)(Radaev等人,2001《, 生物化学杂志(J Biol Chem)》276:16469-16477)。
1IIS和1IIX)(Radaev等人,2001《, 生物化学杂志(J Biol Chem)》276:16469-16477)。
[0131] 不同的IgG子类别对FcγR具有不同的亲和力，与IgG2和IgG4相比，IgG1和IgG3通常基本与受体更好结合(Jefferis等人,2002《,免疫学快报》82:57-65)。所有FcγR与IgG Fc上的相同区结合，但亲和力不同：高亲和力结合剂FcγRI对IgG1的Kd为10-8M-1，而低亲和力受体FcγRII和FcγRIII通常分别以10-6和10-5结合。FcγRIIIa和FcγRIIIb的细胞外结构域96％相同；然而，FcγRIIIb不具有细胞内信号传导结构域。此外，鉴于FcγRI、FcγRIIa/c和FcγRIIIa是免疫复合物触发活化的正调节因子，其特征在于细胞内结构域具有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)，FcγRIIb具有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)并且因此是抑制性的。因此，前者被称为活化受体，而FcγRIIb被称为抑制受体。受体在不同免疫细胞上的表达模式和水平也不同。另一层复杂性是人类蛋白质组中存在许多FcγR多态性。具有临床显著性的特别相关的多态性为V158/F158FcγRIIIa。人IgG1与V158同种异型结合的亲和力高于与F158同种异型结合的亲和力。已经示出亲和力的这种差异以及可能地亲和力对ADCC和/或ADCP的影响是抗CD20抗体利妥昔单抗( IDEC制药公司(IDEC Pharmaceuticals Corporation)的注册商标)的功效的重要决定因素。V158同种异型患者对利妥昔单抗治疗反应良好；然而，具有较低亲和力F158同种异型的患者反应较差(Cartron等人,2002《,血液(Blood)》99:754-758)。大约10-20％的人类是V158/V158纯合子的，45％的人类是V158/F158杂合子的，并且35-45％的人类是F158/F158纯合子的
(Lehrnbecher等人,1999《, 血液(Blood)》94:4220-4232；Cartron等人,2002《, 血液》99:
754-758)。因此，80-90％的人类反应较差，也就是说，这些人类具有F158 FcγRIIIa的至少一个等位基因。
(Lehrnbecher等人,1999《, 血液(Blood)》94:4220-4232；Cartron等人,2002《, 血液》99:
754-758)。因此，80-90％的人类反应较差，也就是说，这些人类具有F158 FcγRIIIa的至少一个等位基因。
[0132] Fc区也参与补体级联的活化。在经典的补体途径中，C1与其C1q亚基结合到IgG或IgM的Fc片段，Fc片段已与一种或多种抗原形成复合物。在某些实施例中，对Fc区的修饰包括改变(增强或降低)本文所述的VISTA特异性抗体的能力以活化补体系统的修饰(参见例如美国专利7,740,847)。为了评估补体活化，可以进行补体依赖性细胞毒性(CDC)测定(参见例如，Gazzano-Santoro等人《, 免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)》,202:163(1996))。
[0133] 因此，在某些实施例中，本公开提供了具有修饰的Fc区的抗VISTA抗体，所述Fc区具有改变的功能特性，如降低或增强的CDC、ADCC或ADCP活性或增强的针对特异性FcγR的结合亲和力或延长的血清半衰期。在以下中描述了本文设想的其它修饰的Fc区，例如，发布的美国专利7,317,091；7,657,380；7,662,925；6,538,124；6,528,624；7,297,775；7,364,731；公开的美国申请US 2009092599；US 20080131435；US 20080138344；以及公开的国际申请WO 2006/105338；WO 2004/063351；WO2006/088494；WO 2007/024249。
[0134] 因此，在某些实施例中，将具有所期望的结合特异性的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。在某些实施例中，融合是与Ig重链恒定结构域(包括铰链、CH2和CH3区的至少一部分)进行的融合。优选地，使含有轻链键合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)存在于融合体中的至少一种融合体中。将编码免疫球蛋白重链融合体和(如果期望的)免疫球蛋白轻链的DNA插入到单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主细胞中。在实施例中，当用于构建中的三个多肽链的不相等的比率提供所期望的双特异性抗体的最佳产率时，这在调节三个多肽片段的相互比例方面提供了更大的灵活性。然而，当以相等的比率表达至少两个多肽链导致高产率或当比率对所期望的链组合的产率没有显著影响时，可以将两个或全部三个多肽链的编码序列插入到单个表达载体中。
[0135] 还可以修饰本公开的抗体(以及其抗原结合片段和变体)以包含例如用于纯化或诊断应用的表位标签或标记。存在许多本领域已知的用于制备抗体缀合物的连接基团，包含例如在美国专利第5,208,020号或欧洲专利0 425 235 B1和Chari等人《癌, 症研究》52:127-131(1992)中公开的连接基团。所述连接基团包含如上述专利中所公开的二硫基、硫醚基、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，二硫基和硫醚基是优选的。
[0136] 在另一个设想的实施例中，本文描述的VISTA特异性抗体可以与另一治疗化合物(在本文中称为缀合物)缀合或可操作地连接。缀合物可以是细胞毒性剂、化学治疗剂、细胞因子、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂、毒素、放射性同位素或其它治疗活性剂。上文已经描述了化学治疗剂、细胞因子、抗血管生成剂、酪氨酸激酶抑制剂和其它治疗剂，并且所有这些上述治疗剂都可以用作抗体缀合物。
[0137] 在替代性实施例中，抗体与毒素缀合或可操作地连接，所述毒素包含但不限于细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素和酶活性毒素，包含其片段和/或变体。小分子毒素包含但不限于皂草素(Kuroda K等人《, 前列腺(The Prostate)》70:1286-1294(2010)；Lip,WL.等人,2007《分子药剂学(Molecular Pharmaceutics)》4:241-251；Quadros EV.等人,2010《分子癌症治疗(Mol Cancer Ther)》；9(11)；3033-40；Polito L.等人2009《英国血液学杂志(British Journal of Haematology)》,147,710-718)，卡奇霉素、美登素(美国专利第5,208,020号)、单端孢霉烯以及CC1065。毒素包含但不限于RNase、白树毒素、烯二炔、蓖麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍乱毒素、白树毒素、假单胞菌外毒素(PE40)、志贺氏菌毒素、产气荚膜梭菌毒素和商陆抗病毒蛋白。
[0138] 在一个实施例中，本公开的抗体或其抗原结合片段与一个或多个美登木素生物碱分子缀合。美登木素生物碱是通过抑制微管蛋白聚合而起作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木中分离而来(美国专利第3,896,111号)。随后，发现某些微生物也产生美登木素生物碱，如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利第4,151,042号)。合成的美登醇以及其衍生物和类似物公开于例如美国专利第4,137,230号；第4,248,870号；第4,256,746号；第4,260,608号；第4,265,814号；第4,294,757号；第4,307,016号；第4,308,268号；
第4,308,269号；第4,309,428号；第4,313,946号；第4,315,929号；第4,317,821号；第4,
322,348号；第4,331,598号；第4,361,650号；第4,364,866号；第4,424,219号；第4,450,254号；第4,362,663号；以及第4,371,533号。含有美登木素生物碱的免疫缀合物以及其治疗用途公开于例如美国专利第5,208,020号、第5,416,064号和欧洲专利EP 0 425 235 B1。Liu等人《, 美国国家科学院院刊》93:8618-8623(1996)描述了包括美登木素生物碱的免疫缀合物，所述美登木素生物碱被指定为与针对人类结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的DM1。发现所述缀合物对培养的结肠癌细胞具有高度的细胞毒性，并且在体内肿瘤生长测定中示出抗肿瘤活性。
第4,308,269号；第4,309,428号；第4,313,946号；第4,315,929号；第4,317,821号；第4,
322,348号；第4,331,598号；第4,361,650号；第4,364,866号；第4,424,219号；第4,450,254号；第4,362,663号；以及第4,371,533号。含有美登木素生物碱的免疫缀合物以及其治疗用途公开于例如美国专利第5,208,020号、第5,416,064号和欧洲专利EP 0 425 235 B1。Liu等人《, 美国国家科学院院刊》93:8618-8623(1996)描述了包括美登木素生物碱的免疫缀合物，所述美登木素生物碱被指定为与针对人类结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的DM1。发现所述缀合物对培养的结肠癌细胞具有高度的细胞毒性，并且在体内肿瘤生长测定中示出抗肿瘤活性。
[0139] 在不显著降低抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性的情况下，通过将抗体化学连接到美登木素生物碱分子来制备抗体-美登木素生物碱缀合物。每个抗体分子缀合的3到4个美登木素生物碱分子的平均值已经示出增强靶细胞的细胞毒性而不负面地影响抗体的功能或溶解度的功效，即使将期望，与使用裸抗体相比，毒素/抗体的甚至一个分子会增强细胞毒性。美登木素生物碱是本领域众所周知的，并且可以通过已知技术合成或从天然来源分离。合适的美登木素生物碱在例如美国专利第5,208,020号以及以上提及的其它专利和非专利出版物中公开。优选的美登木素生物碱是美登醇和在美登醇分子的芳环中或其它位置处修饰的美登醇类似物，如各种美登醇酯。
[0140] 所关注的另一缀合物包括与一个或多个卡奇霉素分子缀合的抗体。抗生素的卡奇霉素家族能够在亚皮摩尔浓度下产生双链DNA断裂。还可以使用卡奇霉素的结构类似物(Hinman等人,1993《, 癌症研究》53:3336-3342；Lode等人,1998《, 癌症研究》58:2925-2928)(美国专利第5,714,586号；美国专利第5,712,374号；美国专利第5,264,586号；美国专利第5,773,001号。尾海兔素10类似物(如耳他汀E(AE)和单甲基耳他汀E(MMAE))可以用作当前公开的抗体或其变体的缀合物(Doronina等人,2003《,自然生物科技(Nat Biotechnol)》21(7):778-84；Francisco等人,2003《血液》102(4):1458-65)。有用的酶活性毒素包含但不限于白喉A链、白喉毒素的非结合活性片段、(来自铜绿假单胞菌)的外毒素A链、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒素A链、蒴莲根毒素A链、α-八叠球菌、油桐蛋白、石斑鱼蛋白、美洲商陆蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草抑制剂、白树毒素、迈托毒素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯。参见例如PCT WO
93/21232。本公开进一步设想了在本文所述的VISTA特异性抗体与具有核解活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，如脱氧核糖核酸酶(DNase))之间形成缀合物或融合体的实施例。
93/21232。本公开进一步设想了在本文所述的VISTA特异性抗体与具有核解活性的化合物(例如，核糖核酸酶或DNA核酸内切酶，如脱氧核糖核酸酶(DNase))之间形成缀合物或融合体的实施例。
[0141] 在替代性实施例中，本文公开的抗体可以与放射性同位素缀合或可操作地连接以形成放射性缀合物。各种放射性同位素可用于产生放射性缀合物抗体。实例包含但不限于90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。
[0142] 在某些其它实施例中，本文描述的抗体可以与如细胞毒素(例如，细胞生长抑制剂或杀细胞剂)、治疗剂或放射性元素(例如，α-发射剂、γ-发射剂等)等治疗部分缀合。细胞毒素或细胞毒性剂包含任何对细胞有害的药剂。实例包含紫杉醇(paclitaxel)/紫杉醇(paclitaxol)、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽醌二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔和嘌呤霉素以及其类似物或同源物。一个优选的示例性细胞毒素是皂草素(可从加利福尼亚州圣地亚哥市高级靶向系统公司(Advanced Targeting Systems)获得)。治疗剂包含但不限于抗代谢药(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶脱卡巴嗪)、烷化剂(例如，氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫斯汀(BSNU)和洛莫斯汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环类药物(例如，柔红霉素(以前称为道诺霉素)和阿霉素)、抗生素(例如，放线菌素(以前称为放线菌素)博来霉素、光神霉素和蒽霉素(AMC)以及抗有丝分裂剂(例如，长春新碱和长春碱)。
[0143] 此外，在某些实施例中，可以将VISTA特异性抗体(包含本文提供的其功能片段，如抗原结合片段)与治疗部分(如可用于缀合放射性金属离子的放射性物质或大环螯合剂)缀合。在某些实施例中，大环螯合剂是1,4,7,10-四氮杂环十二烷-N,N',N",N"'-四乙酸(DOTA)，其可以通过连接子分子与抗体连接。此类连接子分子是本领域公知的，并且描述于Denardo等人,1998《,临床癌症研究(Clin Cancer Res.)》4:2483-90；Peterson等人,1999,《生物缀合化学(Bioconjug.Chem.)》10:553；以及Zimmerman等人,1999《, 核医学和生物学(Nucl.Med.Biol.)》,26:943-50。
[0144] 在又另一个实施例中，可以将抗体与“受体”(如链霉亲和素)缀合以用于肿瘤预靶向，其中将抗体-受体缀合物施用于患者，接着使用清除剂从循环中除去未结合的缀合物，并且然后施用与细胞毒性剂(例如，放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如，抗生物素蛋白)。在替代性实施例中，抗体与酶缀合或可操作地连接，以采用抗体依赖性酶介导的前药疗法(ADEPT)。可以通过将抗体与将前药(例如，肽基化学治疗剂，参见PCT WO 81/01145)转化为活性抗癌药的前药活化酶缀合或可操作地连接来使用ADEPT。参见例如PCT WO 88/07378和美国专利第4,975,278号。可用于ADEPT的免疫缀合物的酶组分包含能够以此方式作用于前药以将其转化为其更具活性的细胞毒性形式的任何酶。可用于这些和相关实施例的方法中的酶包含但不限于可用于将含磷酸盐的前药转化为游离药物的碱性磷酸酶；可用于将含硫酸盐的前药转化为游离药物的芳基硫酸酯酶；可用于将无毒的5-氟胞嘧啶转化为抗癌药物(即5-氟尿嘧啶)的胞嘧啶脱氨酶；可用于将含肽前药转化为游离药物的蛋白酶，如沙雷氏菌蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、羧肽酶和组织蛋白酶(如组织蛋白酶B和L)；可用于转化含D-氨基酸取代基的前药的D-丙氨酰基羧肽酶；可用于将糖基化前药转化为游离药物的碳水化合物裂解酶，如β-半乳糖苷酶和神经酰胺酶；可用于将用β-内酰胺衍生的药物转化为游离药物的β-内酰胺酶；以及可用于将分别在其胺氮处用苯氧基乙酰基或苯乙酰基衍生的药物转化为游离药物的青霉素酰胺酶，如青霉素V酰胺酶或青霉素G酰胺酶。可替代地，具有酶活性的抗体(在本领域中也称为“抗体酶”)可以用于将前药转化为游离活性药物(参见例如Massey,1987《, 自然》328:457-458)。可以制备抗体-抗体酶缀合物，以将抗体酶递送到肿瘤细胞群。
[0145] 使用多种双功能蛋白偶联剂(如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基四氢噻吩(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二亚氨盐二甲酯HCL)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺)、醛(如戊二醛)、双叠氮基化合物(如双(对-叠氮基苯甲酰基)己二胺)、双重氮基衍生物(如双-(对-重氮基苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯))制备免疫缀合物。特定的偶联剂包含提供二硫键的N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等人《, 生物化学期刊(Biochem.J.)》
173:723-737[1978])和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶硫基)戊酸酯(SPP)。连接子可以是促进一种或多种可裂解组分释放的“可裂解连接子”。例如，可以使用酸不稳定连接子(《癌症研究》52:127-131(1992))；美国专利第5,208,020号。
173:723-737[1978])和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶硫基)戊酸酯(SPP)。连接子可以是促进一种或多种可裂解组分释放的“可裂解连接子”。例如，可以使用酸不稳定连接子(《癌症研究》52:127-131(1992))；美国专利第5,208,020号。
[0146] 本文还设想了本公开的抗体(和多肽)的其它修饰。例如，抗体可以连接到多种非蛋白质聚合物中的一种非蛋白质聚合物，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯或聚乙二醇和聚丙二醇的共聚物。在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中，还可以例如通过凝聚技术或通过界面聚合(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚-(甲基-甲基丙烯酸酯)微胶囊)将所述抗体包埋在制备的微胶囊中。此类技术在《雷明顿药物科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)》,第16版,Oslo A.编辑,(1980)中公开。
[0147] 如本文所使用的，“载剂”包含在所采用的剂量和浓度下对暴露于其中的细胞或哺乳动物无毒的药物上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂。生理学上可接受的载剂通常是含水pH缓冲溶液。生理学上可接受的载剂的实例包含如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸等缓冲液；包含抗坏血酸的抗氧化剂；低分子量(少于约10个残基)的多肽；如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质；如聚乙烯吡咯烷酮等亲水性聚合物；如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸等氨基酸；包含葡萄糖、甘露糖或糊精的单糖、二糖和其它碳水化合物；如EDTA等螯合剂；如甘露醇或山梨醇等糖醇；如钠等成盐抗衡离子；和/或非离子表面活性剂，如聚山梨醇酯20(TWEENTM)聚乙二醇(PEG)和泊咯沙姆(PLURONICSTM)等。
[0148] 可以使用技术人员已知的多种方法，如亲和力/结合测定(例如，表面等离振子共振、竞争性抑制测定)；使用体外或体内模型进行的细胞毒性测定、细胞活力测定、细胞增殖或分化测定、癌细胞和/或肿瘤生长抑制来评估抗VISTA抗体的所期望的功能特性。其它测定可以测试本文描述的阻断正常VISTA介导的应答的抗体的能力，如抑制T细胞增殖、抑制T细胞活化、抑制T细胞细胞因子产生(例如IFNγ和IL-2)以及诱导由单核细胞产生IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α。还可以测试本文所述的抗体的体外和体内功效。可以使用技术人员已知的公认的方案来进行此类测定(参见例如《当前分子生物学方案》(格林出版联合公司
(Greene Publ.Assoc.)和纽约州纽约市约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.))；
《当前免疫学方案》(由纽约州纽约市约翰·威立父子公司的John E.Coligan、Ada
M.Kruisbeek、David H.Margulies、Ethan M.Shevach、Warren Strober 2001编辑)；或商业上可获得的试剂盒。
(Greene Publ.Assoc.)和纽约州纽约市约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons,Inc.))；
《当前免疫学方案》(由纽约州纽约市约翰·威立父子公司的John E.Coligan、Ada
M.Kruisbeek、David H.Margulies、Ethan M.Shevach、Warren Strober 2001编辑)；或商业上可获得的试剂盒。
[0149] 在某些实施例中，本公开进一步提供了一种对本文所述的抗体或其抗原结合片段进行编码的分离的核酸，例如对本文所述的CDR或VH或VL结构域进行编码的核酸。核酸包含DNA和RNA。这些和相关的实施例可以包含对结合本文所述的VISTA的抗体进行编码的多核苷酸。如本文所使用的，术语“分离的多核苷酸”应意指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或其某种组合，凭借其来源，分离的多核苷酸：(1)不与其中在自然界中发现的分离的多核苷酸的多核苷酸的全部或一部分缔合；(2)与未与其天然连接的多核苷酸连接；或(3)作为较大序列的一部分在自然界中不存在。
[0150] 术语“可操作地连接”意指所述术语所适用的组分处于允许其在适当条件下执行其固有功能的关系中。例如，将与蛋白质编码序列“可操作地连接”的转录控制序列连接到其上，使得在与控制序列的转录活性相容的条件下实现蛋白质编码序列的表达。
[0151] 如本文所使用的，术语“控制序列”是指可能影响与其连接或可操作地连接的编码序列的表达、加工或细胞内定位的多核苷酸序列。此类控制序列的性质可能取决于宿主生物体。在特定实施例中，原核生物的转录控制序列可以包含启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。在其它特定实施例中，真核生物的转录控制序列可以包含启动子，所述启动子包括一个或多个用于转录因子、转录增强子序列、转录终止序列和聚腺苷酸化序列的识别位点。在某些实施例中，“控制序列”可以包含前导序列和/或融合配偶体序列。
[0152] 如本文所提及的，术语“多核苷酸”意指单链或双链核酸聚合物。在某些实施例中，包括多核苷酸的核苷酸可以是核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸或任一种类型的核苷酸的修饰形式。所述修饰包含如溴尿嘧啶核苷等碱基修饰；如阿拉伯糖苷和2',3'-双脱氧核糖等核糖修饰；以及如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺磷酸硫醇酯(phosphoroanilothioate)、缩苯胺磷酸酯(phoshoraniladate)和氨基磷酸酯(phosphoroamidate)等核苷酸间连接修饰。术语“多核苷酸”具体包含DNA的单链和双链形式。
[0153] 术语“天然存在的核苷酸”包含脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。术语“修饰的核苷酸”包含具有修饰的或取代的糖基的核苷酸等。术语“寡核苷酸连接”包含寡核苷酸连接，如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、苯胺磷酸硫醇酯、缩苯胺磷酸酯和氨基磷酸酯等。参见例如LaPlanche等人,1986《, 核酸研究(Nucl.Acids Res.)》,14:9081；Stec等人,1984《,美国化学会志》,106:6077；Stein等人,1988《, 核酸研究》,16:3209；Zon等人,1991《, 抗癌药物研制(Anti-Cancer Drug Design)》,6:539；Zon等人,1991《, 寡核苷酸和类似物：实用方法(OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES:A PRACTICAL APPROACH)》,第87-
108页(F.Eckstein编辑)，英国牛津大学，牛津大学出版社；Stec等人,美国专利第5,151,
510号；Uhlmann和Peyman,1990《, 化学评论(Chemical Reviews)》,90:543，出于任何目的其公开内容通过引用并入本文中。寡核苷酸可以包含可检测的标记，以使得能够检测寡核苷酸或其杂化。
108页(F.Eckstein编辑)，英国牛津大学，牛津大学出版社；Stec等人,美国专利第5,151,
510号；Uhlmann和Peyman,1990《, 化学评论(Chemical Reviews)》,90:543，出于任何目的其公开内容通过引用并入本文中。寡核苷酸可以包含可检测的标记，以使得能够检测寡核苷酸或其杂化。
[0154] 术语“载体”用于指用于将编码信息转移到宿主细胞的任何分子(例如，核酸、质粒或病毒)。术语“表达载体”是指适于转化宿主细胞并含有指导和/或控制插入的异源核酸序列表达的核酸序列的载体。如果存在内含子，则表达包含但不限于如转录、转译和RNA剪接等过程。
[0155] 如本领域技术人员将理解的，多核苷酸可以包含表达或可以适于表达蛋白质、多肽、肽等的基因组序列、基因组外和质粒编码的序列以及较小的工程化基因片段。此类片段可以天然分离的或由技术人员合成修饰的。
[0156] 还如本领域技术人员认识到的，多核苷酸可以是单链(编码或反义)或双链的，并且可以是DNA(基因组、cDNA或合成的)或RNA分子。RNA分子可以包含含有内含子并以一对一方式对应于DNA分子的HnRNA分子以及不含有内含子的mRNA分子。另外的编码或非编码序列可以但不必存在于根据本公开的多核苷酸内，并且多核苷酸可以但不必与其它分子和/或支持材料连接。多核苷酸可以包括天然序列或可以包括编码此类序列的变体或衍生物的序列。
[0157] 因此，根据这些和相关实施例，本公开还提供了对本文所述的抗VISTA抗体进行编码的多核苷酸。在某些实施例中，提供了多核苷酸，所述多核苷酸包括对本文所述的抗体进行编码的多核苷酸序列中的一些或全部以及此类多核苷酸的互补体。
[0158] 在其它相关实施例中，多核苷酸变体可以与对本文所述的抗VISTA抗体进行编码的多核苷酸序列具有实质同一性。例如，多核苷酸可以是包括与参考多核苷酸序列(如使用本文描述的方法(例如，如下所述使用标准参数进行的BLAST分析)对本文描述的抗体进行编码的序列)相比具有至少70％序列同一性，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高序列同一性的多核苷酸。本领域技术人员将认识到，可以通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等来适当地调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的对应同一性。
[0159] 通常，多核苷酸变体将含有一个或多个取代、添加、缺失和/或插入，优选地使得相对于由本文具体阐述的多核苷酸序列编码的抗体，由变体多核苷酸编码的抗体的结合亲和力基本上不降低。
[0160] 在某些其它相关的实施例中，多核苷酸片段可以包括与本文所述的对抗体进行编码的序列相同或互补的序列的各种长度的连续延伸或基本上由所述连续延伸组成。例如，提供了多核苷酸，所述多核苷酸包括以下或基本上由以下组成：对本文所公开的抗体或其抗原结合片段进行编码的序列的至少约5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、120个、130个、140个、150个、200个、300个、400个、500个或1000个或更多个连续核苷酸以及其间的所有中间长度。应容易理解，在此上下文中，“中间长度”意指所引用值之间的任何长度，如50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包含200-500中的所有整数；500-1,000等。如本文描述的多核苷酸序列可以在一端或两端处延伸未在天然序列中发现的另外的核苷酸。这个另外的序列可以由以下组成：对本文描述的抗体进行编码的多核苷酸的任一端处或对本文描述的抗体进行编码的多核苷酸的两端处的1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个核苷酸。
[0161] 在另一个实施例中，提供了能够在中等到高严格条件下与对本文提供的抗体或其抗原结合片段或其片段或其互补序列进行编码的多核苷酸序列杂化的多核苷酸。杂化技术是分子生物学领域众所周知的。出于说明目的，用于测试本文提供的多核苷酸与其它多核苷酸的杂化的适当中等严格条件包含在5X SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中预洗涤；在50℃-60℃下在5X SSC下杂化过夜；接着在65℃下用含有0.1％SDS的2X、0.5X和0.2X SSC中的每一种洗涤两次，每次20分钟。本领域技术人员将理解，可以如通过改变杂化溶液的盐含量和/或进行杂化的温度来容易地操纵杂化的严格性。例如，在另一个实施例中，合适的高度严格的杂化条件包含上述那些条件，除了杂化温度升高到例如60℃-65℃或
65℃-70℃之外。
65℃-70℃之外。
[0162] 在某些实施例中，上述多核苷酸(例如，多核苷酸变体、片段和杂化序列)对结合VISTA的抗体或其抗原结合片段进行编码。在其它实施例中，此类多核苷酸对与VISTA结合至少约50％、至少约70％、以及在某些实施例中至少约90％的抗体或其抗原结合片段或其CDR以及本文具体阐述的抗体序列进行编码。在另外的实施例中，此类多核苷酸对与VISTA结合的抗体或抗原结合片段或其CDR以及本文具体列出的抗体序列进行编码，VISTA的亲和力大于本文所述的抗体的亲和力，例如定量结合至少约105％、106％、107％、108％、109％或110％。
[0163] 如本文其它地方所述的，可以通过常规方法确定代表性多肽(例如，本文提供的变体VISTA特异性抗体，例如具有本文提供的抗原结合片段的抗体蛋白)的三维结构，使得用所选天然氨基酸或非天然氨基酸对一种或多种氨基酸进行的取代、添加、缺失或插入可以被虚拟建模，以便确定如此衍生的结构变体是否保留当前公开的物种的空间填充特性。用于确定抗体内合适的氨基酸取代(或对氨基酸序列进行编码的合适的多核苷酸)的多种计算机程序是技术人员已知的，使得例如维持亲和力或实现更好的亲和力。
[0164] 无论编码序列本身的长度如何，本文所描述的多核苷酸或其片段可以与其它DNA序列(如启动子、多腺苷酸化信号、另外的限制酶位点、多克隆位点、其它编码区段等)组合，使得其总长度可以改变很大。因此，设想可以采用几乎任何长度的核酸片段，其中总长度优选地受限于制备的容易性和在预期重组DNA方案中的使用。例如，设想说明性多核苷酸片段的总长度为约10,000、约5000、约3000、约2,000、约1,000、约500、约200、约100、约50个碱基对等(包含所有中间长度)是有用的。
[0165] 当比较多核苷酸序列时，如果两个序列中的核苷酸序列在进行对准以获得最大对应性时相同，则这两个序列被称为“相同”，如下所述。通常通过在比较窗口上比较序列来进行两个序列之间的比较，以识别和比较序列相似性的局部区。本文所使用的“比较窗口”是指至少约20个、通常约30到约75个、约40到约50个连续位置的区段，其中在两个序列最佳比对后，序列可以与具有相同数目的连续位置的参考序列进行比较。
[0166] 使用默认参数，可以使用 生物信息学软件套件(威斯康星州麦迪逊市DNASTAR，Inc.)中的MegalignTM程序对序列进行最佳比对以进行比较。这个程序体现了以下参考文献中描述的若干种比对方案：Dayhoff,M.O.(1978)“蛋白质中演化变化的模型-用于检测远缘关系的矩阵(A model of evolutionary change in proteins-Matrices for detecting distant relationships)”,Dayhoff,M.O.(编辑)《蛋白质序列和结构图谱(Atlas of Protein Sequence and Structure)》,华盛顿特区全国生物医学研究基金会,第5卷,增刊3,第345-358页；Hein J.《,比对和发生学的统一方法(Unified Approach to Alignment and Phylogenes)》,第626-645页(1990)；《酶学方法(Methods in
Enzymology)》第183卷,加利福尼亚州圣地亚哥市学术出版社公司(Academic Press,
Inc.)；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.,CABIOS 5:151-153(1989)；Myers,E.W.和Muller W.,CABIOS 4:11-17(1988)；Robinson,E.D.《,组合理论(Comb.Theor)》11:105(1971)；Santou,N.Nes,M.《, 分子生物学与进化学(Mol.Biol.Evol.)》4:406-425(1987)；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.,《数值分类法-数值分类法的原理与实践(Numerical Taxonomy-the
Principles and Practice of Numerical Taxonomy)》,加利福尼亚州圣弗朗西斯市弗里曼出版社(Freeman Press)(1973)；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.《, 美国国家科学院院刊》
80:726-730(1983)。
Enzymology)》第183卷,加利福尼亚州圣地亚哥市学术出版社公司(Academic Press,
Inc.)；Higgins,D.G.和Sharp,P.M.,CABIOS 5:151-153(1989)；Myers,E.W.和Muller W.,CABIOS 4:11-17(1988)；Robinson,E.D.《,组合理论(Comb.Theor)》11:105(1971)；Santou,N.Nes,M.《, 分子生物学与进化学(Mol.Biol.Evol.)》4:406-425(1987)；Sneath,P.H.A.和Sokal,R.R.,《数值分类法-数值分类法的原理与实践(Numerical Taxonomy-the
Principles and Practice of Numerical Taxonomy)》,加利福尼亚州圣弗朗西斯市弗里曼出版社(Freeman Press)(1973)；Wilbur,W.J.和Lipman,D.J.《, 美国国家科学院院刊》
80:726-730(1983)。
[0167] 可替代地，用于比较的序列的最佳比对可以通过Smith和Waterman《,高等应用数学(Add.APL.Math)》2:482(1981)的局部同一性算法、通过Needleman和Wunsch《, 分子生物学杂志》48:443(1970)的同一性比对算法、通过寻找Pearson和Lipman《,美国国家科学院院刊》85:2444(1988)的相似性方法、通过这些算法(威斯康星州麦迪逊市575理学博士遗传学计算机组(GCG)威斯康星州遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA)或通过检查进行。
[0168] 适用于测定百分比序列同一性和序列相似性的算法的一个优选实例是分别在以下中描述的BLAST和BLAST 2.0算法，Altschul等人《, 核酸研究》25:3389-3402(1977)和Altschul等人《,分子生物学杂志》215:403-410(1990)。BLAST和BLAST 2.0可以例如与本文描述的参数一起使用，以测定两个或更多个多核苷酸之间的序列同一性百分比。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。在一个说明性实例中，对于核苷酸序列，可以使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；总是>0)和N(错配残基的罚分；总是<0)来计算累积得分。
在以下情况下，中止在每个方向上词命中的扩展：累积比对齐得分从其最大实现值减小了数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X测定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用默认字长(W)11、期望值(E)10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff《, 美国国家科学院院刊》89:10915(1989))比对，(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4以及对两条链的比较。
在以下情况下，中止在每个方向上词命中的扩展：累积比对齐得分从其最大实现值减小了数量X；由于一个或多个负得分残基比对的累积，累积得分变为零或更低；或到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X测定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用默认字长(W)11、期望值(E)10和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff《, 美国国家科学院院刊》89:10915(1989))比对，(B)50，期望值(E)10，M＝5，N＝-4以及对两条链的比较。
[0169] 在某些实施例中，“序列同一性的百分比”通过在至少20个位置的比较窗口上比较两个最佳比对的序列来确定，其中比较窗口中的多核苷酸序列的部分可以包括与参考序列(不包括添加或缺失)相比添加或缺失(即缺口)20％或更少、通常5％到15％或10％到12％以使两个序列进行最佳比对。百分比通过以下计算：确定在两个序列中出现相同核酸碱基的位置的数量，以得出匹配的位置的数量；将匹配的位置的数量除以参考序列(即窗口尺寸)中的位置的总数量；以及将结果乘以100，以得出序列同一性的百分比。
[0170] 所属领域的普通技术人员将认识到，由于遗传密码的简并性，存在许多对本文所述的抗体进行编码的核苷酸序列。这些多核苷酸中的一些与对结合VISTA的抗体进行编码的天然或原始多核苷酸序列的核苷酸序列具有最小的序列同一性。尽管如此，本公开中明确设想了由于密码子使用的差异而变化的多核苷酸。在某些实施例中，特别设想了已针对哺乳动物表达进行密码子优化的序列。
[0171] 因此，在另一个实施例中，诱变方法(如位点特异性诱变)可以用于制备本文所述的抗体的变体和/或衍生物。通过这个方法，可以通过对其进行编码的潜在多核苷酸的诱变在多肽序列中进行特异性修饰。这些技术提供了一种用于制备和测试序列变体的直截了当的方法，例如通过将一个或多个核苷酸序列变化引入到多核苷酸中来结合上述考虑中的一个或多个。
[0172] 位点特异性诱变允许通过使用对所期望的突变的DNA序列进行编码的特异性寡核苷酸序列以及足够数量的相邻核苷酸来产生突变体，以提供具有足够尺寸和序列复杂性的引物序列，从而在被遍历的缺失连接处的两侧处形成稳定双链体。突变可以用在所选多核苷酸序列中，以改善、改变、减少、修饰或以其它方式改变多核苷酸本身的特性和/或改变经过编码的多肽的特性、活性、组合物、稳定性或一级序列。
[0173] 在某些实施例中，诸位发明人设想了对本文所公开的抗体或其抗原结合片段进行编码的多核苷酸序列的诱变以改变经过编码的多肽的一种或多种特性，如抗体或其抗原结合片段的结合亲和力或特定Fc区的功能或Fc区对特定FcγR的亲和力。位点特异性诱变的技术是本领域已知的，并且广泛用于产生多肽和多核苷酸两者的变体。例如，位点特异诱变常常用于改变DNA分子的特定部分。在这种实施例中，使用通常包括长度为约14个到约25个核苷酸的引物，其中序列的连接处的两侧上的约5到约10个残基被改变。
[0174] 如本领域技术人员将理解的，位点特异性诱变技术常常采用以单链和双链形式存在的噬菌体载体。用于定点诱变的典型载体包含如M13噬菌体等载体。这些噬菌体易于商购获得，并且其用途通常是本领域技术人员众所周知的。消除将所关注基因从质粒转移到噬菌体的步骤的定点诱变也常规采用双链质粒。
[0175] 通常，根据本发明的定点诱变通过以下来进行：首先获得单链载体或融化分解开双链载体的两条链，所述双链载体在其序列内包含对所期望的肽进行编码的DNA序列。通常以合成的方式制备一种携带所期望的突变序列的寡核苷酸引物。然后，使这个引物与单链载体粘接，并且使所述引物经受DNA聚合酶(如大肠杆菌聚合酶I克列诺片段)，以完成携带突变的链的合成。因此，形成了异源双链体，其中一条链对原始非突变序列进行编码，并且第二条链携带所期望的突变。然后，使用这个异源双链体载体转化适当的细胞(如大肠杆菌细胞)，并且选择包含携带突变序列布置的重组载体的克隆。
[0176] 使用定点诱变制备对所选肽进行编码的DNA区段的序列变体提供了一种产生潜在有用物种的方法，并且不意在是限制性的，因为存在可以获得肽的序列变体和对其进行编码的DNA序列的其它方式。例如，可以用诱变剂(如羟胺)处理对所期望的肽序列进行编码的重组载体，以获得序列变体。关于这些方法和方案的具体细节发现于以下的教导中：Maloy等人,1994；Segal,1976；Prokop和Bajpai,1991；Kuby,1994；以及Maniatis等人,1982，出于所述目的，每个通过引用并入本文中。
[0177] 如本文所使用的，术语“寡核苷酸定向诱变程序”是指导致特定核酸分子的浓度相对于其初始浓度增加或导致可检测信号的浓度增加(如扩增)的模板依赖性过程和载体介导的传播。如本文所使用的，术语“寡核苷酸定向诱变程序”旨在指涉及引物分子的模板依赖性扩展的过程。术语模板依赖性过程是指RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成核酸链的序列由众所周知的互补碱基配对规则指示(参见例如Watson，1987)。通常，载体介导的方法涉及将核酸片段引入到DNA或RNA载体中、对载体进行克隆扩增以及回收扩增的核酸片段。此类方法的实例由美国专利第4,237,224号提供，所述美国专利具体地以全文引用的方式并入本文中。
[0178] 在产生多肽变体的另一种方法中，可以采用如美国专利第5,837,458号中所描述的递归序列重组。在此方法中，进行了重组和筛选或选择的迭代循环以“进化”具有例如增加的结合亲和力的单独多核苷酸变体。某些实施例还提供了呈质粒、载体、转录或表达盒的形式的构建体，所述构建体包括本文所述的至少一个多核苷酸。
[0179] 在许多实施例中，将对主题单克隆抗体进行编码的核酸直接引入到宿主细胞中，并且在足以诱导经过编码的抗体的表达的条件下温育细胞。使用本领域技术人员已知的标准技术并与本文提供的多肽和核酸序列组合来制备本公开的抗体。多肽序列可以用于测定对由此公开的特定抗体进行编码的适当的核酸序列。根据本领域技术人员已知的标准方法，可以对核酸序列进行优化，以反映各种表达系统的特定密码子“偏好”。
[0180] 根据某些相关实施例，提供了一种包括如本文所述的一种或多种构建体的重组宿主细胞；对任何抗体、CDR、VH或VL结构域或其抗原结合片段进行编码的核酸；以及一种产生经过编码的产物的方法，所述方法包括由其编码核酸进行表达。可以通过在适当的条件下培养含有核酸的重组宿主细胞方便地实现表达。在通过表达产生后，可以使用任何合适的技术分离和/或纯化抗体或其抗原结合片段，并且然后根据需要使用。
[0181] 本文提供的抗体或其抗原结合片段以及编码核酸分子和载体可以以基本上纯的或均质的形式例如从其天然环境中分离和/或纯化，或在核酸的情况下，除了对具有所期望的功能的多肽进行编码的序列之外，不含或基本上不含核酸或基因来源。核酸可以包括DNA和/或RNA并且可以是完全或部分合成的。除非上下文另有要求，否则如在此提到的核苷酸序列涵盖具有规定序列的DNA分子，并且涵盖具有其中U取代T的规定序列的RNA分子。
[0182] 用于在多种不同宿主细胞中克隆和表达多肽的系统是已知的。合适的宿主细胞包含细菌、哺乳动物细胞、酵母和杆状病毒系统。本领域中可用于表达异源多肽的哺乳动物细胞系包含中国仓鼠卵巢细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾细胞、NSO小鼠黑素瘤细胞和许多其它细胞。常见的、优选的细菌宿主是大肠杆菌。
[0183] 在原核细胞(如大肠杆菌)中表达抗体和抗原结合片段在本领域中已经良好建立。关于综述，参见例如Pluckthun《, 生物技术》9:545-551(1991)。培养的真核细胞中的表达对于本领域技术人员而言也可用作为产生抗体或其抗原结合片段的选择，参见最近的综述，例如Ref,M.E.(1993)《生物技术当前评述(Curr.Opinion Biotech.)》4:573-576；Trill J.J.等人(1995)《生物技术当前评述》6:553-560。
[0184] 适当时，可以选择或构建含有适当的调节序列(包含启动子序列、终止子序列、多腺苷酸化序列、增强子序列、标记基因)和其它序列的合适的载体。适当时，载体可以是质粒、病毒(例如，噬菌体)或噬菌粒。关于进一步细节，参见例如《分子克隆：实验室手册》:第2版,Sambrook等人,1989,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)。用于操纵核酸的许多已知的技术和方案(例如，制备核酸构建体、诱变、测序、将DNA引入到细胞中以及基因表达和蛋白质的分析)详细描述在《当前分子生物学方案》,第二版,
Ausubel等人编辑,约翰·威立父子公司,1992或者其后续的更新。
Ausubel等人编辑,约翰·威立父子公司,1992或者其后续的更新。
[0185] 术语“宿主细胞”用于指已经引入或能够引入对本文所述抗体中的一种或多种抗体进行编码的核酸序列并且进一步表达或能够表达所关注的所选基因(如对任何本文所述的抗体进行编码的基因)的细胞。所述术语包含亲本细胞的子代，无论所述子代是否在形态上或遗传构成上与原始亲本相同，只要存在所选基因即可。因此，还设想了一种包括将此类核酸引入到宿主细胞中的方法。所述引入可以采用任何可供使用的技术。对于真核细胞，合适的技术可以包含磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖、电穿孔、脂质体介导的转染以及使用逆转录病毒或其它病毒(例如，牛痘，或对于昆虫细胞，杆状病毒)的转导。对于细菌细胞，合适的技术可以包括氯化钙转化、电穿孔和使用噬菌体的转染。引入后可以为引起或允许来自核酸的表达，例如通过在用于表达基因的条件下培养宿主细胞。在一个实施例中，核酸整合到宿主细胞的基因组(例如，染色体)中。根据标准技术，可以通过包含促进与基因组重组的序列来促进整合。
[0186] 在某些实施例中，本公开还提供了一种方法，所述方法包括在表达系统中使用上述构建体以表达特定多肽，如本文所述的VISTA特异性抗体。术语“转导”用于指基因从一种细菌转移到另一种细菌，通常通过噬菌体转移。“转导”也指通过逆转录病毒获取和转移真核细胞序列。术语“转染”用于指细胞对外来或外源性DNA的摄取，并且当外源性DNA被引入细胞膜内时，细胞已经被“转染”。许多转染技术是本领域众所周知的并在本文中公开。参见例如Graham等人,1973《, 病毒学(Virology)》52:456；Sambrook等人,2001《,分子克隆，实验室手册》，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratories)；Davis等人,1986《，分子生物学基础方法(BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY)》,爱思唯尔(Elsevier)；以及Chu等人,1981《, 基因(Gene)》13:197。此类技术可以用于将一个或多个外源性DNA部分引入到合适的宿主细胞中。
[0187] 如本文所使用的，术语“转化”是指细胞的遗传特性的变化，并且当细胞被修饰为含有新的DNA时，细胞已经被转化。例如，在细胞从其天然状态被遗传修饰时，所述细胞被转化。在转染或转导后，转化DNA可以通过物理整合到细胞染色体中来与细胞的DNA重组，或者可以作附加体元件瞬时维持而不被复制，或者可以作为质粒独立复制。在DNA随细胞分裂而被复制时，细胞被认为已经被稳定转化。当与生物材料(如核酸分子、多肽、宿主细胞等)结合使用时，术语“天然存在的”或“天然的”是指在自然界中发现且不被人操纵的材料。类似地，如本文所使用的，“非天然存在的”或“非天然的”是指未在自然界中发现或已经被人类结构上修饰或合成的材料。
[0188] 术语“多肽”、“蛋白质”、“肽”和“糖蛋白”可互换使用，并且意指不限于任何特定长度的氨基酸的聚合物。所述术语不排除如豆蔻酰化、硫酸化、糖基化、磷酸化和信号序列的添加或缺失等修饰。术语“多肽”或“蛋白质”意指一个或多个氨基酸链，其中每个链包括通过肽键共价连接的氨基酸，并且其中所述多肽或蛋白质可以包括多个通过肽键非共价和/或共价连接且具有天然蛋白质序列的链，即，由天然存在的以及特别是非重组细胞、或基因工程或重组细胞产生的蛋白质，并且包括具有天然蛋白质的氨基酸序列的分子、或具有天然序列的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的分子。术语“多肽”和“蛋白质”具体涵盖与本公开的VISTA结合的抗体，或具有抗VISTA抗体的一个或多个氨基酸的缺失、添加和/或取代的序列。因此，“多肽”或“蛋白质”可以包括一个(称为“单体”)或多个(称为“多聚体”)氨基酸链。
[0189] 本文提及的术语“分离的蛋白质”是指主题蛋白质：(1)不含至少一些通常与其一起在自然界中发现的其它蛋白质；(2)基本上不含来自相同来源，例如来自相同物种的其它蛋白质；(3)由来自不同物种的细胞表达；(4)已经与至少约50％的多核苷酸、脂质、碳水化合物或与其天然缔合的其它物质分离；(5)不和与“分离的蛋白质”天然缔合的蛋白质部分缔合(通过共价或非共价相互作用)；(6)和不与其天然缔合的多肽可操作地缔合(通过共价或非共价相互作用)；或(7)在自然界中不存在。这种分离的蛋白质可以由基因组DNA、cDNA、mRNA或其它RNA编码，或者可以具有合成来源，或其任何组合。在某些实施例中，分离的蛋白质基本上不含在其天然环境中会发现的且会干扰其使用(治疗、诊断、预防、研究或其它)的蛋白质或多肽或其它污染物。
[0190] 术语“多肽片段”是指多肽，所述多肽可以是单体的或多聚体的、具有天然存在的或重组产生的多肽的氨基端缺失、羧基端缺失和/或内部缺失或取代。在某些实施例中，多肽片段可以包括长度为至少5个到约500个氨基酸的氨基酸链。应当理解的是，在某些实施例中，片段的长度为至少5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个、100个、110个、
150个、200个、250个、300个、350个、400个或450个氨基酸。特别有用的多肽片段包含功能性结构域，所述功能性结构域包含抗原结合结构域或抗体片段。在抗VISTA抗体的情况下，有用的片段包含但不限于：CDR区，特别是重链或轻链的CDR3区；重链或轻链的可变区；抗体链的一部分或仅仅是包含两个CDR的其可变区；等等。
150个、200个、250个、300个、350个、400个或450个氨基酸。特别有用的多肽片段包含功能性结构域，所述功能性结构域包含抗原结合结构域或抗体片段。在抗VISTA抗体的情况下，有用的片段包含但不限于：CDR区，特别是重链或轻链的CDR3区；重链或轻链的可变区；抗体链的一部分或仅仅是包含两个CDR的其可变区；等等。
[0191] 多肽可以包括蛋白质的N端处的信号(或前导)序列，其共转译或转译后引导蛋白质转移。在没有此类信号或前导肽的情况下，本文所提供的包含信号肽的任何多肽氨基酸序列也被设想用于本文所述的任何用途。如本领域技术人员所认识到的，信号肽通常在加工过程中被切割并且不包含在活性抗体蛋白中。多肽也可以框内融合或与连接子或其它序列缀合，以便合成、纯化或鉴定多肽(例如，聚-His)或增强多肽与固体支持物的结合。
[0192] 如果需要，肽连接子/间隔子序列也可以用于将多个多肽组分分开足够的距离，以确保每个多肽折叠成其二级结构和/或三级结构。此类肽连接子序列可以使用本领域众所周知的标准技术并入到融合多肽中。
[0193] 可以例如基于以下来选择某些肽间隔子序列：(1)其能够采用灵活的伸展构象；(2)其不能采用可以与第一多肽和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构；和/或(3)缺乏可以与多肽功能性表位反应的疏水残基或带电残基。
[0194] 在一个说明性实施例中，肽间隔子序列含有例如Gly、Asn和Ser残基。其它近中性氨基酸(如Thr和Ala)还可以包含在间隔子序列中。
[0195] 可以有效地用作间隔子的其它氨基酸序列包含以下中公开的氨基酸序列：Maratea等人《,基因》40:39 46(1985)；Murphy等人《, 美国国家科学院院刊》83:8258 8262(1986)；美国专利第4,935,233号；以及美国专利第4,751,180号。
[0196] 其它说明性间隔子可以包含例如Glu-Gly-Lys-Ser-Ser-Gly-Ser-Ser-Ser-Gly-Ser-Glu-Ser-Lys-val-Asp(SEQ ID NO:X)(Chaudhary等人,1990《,美国国家科学院院刊》87:1066-1070)和Lys-Glu-Ser-Gly-Ser-Val-Ser-Ser-Ser-Glu-Gln-Leu-Ala-Gln-Phe-Arg-Ser-Leu-Asp(SEQ ID NO:X)(Bird等人,1988《, 科学》242:423-426)。
[0197] 在一些实施例中，当第一多肽和第二多肽具有可以用于将功能性结构域分开并防止空间干扰的非必需N端氨基酸区时，不需要间隔子序列。两个编码序列可以直接融合而不需要任何间隔子，或者通过使用由例如重复1到3次的五聚体Gly-Gly-Gly-Gly-Ser(SEQ ID NO:X)构成的柔性聚连接子。此类间隔子已经用于通过插入VH与VL(Bird等人,1988《,科学》242:423-426；Huston等人,1988《, 美国国家科学院院刊》85:5979-5883)之间来构建单链抗体(scFv)。
[0198] 在某些实施例中，肽间隔子被设计成使正确的相互作用能够在形成单链抗体的可变区的两个β片层之间进行。
[0199] 在某些说明性实施例中，肽间隔子为1个到5个氨基酸、5个到10个氨基酸、5个到25个氨基酸、5个到50个氨基酸、10个到25个氨基酸、10个到50个氨基酸、10个到100个氨基酸或任何中间范围的氨基酸。
[0200] 在其它说明性实施例中，肽间隔子包括长度为约1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个氨基酸。
[0201] 设想了本文所述抗体的一个或多个氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。例如，抗体的氨基酸序列变体可以通过将适当的核苷酸变化引入到对抗体或其链进行编码的多核苷酸中或通过肽合成来制备。此类修饰包含例如抗体的氨基酸序列内的残基缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以得到最终抗体，条件是最终构建体具有所期望的特性(例如，与VISTA的高亲和力结合)。氨基酸变化还可以改变抗体的转译后过程，如改变糖基化位点的数目或位置。上文描述的本公开的多肽的变化和修饰中的任一种可以包含在本公开的抗体中。
[0202] 本公开提供了本文公开的抗体的变体。在某些实施例中，此类变体抗体或抗原结合片段或其CDR与VISTA结合至少约50％、至少约70％，并且在某些实施例中，至少约90％，并且与本文具体阐述的抗体序列结合。在另外的实施例中，此类变体抗体或抗原结合片段或其CDR与VISTA以及本文具体阐述的抗体序列结合，与VISTA结合的亲和力大于与本文所述的抗体结合的亲和力，例如定量结合至少约105％、106％、107％、108％、109％或110％。
[0203] 在特定实施例中，主题抗体可以具有：a)重链可变区，所述重链可变区具有与本文所述的抗VISTA抗体的重链可变区至少80％相同、至少95％相同、至少90％、至少95％或至少98％或99％相同的氨基酸序列；以及b)轻链可变区，所述轻链可变区具有与本文所述的抗VISTA抗体的轻链可变区至少80％相同、至少85％相同、至少90％、至少95％或至少98％或99％相同的氨基酸序列。说明性重链区和轻链区的氨基酸序列在SEQ ID NO:1-113中示出。
[0204] 在特定实施例中，所述抗体可以包括：a)重链可变区，所述重链可变区包括：i.CDR1区，所述CDR1区的氨基酸序列与本文所述的所选抗体的重链CDR1区的氨基酸序列相同；ii.CDR2区，所述CDR2区的氨基酸序列与所选抗体的重链CDR2区的氨基酸序列相同；以及iii.CDR3区，所述CDR3区的氨基酸序列与所选抗体的重链CDR3区的氨基酸序列相同；以及b)轻链可变区，所述轻链可变区包括：i.CDR1区，所述CDR1区的氨基酸序列与所选抗体的轻链CDR1区的氨基酸序列相同；ii.CDR2区，所述CDR2区的氨基酸序列与所选抗体的轻链CDR2区的氨基酸序列相同；以及iii.CDR3区，所述CDR3区的氨基酸序列与所选抗体的轻链CDR3区的氨基酸序列相同；其中所述抗体特异性结合所选靶标(例如，VISTA)。在另外的实施例中，抗体或其抗原结合片段是变体抗体，其中除了在VH区和VL区的CDR区中多达8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个氨基酸取代之外，所述变体包括与所选抗体相同的重链和轻链。在这方面，所选抗体的CDR区中可能有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、
8个氨基酸取代，或在某些实施例中，9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个氨基酸取代。取代可以在VH区和/或VL区中的CRD中。(参见例如Muller,1998,《结构
(Structure)》6:1153-1167)。
8个氨基酸取代，或在某些实施例中，9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个或更多个氨基酸取代。取代可以在VH区和/或VL区中的CRD中。(参见例如Muller,1998,《结构
(Structure)》6:1153-1167)。
[0205] 可以通过常规方法确定代表性多肽(例如，本文提供的变体VISTA特异性抗体，例如具有本文提供的抗原结合片段的抗体蛋白)的三维结构，使得用所选天然氨基酸或非天然氨基酸对一种或多种氨基酸进行的取代、添加、缺失或插入可以被虚拟建模，以便确定如此衍生的结构变体是否保留当前公开的物种的空间填充特性。参见例如Donate等人,1994,《保护科学(Prot.Sci.)》3:2378；Bird等人《, 科学》309:1868-1871(2005)；Schueler-Furman等人《, 科学》310:638(2005)；Dietz等人《, 美国国家科学院院刊》103:1244(2006)；Dodson等人《, 自然》450:176(2007)；Qian等人《,自然》450:259(2007)；Raman等人《,科学》
327:1014-1018(2010)。可以用于这些和相关实施例(如本文提供的用于VISTA特异性抗体或其抗原结合域的合理设计)的计算机算法的一些另外的非限制性实例包含VMD，所述VMD是用于使用3-D图形和内置脚本(参见乌尔班纳伊利诺斯大学-香槟分校理论和计算生物物理组(Theoretical and Computational Biophysics Group)的网站ks.uiuc.edu/
Research/vmd/)显示、动画和分析大型生物分子系统的分子可视化程序。许多其它计算机程序是本领域已知的并可供技术人员使用并且允许根据能量最小化构象的空间填充模型(范德华半径(van der Waals radii))确定原子尺度；试图确定针对不同化学基团的高亲和力区从而增强结合的GRID、计算数学比对的蒙特卡罗搜索(Monte Carlo searches)以及评估力场计算的CHARMM(Brooks等人(1983)《计算化学杂志(J.Comput.Chem.)》4:187-217)和AMBER(Weiner等人(1981)《计算化学杂志》106:765)以及分析(还参见Eisenfield等人(1991)《美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)》261:C376-386；Lybrand(1991)《比利时药理学杂志(J.Pharm.Belg.)》46:49-54；Froimowitz(1990)《生物技术(Biotechniques)》8:640-
644；Burbam等人(1990)《蛋白质(Proteins)》7:99-111；Pedersen(1985)《环境健康视角(Environ.Health Perspect.)》61:185-190；以及Kini等人(1991)《生物分子结构与动力学杂志(J.Biomol.Struct.Dyn.)》9:475-488)。各种适当的计算计算机程序也可商购获得，如来自 (德国慕尼黑)。
327:1014-1018(2010)。可以用于这些和相关实施例(如本文提供的用于VISTA特异性抗体或其抗原结合域的合理设计)的计算机算法的一些另外的非限制性实例包含VMD，所述VMD是用于使用3-D图形和内置脚本(参见乌尔班纳伊利诺斯大学-香槟分校理论和计算生物物理组(Theoretical and Computational Biophysics Group)的网站ks.uiuc.edu/
Research/vmd/)显示、动画和分析大型生物分子系统的分子可视化程序。许多其它计算机程序是本领域已知的并可供技术人员使用并且允许根据能量最小化构象的空间填充模型(范德华半径(van der Waals radii))确定原子尺度；试图确定针对不同化学基团的高亲和力区从而增强结合的GRID、计算数学比对的蒙特卡罗搜索(Monte Carlo searches)以及评估力场计算的CHARMM(Brooks等人(1983)《计算化学杂志(J.Comput.Chem.)》4:187-217)和AMBER(Weiner等人(1981)《计算化学杂志》106:765)以及分析(还参见Eisenfield等人(1991)《美国生理学杂志(Am.J.Physiol.)》261:C376-386；Lybrand(1991)《比利时药理学杂志(J.Pharm.Belg.)》46:49-54；Froimowitz(1990)《生物技术(Biotechniques)》8:640-
644；Burbam等人(1990)《蛋白质(Proteins)》7:99-111；Pedersen(1985)《环境健康视角(Environ.Health Perspect.)》61:185-190；以及Kini等人(1991)《生物分子结构与动力学杂志(J.Biomol.Struct.Dyn.)》9:475-488)。各种适当的计算计算机程序也可商购获得，如来自 (德国慕尼黑)。
[0206] 在另一个实施例中，抗VISTA抗体以及其人源化版本衍生自兔单克隆抗体，并且具体地使用 技术产生。这些抗体是有利的，因为其需要最小序列修饰，从而促进在使用突变谱系指导(MLG)人源化技术(参见例如美国专利第7,462,697号)进行人源化后保留功能特性。因此，用于制备本公开的抗VISTA抗体的说明性方法包含例如美国专利5,675,
063和7,429,487中所述的 兔单克隆抗体技术。在这方面，在某些实施例中，在兔
中产生本公开的抗VISTA抗体。在特定实施例中，能够与兔脾细胞或外周B淋巴细胞融合的兔源性永生B淋巴细胞用于生产产生抗体的混合细胞。永生B淋巴细胞不会可检测地表达内源性免疫球蛋白重链，并且在某些实施例中，可以含有改变的免疫球蛋白重链编码基因。
063和7,429,487中所述的 兔单克隆抗体技术。在这方面，在某些实施例中，在兔
中产生本公开的抗VISTA抗体。在特定实施例中，能够与兔脾细胞或外周B淋巴细胞融合的兔源性永生B淋巴细胞用于生产产生抗体的混合细胞。永生B淋巴细胞不会可检测地表达内源性免疫球蛋白重链，并且在某些实施例中，可以含有改变的免疫球蛋白重链编码基因。
[0207] 组合物和使用方法
[0208] 本公开提供了包括VISTA特异性抗体或其抗原结合片段的组合物以及此类组合物在各种治疗环境(包含癌症、炎性疾病和感染性疾病的治疗)中的施用。
[0209] 以纯粹形式或在适当的药物组合物中施用本文所述的VISTA特异性抗体可以通过任何可接受的药剂施用方式进行，以用于类似的用途。药物组合物可以通过将抗体或含有抗体的组合物与适当的生理学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂混合来制备，并且可以调配成固体、半固体、液体或气体形式的制剂，如片剂、胶囊、粉末、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂、凝胶剂、微球体和气雾剂。此外，其它药物活性成分(包含本文其它地方描述的其它抗癌剂)和/或合适的赋形剂(如盐、缓冲剂和稳定剂)可以但不必存在于组合物中。可以通过各种不同途径实现施用，包含口服、肠胃外、鼻腔、静脉内、皮内、皮下或局部。优选的施用方式取决于待治疗或预防的病状的性质。施用后减少、抑制、预防或延迟癌症进展和/或癌症转移的量被认为是有效的。
[0210] 在某些实施例中，施用的量足以使肿瘤消退，如肿瘤存活量的统计学显著降低(例如，肿瘤质量降低至少50％)或改变的(例如，具有统计学显著性的降低)扫描尺度所指示的。
[0211] 精确的剂量和治疗持续时间是所治疗疾病的函数，并且可以使用已知的测试方案凭经验确定，或者通过在本领域已知的模型系统中测试组合物并从中推断。也可以进行受控的临床试验。剂量也可以随着待缓解的病状的严重程度而变化。通常调配和施用药物组合物以发挥治疗有用的效果，同时使不希望的副作用最小化。所述组合物可以一次施用，或者可以分成许多较小的剂量而每隔一段时间施用。对于任何特定受试者，可以根据个体需要随时间调整特定剂量方案。
[0212] 含有VISTA特异性抗体的组合物可以单独施用或与其它已知的癌症治疗组合施用，如放射疗法、化学疗法、移植、免疫疗法、激素疗法、光动力疗法等。组合物还可以与抗生素组合施用。
[0213] 因此，施用这些和相关药物组合物的典型途径包含但不限于口服、局部、透皮、吸入、肠胃外、舌下、口腔、直肠、阴道、玻璃体内和鼻内。本文所使用的术语肠胃外包含皮下注射、静脉内、肌肉内、胸骨内注射或输注技术。调配根据某些实施例的药物组合物，以便在将组合物施用于患者时允许其中含有的活性成分是生物可利用的。将施用于受试者或患者的组合物可以采取一个或多个剂量单位的形式，其中例如，片剂可以是单剂量单位，并且本文所述的呈气雾剂形式的VISTA特异性抗体的容器可以容纳多个剂量单位。制备这种剂型的实际方法对于本领域技术人员来说是已知的、或者是显而易见的；例如，参见《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practice of Pharmacy)》,第20版(费城医药科学学院,2000)。在任何情况下，待施用的组合物含有治疗有效量的本公开的抗体，用于根据本文的教导治疗所关注的疾病或病状。
[0214] 药物组合物可以呈固体或液体的形式。在一个实施例中，一种或多种载剂是颗粒状的，使得组合物呈例如片剂或粉末形式。一种或多种载剂可以是液体，而组合物是例如口服油、可注射液体或气雾剂，其可用于例如吸入施用。当旨在用于口服施用时，药物组合物优选地呈固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包含在本文所述的为固体或液体的形式中。
[0215] 作为用于口服施用的固体组合物，可以将药物组合物调配成粉末、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、口香糖、薄片等。这种固体组合物通常将含有一种或多种惰性稀释剂或可食用载剂。此外，可能存在以下中的一种或多种：如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶等粘合剂；如淀粉、乳糖或糊精等赋形剂、如海藻酸、海藻酸钠、羧甲基淀粉钠，玉米淀粉等崩解剂；如硬脂酸镁或氢化蓖麻油等润滑剂；如胶体二氧化硅等助流剂；如蔗糖或糖精等甜味剂；如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味品等调味剂；以及着色剂。当药物组合物呈胶囊形式时，例如，明胶胶囊，除了上述类型的材料外，所述药物组合物还可以含有如聚乙二醇或油等液体载剂。
[0216] 药物组合物可以呈液体形式，例如，酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。作为两个实例，液体可以用于口服施用或通过注射递送。当旨在用于口服施用时，除本发明化合物外，优选的组合物还含有甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和增味剂中的一种或多种。在旨在通过注射施用的组合物中，可以包含表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一种或多种。
[0217] 液体药物组合物(无论其是溶液、悬浮液或其它类似形式)可以包含以下佐剂中的一种或多种：如注射用水等无菌稀释剂、盐水溶液、优选地生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、如可以用作溶剂或悬浮培养基的合成甘油单酯或甘油二酯等固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及用于调节张力的试剂，如氯化钠或葡萄糖。肠胃外制剂可以被封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水是优选佐剂。可注射药物组合物优选地是无菌的。
[0218] 旨在用于肠胃外或口服施用的液体药物组合物应含有一定量的如本文公开的VISTA特异性抗体，使得将获得合适的剂量。通常，这个量为组合物中抗体的至少0.01％。当旨在用于口服施用时，这个量可以在组合物重量的0.1％与约70％之间变化。某些口服药物组合物含有介于约4％与约75％之间的抗体。在某些实施例中，药物组合物和制剂被制备成使得肠胃外剂量单位在稀释前含有介于0.01％到10％之间的抗体重量。
[0219] 药物组合物可以旨在用于局部施用，在这种情况下，载剂可以适当地包括溶液、乳剂、乳膏或凝胶基质。例如，基质可以包括以下中的一种或多种：矿脂、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、如水和醇等稀释剂、以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于局部施用的药物组合物中。如果旨在用于经皮施用，则所述组合物可以包含透皮贴剂或离子电渗疗法装置。药物组合物可以旨在用于例如栓剂形式的直肠施用，其将在直肠中融化并释放药物。用于直肠施用的组合物可以含有作为合适的无刺激性赋形剂的油性基质。此类基质包含但不限于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。
[0220] 药物组合物可以包含各种材料，这些材料改变固体或液体剂量单位的物理形式。例如，组合物可以包含在活性成分周围形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常是惰性的，并且可以选自例如糖、虫胶和其它肠溶包衣剂。可替代地，可以将活性成分包裹在明胶胶囊中。呈固体或液体形式的药物组合物可以包含与抗体结合并且由此有助于递送化合物的药剂。可以以这种能力起作用的合适药剂包含其它单克隆或多克隆抗体、一种或多种蛋白质或脂质体。药物组合物可以基本上由可以作为气雾剂施用的剂量单位组成。术语气雾剂用于表示从胶体性质到由加压包装组成的系统的各种系统。可以通过液化或压缩气体或通过分配活性成分的合适泵系统进行递送。气雾剂可以以单相、双相或三相系统递送，以递送一种或多种活性成分。气雾剂的递送包含必要的容器、活化剂、阀门、子容器等，这些一起可以形成试剂盒。本领域普通技术人员无需过多实验即可确定优选的气雾剂。
[0221] 药物组合物可以通过制药领域熟知的方法制备。例如，旨在通过注射施用的药物组合物可以通过将包括本文所述的VISTA特异性抗体的组合物以及任选地盐、缓冲剂和/或稳定剂中的一种或多种与无菌蒸馏水组合从而形成溶液来制备。可以加入表面活性剂以促进均匀溶液或悬浮液的形成。表面活性剂是与抗体组合物非共价相互作用的化合物，以促进抗体在含水递送系统中的溶解或均匀悬浮。
[0222] 组合物可以以治疗有效量施用，所述治疗有效量将根据多种因素而变化，包含所采用的特定化合物(例如，VISTA特异性抗体)的活性；化合物的代谢稳定性和作用时间；患者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；施用方式和时间；排泄率；药物组合；特定障碍或病状的严重程度；以及受试者正在接受的治疗。通常，治疗有效日剂量(对于70kg哺乳动物)为约0.001mg/kg(即，0.07mg)到约100mg/kg(即，约7.0g)；优选地，治疗有效剂量(对于70kg哺乳动物)为约0.01mg/kg(即，0.7mg)到约50mg/kg(即，3.5g)；更优选地，治疗有效剂量(对于70kg哺乳动物)为约1mg/kg(即，70mg)到约25mg/kg(即，1.75g)。
[0223] 包括本公开的VISTA特异性抗体的组合物也可以在施用一种或多种其它治疗剂的同时、之前或之后施用。此类组合疗法可以包含施用含有抗体和一种或多种另外的活性剂的单一药物剂型调配物，以及在其自身单独的药物剂型调配物中施用包括本公开的抗体和每种活性剂的组合物。例如，如本文所述的抗体和其它活性剂可以以单一口服剂量组合物(如片剂或胶囊)一起施用于患者，或者以单独的口服剂量调配物施用每种药剂。类似地，如本文所述的抗体和其它活性剂可以以单一肠胃外剂量组合物(如以盐水溶液或其它生理学上可接受的溶液)一起施用于患者，或者以单独的肠胃外剂量调配物施用每种药剂。当使用单独的剂量调配物时，包括抗体和一种或多种另外的活性剂的组合物可以基本上在同一时间(即同时)或在分开交错的时间(即顺序地和以任何顺序)施用；组合疗法应被理解为包含所有这些方案。
[0224] 因此，在某些实施例中，还可设想施用本公开的抗VISTA抗体组合物与一种或多种其它治疗剂的组合。本领域可以接受此类治疗剂作为针对如本文所述的特定疾病状态(如风湿性关节炎、炎症或癌症)的标准治疗。所设想的示例性治疗剂包含细胞因子、生长因子、类固醇、NSAID、DMARD、抗炎剂、化学治疗剂、放射治疗剂或其它活性剂和辅助剂。
[0225] 在某些实施例中，本文公开的抗VISTA抗体与一种或多种癌症免疫治疗剂组合施用。在某些实例中，免疫治疗剂调节受试者的免疫应答例如以增加或保持癌症相关或癌症特异性免疫应答，并且由此导致增加的免疫细胞抑制或癌细胞的减少。示例性免疫治疗剂包含多肽(例如，抗体和其抗原结合片段)、配体和小肽以及其混合物。免疫治疗剂还包含小分子、细胞(例如，免疫细胞，如T细胞)、各种癌症疫苗、基因治疗剂或其它基于多核苷酸的药剂，包含如溶瘤病毒等病毒剂、以及本领域已知的其它药剂。因此，在某些实施例中，癌症免疫治疗剂选自免疫检查点调节剂、癌症疫苗、溶瘤病毒、细胞因子和基于细胞的免疫疗法中的一种或多种。
[0226] 在某些实施例中，癌症免疫治疗剂是免疫检查点调节剂。具体实例包含一种或多种抑制性免疫检查点分子的“拮抗剂”和一种或多种刺激性免疫检查点分子的“激动剂”。通常，免疫检查点分子是免疫系统的增强信号(共刺激分子)或减弱信号的组分，所述组分的靶向具有对癌症的治疗潜力，因为癌细胞可以扰乱免疫检查点分子的天然功能(参见例如，Sharma和Allison《, 科学》348:56-61,2015；Topalian等人《, 癌细胞(Cancer Cell.)》27:450-461,2015；Pardoll《, 癌症自然评论(Nature Reviews Cancer.)》12:252-264,2012)。
在一些实施例中，免疫检查点调节剂(例如，拮抗剂、激动剂)“结合”或“特异性结合”一个或多个免疫检查点分子，如本文所描述的。
在一些实施例中，免疫检查点调节剂(例如，拮抗剂、激动剂)“结合”或“特异性结合”一个或多个免疫检查点分子，如本文所描述的。
[0227] 在一些实施例中，免疫检查点调节剂是一种或多种抑制性免疫检查点分子的拮抗剂或抑制剂。示例性抑制性免疫检查点分子包含：程序性死亡-配体1(PD-L1)、程序性死亡-配体2(PD-L2)、程序性死亡1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA-4)、吲哚胺2,3-加双氧酶(IDO)、色氨酸2,3-加双氧酶(TDO)、T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)、淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)、B和T淋巴细胞弱化子(BTLA)、CD160以及具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)。
[0228] 在某些实施例中，药剂是PD-1(受体)拮抗剂或抑制剂，其靶向已经被示出为恢复肿瘤环境下的免疫功能(参见例如，Phillips等人《,国际免疫杂志(Int Immunol.)》27:39-46,2015)。PD-1是属于免疫球蛋白超家族并且在T细胞和祖B细胞上表达的细胞表面受体。
PD-1与两个配体(PD-L1和PD-L2)相互作用。PD-1例如通过减少或防止T细胞的活化来充当抑制性免疫检查点分子，这进而降低自身免疫并提高自身耐受性。PD-1的抑制效果至少部分地通过促进淋巴结中的抗原特异性T细胞的细胞凋亡以及减少调节性T细胞(抑制性T细胞)的细胞凋亡的双重机制完成。PD-1拮抗剂或抑制剂的一些实例包含特异性结合PD-1并减少其免疫抑制活性中的一种或多种(例如，其下游信号传导或其与PD-L1的相互作用)的抗体或抗原结合片段或小分子。PD-1拮抗剂或抑制剂的具体实例包含抗体纳武单抗、派姆单抗、PDR001、MK-3475、AMP-224、AMP-514和皮地利珠单抗以及其抗原结合片段(参见例如，美国专利第8,008,449号；第8,993,731号；第9,073,994号；第9,084,776号；第9,102,727号；第9,102,728号；第9,181,342号；第9,217,034号；第9,387,247号；第9,492,539号；第9,
492,540号；以及美国申请第2012/0039906号；2015/0203579)。
PD-1与两个配体(PD-L1和PD-L2)相互作用。PD-1例如通过减少或防止T细胞的活化来充当抑制性免疫检查点分子，这进而降低自身免疫并提高自身耐受性。PD-1的抑制效果至少部分地通过促进淋巴结中的抗原特异性T细胞的细胞凋亡以及减少调节性T细胞(抑制性T细胞)的细胞凋亡的双重机制完成。PD-1拮抗剂或抑制剂的一些实例包含特异性结合PD-1并减少其免疫抑制活性中的一种或多种(例如，其下游信号传导或其与PD-L1的相互作用)的抗体或抗原结合片段或小分子。PD-1拮抗剂或抑制剂的具体实例包含抗体纳武单抗、派姆单抗、PDR001、MK-3475、AMP-224、AMP-514和皮地利珠单抗以及其抗原结合片段(参见例如，美国专利第8,008,449号；第8,993,731号；第9,073,994号；第9,084,776号；第9,102,727号；第9,102,728号；第9,181,342号；第9,217,034号；第9,387,247号；第9,492,539号；第9,
492,540号；以及美国申请第2012/0039906号；2015/0203579)。
[0229] 在一些实施例中，药剂是PD-L1拮抗剂或抑制剂。如以上所述，PD-L1是PD-1受体的天然配体之一。PD-L1拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合PD-L1并减少其免疫抑制活性中的一种或多种(例如其结合PD-1受体)的抗体或抗原结合片段或小分子。PD-L1拮抗剂的具体实例包含抗体阿特珠单抗(MPDL3280A)、阿维单抗(MSB0010718C)和度伐鲁单抗(MEDI4736)以及其抗原结合片段(参见例如，美国专利第9,102,725号；第9,393,301号；第9,402,899号；第9,439,962号)。
[0230] 在一些实施例中，药剂是PD-L2拮抗剂或抑制剂。如以上所述，PD-L2是PD-1受体的天然配体之一。PD-L2拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合PD-L2并减少其免疫抑制活性中的一种或多种(例如其结合PD-1受体)的抗体或抗原结合片段或小分子。
[0231] 在一些实施例中，药剂是CTLA-4拮抗剂或抑制剂。CTLA4或CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)也被称为CD152(分化簇152)是例如通过当T细胞在抗原呈递细胞的表面上结合CD80或CD86时将抑制信号传输到所述T细胞来充当抑制性免疫检查点分子的蛋白受体。CTLA-4拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合CTLA-4的抗体或抗原结合片段或小分子。具体实例包含抗体伊匹木单抗和曲美木单抗以及其抗原结合片段。据信伊匹木单抗的活性中的至少一些由表达CTLA-4的抑制因子Treg的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)杀伤介导。
[0232] 在一些实施例中，药剂是IDO拮抗剂或抑制剂或者TDO拮抗剂或抑制剂。IDO和TDO是具有免疫抑制性质的色氨酸分解代谢的酶。例如，已知IDO抑制T细胞和NK细胞，产生并活化Treg和髓源性抑制细胞，并且促进肿瘤血管生成。IDO和TDO拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合IDO或TDO(参见例如，Platten等人,《免疫学前沿(Front Immunol.)》5:673,2014)并且减少或抑制一种或多种免疫抑制活性的抗体或抗原结合片段或小分子。IDO拮抗剂或抑制剂的具体实例包含吲哚莫德(NLG-8189)、1-甲基色氨酸(1MT)、β-咔啉(去甲哈尔满；9H-吡啶并[3,4-b]吲哚)、迷迭香酸和依帕卡朵丝坦(参见例如，Sheridan《,自然生物技术》33:321-322,2015)。TDO拮抗剂或抑制剂的具体实例包含680C91和LM10(参见例如，Pilotte等人《, 美国国家科学院院刊》109:2497-2502,2012)。
[0233] 在一些实施例中，药剂是TIM-3拮抗剂或抑制剂。T细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域3(TIM-3)在活化的人CD4+T细胞上表达并且调节Th1和Th17细胞因子。TIM-3还通过在与细胞的配体、半乳凝素-9相互作用时触发细胞死亡来充当具有Th1/Tc1功能的负调节因子。TIM-3有助于抑制性肿瘤微环境，并且其过表达与各种癌症的预后不良相关(参见例如，Li等人《,肿瘤学报(Acta Oncol.)》54:1706-13,2015)。TIM-3拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合TIM-3并减少或抑制其免疫抑制活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子。
[0234] 在一些实施例中，药剂是LAG-3拮抗剂或抑制剂。淋巴细胞活化基因-3(LAG-3)在活化的T细胞、天然杀伤细胞、B细胞和浆细胞样树突细胞上表达。其以与CTLA-4和PD-1类似的方式负调控T细胞的细胞增殖、活化和稳态(参见例如，Workman和Vigali《.欧洲免疫学杂志(European Journal of Immun.)》33:970-9,2003；以及Workman等人《,免疫学杂志》172:5450-5,2004)，并且已经报告在Treg抑制功能中发挥作用(参见例如，Huang等人《, 免疫(Immunity.)》21:503-13,2004)。LAG3还使CD8+T细胞保持在致耐受性状态并且与PD-1组合以保持CD8 T细胞耗尽。LAG-3拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合LAG-3并抑制其免疫抑制活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子。具体实例包含抗体BMS-
986016和其抗原结合片段。
986016和其抗原结合片段。
[0235] 在一些实施例中，药剂是BTLA拮抗剂或抑制剂。B和T淋巴细胞弱化子(BTLA；CD272)表达在T细胞活化期间诱导，并且其通过与肿瘤坏死家族受体(TNF-R)和B7细胞表面受体家族相互作用来抑制T细胞。BTLA是肿瘤坏死因子(受体)超家族成员14(TNFRSF14)的配体，也被称为疱疹病毒进入介体(HVEM)。BTLA-HVEM复合物例如通过抑制人CD8+癌症特异性T细胞的功能负向调节T细胞免疫应答(参见例如，Derré等人《, 临床研究杂志(J Clin Invest)》120:157-67,2009)。BTLA拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合BTLA-4并减少其免疫抑制活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子。
[0236] 在一些实施例中，药剂是HVEM拮抗剂或抑制剂，例如特异性结合HVEM并且干扰其与BTLA或CD160的相互作用的拮抗剂或抑制剂。HVEM拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合HVEM、任选地减少HVEM/BTLA和/或HVEM/CD160相互作用并且由此减少HVEM的免疫抑制活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子。
[0237] 在一些实施例中，药剂是CD160拮抗剂或抑制剂，例如特异性结合CD160并且干扰其与HVEM的相互作用的拮抗剂或抑制剂。CD160拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合CD160、任选地减少CD160/HVEM相互作用并且由此减少或抑制其免疫抑制活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子。
[0238] 在一些实施例中，药剂是TIGIT拮抗剂或抑制剂。T细胞Ig和ITIM结构域(TIGIT)是在各种淋巴细胞的表面上发现并且例如通过Treg抑制抗肿瘤免疫的共抑制受体(Kurtulus等人《,临床研究杂志》125:4053-4062,2015)。TIGIT拮抗剂或抑制剂的一般实例包含特异性结合TIGIT并减少其免疫抑制活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子(参见例如，Johnston等人《, 癌细胞(Cancer Cell.)》26:923-37,2014)。
[0239] 在某些实施例中，免疫检查点调节剂是一种或多种刺激性免疫检查点分子的激动剂。示例性刺激性免疫检查点分子包含CD40、OX40、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)、CD137(4-1BB)、CD27、CD28、CD226和疱疹病毒进入介体(HVEM)。
[0240] 在一些实施例中，药剂是CD40激动剂。CD40在抗原呈递细胞(APC)和一些恶性肿瘤上表达。其配体是CD40L(CD154)。在APC上，连接导致共刺激分子上调，从而潜在地绕过对抗肿瘤免疫应答中的T细胞辅助的需要。CD40激动剂疗法在APC成熟和其从肿瘤到淋巴结的迁移中起重要作用，从而导致提高的抗原呈递和T细胞活化。抗CD40激动剂抗体产生动物模型中的实质性应答和持久性抗癌免疫，这是至少部分地由细胞毒性T细胞介导的效果(参见例如，Johnson等人《临床癌症研究》21:1321-1328,2015；以及Vonderheide和Glennie，《临床癌症研究》19:1035-43,2013)。CD40激动剂的一般实例包含特异性结合CD40并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。特定实例包含CP-870,893、达西珠单抗、Chi Lob 7/4、ADC-1013、CD40L、rhCD40L以及其抗原结合片段。CD40激动剂的具体实例包含但不限于APX005(参见例如US 2012/0301488)和APX005M(参见例如US
2014/0120103)。
2014/0120103)。
[0241] 在一些实施例中，药剂是OX40激动剂。OX40(CD134)促进效应T细胞和记忆T细胞的扩增并且抑制调节性T细胞的分化和活性(参见例如，Croft等人《, 免疫学评论》,229:173-91,2009)。其配体是OX40L(CD252)。由于OX40信号传导影响T细胞活化和存活，因此其在启动淋巴结中的抗肿瘤免疫应答以及在肿瘤微环境下保持抗肿瘤免疫应答方面起重要作用。
OX40激动剂的一般实例包含特异性结合OX40并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。具体实例包含OX86、OX-40L、Fc-OX40L、GSK3174998、MEDI0562(人源化OX40激动剂)、MEDI6469(鼠类OX4激动剂)和MEDI6383(OX40激动剂)以及其抗原结合片段。
OX40激动剂的一般实例包含特异性结合OX40并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。具体实例包含OX86、OX-40L、Fc-OX40L、GSK3174998、MEDI0562(人源化OX40激动剂)、MEDI6469(鼠类OX4激动剂)和MEDI6383(OX40激动剂)以及其抗原结合片段。
[0242] 在一些实施例中，药剂是GITR激动剂。糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)增加T细胞扩增，抑制Treg的抑制活性并且延长T效应细胞的存活。GITR激动剂已经被示出用于通过缺失Treg谱系稳定性来促进抗肿瘤应答(参见例如，Schaer等人《, 癌症免疫学研究》1:320-31,2013)。这些不同机制示出GITR在启动淋巴结中的免疫应答以及在保持肿瘤组织中的免疫应答方面起重要作用。配体是GITRL。GITR激动剂的一般实例包含特异性结合GITR并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。特定实例包含GITRL、INCAGN01876、DTA-1、MEDI1873以及其抗原结合片段。
[0243] 在一些实施例中，药剂是CD137激动剂。CD137(4-1BB)是肿瘤坏死因子(TNF)受体家族的成员，并且CD137的交联增强T细胞增殖、IL-2分泌、存活和溶细胞活性。CD137介导的信号传导还保护如CD8+T细胞等T细胞免受活化诱导的细胞死亡。CD137激动剂的一般实例包含特异性结合CD137并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。特定实例包含CD137(或4-1BB)配体(参见例如，Shao和Schwarz《, 白细胞生物学杂志(J Leukoc Biol.)》,89:21-9,2011)和抗体乌托米单抗，包含其抗原结合片段。
[0244] 在一些实施例中，药剂是CD27激动剂。刺激CD27增加初始T细胞的抗原特异性扩增并且有助于T细胞记忆和T细胞免疫的长期保持。其配体是CD70。具有激动剂抗体的人CD27的靶向刺激T细胞活化和抗肿瘤免疫(参见例如，Thomas等人,《肿瘤免疫学(Oncoimmunology.)》2014；3:e27255.doi:10.4161/onci.27255；以及He等人《, 免疫学杂志》191:4174-83,2013)。CD27激动剂的一般实例包含特异性结合CD27并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。特定实例包含CD70和抗体瓦利路单抗和CDX-1127(1F5)，包含其抗原结合片段。
[0245] 在一些实施例中，药剂是CD28激动剂。CD28是组成型表达的CD4+T细胞和一些CD8+T细胞。其配体包含CD80和CD86，并且其刺激增加T细胞扩增。CD28激动剂的一般实例包含特异性结合CD28并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。特定实例包含CD80、CD86、抗体TAB08以及其抗原结合片段。
[0246] 在一些实施例中，药剂是CD226激动剂。CD226是与TIGIT共享配体的刺激受体，并且与TIGIT相反，CD226的接合增强T细胞活性(参见例如，Kurtulus等人《, 临床研究杂志》125:4053-4062,2015；Bottino等人,《实验医学杂志》1984:557-567,2003；以及Tahara-Hanaoka等人《,国际免疫杂志》16:533-538,2004)。CD226激动剂的一般实例包含特异性结合CD226并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子或配体(例如，CD112、CD155)。
[0247] 在一些实施例中，药剂是HVEM激动剂。疱疹病毒进入介体(HVEM)(也被称为肿瘤坏死因子受体超家族成员14(TNFRSF14))是TNF受体超家族的人类细胞表面受体。HVEM在包含T细胞、APC和其它免疫细胞的各种细胞上发现。不像其它受体，HVEM以高水平在静息的T细胞上表达并且在活化时被下调。已经示出HVEM信号传导在T细胞活化的早期阶段以及在淋巴结中的肿瘤特异性淋巴细胞群的扩增期间起重要作用。HVEM激动剂的一般实例包含特异性结合HVEM并增加其免疫刺激活性中的一种或多种的抗体或抗原结合片段或小分子或配体。
[0248] 在某些实施例中，本文公开的抗VISTA抗体与一种或多种双特异性或多特异性抗体组合施用。例如，某些双特异性或多特异性抗体能够(i)结合并抑制一种或多种抑制性免疫检查点分子，并且还(ii)结合并激动一种或多种刺激性免疫检查点分子。在某些实施例中，双特异性或多特异性抗体(i)结合并抑制PD-L1、PD-L2、PD-1、CTLA-4、IDO、TDO、TIM-3、LAG-3、BTLA、CD160和/或TIGIT中的一种或多种，并且还(ii)结合并激动CD40、OX40、糖皮质激素诱导的TNFR家族相关基因(GITR)、CD137(4-1BB)、CD27、CD28、CD226和疱疹病毒进入介体(HVEM)中的一种或多种。
[0249] 在一些实施例中，本文公开的抗VISTA抗体与一种或多种癌症疫苗组合施用。在某些实施例中，所述癌症疫苗选自以下中的一种或多种：Oncophage；人乳头瘤病毒HPV疫苗，任选地Gardasil或Cervarix；乙型肝炎疫苗，任选地Engerix-B、Recombivax HB或Twinrix；以及sipuleucel-T(普罗文奇(Provenge))，或者包括选自以下中的一种或多种的癌抗原：
人Her2/neu、Her1/EGF受体(EGFR)、Her3、A33抗原、B7H3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、MAGE-3、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF(例如，VEGF-A)、VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、鸟苷酸环化酶C、NY-ESO-1、p53、生存素、整合素αvβ3、整合素α5β1、叶酸受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40泛癌抗原、B细胞活化因子(BAFF)、血小板衍生的生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-1、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷酸酶3(PRL-3)、前列腺酸性磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(在神经外胚层来源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷脂)、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)以及间皮素。
人Her2/neu、Her1/EGF受体(EGFR)、Her3、A33抗原、B7H3、CD5、CD19、CD20、CD22、CD23(IgE受体)、MAGE-3、C242抗原、5T4、IL-6、IL-13、血管内皮生长因子VEGF(例如，VEGF-A)、VEGFR-1、VEGFR-2、CD30、CD33、CD37、CD40、CD44、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CD152、CD200、CD221、CCR4、HLA-DR、CTLA-4、NPC-1C、腱生蛋白、波形蛋白、胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)、甲胎蛋白、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、碳酸酐酶9(CA-IX)、癌胚抗原(CEA)、鸟苷酸环化酶C、NY-ESO-1、p53、生存素、整合素αvβ3、整合素α5β1、叶酸受体1、跨膜糖蛋白NMB、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、糖蛋白75、TAG-72、MUC1、MUC16(或CA-125)、磷脂酰丝氨酸、前列腺特异性膜抗原(PMSA)、NR-LU-13抗原、TRAIL-R1、肿瘤坏死因子受体超家族成员10b(TNFRSF10B或TRAIL-R2)、SLAM家族成员7(SLAMF7)、EGP40泛癌抗原、B细胞活化因子(BAFF)、血小板衍生的生长因子受体、糖蛋白EpCAM(17-1A)、程序性死亡-1、蛋白质二硫键异构酶(PDI)、肝再生磷酸酶3(PRL-3)、前列腺酸性磷酸酶、Lewis-Y抗原、GD2(在神经外胚层来源的肿瘤上表达的双唾液酸神经节苷脂)、磷脂酰肌醇聚糖-3(GPC3)以及间皮素。
[0250] 在某些实施例中，本文公开的抗VISTA抗体与一种或多种溶瘤病毒组合施用。在一些实施例中，所述溶瘤病毒选自以下中的一种或多种：拉他莫基(talimogene laherparepvec，T-VEC)、柯萨基病毒A21(CAVATAKTM)、安柯瑞(Oncorine)(H101)、佩拉雷奥雷派(pelareorep)( )、塞内卡谷病毒(Seneca Valley virus)(NTX-010)、塞
内卡病毒(Senecavirus)SVV-001、ColoAd1、SEPREHVIR(HSV-1716)、CGTG-102(Ad5/3-D24-GMCSF)、GL-ONC1、MV-NIS和DNX-2401。
内卡病毒(Senecavirus)SVV-001、ColoAd1、SEPREHVIR(HSV-1716)、CGTG-102(Ad5/3-D24-GMCSF)、GL-ONC1、MV-NIS和DNX-2401。
[0251] 在某些实施例中，癌症免疫治疗剂是细胞因子。示例性细胞因子包含干扰素(IFN)-α、IL-2、IL-12、IL-7、IL-21和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。
[0252] 在某些实施例中，癌症免疫治疗剂是基于细胞的免疫疗法，例如基于T细胞的过继免疫疗法。在一些实施例中，基于细胞的免疫疗法包括癌抗原特异性T细胞，任选地离体衍生的T细胞。在一些实施例中，所述癌抗原特异性T细胞选自以下中的一种或多种：嵌合抗原受体(CAR)修饰的T细胞和T细胞受体(TCR)修饰的T细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)以及肽诱导的T细胞。在特定实施例中，CAR修饰的T细胞靶向CD-19(参见例如，Maude等人《, 血液》125:4017-4023,2015)。
[0253] 在一些实施例中，本文公开的抗VISTA抗体用作过继免疫疗法的一部分，例如，自体免疫疗法。因此，某些实施例包含治疗有需要的患者的癌症的方法，所述方法包括：
[0254] (a)将离体衍生的免疫细胞与本文所描述的抗VISTA抗体或其抗原结合片段一起温育；以及
[0255] (b)向所述患者施用所述自体免疫细胞。
[0256] 在一些情况下，离体衍生的免疫细胞是从待治疗的患者获得的自体细胞。在一些实施例中，所述自体免疫细胞包括淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞和/或树突细胞(DC)。在一些实施例中，所述淋巴细胞包括T细胞，任选地细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。参见例如，June《,临床研究杂志》117:1466-1476,2007；以及Rosenberg和Restifo《,科学》348:62-68,2015；Cooley等人《, 血液与骨髓移植生物学(Biol Blood Marrow Transplant.)》13:
33-42,2007；以及Li和Sun《, 临床癌症研究杂志(Clin J Cancer Res.)》30:173-196,2018，了解关于过继性T细胞和NK细胞免疫疗法的描述。在一些实施例中，T细胞包括如本文所述的针对至少一种“癌症抗原”的癌抗原特异性T细胞。在某些实施例中，抗VISTA抗体或其抗原结合片段增强了过继转移的免疫细胞的功效。
33-42,2007；以及Li和Sun《, 临床癌症研究杂志(Clin J Cancer Res.)》30:173-196,2018，了解关于过继性T细胞和NK细胞免疫疗法的描述。在一些实施例中，T细胞包括如本文所述的针对至少一种“癌症抗原”的癌抗原特异性T细胞。在某些实施例中，抗VISTA抗体或其抗原结合片段增强了过继转移的免疫细胞的功效。
[0257] 在某些实施例中，本文公开的抗VISTA抗体可以与任何数目的化学治疗剂结合施用。化学治疗剂的实例包含烷化剂，如噻替派和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸盐，如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷，如苯佐多巴、卡波醌、美妥多巴和脲多巴；亚乙基亚胺和甲基胺类(methylamelamines)，包含六甲蜜胺、曲他胺、替派、三亚乙基硫代磷酰胺和三羟甲密胺(trimethylolomelamine)；氮芥类(nitrogen mustard)，如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺(cholophosphamide)、雌氮芥、依弗酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲洛磷胺、乌拉莫司汀；亚硝脲类，如卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素(cactinomycin)、卡奇霉素、卡拉比星、洋红霉素、嗜癌菌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-二氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、去甲氧基柔红霉素、麻西罗霉素、丝裂霉素类、菌酚酸、诺加霉素、橄榄霉素类、培洛霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢物类，如甲氨蝶呤和5-氟脲嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙；嘌呤类似物，如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、双脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素类，如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯；抗-肾上腺类，如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂，如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；百垂布西；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸(elformithine)；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼； 雷佐生；西佐喃；螺旋锗；细交链孢菌酮酸；三环乙亚胺醌；2,2',2"-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；盖克托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替派；紫杉烷，例如紫杉醇(百时美施贵宝肿瘤学(Bristol-Myers Squibb Oncology)，新泽西州普林斯顿)
和多西紫杉醇( Rhne-Poulenc Rorer，法国安东尼市)；苯丁酸氮芥；吉西他
滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-
16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾；诺维本；诺安托；替尼泊苷；道诺霉素；氨蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物，如TargretinTM(贝沙罗汀)、PanretinTM(阿利维A酸)；
ONTAKTM(地尼白介素)；埃斯波霉素；卡培他滨；以及药学上可接受的盐、酸或以上任一种的衍生物。此定义还包含用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，如抗雌激素，包含例如它莫西芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基三苯氧胺、曲沃昔芬、雷洛西芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；和抗雄激素类，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及药学上可接受的盐、酸或以上任一种的衍生物。
和多西紫杉醇( Rhne-Poulenc Rorer，法国安东尼市)；苯丁酸氮芥；吉西他
滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-
16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾；诺维本；诺安托；替尼泊苷；道诺霉素；氨蝶呤；希罗达(xeloda)；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸衍生物，如TargretinTM(贝沙罗汀)、PanretinTM(阿利维A酸)；
ONTAKTM(地尼白介素)；埃斯波霉素；卡培他滨；以及药学上可接受的盐、酸或以上任一种的衍生物。此定义还包含用于调节或抑制对肿瘤的激素作用的抗激素剂，如抗雌激素，包含例如它莫西芬、雷洛昔芬、芳香酶抑制4(5)-咪唑、4-羟基三苯氧胺、曲沃昔芬、雷洛西芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；和抗雄激素类，如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及药学上可接受的盐、酸或以上任一种的衍生物。
[0258] 多种其它治疗剂可以与本文所述的抗VISTA抗体结合使用。在一个实施例中，所述抗体与抗炎剂一起施用。抗炎剂或药物包含但不限于类固醇和糖皮质激素(包含倍他米松、布地奈德、地塞米松、醋酸氢化可的松、氢化可的松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松龙、泼尼松、曲安奈德)、包含阿司匹林的非甾体类抗炎药(NSAIDS)、布洛芬、萘普生、甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、来氟米特、抗TNF药物、环磷酰胺和霉酚酸酯。
[0259] 示例性NSAID选自由以下组成的组：布洛芬、萘普生、萘普生钠、如 (罗非昔布)和 (塞来昔布)等Cox-2抑制剂以及唾液酸盐。示例性镇痛药选自由以
下组成的组：对乙酰氨基酚、羟考酮、盐酸丙氧芬的曲马多。示例性糖皮质激素选自由以下组成的组：可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松龙或泼尼松。示例性生物应答调节剂包含针对细胞表面标记物(例如，CD4、CD5等)的分子、细胞因子抑制剂如TNF拮抗剂(例如，依那西普( ))、阿达木单抗( )和英夫利昔单抗(
)、趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物应答调节剂包含单克隆抗体以
及重组形式的分子。示例性DMARD包含硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹、金(口服(金诺芬)和肌内)和米诺环素。
下组成的组：对乙酰氨基酚、羟考酮、盐酸丙氧芬的曲马多。示例性糖皮质激素选自由以下组成的组：可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松龙或泼尼松。示例性生物应答调节剂包含针对细胞表面标记物(例如，CD4、CD5等)的分子、细胞因子抑制剂如TNF拮抗剂(例如，依那西普( ))、阿达木单抗( )和英夫利昔单抗(
)、趋化因子抑制剂和粘附分子抑制剂。生物应答调节剂包含单克隆抗体以
及重组形式的分子。示例性DMARD包含硫唑嘌呤、环磷酰胺、环孢菌素、甲氨蝶呤、青霉胺、来氟米特、柳氮磺胺吡啶、羟氯喹、金(口服(金诺芬)和肌内)和米诺环素。
[0260] 在某些实施例中，本文所述的抗体与细胞因子结合施用。如本文所使用的“细胞因子”是指由一种细胞群释放的蛋白质的通用术语，所述细胞群作用于另一个作为细胞间介质的细胞。此类细胞因子的实例为淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包含生长激素，如人类生长激素、N-甲硫氨酰人类生长激素和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺氨酸；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素，如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和黄体生成素(LH)；肝细胞生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子α和肿瘤坏死因子β；副中肾管抑制物质；小鼠促性腺激素关连肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，如NGF-β；血小板生长因子；转化生长因子(TGFs)，如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和胰岛素样生长因子-II；促红细胞产生素(EPO)；骨诱导因子；干扰素，如干扰素-α、干扰素β和干扰素-γ；集落刺激因子(CSF)，如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒细胞-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；以及粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)，如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12；IL-15，一种肿瘤坏死因子，如TNF-α或TNF-β；以及其它包含LIF和试剂盒配体(KL)的多肽因子。如本文所使用的，术语细胞因子包含来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质，以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。
[0261] 包括本文所述VISTA特异性抗体的组合物可以施用于受本文所述疾病影响的个体，所述疾病包含但不限于癌症、自身免疫性疾病、炎性疾病和感染性疾病。所述癌症包含但不限于非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞性白血病、毛细胞白血病、急性淋巴细胞白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、肠胃癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌以及恶性黑素瘤。
[0262] 所述自身免疫性疾病包含但不限于关节炎(包含类风湿关节炎、反应性关节炎)、系统性红斑狼疮(SLE)、银屑病和炎性肠病(IBD)、脑脊髓炎、葡萄膜炎、重症肌无力、多发性硬化、胰岛素依赖型糖尿病、阿狄森氏病(Addison's disease)、乳糜泻、慢性疲劳综合征、自身免疫性肝炎、自身免疫性脱发、强直性脊柱炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、纤维肌痛、寻常型天疱疮、舍格伦综合征、川崎病、甲亢/格雷夫斯氏病、甲减/桥本氏病、子宫内膜异位症、硬皮病、恶性贫血、古德帕斯彻综合征(Goodpasture syndrome)、格林-巴利综合征、韦格纳病、肾小球肾炎、再生障碍性贫血(包含多次输血再生障碍性贫血患者)、阵发性夜间血红蛋白尿、骨髓增生异常综合征、特发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、Evan综合征、因子VIII抑制物综合征、系统性血管炎、皮肌炎、多发性肌炎和风湿热、自身免疫性淋巴增生综合征(ALPS)、自身免疫性大疱性类天疱疮、帕金森病、结节病、白癜风、原发性胆汁性肝硬化和自身免疫性心肌炎。
[0263] 所述炎性疾病包含但不限于克罗恩病、结肠炎、皮炎、银屑病、憩室炎、肝炎、肠易激综合征(IBS)、红斑狼疮、肾炎、帕金森病、溃疡性结肠炎、多发性硬化(MS)、阿尔茨海默病、关节炎、类风湿性关节炎、哮喘以及各种心血管疾病，如动脉粥样硬化和血管炎。在某些实施例中，所述炎性疾病选自由以下组成的组：类风湿性关节炎、糖尿病、痛风、与低温相关的周期性综合征和慢性阻塞性肺病。
[0264] 在这方面，一个实施例提供了一种通过向有需要的患者施用治疗有效量的本文公开的包括激动性抗VISTA抗体的组合物来治疗炎症或炎性疾病、减轻炎症或炎性疾病的严重程度或预防炎症或炎性疾病的方法。一个实施例提供了一种通过向有需要的移植患者施用治疗有效量的本文公开的包括激动性抗VISTA抗体的组合物来治疗移植物抗宿主疾病、减轻移植物抗宿主疾病的严重程度或预防移植物抗宿主疾病的方法。一个实施例提供了一种通过向有需要的移植患者施用治疗有效量的本文公开的包括激动性抗VISTA抗体的组合物来治疗移植排斥、减轻移植排斥的严重程度或预防移植排斥的方法。
[0265] 某些实施例提供了一种通过向有需要的患者施用治疗有效量的本文公开的包括激动性抗VISTA抗体的组合物来治疗感染性疾病、减轻感染性疾病的严重程度或预防感染性疾病的方法。感染性疾病包含但不限于病毒、细菌、(任选地，酵母菌)和原生动物感染。
[0266] 对于针对治疗人类疾病的体内用途，本文所述的抗体通常在施用前掺入到药物组合物中。药物组合物包括本文所述的抗体中的一种或多种抗体与本文其它地方所述的生理学上可接受的载剂或赋形剂的组合。为了制备药物组合物，将有效量的化合物中的一种或多种化合物与本领域技术人员已知的一种或多种任何药物载剂或赋形剂混合，以适合于特定施用方式。药物载剂可以是液体、半液体或固体。用于肠胃外、皮内、皮下或局部应用的溶液或悬浮液可以包含例如无菌稀释剂(如水)、盐水溶液、不挥发性油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；抗菌剂(如苯甲醇和对羟基苯甲酸甲酯)；抗氧化剂(如抗坏血酸和亚硫酸氢钠)和螯合剂(如乙二胺四乙酸(EDTA))；缓冲剂(如乙酸盐、柠檬酸盐和磷酸盐)。如果静脉内施用，则合适的载剂包含生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)以及含有增稠剂和增溶剂(如葡萄糖、聚乙二醇、聚丙二醇以及其混合物)的溶液。
[0267] 本文所述的包括VISTA特异性抗体的组合物可以用保护抗体不会从身体中快速消除(如定时释放调配物或包衣)的载剂制备。此类载体包含控释制剂，如但不限于植入物和微囊化递送系统以及可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、聚原酸酯、聚乳酸以及本领域普通技术人员已知的其它物质。
[0268] 本文提供了使用结合VISTA的抗体的治疗方法。在一个实施例中，向患有涉及VISTA的不适当表达的疾病的患者施用本公开的抗体，其在本公开的上下文中意指包含例如由于存在的蛋白质的量的改变(例如，统计学上显著的增加或减少)或突变蛋白的存在或两者以异常VISTA表达或活性为特征的疾病和病症。过量可能归因于任何原因，包含但不限于以分子水平过表达、作用部位处的长期或累积外观或VISTA的活性相对于正常可检测到的活性的增加(例如，以统计学上显著的方式)。可以相对于VISTA信号传导事件的正常表达、出现或活性测量VISTA的此类过量，并且所述测量可以在本文所述的抗体的研发和/或临床测试中发挥重要作用。
[0269] 具体地，本公开的抗体可用于治疗与VISTA表达相关的各种癌症。例如，一个实施例提供了一种用于通过向癌症患者施用治疗有效量的本文公开的VISTA特异性抗体来治疗癌症的方法，所述癌症包含但不限于非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌和恶性黑素瘤。施用后以统计学上显著的方式(即相对于本领域技术人员将理解的适当对照物)抑制、预防或延迟癌症的进展和/或癌症转移的量被认为是有效的。
[0270] 另一个实施例提供了一种用于通过向癌症患者施用治疗有效量(例如，施用后以统计学上显著的方式抑制、预防或延迟癌症转移的量，即相对于本领域技术人员将理解的适当对照物)的本文公开的VISTA特异性抗体来预防癌症转移的方法，所述癌症包含但不限于非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌和恶性黑素瘤。
[0271] 另一个实施例提供了一种用于通过向癌症患者施用治疗有效量的本文公开的VISTA特异性抗体来预防癌症的方法，所述癌症包含但不限于非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌和恶性黑素瘤。
[0272] 另一个实施例提供了一种用于通过向患有非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病、急性淋巴母细胞白血病、多发性骨髓瘤、胰腺癌、结肠癌、胃肠癌、前列腺癌、膀胱癌、肾癌、卵巢癌、子宫颈癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌和恶性黑素瘤中的一种或多种的患者施用治疗有效量的本文公开的VISTA特异性抗体来治疗这些疾病、抑制这些疾病的进展或预防这些疾病的方法。
[0273] 在另一个实施例中，抗VISTA抗体用于确定结合抗原的结构，例如构象表位，所述结构然后可以用于开发具有或模拟这个结构的化合物，例如通过化学建模和SAR方法。
[0274] 各种其它实施例部分地涉及用于检测表达VISTA的细胞或组织的存在的诊断应用。因此，本公开提供了在样品中检测VISTA的方法，如对表达VISTA的细胞或组织的检测。
此类方法可以应用于多种已知的检测形式，包含但不限于免疫组织化学(IHC)、免疫细胞化学(ICC)、原位杂交(ISH)、全套原位杂交(WISH)、荧光DNA原位杂交(FISH)、流式细胞术、酶免疫测定(EIA)和酶联免疫测定(ELISA)。
此类方法可以应用于多种已知的检测形式，包含但不限于免疫组织化学(IHC)、免疫细胞化学(ICC)、原位杂交(ISH)、全套原位杂交(WISH)、荧光DNA原位杂交(FISH)、流式细胞术、酶免疫测定(EIA)和酶联免疫测定(ELISA)。
[0275] ISH是一种类型的杂交，其使用标记的互补DNA或RNA链(即一级结合剂)将特定DNA或RNA序列定位在细胞或组织的一部分或切片中(原位)，或者如果组织足够小，则定位在整个组织中(整装ISH)。本领域的普通技术人员将会理解，这与免疫组织化学不同，所述免疫组织化学使用抗体作为一级结合剂将蛋白质定位在组织切片中。DNA ISH可以用在基因组DNA上，以测定染色体的结构。荧光DNA ISH(FISH)可以用于例如医学诊断，以评估染色体完整性。RNA ISH(杂交组织化学)用于测量和定位组织切片或组织整体内的mRNA和其它转录体。
[0276] 在各个实施例中，本文所述的抗体与可以直接检测或间接检测的可检测标记缀合。在这方面，抗体“缀合”是指与可检测标记共价连接的抗VISTA抗体。在本公开中，DNA探针、RNA探针、单克隆抗体、其抗原结合片段以及其抗体衍生物(如单链可变片段抗体或表位标记抗体)均可以共价连接到可检测标记。在“直接检测”中，仅使用一种可检测抗体，即一级可检测抗体。因此，直接检测意指与可检测标记缀合的抗体本身可以被检测，而无需添加第二抗体(二级抗体)。
[0277] “可检测标记”是可以产生指示样品中的标记的存在和/或浓度的(如视觉上、以电子方式或以其它方式)可检测信号的分子或材料。当与抗体缀合时，可检测标记可以用于定位和/或定量特异性抗体所针对的靶标。因此，可以通过检测由可检测标记产生的信号来检测样品中靶标的存在和/或浓度。可以直接或间接检测可检测标记，并且可以组合使用与不同特异性抗体缀合的若干种不同的可检测标记，以检测一种或多种靶标。
[0278] 可以直接检测的可检测标记的实例包含荧光染料、放射性物质和金属颗粒。相比之下，间接检测需要在施加一级抗体之后施加一种或多种另外的抗体，即二级抗体。因此，通过检测二级抗体或结合剂与一级可检测抗体的结合来进行检测。需要添加二级结合剂或二级抗体的一级可检测结合剂或一级抗体的实例包含酶可检测结合剂和半抗原可检测结合剂或抗体。
[0279] 在一些实施例中，可检测标记与包括第一粘合剂的核酸聚合物缀合(例如，在ISH过程、WISH过程或FISH过程中)。在其它实施例中，可检测标记与包括第一粘合剂的抗体缀合(例如，在IHC过程中)。
[0281] 荧光标记的实例包含5-(和6)-羧基荧光素、5-或6-羧基荧光素、6-(荧光素)-5-(和6)-羧基氨基己酸、异硫氰酸荧光素、罗丹明、四甲基罗丹明以及如Cy2、Cy3和Cy5等染料、包含AMCA的任选取代的香豆素、PerCP、包含R藻红蛋白(RPE)和异藻红蛋白(APC)的藻胆蛋白类、得克萨斯红、普林斯顿红、绿色荧光蛋白(GFP)以及其类似物、以及R藻红蛋白或异藻红蛋白的缀合物、无机荧光标记如基于半导体材料的颗粒，如包覆的CdSe纳米晶。
[0282] 聚合物颗粒标记的实例包含可以嵌入荧光染料或含有染料、酶或底物的聚合物胶束或胶囊的聚苯乙烯、PMMA或二氧化硅的微颗粒或乳胶颗粒。
[0283] 金属颗粒标记的实例包含可以通过银染色剂转换的金颗粒和包覆的金颗粒。半抗原的实例包含DNP、异硫氰酸荧光素(FITC)、生物素和地高辛。酶标记的实例包含辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(ALP或AP)、β-半乳糖苷酶(GAL)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖酰亚胺酶、β-葡萄糖醛酸酶、转化酶、黄嘌呤氧化酶、萤火虫荧光素酶和葡萄糖氧化酶(GO)。常用的辣根过氧化物酶底物包含3,3'-二氨基联苯胺(DAB)、增镍二氨基联苯胺、3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)、联苯胺二盐酸盐(BDHC)、汉克-耶特试剂(HYR)、吲哚酚蓝(IB)、四甲基联苯胺(TMB)、4-氯-1-萘酚(CN)、α-萘酚吡罗宁(α-NP)、邻二苯胺(OD)、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸酯(BCIP)、硝基蓝四唑(NBT)、2-(对碘苯基)-3-对硝基苯基-1-5-苯基四唑氯化物(INT)、四硝基蓝四唑(TNBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-β-D-半乳糖苷/铁-三氰化铁(BCIG/FF)。
[0284] 常用的碱性磷酸酶底物的实例包含萘酚-AS-B1-磷酸盐/快红TR(NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸盐/快红TR(NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸盐/-快红TR(NABP/FR)、萘酚-AS-MX-磷酸盐/快红TR(NAMP/FR)、萘酚-AS-B1-磷酸/新品红(NABP/NF)、溴氯吲哚基磷酸/硝基蓝四唑(BCIP/NBT)、5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-d-半乳糖苷(BCIG)。
[0285] 发光标记的实例包含鲁米诺、异烟醇、吖啶酯、1,2-二噁烷和吡啶并哒嗪。电化学发光标记的实例包含钌衍生物。放射性标记的实例包含碘、钴、硒、氚、碳、硫和磷的放射性同位素。
[0286] 可检测标记可以与本文所述的抗体或与特异性结合所关注生物标志物(例如，抗体、核酸探针或聚合物)的任何其它分子连接。此外，本领域的普通技术人员应当理解，可检测标记也可以与第二结合剂或抗体、和/或第三结合剂或抗体、和/或第四结合剂或抗体和/或第五结合剂或抗体等缀合。此外，技术人员将理解，用于表征所关注生物标志物的每一种另外的结合剂或抗体可以用作信号放大步骤。可以使用例如光显微镜、荧光显微镜、电子显微镜在视觉上检测生物标志物，其中可检测物质是例如染料、胶体金颗粒、发光试剂。还可以使用分光光度计检测结合生物标志物的视觉上可检测的物质。可以通过放射自显影术在视觉上或使用闪烁计数器在非视觉上对可探测物质进行放射性同位素探测。参见例如，Larsson,1988,《免疫细胞化学：理论和实践(Immunocytochemistry:Theory and Practice)》,(佛罗里达州波卡拉顿市CRC出版社(CRC Press))；《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,第80卷,1998,John D.Pound(编辑)(新泽西州托托瓦胡玛纳出版社(Humana Press))。
[0287] 本公开还提供了用于检测样品中的VISTA或表达VISTA的细胞或组织的试剂盒，其中所述试剂盒含有如本文所述的至少一种抗体、多肽、多核苷酸、载体或宿主细胞。在某些实施例中，试剂盒可以包括缓冲剂、酶、标记、底物、珠或附着本公开的抗体的其它表面等，以及使用说明。
[0288] 实例
[0289] 实例1
[0290] 抗VISTA抗体的产生与人源化
[0291] 用重组人VISTA和VISTA表达性细胞免疫新西兰白兔。所有兔均具有特异性结合人VISTA的高血清滴度，并且为进行细胞融合而将其处死。如通过ELISA结合测定所测量的，选择对结合VISTA呈阳性的二十六例杂交瘤细胞进行功能筛选。图1中比对了26个克隆的VH区和VL区的氨基酸序列。所述抗体中的一些抗体具有与相同的VL区配对的不同的VH区，如下表4所示。
[0292]
[0293]
[0294] 选择所述克隆中的六个克隆(2D12、3A5、14D8、14F1、29G7和41A11)进行用于功能表征的分子克隆和重组表达。
[0295] 重组抗VISTA抗体的功能筛选
[0296] 使用多种测定来表征上述指明的所选抗VISTA抗体的效力。所选抗体由兔mAb转换为具有兔Fab和人IgG1的嵌合mAb。选择抗VISTA人IgG1抗体(VSTB112)作为基准进行比较研究。WO 2015/097536和WO 2016/207717中描述了VSTB112。
[0297] 使用VSTB112进行竞争ELISA测定。用VISTA-his蛋白质涂覆96孔板。用蛋白质温育人IgG1嵌合抗VISTA抗体1小时。将生物素标记的VSTB112添加到孔中，并将其温育另外一小时。对孔进行洗涤，并使用链霉亲和素-HRP检测VSTB112的结合，如图2所示。这些结果示出，与VSTB112相比，S2D12结合VISTA上明显不同的表位，并且与VSTB112相比，29G7也示出不同的结合表位。
[0298] 测试了嵌合VISTA单克隆抗体上调单核细胞上主要组织相容性复合物(MHC)II类分子的能力。通过Ficoll密度离心从血沉棕黄层中分离出人PBMC。使用CD14微珠从人PBMC中富集单核细胞，并以每孔100,000个细胞将所述单核细胞铺板于圆底96孔板中。以0.02、0.2、2和20nM浓度添加抗VISTA抗体，并将板在37℃下温育48小时。采集细胞，并通过流式细胞术(图3)对pan-MHCII(DP、DQ、DR)的表达进行分析。如图3所示，与VSTB112相比，所有6个嵌合VISTA抗体诱导MHCII的更大表达。
[0299] 使用专有的突变谱系指导(MLG)人源化技术(参见例如美国专利第7,462,697号)人源化所述6个克隆(2D12、3A5、14D8、14F1、29G7和41A11)。所述人源化从29G7克隆中提供了两种候选物，即29G7-HZD2和29G7-HZD4。SEQ ID NO:86-99中示出了7组人源化VH区和VL区的氨基酸序列。人源化序列总结于上表3。
[0300] 人源化候选物抗VISTA抗体的功能筛选
[0301] 使用多种体外测定来表征上述指明的7种人源化候选物抗VISTA抗体的效力。首先，测试人源化抗VISTA抗体与可溶性VISTA的结合，如图4所示。
[0302] 为了检查7种人源化抗VISTA抗体与细胞表面表达的VISTA结合的能力，使用Fugene 6转染试剂用人VISTA cDNA转染HEK293细胞24小时。通过胰蛋白酶化采集细胞，将细胞重悬浮于FACS缓冲液中并将细胞铺板于96孔板中。将细胞与图5中所指示的浓度的抗VISTA抗体在冰上一起温育30分钟。使用抗人Ig抗体检测抗体，并在MACSQuant流式细胞仪上评估结合(图5)。下表5提供了7种人源化抗VISTA抗体的结合亲和力。
[0303]
[0304] 在葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激测定中测试人源化抗VISTA抗体增强免疫应答的能力。使用Ficoll密度离心从血沉棕黄层中分离出人PBMC。以每孔200,000个细胞将PBMC铺板于96孔平底板。以图6所指示的浓度添加VISTA抗体。最后，添加10ng/mL的SEB，并将板在37℃下温育4天。温育后，采集上清液，并通过ELISA针对IFN-γ分析上清液(图6)。如图6所示，29G7-HZD4、29G7-HZD2、2D12-HZD3、3A5-HZD和41A11-HZD2的添加导致IFNγ的产生增加，这表明这些人源化抗VISTA抗体是VISTA拮抗剂。
[0305] 然后，测试人源化抗VISTA抗体对混合淋巴细胞反应(MLR)的增强。简而言之，使用CD14微珠从PBMC中分离出人单核细胞，并将人单核细胞在含有50ng/mL的人GM-CSF和100ng/mL的人IL-4的完全培养基中分化为树突细胞，持续7天。使用CD4微珠从人PBMC中富集CD4 T细胞，并用细胞微量紫罗兰(Cell Trace Violet)标记所述CD4 T细胞。以每孔50,
000个细胞将单核细胞衍生的树突细胞(moDC)接种于平底96孔板中。以图7所指示的浓度添加抗体。最后，以200,000每孔添加富集和紫罗兰标记的HLA不匹配CD4 T细胞，并在37℃下将其在200μL的培养基中共培养5天。
000个细胞将单核细胞衍生的树突细胞(moDC)接种于平底96孔板中。以图7所指示的浓度添加抗体。最后，以200,000每孔添加富集和紫罗兰标记的HLA不匹配CD4 T细胞，并在37℃下将其在200μL的培养基中共培养5天。
[0306] 采集并分析细胞以确定增殖百分比(图7)。如图7所示，响应于同种抗原，29G7-HZD2、29G7-HZD4、2D12、14D8-HZD2和41A11-HZD2的添加增加T细胞增殖，这表明这些抗VISTA抗体可以逆转VISTA介导的免疫抑制。
[0307] 实例2
[0308] 抗VISTA抗体的生物活性
[0309] 测试了人嵌合VISTA单克隆抗体活化人NK细胞的能力。通过Ficoll密度离心从血沉棕黄层中分离出人PBMC，并以每孔200,000个细胞将其铺板于圆底96孔板中。以指示浓度添加抗VISTA抗体，并将板在37℃下温育24小时。通过ELISA分析IFN-γ产生的上清液。采集细胞，并通过流式细胞术针对在CD56+NK细胞上的CD69和CD25表达分析细胞。
[0310] 如图8A-8C所示，抗VISTA抗体诱导NK细胞活化和IFN-γ分泌。
[0311] 还测试了人源化抗VISTA抗体在全血测定中诱导细胞因子释放的能力。以每孔200μL将人全血铺板于96孔圆底板上。添加100nM、10nM、1nM和0.1nM的VISTA抗体。将板在37℃下温育24小时。温育后，将板以2000RPM离心5分钟，并使用Luminex收集针对细胞因子和趋化因子分析的血浆。
[0312] 下表6示出了来自6个供体的代表性数据。DC＝树突细胞；MM＝单核细胞/巨噬细胞；L＝淋巴细胞)。
[0313]
[0314] 如图9A-9I所示，抗VISTA抗体可以诱导来自全血培养物中的细胞的细胞因子分泌。由抗VISTA抗体诱导的细胞因子包含IFN-γ、IL-6、IL-1ra、IL-1a、IL-8、MIP-1a、MIP-1b IP-10、TNF-α和MCP-1，其中大部分由髓系衍生的细胞类型所分泌。
[0315] 上述不同的实施例可以组合提供另外的实施例。本说明书中提及的和/或申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、国外专利、国外专利申请和非专利出版物以全文引用的方式并入本文中。如果有必要，则可以对实施例的各方面进行修改以采用各个专利、申请和出版物的概念来提供又另外的实施例。
[0316] 鉴于以上详细描述，可以对实施例进行这些以及其它改变。总之，在以下权利要求中，所用的术语不应解释为将权利要求限于本说明书和权利要求书中所公开的具体实施例，而应解释为包含所有可能的实施例连同这种权利要求有权获得的等效物的整个范围。因此，权利要求不受本公开的限制。
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