一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法
阅读：403发布：2020-05-13
专利汇可以提供一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法，包括以下步骤：S1：菌株培养，将菌株取出并培养复苏；S2：多肽合成，合成MAF-1A并将肽溶解保存；S3：MIC测定及时间-杀菌曲线绘制；S4：提取RNA，将近平滑念珠菌接种到培养基中，培养后加入MIC下的MAF-1A处理6小时和18小时，提取总RNA，测定RNA样品的浓度和 质量 ，构建文库，并对文库有效浓度进行准确定量，测序；S5：数据分析，分别通过差异表达分析、差异基因富集分析、差异基因蛋白网络互作分析以及差异表达基因的验证，得到近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性。本发明测定方法可以有效的测定MAF-1A在抗 真菌 作用机制，对于抗近平滑念珠菌感染药物具有重要的意义。，下面是一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法专利的具体信息内容。
1.一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：菌株培养，将保存-80℃条件下的菌株取出并在35℃下在平板上划线培养24h复苏；
S2：多肽合成，合成MAF-1A并使用灭菌超纯水将肽溶解至5mg/mL并于-20℃保存；
S3：MIC测定及时间-杀菌曲线绘制，测定MIC值；将近平滑念珠菌菌液与MAF-1A混匀，35℃恒温培养，分别取培养后第0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h的菌液稀释100倍后10ul菌液划线涂布于平板上，35℃培养24h后计数菌落；另设无菌超纯水为阴性对照组，每组重复实验3次，绘制时间-杀菌曲线；
S4：提取RNA，将近平滑念珠菌接种到培养基中，35℃下培养24小时后，加入MIC下的MAF-1A处理6小时和18小时，加入等量无菌超纯水处理的近平滑念珠菌做为对照组；提取总RNA，测定RNA样品的浓度和质量，构建文库，并对文库有效浓度进行准确定量，测序；
S5：数据分析，分别通过差异表达分析、差异基因富集分析、差异基因蛋白网络互作分析以及差异表达基因的验证，得到近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性。
2.根据权利要求1所述的一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法，其特征在于，所述步骤S2中，合成的MAF-1A是由26个氨基酸序列组成的线性肽：
KKFKETADKLIESAKQQLESLAKEMK；并使用分析型高效液相色谱(HPLC)鉴定MAF-1A的纯度大于
95％，并进行ESI质谱检测，保证多肽序列正确。
3.根据权利要求1所述的一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法，其特征在于，所述平板选用Sabouraud dextrose agar(SDA)平板；所述培养基选用Sabouraud Dextrose Broth(SDB)培养基。
4.根据权利要求1所述的一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法，其特征在于，所述MIC测定具体为：挑取培养24h近平滑念珠菌菌落并重悬于培养基，浓度调至0.5×103～2.5×103CFU/mL；将MAF-1A梯度稀释(0.2mg/mL至2.4mg/mL)后各浓度取100ul加入
96孔聚丙烯微孔板中，然后向每孔中加入100ul菌悬液，MAF-1A的终浓度为0.1mg/mL～
1.2mg/mL；35℃培养24小时后，酶标仪检测A490值，确定MIC值；
所述MIC的计算公式如下：真菌生长百分率＝(各孔A值-空白对照孔A值)/(生长对照孔A值-空白对照孔A值)×100％；真菌生长抑制百分数＝(1-真菌生长百分数)×100％，取真菌生长抑制百分数在80％以上的最低药物浓度为MIC值。
5.根据权利要求1所述的一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法，其特征在于，所述步骤S5中，使用RNAiso Plus提取总RNA；使用NanoDrop 2000和Agilent 2100 bioanalyzer测定RNA样品的浓度和质量；使用 UltraTM RNA Library Prep Kit
构建文库，使用Agilent 2100 bioanalyzer对纯化文库进行定量，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量。使用Illumina Novoseq测序；其中，建库和测序工作由Novogene Corporation完成。
6.根据权利要求1所述的一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法，其特征在于，所述步骤S4中的培养基选用SDB培养基。
7.根据权利要求1所述的一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法，其特征在于，所述步骤S1的菌株培养为：
(1)将保存-80℃条件下的近平滑念珠菌菌株取出，然后将复苏液预热至20-23℃，将菌株注入复苏液中并混合，以2-3℃/s升温至35～37℃，温育1～2min后得到菌液；
(2)用所得菌液在SDA平板上划线，将其在35℃下静置培养10～14h后，挑取SDA平板上的菌落在斜面微磁培养基上划线，随后将其在35℃下并在垂直于斜面微磁培养基表面10～
15cm处施加4～6T的间歇磁场，培养7～12h后菌落长出；其中，所述间歇磁场的作用时间为8～13min，间歇磁场的间歇时间为25～30min；
(3)用无菌生理盐水将菌落进行洗脱，然后转移到SDB培养基中，培养得到近平滑念珠菌菌液。
8.根据权利要求7所述的一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法，其特征在于，所述斜面微磁培养基配制方法为：将10g蛋白胨、20g琼脂、40g葡萄糖、1.5g吗啉乙磺酸、0.2g无水乙酸钠，加煮沸无菌生理盐水溶解定容至1L得到培养基液，杀菌处理后在无菌坏境下，将培养基液按照体积分数15～25％、25～35％、40～60％分为3份培养基液，分别记作培养基液A、培养基液B和培养基液C，将培养基液A装于烧杯中，等待培养基液A即将凝固时，将烧杯倾斜成与水平面成40°的斜面，待其表面凝固后，将钕铁硼磁粉均匀涂撒在其表面，然后喷涂10～20％的培养基液B凝固后将其余培养基液B倾倒与烧杯内，待其表面凝固后，再将铁钴镍磁粉均匀涂撒在其表面，然后喷涂5～10％的培养基液C凝固后将其余培养基液C倾倒与烧杯内，自然凝固到室温即可得到斜面微磁培养基；其中钕铁硼磁粉涂撒厚度
2±0.5mm，铁钴镍磁粉涂撒厚度为1±0.2mm。
9.根据权利要求7所述的一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法，其特征在于，所述复苏液按重量份数计由1～2份胎牛血清、2～4份无菌生理盐水，其中还含有
0.2mol/L谷氨酰胺、1.5mol/L蔗糖和0.7mol/L七水硫酸镁，将胎牛血清和无菌生理盐水混合后，依次加入谷氨酰胺、蔗糖和七水硫酸镁搅拌混匀，即可得到复苏液。
10.根据权利要求1所述的一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法，其特征在于，所述测定方法用于MAF-1A抗近平滑念珠菌的抗菌机制和耐药机制的研究。
一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法
技术领域
背景技术
[0002] 免疫功能不全的病人是医院获得性真菌感染的高危人群。念珠菌在医院真菌感染中最为常见。白色念珠菌虽然是院内念珠菌感染最为常见的病原体，但在近年来，随着非白色念珠菌感染的增加，其主导地位逐渐下降(Vieira de Melo et al.,2019)。近20年来，在全球多个地区的真菌感染流行病学研究中发现，非白色念珠菌的综合感染率超过了白色念珠菌(Sular et al.,2018)。这提醒我们，有必要对非白色念珠菌进行研究，以便掌握有效的治疗方案，预防感染的爆发流行。在非白色念珠菌感染中，近平滑念珠菌尤为值得我们关注，因为它能够在中心静脉导管及其他医疗植入物上形成坚韧致密的生物膜威胁患者生命健康(Fais et al.,2017；Vieira de Melo et al.,2019)。同时，近平滑念珠菌也极易感染在场外营养的ICU病人、营养不良的儿童及低体重的新生儿。全世界多个地区的流行病学研究显示，近平滑念珠菌已经成为第二或第三最常见患者分离念珠菌(Toth et al.,2019)。近平滑念珠菌不仅感染率较高，其毒性、免疫调节及耐药性等生物学特性与白色念珠菌大有不同(Toth et al.,2019)。如近平滑念珠菌以水平传播的方式感染机体，而白色念珠菌则依赖于定值菌的垂直传播(Lupetti et al.,2002)。这些种间特异性可能影响宿主的识别和清除以及抗真菌药物的疗效。因此，我们有必要对近平滑念珠菌进行研究。
[0003] 常见念珠菌感染病原体均在不同程度上产生了耐药性(Robbins et al.,2017)。这严重威胁着人类的健康。抗真菌耐药问题亟需解决，新型抗真菌药物的研发至关重要。抗菌肽(AMPs)是生物体固有免疫的重要组成部分(Zasloff,2002；Patocka et al.,2018)。在对抗病原体入侵机体的过程中发挥极为重要的作用(Moravej et al.,2018)。其分子量小(20-100个氨基酸)，多数表现出较强的阳离子性及两亲性。抗菌肽来源广泛，且肽段长度、序列或结构各异。其作用模式特殊不易产生耐药性因此，有望成为新型抗真菌药物研发的候选药物(Nuti et al.,2017；Ghosh et al.,2019)。家蝇抗真菌肽-1(MAF-1)是从家蝇幼虫血淋巴中分离得到的一种新型阳离子AMP，具有良好的抗菌作用。在之前的研究中，我们克隆了全长的MAF-1基因，并利用生物信息学分析探索其结构域及其潜在的生理功能。
KKFKETADKLIESAKQQLESLAKEMK是从MAF-1的结构域中提取的，含有26个氨基酸残基。MAF-1A具有显著的抗真菌作用，但MAF-1A具体的抗真菌作用机制尚不清楚。
KKFKETADKLIESAKQQLESLAKEMK是从MAF-1的结构域中提取的，含有26个氨基酸残基。MAF-1A具有显著的抗真菌作用，但MAF-1A具体的抗真菌作用机制尚不清楚。
[0004] 抗菌肽多呈两亲性，其阳离子结构域易与带负电荷的细胞表面发生静电作用，而疏水结构域与细菌膜的脂质相互作用，使细胞膜解体，最终导致细胞死亡(Kobbi et al.,2018)。膜损伤机制是抗菌肽作用机制的重要途径。随着研究的推进，研究还发现，除了膜损伤外，抗菌肽在细胞内也存在特异性靶点。例如抑制DNA，RNA，蛋白质和细胞壁合成(Guilhelmelli et al.,2013；Li et al.,2016)。近年来，随着基因组测序技术的发展，极大的促进了药物抗菌机制及耐药机制的研究，例如，Duan等(Duan et al.,2018)通过转录组高通量测序对传统中药桃红四物汤(THSWD)改善神经功能障碍的分子机制进行研究发现，THSWD可能通过神经活性配体-受体相互作用发挥改善神经功能障碍。Iracane(Iracane et al.,2018)等通过RNA-seq技术找到了近平滑念珠菌中参与内质网应激反应的关键基因HAC1(CPAR2_103720)。
[0005] 近年来，近平滑念珠菌已上升为第二或第三常见的感染念珠菌。其除了较高的感染率外，生物学特性与白色念珠菌也有显著的不同(Holland et al.,2014)。近平滑念珠菌对常用的抗真菌治疗药物产生了不同程度的耐药性，如棘白菌素类，唑类和两性霉素B等(Lotfali et al.,2016；Maria et al.,2018；Thomaz et al.,2018)。因此，研究抗近平滑念珠菌感染药物具有重要意义，现关于抗近平滑念珠菌感染的新型药物的相关资料较少。抗菌肽由于具有多方面良好的抗菌特性，长期以来被认为有望开发为新型抗菌药物(Ghosh et al.,2019)。研究认为抗菌肽主要通过破坏细胞膜，使胞内容物外泄导致细胞溶解和死亡(Shai,1999；Papo and Shai,2003；Paterson et al.,2017；Utesch et al.,2018)。但随着对抗菌肽作用机制研究的进行，研究者们发现，与膜的相互作用仅是抗菌肽复杂作用机制的一部分而非全部。抗菌肽在胞内也存在作用靶点。Park等在研究一种来自亚洲蟾蜍的组蛋白衍生的抗菌肽buforin II提出：buforin II可不破坏细胞膜进入胞内，通过与DNA、RNA结合干扰其功能发挥抗菌效果(Park et al.,1998)。Lee等人研究发现，抗真菌β-peptides通过打孔进入胞内并紊乱细胞核及液泡功能从而使细胞死亡(Lee et al.,
2019)。Chileveru等的研究表明人α-防御素5进入到大肠杆菌的细胞质中并干扰细胞分裂过程发挥抗菌作用(Chileveru et al.,2015)。现认为抗菌肽可能具有多种作用模式，但其确切的作用机制还未有定论。
2019)。Chileveru等的研究表明人α-防御素5进入到大肠杆菌的细胞质中并干扰细胞分裂过程发挥抗菌作用(Chileveru et al.,2015)。现认为抗菌肽可能具有多种作用模式，但其确切的作用机制还未有定论。
[0006] 因此，为制备抗近平滑念珠菌的MAF-1A抗菌药物，以及药物抗菌机制和耐药机制的研究，现需要提供一种用于测定近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法来解决这一问题。
发明内容
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法。
[0008] 本发明的技术方案是:一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法，包括以下步骤：
[0009] S1：菌株培养，将保存-80℃条件下的菌株取出并在35℃下在平板上划线培养24h复苏；
[0010] S2：多肽合成，合成MAF-1A并使用灭菌超纯水将肽溶解至5mg/mL并于-20℃保存；
[0011] S3：MIC测定及时间-杀菌曲线绘制，测定MIC值；将近平滑念珠菌菌液与MAF-1A(反应终浓度为MIC值)混匀，35℃恒温培养，分别取培养后第0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h的菌液稀释100倍后10ul菌液划线涂布于平板上，35℃培养24h后计数菌落；另设无菌超纯水为阴性对照组，每组重复实验3次，绘制时间-杀菌曲线；
[0012] S4：提取RNA，将近平滑念珠菌接种到培养基中，35℃下培养24小时后，加入MIC下的MAF-1A处理6小时(CPAS)和18小时(CPBS)，加入等量无菌超纯水处理的近平滑念珠菌做为对照组(6h：CPAC，18h：CPBC)；提取总RNA，测定RNA样品的浓度和质量，构建文库，并对文库有效浓度进行准确定量，测序；
[0013] S5：数据分析，分别通过差异表达分析、差异基因富集分析、差异基因蛋白网络互作分析以及差异表达基因的验证，得到近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性。
[0014] 进一步地，所述步骤S2中，合成的MAF-1A是由26个氨基酸序列组成的线性肽：KKFKETADKLIESAKQQLESLAKEMK；并使用分析型高效液相色谱(HPLC)鉴定MAF-1A的纯度大于
95％，并进行ESI质谱检测，保证多肽序列正确。
95％，并进行ESI质谱检测，保证多肽序列正确。
[0015] 进一步地，所述平板选用Sabouraud dextrose agar(SDA)平板；所述培养基选用Sabouraud Dextrose Broth(SDB)培养基。
[0016] 进一步地，所述MIC测定具体为：挑取培养24h近平滑念珠菌菌落并重悬于培养基，浓度调至0.5×103～2.5×103CFU/mL；将MAF-1A梯度稀释(0.2mg/mL至2.4mg/mL)后各浓度取100ul加入96孔聚丙烯微孔板中，然后向每孔中加入100ul菌悬液，MAF-1A的终浓度为0.1mg/mL～1.2mg/mL；35℃培养24小时后，酶标仪检测A490值，确定MIC值；
[0017] 所述MIC的计算公式如下：真菌生长百分率＝(各孔A值-空白对照孔A值)/(生长对照孔A值-空白对照孔A值)×100％；真菌生长抑制百分数＝(1-真菌生长百分数)×100％，取真菌生长抑制百分数在80％以上的最低药物浓度为MIC值。
[0018] 进一步地，所述步骤S5中，使用RNAiso Plus提取总RNA；使用NanoDrop 2000和Agilent 2100 bioanalyzer测定RNA样品的浓度和质量；使用 UltraTM RNA Library Prep Kit构建文库，使用Agilent 2100bioanalyzer对纯化文库进行定量，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量。使用Illumina Novoseq测序；其中，建库和测序工作由Novogene Corporation完成。
[0019] 进一步地，所述差异表达分析具体为，将原始序列数据过滤后得到高质量的clean reads进行后续分析，利用HISAT2 v2.0.5将clean reads比对到近平滑念珠菌参考基因组。以FPKM(expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced)估算基因表达水平。使用DESeq2 R软件(1.16.1)进行两个比较组合之间的差异表达分析。使用Benjamini等的方法调整P值(padj)。并以|log2(FoldChange)|>0&padj<0.05为筛选显著差异表达基因的阈值。
[0020] 进一步地，所述差异基因富集分析具体为，通过clusterProfilerR软件实现Gene Ontology(GO)富集，通过clusterProfilerR软件实现Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集。
[0021] 进一步地，所述差异基因蛋白网络互作分析具体为，差异表达基因的PPI分析基于已知和预测蛋白质-蛋白质相互作用的STRING数据库。使用diamond(0.9.13)将目标基因序列与参考蛋白序列进行比对，然后根据相互作用建立网络。Cytoscape用于网络可视化分析。
[0022] 进一步地，所述差异表达基因的验证具体为，为了验证RNA-Seq的结果，选择20个DEG(10个下调和10个上调)用于qRT-PCR。根据SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(Takara)方案，在BIO-RAD CFX-Connect Real-Time System上运行程序，使用25μL反应体系，反应程序为40个循环，95℃30秒，95℃5秒，60℃30秒，使用2-ΔΔCt方法，计算基因表达水平，并以18SrRNA为内参基因，实验设置3个生物学重复。
[0023] 进一步地，所述步骤S1的菌株培养为：
[0024] (1)将保存-80℃条件下的近平滑念珠菌菌株取出，然后将复苏液预热至20～23℃，将菌株注入复苏液中并混合，以2～3℃/s升温至35～37℃，温育1～2min后得到菌液；通过预热复苏液与菌株混合再以该速率升温温育可有效的缩短复苏时间，并且不降低菌株活性；
[0025] (2)用所得菌液在SDA平板上划线，将其在35℃下静置培养10～14h后，挑取SDA平板上的菌落在斜面微磁培养基上划线，随后将其在35℃下并在垂直于斜面微磁培养基表面10～20cm处施加4～6T的间歇磁场，培养7～12h后菌落长出；其中，所述间歇磁场的作用时间为8～13min，间歇磁场的间歇时间为25～30min；通过将菌液先进行SDA平板培养再通过斜面微磁培养基进行培养，通过斜面微磁培养基以及间歇磁场的作用可有效的保证复苏菌液的活性，避免影响后期与MAF-1A抗菌关联性的测定结果准确性；
[0026] (3)用无菌生理盐水将菌落进行洗脱，然后转移到SDB培养基中，培养得到近平滑念珠菌菌液。
[0027] 更进一步地，所述斜面微磁培养基配制方法为：将10g蛋白胨、20g琼脂、40g葡萄糖、1.5g吗啉乙磺酸、0.2g无水乙酸钠，加煮沸无菌生理盐水溶解定容至1L得到培养基液，杀菌处理后在无菌坏境下，将培养基液按照体积分数15～25％、25～35％、40～60％分为3份培养基液，分别记作培养基液A、培养基液B和培养基液C，将培养基液A装于烧杯中，等待培养基液A即将凝固时，将烧杯倾斜成与水平面成40°的斜面，待其表面凝固后，将钕铁硼磁粉均匀涂撒在其表面，然后喷涂10～20％的培养基液B凝固后将其余培养基液B倾倒与烧杯内，待其表面凝固后，再将铁钴镍磁粉均匀涂撒在其表面，然后喷涂5～10％的培养基液C凝固后将其余培养基液C倾倒与烧杯内，自然凝固到室温即可得到斜面微磁培养基；其中钕铁硼磁粉涂撒厚度2±0.5mm，铁钴镍磁粉涂撒厚度为1±0.2mm。本发明制备的斜面微磁培养基可有效的为菌落复苏培养提供间歇性的磁场影响，通过间歇磁场的作用，利用钕铁硼磁粉与铁钴镍磁粉的特性，在间歇磁场停止施加磁场时，铁钴镍磁粉磁场极弱，仅通过钕铁硼磁粉的磁场做主要影响，在间歇磁场施加磁场时，铁钴镍磁粉充磁后，磁性略微增强，通过磁场的不断变化，有效的保证复苏菌液的活性，避免影响后期与MAF-1A抗菌关联性的测定结果准确性。
[0028] 更进一步地，所述复苏液按重量份数计由1～2份胎牛血清、2～4份无菌生理盐水，其中还含有0.2mol/L谷氨酰胺、1.5mol/L蔗糖和0.7mol/L七水硫酸镁，将胎牛血清和无菌生理盐水混合后，依次加入谷氨酰胺、蔗糖和七水硫酸镁搅拌混匀，即可得到复苏液。在该成分配比下的复苏液可有效的降低对菌株复苏时的损伤，避免近平滑念珠菌菌株活性不稳定造成后期与MAF-1A抗菌关联性测定结果的准确性。
[0029] 进一步地，所述测定方法用于MAF-1A抗近平滑念珠菌的抗菌机制和耐药机制的研究。
[0030] 本发明的有益效果是:
[0031] (1)本发明提供了近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法，可以有效的测定MAF-1A在抗真菌作用机制，依次通过菌株培养、多肽合成、MIC测定及时间-杀菌曲线绘制等等，得到MAF-1A对于近平滑念珠菌的抗真菌作用机制，对于抗近平滑念珠菌感染药物具有重要的意义。
[0032] (2)本发明提供了近平滑念珠菌菌株培养的方法，通过预热复苏液与菌株混合再以该速率升温温育可有效的缩短复苏时间，通过间歇磁场的作用，利用斜面微磁培养基的特性，利用磁场的变化，有效的保证复苏菌液的活性，提高了后期与MAF-1A抗菌关联性的测定结果准确性。附图说明
[0033] 图1是MIC浓度的MAF-1A作用于近平滑念珠菌的时间-杀菌曲线图。
[0034] 图2是MAF-1A作用下近平滑念珠菌基因表达情况；A：MAF-1A作用6h差异基因火山图；B：MAF-1A作用于18h差异基因火山图，横坐标表示基因表达差异，纵坐标表示统计学意义；C：差异基因韦恩图，RG1表示6h上调表达、18h变为下调表达的基因，RG2表示6h下调表达、18h变为上调表达的基因；CPAS：MAF-1A作用6h组，CPAC：6h空白对照组，CPBS：MAF-1A作用18h组，CPBC：18h空白对照组。
[0035] 图3是RNA-Seq与qRT-PCR20个基因表达水平比较图；A：MAF-1A作用6hRNA-Seq与qRT-PCR基因表达水平的比较图；B：MAF-1A作用18hRNA-Seq与qRT-PCR基因表达水平的比较图。
[0036] 图4是6h差异基因PPI网络图。
[0037] 图5是6h上调、下调基因KEGG富集柱状图，其中，横坐标为KEGG通路，纵坐标为通路富集的显著性水平。
具体实施方式
[0038] 实施例1
[0039] 一种近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性的测定方法，包括以下步骤：
[0040] S1：菌株培养，将保存-80℃条件下的菌株取出并在35℃下在平板上划线培养24h复苏；平板选用Sabouraud dextrose agar(SDA)平板；培养基选用Sabouraud Dextrose Broth(SDB)培养基；
[0041] S2：多肽合成，合成的MAF-1A是由26个氨基酸序列组成的线性肽：KKFKETADKLIESAKQQLESLAKEMK；并使用分析型高效液相色谱(HPLC)鉴定MAF-1A的纯度大于
95％，并进行ESI质谱检测，保证多肽序列正确；并使用灭菌超纯水将肽溶解至5mg/mL并于-
20℃保存；
95％，并进行ESI质谱检测，保证多肽序列正确；并使用灭菌超纯水将肽溶解至5mg/mL并于-
20℃保存；
[0042] S3：MIC测定及时间-杀菌曲线绘制，挑取培养24h近平滑念珠菌菌落并重悬于培养基，浓度调至0.5×103～2.5×103CFU/mL；将MAF-1A梯度稀释(0.2mg/mL至2.4mg/mL)后各浓度取100ul加入96孔聚丙烯微孔板中，然后向每孔中加入100ul菌悬液，MAF-1A的终浓度为0.1mg/mL～1.2mg/mL；35℃培养24小时后，酶标仪检测A490值，确定MIC值；MIC的计算公式如下：真菌生长百分率＝(各孔A值-空白对照孔A值)/(生长对照孔A值-空白对照孔A值)×
100％；真菌生长抑制百分数＝(1-真菌生长百分数)×100％，取真菌生长抑制百分数在
80％以上的最低药物浓度为MIC值；将近平滑念珠菌菌液与MAF-1A(反应终浓度为MIC值)混匀，35℃恒温培养，分别取培养后第0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h的菌液稀释100倍后10ul菌液划线涂布于平板上，35℃培养24h后计数菌落；另设无菌超纯水为阴性对照组，每组重复实验3次，绘制时间-杀菌曲线；
100％；真菌生长抑制百分数＝(1-真菌生长百分数)×100％，取真菌生长抑制百分数在
80％以上的最低药物浓度为MIC值；将近平滑念珠菌菌液与MAF-1A(反应终浓度为MIC值)混匀，35℃恒温培养，分别取培养后第0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h的菌液稀释100倍后10ul菌液划线涂布于平板上，35℃培养24h后计数菌落；另设无菌超纯水为阴性对照组，每组重复实验3次，绘制时间-杀菌曲线；
[0043] S4：提取RNA，将近平滑念珠菌接种到培养基中，35℃下培养24小时后，加入MIC下的MAF-1A处理6小时(CPAS)和18小时(CPBS)，加入等量无菌超纯水处理的近平滑念珠菌做为对照组(6h：CPAC,18h：CPBC)；按照试剂说明，使用RNAiso Plus提取总RNA；使用NanoDrop 2000和Agilent 2100 bioanalyzer测定RNA样品的浓度和质量；使用 UltraTM
RNALibrary Prep Kit构建文库，使用Agilent 2100bioanalyzer对纯化文库进行定量，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量。使用Illumina Novoseq测序；其中，建库和测序工作由Novogene Corporation完成；
RNALibrary Prep Kit构建文库，使用Agilent 2100bioanalyzer对纯化文库进行定量，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量。使用Illumina Novoseq测序；其中，建库和测序工作由Novogene Corporation完成；
[0044] S5：数据分析，分别通过差异表达分析、差异基因富集分析、差异基因蛋白网络互作分析以及差异表达基因的验证，得到近平滑念珠菌与MAF-1A抗菌关联性。
[0045] 其中，差异表达分析具体为，将原始序列数据过滤后得到高质量的clean reads进行后续分析，利用HISAT2 v2.0.5将clean reads比对到近平滑念珠菌参考基因组。以FPKM估算基因表达水平。使用DESeq2 R软件(1.16.1)进行两个比较组合之间的差异表达分析。使用Benjamini等的方法调整P值(padj)。并以|log2(FoldChange)|>0&padj<0.05为筛选显著差异表达基因的阈值。
[0046] 差异基因富集分析具体为，通过clusterProfilerR软件实现Gene Ontology(GO)富集，通过clusterProfilerR软件实现Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集。
[0047] 差异基因蛋白网络互作分析具体为，差异表达基因的PPI分析基于已知和预测蛋白质-蛋白质相互作用的STRING数据库。使用diamond(0.9.13)将目标基因序列与参考蛋白序列进行比对，然后根据相互作用建立网络。Cytoscape用于网络可视化分析。
[0048] 差异表达基因的验证具体为，为了验证RNA-Seq的结果，选择20个DEG(10个下调和10个上调)用于qRT-PCR。根据SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(Takara)方案，在BIO-RAD CFX-Connect Real-Time System上运行程序，使用25μL反应体系，反应程序为40个循环，95-ΔΔCt
℃30秒，95℃5秒，60℃30秒，使用2 方法，计算基因表达水平，并以18SrRNA为内参基因，实验设置3个生物学重复。
℃30秒，95℃5秒，60℃30秒，使用2 方法，计算基因表达水平，并以18SrRNA为内参基因，实验设置3个生物学重复。
[0049] 其中，本测定方法用于MAF-1A抗近平滑念珠菌的抗菌机制和耐药机制的研究。
[0050] 实施例2
[0051] 本实施例与实施例1基本相同，与其不同之处在于，步骤S1的菌株培养为：
[0052] (1)将保存-80℃条件下的近平滑念珠菌菌株取出，然后将复苏液预热至20℃，将菌株注入复苏液中并混合，以2℃/s升温至35℃，温育1min后得到菌液；通过预热复苏液与菌株混合再以该速率升温温育可有效的缩短复苏时间，并且不降低菌株活性；
[0053] 其中，复苏液按重量份数计由1份胎牛血清、2份无菌生理盐水，其中还含有0.2mol/L谷氨酰胺、1.5mol/L蔗糖和0.7mol/L七水硫酸镁，将胎牛血清和无菌生理盐水混合后，依次加入谷氨酰胺、蔗糖和七水硫酸镁搅拌混匀，即可得到复苏液。在该成分配比下的复苏液可有效的降低对菌株复苏时的损伤，避免近平滑念珠菌菌株活性不稳定造成后期与MAF-1A抗菌关联性测定结果的准确性；
[0054] (2)用所得菌液在SDA平板上划线，将其在35℃下静置培养10h后，挑取SDA平板上的菌落在斜面微磁培养基上划线，随后将其在35℃下并在垂直于斜面微磁培养基表面10cm处施加4T的间歇磁场，培养7h后菌落长出；其中，间歇磁场的作用时间为8min，间歇磁场的间歇时间为25min；通过将菌液先进行SDA平板培养再通过斜面微磁培养基进行培养，通过斜面微磁培养基以及间歇磁场的作用可有效的保证复苏菌液的活性，避免影响后期与MAF-1A抗菌关联性的测定结果准确性；
[0055] 其中，斜面微磁培养基配制方法为：将10g蛋白胨、20g琼脂、40g葡萄糖、1.5g吗啉乙磺酸、0.2g无水乙酸钠，加煮沸无菌生理盐水溶解定容至1L得到培养基液，杀菌处理后在无菌坏境下，将培养基液按照体积分数15％、25％、60％分为3份培养基液，分别记作培养基液A、培养基液B和培养基液C，将培养基液A装于烧杯中，等待培养基液A即将凝固时，将烧杯倾斜成与水平面成40°的斜面，待其表面凝固后，将钕铁硼磁粉均匀涂撒在其表面，然后喷涂10％的培养基液B凝固后将其余培养基液B倾倒与烧杯内，待其表面凝固后，再将铁钴镍磁粉均匀涂撒在其表面，然后喷涂5％的培养基液C凝固后将其余培养基液C倾倒与烧杯内，自然凝固到室温即可得到斜面微磁培养基；其中钕铁硼磁粉涂撒厚度2±0.5mm，铁钴镍磁粉涂撒厚度为1±0.2mm。本发明制备的斜面微磁培养基可有效的为菌落复苏培养提供间歇性的磁场影响，通过间歇磁场的作用，利用钕铁硼磁粉与铁钴镍磁粉的特性，在间歇磁场停止施加磁场时，铁钴镍磁粉磁场极弱，仅通过钕铁硼磁粉的磁场做主要影响，在间歇磁场施加磁场时，铁钴镍磁粉充磁后，磁性略微增强，通过磁场的不断变化，有效的保证复苏菌液的活性，避免影响后期与MAF-1A抗菌关联性的测定结果准确性；
[0056] (3)用无菌生理盐水将菌落进行洗脱，然后转移到SDB培养基中，培养得到近平滑念珠菌菌液。
[0057] 实施例3
[0058] 本实施例与实施例1基本相同，与其不同之处在于，步骤S1的菌株培养为：
[0059] (1)将保存-80℃条件下的近平滑念珠菌菌株取出，然后将复苏液预热至21℃，将菌株注入复苏液中并混合，以3℃/s升温至36℃，温育1.5min后得到菌液；通过预热复苏液与菌株混合再以该速率升温温育可有效的缩短复苏时间，并且不降低菌株活性；
[0060] 其中，复苏液按重量份数计由2份胎牛血清、3份无菌生理盐水，其中还含有0.2mol/L谷氨酰胺、1.5mol/L蔗糖和0.7mol/L七水硫酸镁，将胎牛血清和无菌生理盐水混合后，依次加入谷氨酰胺、蔗糖和七水硫酸镁搅拌混匀，即可得到复苏液。在该成分配比下的复苏液可有效的降低对菌株复苏时的损伤，避免近平滑念珠菌菌株活性不稳定造成后期与MAF-1A抗菌关联性测定结果的准确性；
[0061] (2)用所得菌液在SDA平板上划线，将其在35℃下静置培养13h后，挑取SDA平板上的菌落在斜面微磁培养基上划线，随后将其在35℃下并在垂直于斜面微磁培养基表面16cm处施加5T的间歇磁场，培养11h后菌落长出；其中，间歇磁场的作用时间为11min，间歇磁场的间歇时间为28min；通过将菌液先进行SDA平板培养再通过斜面微磁培养基进行培养，通过斜面微磁培养基以及间歇磁场的作用可有效的保证复苏菌液的活性，避免影响后期与MAF-1A抗菌关联性的测定结果准确性；
[0062] 其中，斜面微磁培养基配制方法为：将10g蛋白胨、20g琼脂、40g葡萄糖、1.5g吗啉乙磺酸、0.2g无水乙酸钠，加煮沸无菌生理盐水溶解定容至1L得到培养基液，杀菌处理后在无菌坏境下，将培养基液按照体积分数20％、30％、50％分为3份培养基液，分别记作培养基液A、培养基液B和培养基液C，将培养基液A装于烧杯中，等待培养基液A即将凝固时，将烧杯倾斜成与水平面成40°的斜面，待其表面凝固后，将钕铁硼磁粉均匀涂撒在其表面，然后喷涂15％的培养基液B凝固后将其余培养基液B倾倒与烧杯内，待其表面凝固后，再将铁钴镍磁粉均匀涂撒在其表面，然后喷涂7％的培养基液C凝固后将其余培养基液C倾倒与烧杯内，自然凝固到室温即可得到斜面微磁培养基；其中钕铁硼磁粉涂撒厚度2±0.5mm，铁钴镍磁粉涂撒厚度为1±0.2mm。本发明制备的斜面微磁培养基可有效的为菌落复苏培养提供间歇性的磁场影响，通过间歇磁场的作用，利用钕铁硼磁粉与铁钴镍磁粉的特性，在间歇磁场停止施加磁场时，铁钴镍磁粉磁场极弱，仅通过钕铁硼磁粉的磁场做主要影响，在间歇磁场施加磁场时，铁钴镍磁粉充磁后，磁性略微增强，通过磁场的不断变化，有效的保证复苏菌液的活性，避免影响后期与MAF-1A抗菌关联性的测定结果准确性；
[0063] (3)用无菌生理盐水将菌落进行洗脱，然后转移到SDB培养基中，培养得到近平滑念珠菌菌液。
[0064] 实施例4
[0065] 本实施例与实施例1基本相同，与其不同之处在于，步骤S1的菌株培养为：
[0066] (1)将保存-80℃条件下的近平滑念珠菌菌株取出，然后将复苏液预热至23℃，将菌株注入复苏液中并混合，以3℃/s升温至37℃，温育2min后得到菌液；通过预热复苏液与菌株混合再以该速率升温温育可有效的缩短复苏时间，并且不降低菌株活性；
[0067] 其中，复苏液按重量份数计由2份胎牛血清、4份无菌生理盐水，其中还含有0.2mol/L谷氨酰胺、1.5mol/L蔗糖和0.7mol/L七水硫酸镁，将胎牛血清和无菌生理盐水混合后，依次加入谷氨酰胺、蔗糖和七水硫酸镁搅拌混匀，即可得到复苏液。在该成分配比下的复苏液可有效的降低对菌株复苏时的损伤，避免近平滑念珠菌菌株活性不稳定造成后期与MAF-1A抗菌关联性测定结果的准确性；
[0068] (2)用所得菌液在SDA平板上划线，将其在35℃下静置培养10～14h后，挑取SDA平板上的菌落在斜面微磁培养基上划线，随后将其在35℃下并在垂直于斜面微磁培养基表面20cm处施加6T的间歇磁场，培养12h后菌落长出；其中，间歇磁场的作用时间为13min，间歇磁场的间歇时间为30min；通过将菌液先进行SDA平板培养再通过斜面微磁培养基进行培养，通过斜面微磁培养基以及间歇磁场的作用可有效的保证复苏菌液的活性，避免影响后期与MAF-1A抗菌关联性的测定结果准确性；
[0069] 其中，斜面微磁培养基配制方法为：将10g蛋白胨、20g琼脂、40g葡萄糖、1.5g吗啉乙磺酸、0.2g无水乙酸钠，加煮沸无菌生理盐水溶解定容至1L得到培养基液，杀菌处理后在无菌坏境下，将培养基液按照体积分数25％、35％、40％分为3份培养基液，分别记作培养基液A、培养基液B和培养基液C，将培养基液A装于烧杯中，等待培养基液A即将凝固时，将烧杯倾斜成与水平面成40°的斜面，待其表面凝固后，将钕铁硼磁粉均匀涂撒在其表面，然后喷涂20％的培养基液B凝固后将其余培养基液B倾倒与烧杯内，待其表面凝固后，再将铁钴镍磁粉均匀涂撒在其表面，然后喷涂10％的培养基液C凝固后将其余培养基液C倾倒与烧杯内，自然凝固到室温即可得到斜面微磁培养基；其中钕铁硼磁粉涂撒厚度2±0.5mm，铁钴镍磁粉涂撒厚度为1±0.2mm。本发明制备的斜面微磁培养基可有效的为菌落复苏培养提供间歇性的磁场影响，通过间歇磁场的作用，利用钕铁硼磁粉与铁钴镍磁粉的特性，在间歇磁场停止施加磁场时，铁钴镍磁粉磁场极弱，仅通过钕铁硼磁粉的磁场做主要影响，在间歇磁场施加磁场时，铁钴镍磁粉充磁后，磁性略微增强，通过磁场的不断变化，有效的保证复苏菌液的活性，避免影响后期与MAF-1A抗菌关联性的测定结果准确性；
[0070] (3)用无菌生理盐水将菌落进行洗脱，然后转移到SDB培养基中，培养得到近平滑念珠菌菌液。
[0071] 测定实验
[0072] 菌株培养条件
[0073] 以近平滑念珠菌标准菌株ATCC22019进行转录谱分析。将保存于-80℃条件下的菌株取出并在35℃下在Sabouraud dextrose agar(SDA)(生工生物工程(上海)股份有限公司)平板上划线培养24h复苏。在涉及MAF-1A的实验中，以Sabouraud Dextrose Broth(SDB)(生工生物工程(上海)股份有限公司)为培养基。
[0074] 多肽合成
[0075] MAF-1A是由26个氨基酸序列组成的线性肽：KKFKETADKLIESAKQ QLESLAKEMK。交由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。使用分析型高效液相色谱(HPLC)鉴定其纯度大于95％，并进行ESI质谱检测，保证多肽序列正确。灭菌超纯水将肽溶解至5mg/mL并于-20℃保存。其中，氨基酸序列：KKFKETADKLIESAKQQLESLAKEMK出自文章:Synthesis and Functional Characterization of MAF-1A Peptide Derived From the Larvae of Housefly,Musca domestica(Diptera:Muscidae)。
[0076] MIC测定及时间-杀菌曲线
[0077] 根据临床和实验室标准研究所(CLSI)M27-A3测定MAF-1A的抗真菌活性。即挑取培养24h近平滑念珠菌菌落并重悬于SDB，浓度调至0.5×103-2.5×103CFU/mL。SDB将MAF-1A梯度稀释(0.2mg/mL至2.4mg/mL)后各浓度取100ul加入96孔聚丙烯微孔板中，然后向每孔中加入100ul菌悬液，MAF-1A的终浓度为(0.1mg/mL至1.2mg/mL)。35℃培养24小时后，酶标仪检测A490值，确定MIC值。计算公式如下：真菌生长百分率＝(各孔A值-空白对照孔A值)/(生长对照孔A值-空白对照孔A值)×100％。真菌生长抑制百分数＝(1-真菌生长百分数)×100％(Li et al.,2008；Sun et al.,2008)。取真菌生长抑制百分数在80％以上的最低药物浓度为MIC值。实验重复进行3次。将近平滑念珠菌菌液与MAF-1A(反应终浓度为MIC值)混匀，35℃恒温培养，分别取培养后第0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20h、22h、24h的菌液稀释100倍后10ul菌液划线涂布于SDA平板上，35℃培养24h后计数菌落。另设无菌超纯水为阴性对照组，每组重复实验3次。绘制时间-杀菌曲线。
[0078] 提取RNA
[0079] 将近平滑念珠菌接种到沙氏葡萄糖肉汤(SDB)培养基(生工生物工程(上海)股份有限公司)中，35℃下培养24小时后。加入MIC下的MAF-1A处理6小时(CPAS)和18小时(CPBS)，加入等量无菌超纯水处理的近平滑念珠菌做为对照组(6h：CPAC，18h：CPBC)。按照试剂说明，用RNAiso Plus(宝生物工程(大连)有限公司)提取总RNA。使用NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific,Wilmington,DE,United States)和Agilent 2100 bioanalyzer(Agilent Technologies,United States)测定RNA样品的浓度和质量。使用UltraTM RNA Library Prep Kit(NEB,USA)。按照说明构建文库，使用Agilent
2100 bioanalyzer对纯化文库进行定量，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量。使用Illumina Novoseq测序(Illumina，USA)。建库和测序工作由Novogene Corporation完成。
2100 bioanalyzer对纯化文库进行定量，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量。使用Illumina Novoseq测序(Illumina，USA)。建库和测序工作由Novogene Corporation完成。
[0080] 差异表达分析
[0081] 将原始序列数据过滤后得到高质量的clean reads进行后续分析，利用HISAT2 v2.0.5将clean reads比对到近平滑念珠菌参考基因组(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term＝candida+parapsilosis)。以FPKM估算基因表达水平(Mortazavi et al.,2008)。使用DESeq2 R软件(1.16.1)进行两个比较组合之间的差异表达分析。使用Benjamini等的方法调整P值(padj)。并以|log2(FoldChange)|>0&padj<0.05为筛选显著差异表达基因的阈值(Benjamini et al.,2001)。
[0082] 差异基因富集分析
[0083] 为进一步掌握DEGs的功能，我们通过clusterProfilerR软件实现Gene Ontology(GO)富集，通过clusterProfilerR软件实现Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)通路富集。
[0084] 差异基因蛋白网络互作分析
[0085] 差异表达基因的PPI分析基于已知和预测蛋白质-蛋白质相互作用的STRING数据库。使用diamond(0.9.13)将目标基因序列与参考蛋白序列进行比对，然后根据相互作用建立网络。Cytoscape用于网络可视化分析(Shannon et al.,2003)。
[0086] 差异表达基因的验证
[0087] 为了验证RNA-Seq的结果，选择20个DEG(10个下调和10个上调)用于qRT-PCR。根据SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒(Takara)方案，在BIO-RAD CFX-Connect Real-Time System上运行程序，使用25μL反应体系，反应程序为40个循环，95℃30秒，95℃5秒，60℃30秒。使用2-ΔΔCt方法(Livak and Schmittgen,2001)。计算基因表达水平，并以18SrRNA为内参基因。
实验设置3个生物学重复。基因的引物序列于附表1中列出，其中，附表1引物序列出处：本发明所有引物均由“生工生物工程(上海)股份有限公司”设计合成。
实验设置3个生物学重复。基因的引物序列于附表1中列出，其中，附表1引物序列出处：本发明所有引物均由“生工生物工程(上海)股份有限公司”设计合成。
[0088] 结果
[0089] MIC值和时间杀菌曲线
[0090] MAF-1A对近平滑念珠菌的MIC值为0.6mg/ml。MIC浓度的MAF-1A作用近平滑念珠菌时间杀菌曲线结果如图1显示，MAF-1A在培养8h内逐步发挥抗菌作用，随着培养时间的延长数量逐渐减少，曲线呈下降趋势，当真菌培养8h后抗菌作用有所降低，曲线略有上升但低于对照组。
[0091] MAF-1A作用于近平滑念珠菌的转录反应
[0092] 通过RNA-seq技术对MAF-1A作用6h和18h的近平滑念珠菌进行转录组分析。在MAF-1A作用组(6h，18h)及对照组(6h，18h)中共检测到6073个基因表达(FPKM≥1)。经过筛选，MAF-1A作用近平滑念珠菌6h和18h共有2439个差异表达基因。在这些基因中，6h差异基因
2187个(上调表达1122个，下调表达1065个)(如图2A所示)占检测到基因的36.01％。18h差异基因252个(上调表达101个，下调表达151个)(如图2B所示)占检测到基因的4.15％。随着MAF-1A作用时间的推移，我们发现，与对照组相比，两个MAF-1A处理组(6h、18h)中67个基因表现出相反的变化趋势(如图2C所示,RG1和RG2)。
2187个(上调表达1122个，下调表达1065个)(如图2A所示)占检测到基因的36.01％。18h差异基因252个(上调表达101个，下调表达151个)(如图2B所示)占检测到基因的4.15％。随着MAF-1A作用时间的推移，我们发现，与对照组相比，两个MAF-1A处理组(6h、18h)中67个基因表现出相反的变化趋势(如图2C所示,RG1和RG2)。
[0093] 差异基因的qRT-PCR验证
[0094] 为了验证RNA-Seq结果，我们从多肽作用的6h和18h差异基因中选择了10个上调基因和10个下调基因进行qRT-PCR验证。结果表明，RNASeq和qRT-PCR的表达水平变化具有一致性。qRT-PCR结果证实了RNA-Seq数据的可靠性，如图3所示。
[0095] ppi互作网络分析
[0096] 通过STRING蛋白质互作数据库中的互作关系对MAF-1A作用6h近平滑念珠菌的差异基因进行互作网络分析。结果显示，互作网络共包含624个节点和6264条边，如图4所示。互作网络中多个基因节点的连接度较高，如如CYS4，CYT1，RPC40，ARX1，DIM1等。
[0097] 差异基因富集分析
[0098] 为了进一步掌握MAF-1A作用于近平滑念珠菌抗菌机制，我们通过富集分析对6h上调、下调表达基因、RG1、RG2的基因进行富集分析。以研究MAF-1A主要通过何种方式发挥抗真菌作用。
[0099] 6h差异表达表达基因：6h上调基因共富集到85个KEGG通路中，选取最显著的20个KEGG通路绘制柱状图，如图5A所示。我们发现，上调基因显著富集到Carbon metabolism，Cell cycle-yeast，Fatty acid degradation等通路上，提示我们，MAF-1A主要影响近平滑念珠菌多个代谢及能量产生相关途径。6h下调基因共富集到85个KEGG通路中，选取最显著的20个KEGG通路绘制柱状图，如图5B所示。我们发现，下调基因显著富集到Steroid biosynthesis，Biosynthesis of amino acids，Cysteine and methionine metabolism等通路上，提示我们，MAF-1A可能通过影响近平滑念珠菌细胞膜甾醇，蛋白质等的生物合成及代谢相关通路基因的表达影响蛋白功能。
[0100] RG1和RG2基因富集分析：RG1中的42个基因共富集到17个KEGG通路上，RG2中的25个基因共富集到13个KEGG通路上，其中多个通路富集显著(padj<0.05)(见表1)。提示我们MAF-1A可能影响近平滑念珠菌的能量产生过程及蛋白质正常的合成阻碍细胞正常的生长代谢发挥抗菌活性。这与6h差异基因的富集结果一致。进一步将RG1，RG2基因通过GO进行基因功能富集分析发现，RG1，RG2基因共富集到290条GO term上，其中8条显著富集(padj<0.05)(见表2)。如表2所示RG1基因主要参与了能量的产生及氧化还原过程。
[0101] 表1：RG1和RG2的差异表达基因显著富集KEGG通路表
[0102]
[0103] 表2：RG1和RG2的显著富集GO term表
[0104]
[0105] 附表1：引物序列
[0106]
[0107]
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