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嵌合病毒样颗粒以及其作为免疫反应的抗原特异性重定向剂的用途

阅读：777发布：2020-05-11

专利汇可以提供嵌合病毒样颗粒以及其作为免疫反应的抗原特异性重定向剂的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及从包含乳头状瘤病毒(PV)L1 蛋白质或L1/L2蛋白质的多肽和包含来源于人类病原体的CD8+T细胞表位的靶肽组装的嵌合病毒样颗粒(VLP)。本发明还涉及使用所述嵌合VLP作为免疫反应的抗原特异性重定向剂的方法。，下面是嵌合病毒样颗粒以及其作为免疫反应的抗原特异性重定向剂的用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种嵌合病毒样颗粒(VLP)，所述嵌合病毒样颗粒包含乳头状瘤病毒(PV)L1蛋白质
和表面展示的靶肽，其中所述靶肽包含人类病原体的CD8+T细胞表位，其中所述CD8+T细胞表位不是肿瘤相关抗原，其中所述靶肽缀合至所述VLP并且其中所述靶肽不经由聚离子:半胱氨酸序列缀合至所述VLP。
2.如权利要求1所述的嵌合VLP，所述嵌合VLP还包含PV L2蛋白质。
3.如权利要求1所述的嵌合VLP，其中所述靶肽经由二硫键联、马来酰亚胺键联或酰胺
键联缀合至所述L1蛋白质的半胱氨酸、赖氨酸或精氨酸。
4.如权利要求2所述的嵌合VLP，其中所述靶肽经由二硫键联、马来酰亚胺键联或酰胺
键联缀合至所述L2蛋白质的半胱氨酸、赖氨酸或精氨酸。
5.如权利要求1所述的嵌合VLP，其中所述靶肽不是乳头状瘤病毒的肽。
6.如权利要求1所述的嵌合VLP，其中所述CD8+T细胞表位来自儿童疫苗的抗原多肽。
7.如权利要求1所述的嵌合VLP，其中所述病原体是病毒、细菌、真菌或寄生虫。
8.如权利要求7所述的嵌合VLP，其中所述病毒是牛痘病毒；水痘带状疱疹病毒；带状疱疹病毒；风疹；肝炎病毒，例如甲型肝炎病毒或乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒；甲型或乙型流感病毒；麻疹病毒；腮腺炎病毒；脊髓灰质炎病毒；天花(痘疮)病毒；狂犬病病毒；登革病毒；埃博拉病毒；西尼罗河病毒；黄热病病毒；或寨卡病毒。
9.如权利要求1所述的嵌合VLP，其中所述靶肽包含表1中所列出的肽。
10.如权利要求7所述的嵌合VLP，其中所述细菌是百日咳博德特氏菌；破伤风梭菌；沙眼衣原体；白喉；流感嗜血杆菌；脑膜炎球菌，例如脑膜炎球菌ACWY；肺炎球菌；霍乱弧菌；结核分枝杆菌；BCG；伤寒；大肠杆菌；沙门氏菌；嗜肺军团菌；立克次氏体；苍白密螺旋体苍白种；A群或B群链球菌；肺炎链球菌；炭疽杆菌；肉毒梭菌；或耶尔森氏菌属某个种，例如鼠疫耶尔森氏菌。
11.如权利要求7所述的嵌合VLP，其中所述寄生虫是溶组织内阿米巴；刚地弓形虫；毛线虫属某个种，例如旋毛形线虫；毛滴虫属某个种，例如阴道毛滴虫；锥虫属某个种，例如布氏冈比亚锥虫、布氏罗得西亚锥虫或克氏锥虫；或疟原虫，例如恶性疟原虫、间日疟原虫或三日疟原虫。
12.如权利要求1所述的嵌合VLP，其中所述L1蛋白质是BPV1或HPV 1、2、3、4、5、6、8、9、
11、15、16、17、18、23、27、38、31、45、33、35、39、51、52、58、66、68、70、76和92型的L1蛋白质。
13.如权利要求2所述的嵌合VLP，其中所述L2蛋白质是BPV1或HPV 1、2、3、4、5、6、8、9、
11、15、16、17、18、23、27、38、31、45、33、35、39、51、52、58、66、68、70、76和92型的L2蛋白质。
14.如权利要求1所述的嵌合VLP，其中所述L1蛋白质包含在所述VLP的表面上呈现的多
于三个半胱氨酸。
15.如权利要求14所述的嵌合VLP，其中所述L1蛋白质是HPV 16RG-1L1蛋白质(SEQ ID
NO:221)。
16.如权利要求15所述的嵌合VLP，其中所述L1蛋白质包含QLYKTCKQAGTCPPDIIPKV(SEQ ID NO:222)。
17.如权利要求1所述的嵌合VLP，其中所述肽缀合至所述L1蛋白质的DE环、HI环或螺旋B4环中的一个或多个。
18.如权利要求1所述的嵌合VLP，其中所述靶肽缀合至人类PV16 L1(HPV16 L1)的螺旋
B4环，或缀合至牛PV(BPV)的DE环，或PV的等效氨基酸136/137。
19.一种抑制癌细胞的生长的方法，所述方法包括使所述细胞与包含有效量的如权利
要求1-16中任一项所述的嵌合VLP的组合物接触。
20.一种抑制受试者中肿瘤的生长、进展或转移的方法，所述方法包括
(a)判定有需要的受试者是否已经针对病原体进行免疫或接种疫苗，
(b)将嵌合乳头状瘤病毒样颗粒(VLP)以足以抑制所述肿瘤的所述生长、进展或转移的
量施用于所述受试者，
其中所述嵌合VLP包含乳头状瘤病毒L1蛋白质和靶肽，其中所述靶肽缀合至所述L1蛋
白质的半胱氨酸、赖氨酸或精氨酸，其中所述靶肽包含所述受试者已经针对其进行免疫的病原体的CD8+T细胞表位并且其中所述靶肽在所述嵌合VLP上表面展示。
21.如权利要求20所述的方法，所述方法还包括确定在所述受试者的细胞上表达的MHC I类分子以及选择其中已知所述靶肽结合所述MHC I类分子的嵌合VLP，然后将所述嵌合VLP施用于所述受试者。
22.如权利要求20所述的方法，其中所述病原体是病毒、细菌或寄生虫。
23.如权利要求20所述的方法，其中所述病毒是牛痘病毒；水痘带状疱疹病毒；带状疱疹病毒；风疹；肝炎病毒，例如甲型肝炎病毒或乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒；甲型或乙型流感病毒；麻疹病毒；腮腺炎病毒；脊髓灰质炎病毒；天花(痘疮)病毒；狂犬病病毒；登革病毒；埃博拉病毒；西尼罗河病毒；黄热病病毒；或寨卡病毒。
24.如权利要求22所述的方法，其中所述细菌是百日咳博德特氏菌；破伤风梭菌；沙眼衣原体；白喉；流感嗜血杆菌；脑膜炎球菌，例如脑膜炎球菌ACWY；肺炎球菌；霍乱弧菌；结核分枝杆菌；BCG；伤寒；大肠杆菌；沙门氏菌；嗜肺军团菌；立克次氏体；苍白密螺旋体苍白种；
A群或B群链球菌；肺炎链球菌；炭疽杆菌；肉毒梭菌；耶尔森氏菌属某个种，例如鼠疫耶尔森氏菌。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述寄生虫是溶组织内阿米巴；刚地弓形虫；毛线虫属某个种，例如旋毛形线虫；毛滴虫属某个种，例如阴道毛滴虫；锥虫属某个种，例如布氏冈比亚锥虫、布氏罗得西亚锥虫、克氏锥虫；疟原虫，例如恶性疟原虫、间日疟原虫或三日疟原虫。
26.如权利要求20所述的方法，其中所述靶肽通过二硫键联或马来酰亚胺键联缀合至
所述L1蛋白质的半胱氨酸。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述靶肽缀合至所述L1蛋白质的环。
28.如权利要求26所述的方法，其中所述靶肽不缀合至所述L1蛋白质的环。
29.如权利要求20所述的方法，其中所述CD8+T细胞表位是表1中所列举的表位。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述CD8+T细胞表位结合至表I中所列举的MHC I类
分子。
31.如权利要求30所述的方法，其中所述MHC I类分子是HLA-A*02:01、HLA-A*03:01/
HLA-A*11:01、HLA-A*0201、HLA-A*020101、HLA-A*0203、HLA-A*0206、HLA-A2、HLA-A2.1或HLA-A*02。
32.如权利要求21所述的方法，其中所述CD8+T细胞表位结合至MHC I类分子HLA-A、
HLA-B或HLA-C家族。
33.如权利要求20所述的方法，进一步其中在放射疗法或化学疗法之后施用所述嵌合
VLP。
34.如权利要求20所述的方法，所述方法还包括将检查点抑制剂施用于所述受试者。
35.如权利要求34所述的方法，其中与所述嵌合VLP依序或基本上同时施用所述检查点
抑制剂。
36.如权利要求34所述的方法，其中所述检查点抑制剂是伊匹单抗派姆单
抗和纳武单抗阿特珠单抗(Tecentriq)、阿维鲁单抗
(Bavencio)、德瓦鲁单抗(Imfinzi)。
37.一种抑制受试者中癌症的生长的方法，所述方法包括
(a)将所述受试者鉴定为患有癌症的受试者，
(b)鉴定先前已经施用于所述受试者的包含抗原剂的疫苗，
(c)向所述受试者施用包含有效量的包含乳头状瘤L1蛋白质和靶肽的嵌合VLP的组合
物，其中所述靶肽缀合至所述L1蛋白质并且所述靶肽包含先前施用于所述受试者的所述疫苗中的所述抗原剂的CD8+T细胞表位，
其中以足以刺激所述受试者中的免疫反应的量施用所述嵌合VLP，所述刺激所述受试
者中的免疫反应包括刺激对所述抗原剂的所述CD8+T细胞表位具有特异性的CD8+T细胞并且从而抑制所述癌症的所述生长。
38.一种抑制受试者中癌症的生长的方法，所述方法包括
(a)将所述受试者鉴定为患有肿瘤的受试者，
(b)将嵌合VLP以足以诱导所述受试者对所述靶肽的细胞免疫反应的量施用于所述受
试者，
其中所述嵌合VLP包含乳头状瘤L1蛋白质或L2蛋白质或L1和L2蛋白质两者以及靶肽，
其中所述靶肽缀合至所述L1或L2蛋白质的半胱氨酸、赖氨酸或精氨酸，其中所述靶肽包含不是来自所述肿瘤的肿瘤相关抗原的CD8+T细胞表位，并且其中所述细胞免疫反应抑制所述肿瘤的所述生长。
39.一种制造如权利要求1所述的嵌合VLP的方法，所述方法包括从乳头状瘤病毒L1蛋
白质，或L1蛋白质和L2蛋白质组装VLP；使所述VLP经受足以还原所述VLP的还原条件，同时维持所述VLP的衣壳样二十面体结构；以及使所述靶肽缀合至所述还原的VLP，从而形成所述嵌合VLP。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述靶肽缀合至所述VLP的L1或L2蛋白质的半胱氨
酸和/或赖氨酸。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述靶肽经由二硫键联、马来酰亚胺键联或酰胺键联缀合至所述VLP的L1或L2蛋白质。
42.如权利要求40所述的方法，其中所述VLP的至少30％的表面半胱氨酸包含靶肽。
43.如权利要求39所述的方法，其中所述VLP的至少约30％的表面半胱氨酸包含靶肽。
44.一种包含嵌合VLP的群体的组合物，其中每个VLP包含乳头状瘤病毒L1蛋白质和靶
肽，其中所述VLP的至少30％的半胱氨酸或30％的赖氨酸或30％的半胱氨酸和赖氨酸两者经由二硫键联、马来酰亚胺键联或缀合至靶肽。

说明书全文

嵌合病毒样颗粒以及其作为免疫反应的抗原特异性重定向剂

的用途

[0001] 本申请要求2018年5月25日提交的申请号62/676,566和2017年6月23日提交的申请号62/524,308的优先权益，这些申请以全文引用的方式并入本文中。发明领域

[0002] 本发明涉及从包含乳头状瘤病毒(PV)L1蛋白质或L1/L2蛋白质并包含来源于一种或多种人类病原体的一种或多种含CD8+ T细胞表位的肽的嵌合多肽组装的嵌合病毒样颗粒(VLP)，包含此类嵌合VLP的组合物，以及所述嵌合VLP在用于癌症治疗的先天性和适应性免疫两者的重定向和刺激中的治疗性用途。

[0003] 发明背景

[0004] 根据国家癌症研究所(National Cancer Institute)，总体癌症死亡率持续降低：总体癌症发病率在男性中已经下降并且在女性中已经稳定。大多数但并非所有常见癌症的五年存活率也已经提高。然而，据估计仅在美国2017年将存在额外1,688,780例诊断出的新癌症病例和600,920例癌症死亡。

[0005] 细胞毒性CD8+ T淋巴细胞(常称为细胞毒性T淋巴细胞或CTL)可以选择性地杀伤癌细胞并且因此已经推行基于肿瘤相关抗原的抗原特异性免疫疗法作为用以控制肿瘤的有前景的方法。已经尝试使用此种免疫疗法来刺激免疫系统并且特异性地靶向并消除肿瘤细胞。此类疗法具有吸引力，这是在于其为标靶特异性的并且潜在地毒性较小而不存在非特异性自体免疫。此类疗法与手术、放射或化学疗法相比也被视为较小侵入性或创伤性的。然而，基于肿瘤相关抗原的癌症疫苗归因于不良临床免疫原性、免疫耐受性和不良临床结果迄今已经取得有限的成功。此外，此类方法通常需要鉴定肿瘤相关抗原以特异性地靶向肿瘤。此外，逐渐了解到肿瘤微环境可以包含免疫抑制因子，例如检查点(CP)蛋白质，例如PD-1/PD-L1、CTLA-4/(B7-1/B7-2)、CD86、GITR、LAG3、VISTA、TIGIT和CD137L，这些蛋白质可以抑制T细胞杀伤癌细胞。CP蛋白质可以削弱通过定向抗原免疫疗法的努力所诱导的免疫反应的诱导期或效应期。为克服此种免疫抑制，免疫CP抑制剂已经用于阻断CP蛋白质并且救助肿瘤微环境中削弱的肿瘤抗原特异性T细胞，使其能够更好地杀伤癌细胞。虽然具有开创性，但CP抑制剂的反应率最佳为约30％，这是因为其功效需要抗肿瘤特异性免疫反应的存在。因此，仍然需要产生或利用现有强而稳固的T细胞反应以抑制肿瘤生长、进展和转移的组合物和方法。

发明内容

[0006] 本发明涉及一种从包含乳头状瘤病毒(PV)L1蛋白质、重组PV L1蛋白质或PV L1蛋白质和L2蛋白质的多肽组装的嵌合病毒样颗粒(VLP)。本发明的嵌合VLP还包含一个或多个靶肽。如本文所定义的靶肽包含由已有记忆CD8+ T细胞识别的T细胞表位。在本发明的一个实施方案中，本发明的嵌合VLP包含表面展示的一个或多个靶肽。在一些实施方案中，靶肽附接或缀合至VLP的表面，并且在一些实施方案中，靶肽以重组方式插入L1或L2蛋白质中以使得靶肽在组装的VLP的表面上展示。靶肽包含来自另一种人类病原体的T细胞表位，并且在一些实施方案中，靶肽不是乳头状瘤病毒的肽。在一些实施方案中，靶肽不包含鼠类E7表位(aa49-57)。本发明还涉及包含本发明嵌合VLP的组合物，以及在癌症治疗中使用嵌合VLP的方法。

[0007] 在本发明的一个方面，靶肽来源于人类病原体，例如病毒、细菌、真菌或寄生虫，并且不是肿瘤相关抗原。病毒包括但不限于牛痘病毒；水痘带状疱疹病毒；腺病毒；虫媒病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-barr virus)；冠状病毒；巨细胞病毒；柯萨奇病毒(Coxsakie virus)；带状疱疹病毒；风疹；肝炎病毒，例如甲型肝炎病毒或乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒；1型或2型单纯疱疹病毒；JC病毒；甲型或乙型流感；麻疹病毒；腮腺炎病毒；副流感病毒；
脊髓灰质炎病毒；天花(痘疮)病毒；狂犬病病毒；呼吸道合胞病毒；鼻病毒；轮状病毒；登革病毒(dengue virus)；埃博拉病毒(ebola virus)；西尼罗河病毒(west nile virus)；黄热病病毒；或寨卡病毒(zika virus)。

[0008] 在本发明的一个方面，从乳头状瘤病毒科的任何成员的L1蛋白质组装VLP。在本发明的一个方面，乳头状瘤L1蛋白质是动物乳头状瘤病毒(例如棉尾兔PV、小鼠PV或牛PV)或人类PV(HPV)，例如HPV 16、HPV18、HPV5、HPV31等的L1蛋白质。在本发明的一个方面，乳头状瘤L1蛋白质是牛(BPV)或HPV的L1蛋白质。在本发明的一个方面，VLP是RG1-VLP。从经过修饰以呈现HPV16 L1的DE-表面环内的HPV16 L2氨基酸17-36(RG1表位)的HPV16 L1蛋白质组装RG1-VLP(Schellenbacher等2013 J.Invest Dermatol；133(12)：2706-2713；Slupetzky等，2007Vaccine 25：2001-10；Kondo等2008 J.Med.Virol 80；841-6；Schellenbacher等2009 J.Virol 83：10085-95；Caldeira等2010Vaccine 28：4384-93)。

[0009] 在本发明的一个方面，靶肽附接至VLP。在本发明的一个方面，靶肽的N端或C端缀合至VLP表面上的氨基酸残基。表面残基可以是例如半胱氨酸、赖氨酸或精氨酸。使肽缀合至蛋白质的许多方法在本领域中是已知的，参见例如Bioconjugate Techniques，第3版(2013)，作者GregT.Hermanson，Ionescu等Journal of Pharmaceutical Sciences，2006年1月，95(1)：70-79，以及Jones等，Journal of the American Chemical Society，2012，
134：1847-1852，全部以引用的方式并入本文中用于公开此类方法。

[0010] 在本发明的一个方面，从乳头状瘤病毒L1蛋白质，或L1蛋白质和L2蛋白质组装VLP；然后经受足以使VLP中半胱氨酸残基的二硫键还原成巯基的还原条件，同时维持VLP的衣壳样二十面体结构；并且靶肽经由二硫键联或马来酰亚胺键联缀合至巯基。在本发明的一个实施方案中，半胱氨酸在VLP的表面上。在本发明的一个方面，靶肽缀合至VLP的L1蛋白质的半胱氨酸的巯基。在本发明的一个方面，靶肽缀合至VLP的L2蛋白质的半胱氨酸的巯基。在本发明的一个方面，半胱氨酸不是聚离子：半胱氨酸、聚阳离子：半胱氨酸或聚阴离子：半胱氨酸序列的一部分。在本发明的一个方面，从乳头状瘤病毒L1蛋白质，或L1蛋白质和L2蛋白质组装VLP；并且靶肽经由二硫键联或马来酰亚胺键联缀合至组装的VLP的半胱氨酸的巯基，其中缀合反应在氮气气氛下进行。在本发明的一个实施方案中，半胱氨酸在VLP的表面上。

[0011] 在本发明的一个方面，从乳头状瘤病毒L1蛋白质，或L1蛋白质和L2蛋白质组装VLP；然后经受碱性pH值的环境条件，同时维持VLP的衣壳样二十面体结构；并且在N端具有马来酰亚胺基的靶肽经由1-4加成反应缀合至VLP的赖氨酸上的伯胺和/或精氨酸残基上的胍基。在本发明的一个实施方案中，赖氨酸和/或精氨酸在VLP的表面上。

[0012] 在本发明的一个方面，从乳头状瘤病毒L1蛋白质，或L1蛋白质和L2蛋白质组装VLP；然后经受碱性pH值的环境条件，同时维持VLP的衣壳样二十面体结构；并且在N端具有二溴或二碘马来酰亚胺基的靶肽经由1-4加成反应缀合至VLP的赖氨酸残基上的伯胺基和/或精氨酸残基上的胍基。在本发明的一个实施方案中，赖氨酸和/或精氨酸在VLP的表面上。

[0013] 在本发明的一个方面，从乳头状瘤病毒L1蛋白质，或L1蛋白质和L2蛋白质组装VLP；然后经受生理至碱性pH值的环境条件，同时维持VLP的衣壳样二十面体结构；并且在C端具有N-羟基琥珀酰亚胺酯基的N保护靶肽经由酰胺形成缀合至VLP上的赖氨酸残基上的伯胺基和/或精氨酸残基上的胍基。在本发明的一个实施方案中，赖氨酸和/或精氨酸在VLP的表面上。

[0014] 在本发明的一个方面，靶肽附接至PV L1蛋白质的环，例如BC、CD、DE、EF、FG或HI环。在本发明的一个方面，靶肽附接至HPV L1蛋白质的DE环、H1环或螺旋B4环。在本发明的一个方面，标靶附接至螺旋B4环，例如在HPV16 L1的氨基酸430与433之间，或附接至DE环，例如在牛PV(BPV)的氨基酸133/134之间，或PV，包括但不限于HPV的等效氨基酸136/137。

[0015] 在本发明的一个实施方案中，靶肽或VLP不包含用于使靶肽停泊至VLP以形成嵌合VLP的聚离子：半胱氨酸、聚阳离子：半胱氨酸或聚阴离子：半胱氨酸序列。在本发明的一个实施方案中，靶肽和VLP都不包含用于使靶肽停泊至VLP以形成本发明的嵌合VLP的聚离子：半胱氨酸、聚阳离子：半胱氨酸或聚阴离子：半胱氨酸序列。

[0016] 靶肽可能经由二硫键结缀合至VLP，参见Pejawar-Gaddy等Cancer Immunol Immunother(2010)59(11)：1685-1696，以全文引用的方式并入本文中。

[0017] 在本发明的一个方面，靶肽以重组方式插入PV L1蛋白质的环中，例如PV L1蛋白质的BC、CD、DE、EF、FG或HI环。在本发明的一个方面，靶肽插入HPV L1蛋白质的DE环或螺旋B4环中。在本发明的一个方面，标靶插入HPV16 L1的氨基酸430与433之间的螺旋B4环中，或插入牛PV(BPV)的氨基酸133/134之间的DE环中，或HPV的等效氨基酸136/137。

[0018] 在本发明的一个方面，带电荷肽，例如9个谷氨酸或9个精氨酸氨基酸以重组方式插入PV L1蛋白质的环中。靶肽然后缀合至环中的带电荷肽。环可以是例如PV L1蛋白质的BC、CD、DE、EF、FG或HI环。在本发明的一个方面，靶肽缀合至HPV L1蛋白质的DE环或螺旋B4环中的带电荷肽。在本发明的一个方面，靶肽缀合至带电荷肽，所述带电荷肽插入HPV16 L1的氨基酸430与433之间的螺旋B4环中，或插入牛PV(BPV)的氨基酸133/134之间的DE环中，或HPV的等效氨基酸136/137。

[0019] 在本发明的一个方面，首先从乳头状瘤病毒L1蛋白质，或L1和L2蛋白质组装VLP；并且包含来源于人类病原体的CD8+ T细胞表位的靶肽然后附接至VLP以产生具有表面展示的靶肽的嵌合VLP。在本发明的一个方面，靶肽附接至L1或L2蛋白质，然后组装VLP以使得表面展示靶肽。靶肽可以附接至VLP的L1蛋白质或L2蛋白质或附接至VLP的L1和L2蛋白质两者。靶肽附接至VLP可以通过使靶肽经由二硫、马来酰亚胺或酰胺键联缀合至VLP。

[0020] 嵌合VLP还可以依重组方式产生并且从乳头状瘤病毒L1蛋白质，或L1和L2蛋白质组装，其中L1蛋白质或L2蛋白质已经在其中插入靶肽以使得靶肽在组装的VLP上表面展示。

[0021] 在本发明的一个实施方案中，靶肽由连接子附接至VLP。在本发明的一个实施方案中，靶肽包含CD8+ T细胞表位和连接子，基本上由上述组成，或由上述组成。在本发明的一个方面，连接子包含由肿瘤细胞所表达或肿瘤微环境中所存在的一种或多种酶识别和裂解的一个或多个氨基酸序列。一个或多个裂解位点可以定位于靶肽中以使得一个或多个位点的裂解从靶肽中释放肽，其中所释放的肽包含CD8+T细胞表位，基本上由上述组成，或由上述组成。所释放的肽能够与MHC结合以使得复合物由对所释放的肽的CD8+ T细胞表位具有特异性的已有CTL识别并活化所述CTL。酶可以是例如弗林蛋白酶(furin)；基质金属蛋白酶(MMP)，例如MMP 1、2、3、7、8、9、11、13、14或19；ADAM(去整合素和金属蛋白酶)，例如ADAMS8、9、10、15、17或28；组织蛋白酶，例如组织蛋白酶B、D，D、G或H、N；弹性蛋白酶；蛋白酶-3；天青杀素(Azurocidin)；或ADAMTS-1；或人类肿瘤细胞的蛋白酶体中的酶。酶裂解位点可以是例如RX-K/R-R(SEQ ID NO：209)，其中X可以是任何氨基酸，例如RVKR(SEQ ID NO：210)或MMP可裂解肽底物，例如Glu-Pro-Cit-Gly-Hof-Tyr-Leu(SEQ ID NO：211)或Gly-Pro-Leu-Gly-Ile-Ala-Gly-Gln**(SEQ ID NO：212)或Pro-Val-Gly-Leu-Ile-Gly(SEQ ID NO：213)。在本发明的一个方面，裂解位点不是弗林蛋白酶裂解位点或基质金属蛋白酶(MMP)裂解位点。在本发明的一个方面，裂解位点不是以下一种或多种的裂解位点：MMP 1、2、3、7、8、9、11、13、
14或19；ADAM(去整合素和金属蛋白酶)，例如ADAMS 8、9、10、15、17或28；组织蛋白酶，例如组织蛋白酶B、D，D、G或H、N；弹性蛋白酶；蛋白酶-3；天青杀素或ADAMTS-1。在本发明的一个方面，靶肽不包含酶裂解位点。

[0022] 在本发明的一个方面，靶肽包含一种或多种人类病原体，例如寄生虫、细菌或病毒的CD8+ T细胞表位。

[0023] 来源于此种病原体的靶肽优选地是包含结合至主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的CD8+ T细胞表位的靶肽。MHC I类分子可以是例如HLA-A、B或C家族的MHC I类。MHC I类分子可以是例如表1或表2中所列举的MHC I类分子。MHC I类分子可以是例如HLA-A*02：01、HLA-A*03：01/HLA-A*11：01、HLA-A*0201、HLA-A*020101、HLA-A*0203、HLA-A*0206、HLA-A2、HLA-A2.1或HLA-A*02。

[0024] 在本发明的一个方面，病原体是病毒，包括但不限于牛痘病毒；水痘带状疱疹病毒；腺病毒；虫媒病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒；冠状病毒；巨细胞病毒；柯萨奇病毒；带状疱疹病毒；1型或2型单纯疱疹病毒；JC病毒；风疹病毒；肝炎病毒，例如甲型肝炎病毒或乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒；甲型或乙型流感病毒；麻疹病毒；腮腺炎病毒；副流感病毒；脊髓灰质炎病毒；天花(痘疮)病毒；狂犬病病毒；呼吸道合胞病毒；鼻病毒；轮状病毒；登革病毒；埃博拉病毒；西尼罗河病毒；黄热病病毒；或寨卡病毒。CD8+ T细胞表位可以来自脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、爱泼斯坦巴尔病毒、流感病毒、巨细胞病毒(CMV)或肝炎病毒。

[0025] 在本发明的一个方面，病原体是细菌。此种细菌的非限制性实例包括百日咳博德特氏菌(bordatella pertussis)；沙眼衣原体(chlamydia trachomatis)；破伤风梭菌(Clostridium tetani)；白喉；流感嗜血杆菌(hemophilus influenza)；脑膜炎球菌；肺炎球菌；霍乱弧菌(vibrio cholera)；结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)；BCG；伤寒；大肠杆菌(E.coli)；沙门氏菌(salmonella)；嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)；立克次氏体(rickettsias)；苍白密螺旋体苍白种(Treponema pallidum pallidum)；A群或B群链球菌；肺炎链球菌(streptococcus pneumonia)；炭疽杆菌(Bacillus anthracis)；肉毒梭菌(chostridium botulinum)；耶尔森氏菌属(Yersinia)某个种，例如鼠疫耶尔森氏菌(yerisnia pestis)。

[0026] 在本发明的一个方面，病原体是寄生虫。此类寄生虫的非限制性实例包括溶组织内阿米巴(enamoeba histolytica)；刚地弓形虫(toxoplasma gondii)；毛线虫属(trichinella)某个种，例如旋毛形线虫(trichinella spiralis)；毛滴虫属
(trichomonas)某个种，例如阴道毛滴虫(tricomnas vaginalis)；锥虫属(trypanosoma)某个种，例如布氏冈比亚锥虫(trypanosoma brucei gambiense)、布氏罗得西亚锥虫
(Trypanosoma brucei rhodesiense)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)。

[0027] 本发明还涉及使用本发明的嵌合VLP和组合物抑制肿瘤生长、增殖和转移的方法。

[0028] 在本发明的一个实施方案中，如本文所描述的本发明的嵌合VLP应用于检测具有能够结合并展示靶肽的CD8+ T细胞表位的MHC分子的抗原呈递细胞，以及检测识别靶肽的CD8+ T细胞表位的CD8+ T细胞。举例来说，来自具有已有免疫反应的动物的脾细胞可以与本发明的嵌合VLP共培养，并且利用例如本领域中已知的免疫荧光染色和干扰素-γCD8+ T细胞活化测定对共培养的细胞评估T细胞的再活化。裸VLP，即，不具有靶肽的VLP可以用作阴性对照。

[0029] 本文所描述的本发明的一个方面是一种通过利用先前感染和/或针对各种病原体接种疫苗所赋予的已有免疫来抑制肿瘤的生长和/或进展和/或转移的方法。本文所描述的方法利用使大的人类群体暴露于各种病原体或针对各种病原体进行免疫的事实。此外，关于后者，其免疫和接种疫苗的记录是可得的。举例来说，在儿童期大的人类群体主动地针对多种病原体用本领域中众所周知的疫苗进行接种疫苗。在本文所描述的方法中，本领域技术人员可以容易地判定患有肿瘤的受试者的接种疫苗/免疫史或感染史，然后施用适当嵌合VLP，所述嵌合VLP展示包含与疫苗相关的T细胞表位的靶肽以引出受试者的现有CD8+记忆T细胞。

[0030] 本发明方法优于已有方法，这是因为其不需要鉴定特异性肿瘤相关抗原以使T细胞靶向特异性肿瘤。因此，本文所描述的方法可以应用于先前针对病原体接种疫苗或受病原体感染的受试者中的所有肿瘤以抑制其生长、进展和转移，而与肿瘤细胞所表达的肿瘤相关抗原无关。

[0031] 在本发明的一个方面，为确定哪个(哪些)嵌合VLP施用于受试者，我们判定受试者是否已经主动地针对给定的病原体用疫苗进行免疫，所述病原体例如病毒，例如甲型流感、肝炎、麻疹或脊髓灰质炎；细菌，例如脑膜炎球菌；真菌，例如白色念珠菌(Candida albicans)；或寄生虫。然后施用包含靶肽的嵌合VLP，所述靶肽含有来自受试者已经针对其进行免疫的病原体的CD8+ T细胞表位。在本发明的一个方面，为确定哪个(哪些)VLP施用于受试者，我们判定受试者是否已经自然地受给定的病原体感染，所述病原体例如病毒，例如甲型流感、肝炎、麻疹或脊髓灰质炎；细菌，例如脑膜炎球菌；真菌，例如白色念珠菌；或寄生虫。然后将包含靶肽的嵌合VLP施用于受试者，所述靶肽含有来自此种病原体的CD8+ T细胞表位。CD8+ T细胞表位是结合MHC I类分子的表位。结合至特定MHC I类分子的CD8+ T细胞表位的非限制性实例在表1和表2中列出(参见Rickinson和Moss，Ann.Rev.Immunology(1997)15：405-431，以引用的方式并入本文中)。本文所描述的方法还可以包括确定受试者所表达的哪个(哪些)MHC I类决定簇，然后施用包含具有已知与那个(那些)MHC I类决定簇形成复合物的CD8+ T细胞表位的靶肽的嵌合VLP。

[0032] 本发明的一个实施方案是一种抑制或预防有需要的受试者中肿瘤的生长、进展和/或转移或癌细胞的增殖的方法，所述方法包括以下步骤：确定肿瘤的组织来源，确定受试者是否已经针对对组织来源具有趋向性的病原体接种疫苗或受所述病原体感染，以及向受试者施用包含病原体或疫苗的抗原组分的CD8+ T细胞表位的嵌合VLP。在本发明的一个方面，将嵌合VLP以足以刺激CD8+ T细胞的量施用于受试者，所述CD8+ T细胞识别与MHC I类分子复合的CD8+表位并且将其细胞毒性活性重定向至肿瘤。在本发明的一个方面，以足以抑制肿瘤的生长、进展和/或转移的量施用嵌合VLP。还可以将嵌合VLP以足以抑制癌细胞的增殖和/或诱导癌细胞的凋亡的量施用于受试者。

[0033] 本发明的一个实施方案是一种抑制或预防有需要的受试者中肿瘤的生长、进展和/或转移或癌细胞的增殖的方法，所述方法包括确定受试者是否已经主动地针对对具有肿瘤块的组织具有趋向性的病原体接种疫苗或受所述病原体感染，以及向受试者施用包含受试者已经针对其进行免疫的病原体或那种疫苗的抗原组分的CD8+ T细胞表位的嵌合VLP。在本发明的一个方面，将嵌合VLP以足以刺激CD8+T细胞，例如具有肿瘤块的组织中的组织驻留记忆T细胞的量施用于受试者，所述T细胞识别与MHC I类分子复合的CD8+表位并且将其细胞毒性活性重定向至肿瘤。在本发明的一个实施方案中，肿瘤块和驻留肿瘤的组织是不同组织类型，例如肺组织中的肝肿瘤转移或脑组织中的肺肿瘤转移。

[0034] 本发明的一个实施方案是一种抑制或预防肿瘤的生长、进展和/或转移或癌细胞的增殖的方法，所述方法包括以下步骤：确定患有肿瘤的受试者是否先前已经针对病原体接种疫苗，所述病原体例如寄生虫、细菌或病毒，例如麻疹病毒、流感病毒、肝炎病毒或脊髓灰质炎病毒中的一种或多种，然后向此种患者施用有效量的包含表面展示的靶肽的一种或多种嵌合VLP，所述靶肽来源于受试者已经针对其接种疫苗的病原体。靶肽包含疫苗中所含的抗原组分的CD8+ T细胞表位。本发明的方法的一个实施方案包括以下步骤：确定患有肿瘤的受试者是否先前已经受病原体感染，所述病原体例如寄生虫、细菌或病毒，例如麻疹病毒、流感病毒、肝炎病毒或脊髓灰质炎病毒中的一种或多种，然后向此种患者施用有效量的包含表面展示的肽的一种或多种嵌合VLP，所述肽包含来源于此类病原体的CD8+ T细胞表位。将嵌合VLP以足以抑制肿瘤的生长、进展和/或转移的量施用于受试者。还可以将嵌合VLP以足以抑制癌细胞的增殖和/或诱导癌细胞的凋亡的量施用于受试者。这种方法还可以包括确定已经针对预选病原体接种疫苗的受试者是否具有针对病原体的记忆T细胞，即，识别病原体的CD8+ T细胞表位的已有CTL。如果受试者不具有此类CTL，那么所述方法还包括将受试者针对病原体再接种疫苗的进一步“加强”步骤。受试者已经再接种疫苗之后，以足以结合肿瘤，从而将CD8+ T细胞特异性CTL重定向至结合有嵌合VPL的肿瘤的量施用包含病原体的CD8+ T细胞表位的嵌合VLP。测定受试者的对给定的CD8+ T细胞表位具有特异性的活化CTL的方法在本领域中是众所周知的。

[0035] 本发明的又一个实施方案是一种抑制或预防原初受试者，即，不具有对预选病原体的表位具有特异性的已有CTL的受试者中肿瘤的生长、进展和/或转移或癌细胞的增殖的方法。原初受试者包括例如先前尚未主动地针对病原体接种疫苗，或自然地对病原体免疫/暴露于病原体的受试者。还可以测定受试者细胞的对预选病原体的表位具有特异性的CTL的存在。可以确定受试者是否已经针对病原体接种疫苗或暴露于病原体，例如，通过复查受试者的接种疫苗记录或询问受试者是否已经接种疫苗或暴露于或接触特定疾病。所述方法包括将有需要的原初受试者针对预选病原体用疫苗主动地接种疫苗。将受试者接种疫苗之后，将展示病原体的CD8+ T细胞表位的本发明的嵌合VLP以足以使嵌合VLP结合至肿瘤，从而将CD8+ T细胞表位特异性CTL重定向至结合有嵌合VLP的肿瘤细胞的量施用于受试者。通过将CTL重定向至嵌合VLP结合的肿瘤细胞来抑制或预防肿瘤的生长、进展和/或转移或癌细胞的增殖。在一个实施方案中，在将受试者接种疫苗以允许在嵌合VLP施用前活化CTL之后1周、2周或更长时间将嵌合VLP施用于受试者。在本发明的一个实施方案中，将原初受试者针对预选病原体接种疫苗，然后监测受试者的对疫苗的CD8+ T细胞表位具有特异性的活化CTL细胞的存在。检测到此类活化CTL之后，将包含CD8+ T细胞表位的嵌合VLP施用于受试者。以足以结合肿瘤并且将对嵌合VLP的CD8+ T细胞表位具有特异性的CTL重定向至结合的肿瘤的量施用嵌合VLP。重定向的CTL然后抑制或预防肿瘤的生长、进展和/或转移或癌细胞的增殖。疫苗可以针对如本文所描述的任何病原体，例如麻疹、腮腺炎、水痘或乙型肝炎。

[0036] 已经报道HPV衣壳(VLP和假病毒粒子(PsV))具有肿瘤趋向性并且直接结合并感染肿瘤细胞，包括例如卵巢和肺癌细胞。参见Kines等International Journal of Cancer(2016年2月15日)138(4)：901-911，以引用的方式并入本文中。Kines报道此种结合可以是硫酸类肝素蛋白多糖(HSPG)依赖性的。不希望受理论约束，预期本文所描述的嵌合VLP优先结合至肿瘤细胞，例如，其相比非肿瘤细胞更多地结合至肿瘤细胞，并且嵌合VLP的存在可以产生吸引浸润性CD8+ T细胞的正向促发炎肿瘤微环境。同时，VLP可以刺激由先前接种疫苗或感染产生并且识别靶肽的CD8+ T细胞表位的适应性记忆T细胞所引起的反应。预期这些强反应能够避开免疫耐受性，并且促使肿瘤细胞易受这种已有免疫，从而抑制肿瘤的生长、进展和转移。

[0037] 可以将本文所描述的嵌合VLP或包含嵌合VLP的组合物静脉内、肌肉内、皮下、腹膜内、鼻内、眼内、皮内、瘤内、经粘膜或作为气雾剂施用于有需要的受试者。

[0038] 在本发明的另一个实施方案中，将本发明的嵌合VLP与另一种抗癌疗法，例如放射疗法、化学疗法、免疫疗法或手术联合施用于患有肿瘤的受试者。举例来说，将嵌合VLP与检查点抑制剂联合施用于患有肿瘤的受试者。本领域中已知并且适用于本发明中的检查点抑制剂包括但不限于伊匹单抗(ipilimumab) 、派姆单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab) 、阿特珠单抗(Atezolizumab)
(Tecentriq)、阿维鲁单抗(Avelumab)(Bavencio)、德瓦鲁单抗(Durvalumab)(Imfinzi)。检查点抑制剂的施用和给药时程在每种检查点抑制剂的处方信息中陈述，所述信息以引用的方式并入本文中。

[0039] 化学治疗剂在本领域中是众所周知的并且包括但不限于阿柏西普(aflibercept)、天冬酰胺酶(asparaginase)、博莱霉素(bleomycin)、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、克拉屈滨(cladribine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、阿糖胞苷(cytarabine)、达卡巴嗪(dacarbazine)、柔红霉素
(daunorubicin)、阿霉素(doxorubicin)、依托泊苷(etoposide)、氟达拉滨(fludarabine)、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲(hydroxyurea)、伊达比星(idarubicin)、异环磷酰胺(ifosfamide)、伊立替康(irinotecan)、洛莫司汀(lomustine)、二氯甲基二乙胺
(mechlorethamine)、美法仑(melphalan)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、甲氨蝶呤
(methotrexate)、丝裂霉素(mitomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、喷司他丁
(pentostatin)、丙卡巴肼(procarbazine)、拓扑替康(topotecan)、长春碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、视黄酸(retinoic acid)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡铂
(carboplatin)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、替尼泊苷(teniposide)、安吖啶
(amasacrine)、多西紫杉醇(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、长春瑞滨
(vinorelbine)、硼替佐米(bortezomib)、氯法拉滨(clofarabine)、卡培他滨
(capecitabine)、放线菌素D(actinomycin D)、表柔比星(epirubicin)、长春地辛
(vindesine)、甲氨蝶呤、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、替吡法尼(tipifarnib)、伊马替尼(imatinib)、埃罗替尼(erlotinib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、达沙替尼(dasatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、拉帕替尼(lapatinib)、吉非替尼(gefitinib)、替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司(everolimus)、雷帕霉素(rapamycin)、博舒替尼(bosutinib)、培唑帕尼(pzopanib)、阿昔替尼(axitinib)、来那替尼(neratinib)、瓦他拉尼(vatalanib)、帕唑帕尼(pazopanib)、米哚妥林(midostaurin)、恩扎妥林
(enzastaurin)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、西妥昔单抗(cetuximab)、帕尼单抗
(panitumumab)、利妥昔单抗(rituximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、马帕木单抗
(mapatumumab)、康纳木单抗(conatumumab)和来沙木单抗(lexatumumab)。使用此类剂的方法在本领域中也是众所周知的。

[0040] 本发明的又一个实施方案是一种药学上可接受的组合物，所述组合物包含本发明的嵌合VLP和一种或多种载体或赋形剂。组合物可以包含例如单一类型的嵌合VLP或多种嵌合VLP以使得嵌合VLP中的至少两种不包含相同靶肽。

[0041] 本发明的另一个方面是一种包含本发明的嵌合VLP的试剂盒。试剂盒可以包括用于确定受试者的接种疫苗/免疫史和/或感染史以及用于将试剂盒中的适当嵌合VLP施用于受试者的说明书。适当嵌合VLP包含靶肽，所述靶肽包含受试者已经主动地针对其进行免疫的病原体或先前已经感染受试者的病原体的CD8+ T细胞表位。说明书还可能包括用于确定由受试者表达或基于种族世系预期由受试者表达的MHC I类分子补体，以及将试剂盒中的适当嵌合VLP施用于受试者的说明书，其中适当嵌合VLP包含结合至由受试者表达或预期由受试者表达的MHC I类分子的病原体的CD8+ T细胞表位。附图说明

[0042] 图1描绘了本文所描述的本发明方法的一个实施方案。具有包含由已有免疫(例如MMR、水痘、脊髓灰质炎)识别的免疫原性CD8+ T细胞表位的靶肽的嵌合VLP选择性地结合至肿瘤细胞以使得避开免疫耐受性并且已有免疫用于控制结合嵌合VLP的肿瘤：作为儿童的受试者接受多种获批准的疫苗，所述疫苗产生T细胞和抗体反应两者的强免疫(白点)(I)；作为成人的受试者不幸地发展出癌症，评估受试者的接种疫苗史并且向受试者施用包含受试者针对其接种疫苗的病原体的CD8+ T细胞表位的本发明的一种或多种嵌合VLP(III)。将受刺激的现有CD8+ T细胞，即回放免疫反应重定向以攻击已经结合嵌合VLP的肿瘤(III)，从而抑制癌症的生长、进展和/或转移(IV)。在一个实施方案中，CTL表位可以进一步来自对驻留肿瘤的所关注器官具有天然组织趋向性的病毒。

[0043] 图2描绘了示出缀合VLP与空的非缀合VLP(50nM)相比稍大(60-70nM)的TEM。

[0044] 图3描绘了缀合至来源于流感、乙型肝炎、麻疹和水痘病毒的表位的HPV 16RG-1 VLP(左图)或野生型HPV 16L1 VLP(右图)的SDS PAGE分析。

[0045] 图4描绘了VLP结合至肿瘤细胞的流式细胞术分析的结果。细胞群体的偏移展示VLP结合至所有测试的肿瘤细胞系。顶行示出了空HPV16 RG-1 VLP结合至各种肿瘤细胞系的结果并且底行示出了具有以重组方式插入一个L1环中的肽的牛乳头状瘤病毒(BPV)VLP的结果。

[0046] 图5描绘了包含靶肽的嵌合VLP的流式细胞术分析的结果。结果展示嵌合VLP的肿瘤结合能力不会因缀合VLP表面上的肽而受损。

[0047] 图6展示了如经由表面CD8和细胞内IFN-γ染色继之以流式细胞术分析评估的OT-1特异性CTL活化。

[0048] 图7展示了如经由表面CD8和细胞内IFN-γ染色继之以流式细胞术分析评估的E7特异性CTL活化。

[0049] 图8描绘了基于由活ID8/luc细胞的荧光素酶表达的生物发光成像的结果。这些细胞通常不被OVA特异性CD8+ T细胞识别。结果展示与AIR-VLP(包含OVA靶肽的嵌合VLP)而不是空的非缀合VLP一起孵育使得肿瘤细胞变得被OVA特异性CD8+ T细胞识别。与AIR-VLP一起孵育引起通过OVA特异性CD8+ T细胞杀伤介导的最大量的肿瘤细胞死亡，这由发光活性的显著降低来展示。

[0050] 图9描绘了基于由活ID8/luc细胞的荧光素酶表达的生物发光成像的结果。这些细胞通常不被E7aa49-57特异性CTL识别。用0.3μg/ml空的非缀合VLP或嵌合VLP-R-E7(缀合至鼠类H2-DB限制的HPV16-E7表位(aa49-57)，即肿瘤相关抗原的牛乳头状瘤病毒VLP)处理ID8/luc肿瘤细胞，然后孵育E7aa49-57特异性CTL。对于用嵌合VLP-R-E7处理并且与E7特异性CTL一起孵育的ID8肿瘤细胞观测到显著较低的荧光素酶活性，这指示在处理之后ID8肿瘤细胞活力的显著降低。

具体实施方式

[0051] 乳头状瘤病毒是小的、双链、环状DNA肿瘤病毒。乳头状瘤病毒病毒粒子壳含有L1主要衣壳蛋白和L2次要衣壳蛋白。在真核或原核表达系统中单独或与L2蛋白质组合的L1蛋白质的表达已知得以组装衣壳粒和VLP。如本文所用的术语“衣壳粒”打算意味着乳头状瘤病毒L1多肽(包括全长L1蛋白质和其片段)的五聚体组装。原生L1衣壳蛋白经由分子间二硫键自组装以形成五聚体(衣壳粒)。

[0052] 乳头状瘤病毒病毒粒子含有L1蛋白质的72个五聚体(衣壳粒)。Trus等，4Nat.Struct.Biol.413-20(1997)。L1蛋白质能够自组装成衣壳样结构，当在真核细胞中表达时其在形态上可与原生病毒粒子区分。参见Buck等，82J.Virol.5190-97(2008)和Roy等，
4Hum.Vaccin.5-12(2008)，两者都以引用的方式并入本文中。L1 单体含有12个β链、6个环(BC、CD、DE、EF、FG、HI)和5个螺旋(H1-H5)。大多数环朝向衣壳的外表面高度暴露，靶肽通过例如二硫键联、马来酰亚胺键联，通过“点击”化学或通过结合至聚离子停泊位点附接至这些环中的一个如本文所描述在这些方面将使得靶肽在VLP的外表面上展示。

[0053] 本发明的一个实施方案是一种嵌合VLP，其包含乳头状瘤病毒(PV)L1蛋白质或PV L1和PV L2蛋白质以及表面展示的靶肽。靶肽包含人类病原体的CD8+ T细胞表位，基本上由上述组成，或由上述组成，其中CD8+ T细胞表位不是肿瘤相关抗原。在本发明的一个方面，靶肽缀合至VLP的半胱氨酸的还原巯基，并且任选地，半胱氨酸不是聚离子：半胱氨酸、聚阳离子：半胱氨酸或聚阴离子：半胱氨酸序列的一部分。VLP可以包含乳头状瘤L1和L2蛋白质两者。靶肽可以经由二硫键联或马来酰亚胺键联缀合至L1蛋白质和/或L2蛋白质的一个或多个还原巯基。在本发明的一个方面，靶肽经由酰胺键联缀合至VLP的赖氨酸和/或精氨酸。

[0054] 如本文所用的术语“病毒样颗粒”或“VLP”是指由衣壳粒的高度有序组装组成的颗粒。VLP是非感染性和非复制性的，而形态上类似于原生乳头状瘤病毒病毒粒子。此种高度有序组装的一个实例是具有整体(72个衣壳粒)或大体上整体的视觉外观的颗粒，即空乳头状瘤病毒衣壳，其直径为约50至约60nm并且具有T＝7二十面体构造。此种高度有序组装的另一个实例是约30至约35nm直径的颗粒，其小于原生乳头状瘤病毒病毒粒子的尺寸并且具有T＝1构造(含有12个衣壳粒)。出于本发明的目的，衣壳粒的其它高度有序组装也打算由术语VLP涵盖。在某些实施方案中，VLP可以复制L1蛋白质或多肽或者L2蛋白质或多肽所来源的原生乳头状瘤病毒的构象表位。组装和形成本发明的人类乳头状瘤病毒VLP和衣壳粒的方法在本领域中是众所周知的。参见例如美国专利号6,165,471、6,153,201和9,149,503以及WO 94/020137，全部以全文引用的方式并入本文中。

[0055] 本发明涉及嵌合乳头状瘤病毒VLP、包含嵌合VLP的组合物、制造嵌合VLP的方法以及嵌合VLP治疗肿瘤的用途。本发明的嵌合乳头状瘤病毒VLP包含靶肽。在一些实施方案中，靶肽包含CD8+ T细胞表位，基本上由CD8+表位组成，或由CD8+ T细胞表位组成。在一些实施方案中，靶肽包含CD8+ T细胞表位和用于使靶肽附接至VLP的连接子，基本上由上述组成，或由上述组成。连接子可以包含用于从VLP中释放CD8+ T细胞表位的酶裂解位点。在本发明的一个方面，CD8+ T细胞表位属于人类病原体，例如寄生虫、真菌、细菌或病毒。病毒的非限制性实例包括牛痘病毒；水痘带状疱疹病毒；带状疱疹病毒；风疹；肝炎病毒，例如甲型肝炎病毒或乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒；流感，例如甲型或乙型；麻疹病毒；腮腺炎病毒；脊髓灰质炎病毒；天花(痘疮)病毒；狂犬病病毒；登革病毒；埃博拉病毒；西尼罗河病毒；黄热病病毒；或寨卡病毒。

[0056] 细菌的非限制性实例包括百日咳博德特氏菌；沙眼衣原体；破伤风梭菌；白喉；流感嗜血杆菌；脑膜炎球菌；肺炎球菌；霍乱弧菌；结核分枝杆菌；BCG；伤寒；大肠杆菌；沙门氏菌；嗜肺军团菌；立克次氏体；苍白密螺旋体苍白种；A群或B群链球菌；肺炎链球菌；炭疽杆菌；肉毒梭菌；耶尔森氏菌属某个种，例如鼠疫耶尔森氏菌。

[0057] 寄生虫的非限制性实例包括溶组织内阿米巴；刚地弓形虫；毛线虫属某个种，例如旋毛形线虫；毛滴虫属某个种，例如阴道毛滴虫；锥虫属某个种，例如布氏冈比亚锥虫、布氏罗得西亚锥虫、克氏锥虫；或疟原虫(plasmodium)，例如恶性疟原虫(plamodium falciparium)、间日疟原虫(plasmodium vivax)或三日疟原虫(plasmodium malariae)。

[0058] 在本发明的一个方面，CD8+ T细胞表位属于脊髓灰质炎病毒、麻疹病毒、爱泼斯坦巴尔病毒、甲型流感病毒或巨细胞病毒(CMV)或乙型肝炎病毒。在本发明的一个方面，CD8+ T细胞表位是表1中所列出的T细胞表位。在本发明的一个方面，CD8+ T细胞表位是：

[0059] KLWESPQEI(SEQ ID NO：6)，

[0060] YVYDHSGEAVK(SEQ ID NO：15)，

[0061] FLPSDFFPSV(SEQ ID NO：69)，

[0062] FLLTRILTI(SEQ ID NO：70)，

[0063] WLSLLVPFV(SEQ ID NO：71)，

[0064] GLSRYVARL(SEQ ID NO：72)，

[0065] FLLSLGIHL(SEQ ID NO：73)，

[0066] (K)GILGFVFTL(T)(V)(SEQ ID NO：217)，

[0067] KLSTRGVQIASNEN(SEQ ID NO：125)，

[0068] RGLQRRRFVQNALNGNG(SEQ ID NO：131)，

[0069] FMYSDFHFI(SEQ ID NO：136)，

[0070] NLVPMVATV(SEQ ID NO：151)，

[0071] VAIIEVDNEQPTTRAQKL(SEQ ID NO：152)，

[0072] TRAQKLFAMWRITYKDTV(SEQ ID NO：153)，

[0073] GACVAIIEVDNEQPTTRAQKLFAMWRITYKDTVQLRRKL的任何9聚体序列(SEQ ID NO：154)，

[0074] SVRDRLARL(SEQ ID NO：167)，

[0075] LLDRVRFMGV(SEQ ID NO：217)，

[0076] CLGGLLTMV(SEQ ID NO：196)，或

[0077] GLCTLVAML(SEQ ID NO：143)。

[0078] SLPRSRTPI(SEQ ID NO：218)，或

[0079] SAPLPSNRV(SEQ ID NO：219)。

[0080] 在本发明的一个方面，靶肽的CD8+ T细胞表位结合至MHC I类分子。MHC I类分子可以来自HLA-A、B、C家族。MHC I类分子可以是表1或表2中所列举的MHC I类分子。MHC I类分子可以是例如HLA-A*02：01、HLA-A*03：01、HLA-A*11：01、HLA-A*0201、HLA-A*020101、HLA-A*0203、HLA-A*0206、HLA-A2、HLA-A2.1或HLA-A*02。

[0081] 在本发明的一个方面，靶肽为约8个氨基酸至约50个氨基酸长度，或约8个氨基酸至约45个氨基酸长度，或约8个氨基酸至约40个氨基酸长度，约8个氨基酸至约35个氨基酸长度，或约8个氨基酸至约30个氨基酸长度，约8个氨基酸至约25个氨基酸长度，约8个氨基酸至约20个氨基酸长度，约8个氨基酸至约15个氨基酸长度。在本发明的一个方面，靶肽为约13个氨基酸至约50个氨基酸长度，或约13个氨基酸至约45个氨基酸长度，或约13个氨基酸至约40个氨基酸长度，约13个氨基酸至约35个氨基酸长度，或约13个氨基酸至约30个氨基酸长度，约13个氨基酸至约25个氨基酸长度，约13个氨基酸至约20个氨基酸长度，约13个氨基酸至约15个氨基酸长度。在本发明的一个方面，CD8+ T细胞表位可以为例如8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个氨基酸长度。

[0082] 在本发明的一个实施方案中，嵌合乳头状瘤病毒VLP包含L1多肽和靶肽。在其它实施方案中，嵌合VLP可以包含L1多肽和L2多肽以及靶肽。L1多肽可以是全长L1蛋白质或L1多肽片段。在特定实施方案中，全长L1蛋白质或L1多肽片段具有VLP组装能力；即，L1多肽将自组装形成衣壳粒，所述衣壳粒有能力自组装成高度有序组装，从而形成VLP。在更特定实施方案中，VLP包含完全组装的乳头状瘤病毒衣壳，一种约50nm的结构并且由L1蛋白质的72个衣壳粒或360个拷贝组成。

[0083] L1序列对于迄今所鉴定的大体上所有乳头状瘤病毒基因型是已知的，并且这些L1序列或片段中的任一个可以用于本发明中。L1多肽的实例包括但不限于全长L1多肽(例如HPV16 L1多肽，SEQ ID NO：205)、缺乏原生C端的L1截短、缺乏原生N端的L1截短，以及缺乏内部结构域的L1截短。参见Conway等，88(4)J.Dental Res.307-17(2009)；Chen等，5Mol.Cell.557-67(2000)；以及Paintsil等，223(1)Virology 238-44(1996)，全部以全文引用的方式并入本文中。LI蛋白质可以是例如经过修饰的L1蛋白质，例如经过修饰的
HPV16L1蛋白质，其中HPV16 L2氨基酸17-36(RG1表位)插入HPV16 L1的DE-表面环内
(Schellenbacher等2013J.Invest Dermatol；133(12)：2706-2713；Slupetzky等，
2007Vaccine 25：2001-10；Kondo等2008J.Med.Virol80；841-6；Schellenbacher等
2009J.Virol 83：10085-95；Caldeira等2010Vaccine 28：4384-93)。

[0084] L2多肽可以是全长L2蛋白质或L2多肽片段。L2序列对于迄今所鉴定的大体上所有乳头状瘤病毒基因型是已知的，并且这些L2序列或片段中的任一个可以用于本发明中。L2多肽的实例包括但不限于全长L2多肽(例如HPV16 L2多肽，SEQ ID NO：207)、缺乏原生C端的L2截短、缺乏原生N端的L2截短，以及缺乏内部结构域的L2截短。

[0085] 可以使用来自任何动物乳头状瘤病毒的L1和任选的L2多肽或其衍生物或片段形成乳头状瘤病毒VLP。因此，人、牛、马、绵羊、猪、鹿、犬、猫、啮齿动物、兔等乳头状瘤病毒的任何已知(或此后所鉴定)的L1和任选的L2序列可以用于制备本发明的VLP或衣壳粒。对于乳头状瘤病毒基因型和其关联性的接近完整清单，参见de Villiers等，Virology 324：17-27(2004)，以引用的方式并入本文中。

[0086] 在某些实施方案中，用于形成VLP的L1和任选的L2多肽来自非人类乳头状瘤病毒或除HPV-6、HPV-11、HPV-16和HPV-18以外的人类乳头状瘤病毒基因型。举例来说，L1和/或L2蛋白质可以来自HPV 1、2、3、4、5、6、8、9、15、17、23、27、31、33、35、38、39、45、51、52、58、66、68、70、76或92。

[0087] 在特定实施方案中，嵌合VLP(无论其包含L1多肽还是L1和L2多肽)包含表面暴露区上的带负电荷氨基酸区域，所述区域能够结合至包含带正电荷氨基酸区域的靶肽。在其它实施方案中，带负电荷氨基酸区域可以在一侧或两侧上侧接有一个或多个半胱氨酸残基(称作聚阴离子：半胱氨酸，或更具体地，聚谷氨酸：半胱氨酸或聚天冬氨酸：半胱氨酸)。在此类情况下，VLP和靶肽的缀合将通过VLP与靶肽的互补氨基酸电荷之间的非共价结合以及半胱氨酸之间的二硫键形成。在其它实施方案中，一个或多个半胱氨酸是远离带电荷氨基酸区域的一个或多个氨基酸，以使得任何二级/三级结构将使带电荷氨基酸区域极接近于一个或多个半胱氨酸。参见例如2014年2月20日公布的美国公布号2014/0050753，以全文引用的方式并入本文中。在本发明的一个实施方案中，靶肽包含CD8+ T细胞表位，例如表1或表2的CD8+ T细胞表位，以及用于使靶肽附接至包含互补聚离子：半胱氨酸序列的VLP的聚离子：半胱氨酸。在本发明的一个实施方案中，靶肽包含CD8+ T细胞表位和用于使靶肽附接至包含互补聚离子：半胱氨酸序列的VLP的聚离子：半胱氨酸以及定位于末端半胱氨酸与CD8+ T细胞表位之间的酶裂解位点，基本上由上述组成，或由上述组成。在本发明的一个实施方案中，靶肽包含末端半胱氨酸，CD8+ T细胞表位，例如表1或表2的CD8+ T细胞表位，以及定位于末端半胱氨酸与CD8+ T细胞表位之间的酶裂解位点，基本上由上述组成，或由上述组成。

[0088] 可以用于产生嵌合VLP的带负电荷氨基酸包括例如谷氨酸和天冬氨酸。这些氨基酸可以单独(例如聚谷氨酸)或组合使用。在一个特定实施方案中，区域包含谷氨酸。带负电荷氨基酸的数目可以改变，并且可以包括约4个至约20个氨基酸、约6个至约18个氨基酸、约8个至约16个氨基酸，等等。在一个特定实施方案中，区域包含约8个带负电荷氨基酸。在一个更特定实施方案中，区域包含EEEEEEEEC(E8C)(SEQ ID NO：214)。在另一个实施方案中，区域包含CEEEEEEEEC(SEQ ID NO：215)。对于使靶肽经由二硫键结缀合至VLP的方法，参见例如Pejawar-Gaddy等Cancer Immunol Immunother (2010)59(11)：1685-1696，以全文引用的方式并入本文中。简单地说，靶肽上聚精氨酸-半胱氨酸部分的存在允许肽停泊至L1颗粒的各种环中所存在的聚阴离子位点(EEEEEEEEC，E8C(SEQ ID NO：214))。两个半胱氨酸残基之间的共价交联应促使这种缔合在氧化条件下不可逆。对于缀合反应，在缀合缓冲液(20mM Tris/HCl pH＝7.5、150mM NaCl、5％甘油、0.5mM CaCl2)中透析纯化的HPV颗粒，然后添加肽和氧化试剂，允许反应在4℃下进行16小时。在孵育结束时，将反应混合物施加至尺寸排阻柱(Sephadex G-100，Pharmacia，体积20ml，流动速率1ml/min，10mM Tris/HCl(pH＝7.4)、150mM NaCl、0.5mM CaCl2)以去除未缀合的肽并更换缓冲液。由SDS-PAGE上L1蛋白质的存在来鉴定在空隙体积中洗脱的缀合的颗粒。通过电子显微术分析缀合的颗粒。本领域普通技术人员可以通过常规实验形成包括表面暴露区(例如一个或多个环)中的聚离子区域并且具有VLP组装能力的VLP。

[0089] 在替代性实施方案中，嵌合乳头状瘤病毒VLP经过工程改造以包含表面暴露区上的带正电荷氨基酸和一个或多个半胱氨酸(聚阳离子：半胱氨酸)的区域，所述区域能够结合至包含带负电荷氨基酸和一个或多个半胱氨酸(聚阴离子：半胱氨酸)的区域的靶肽。

[0090] 在特定实施方案中，嵌合VLP包含L1多肽(例如全长)，其中聚阴离子：半胱氨酸氨基酸区域插入L1多肽的一个或多个环(例如HI环)中。此类区域可以例如插入编码特定环的氨基酸序列中(不缺失对应的L1氨基酸，插入并置换环中的L1氨基酸，或甚至插入并部分缺失特定环中的L1氨基酸)。在特定实施方案中，嵌合VLP包含L2多肽(例如全长)，其中聚阴离子：半胱氨酸氨基酸区域插入其中。插入可以不缺失对应的L2氨基酸，或所述区域可以插入并且氨基酸可以从L2多肽中缺失。使用常规实验的本领域技术人员可以针对聚阴离子氨基酸序列的放置优化嵌合VLP以适合特定靶肽。

[0091] 或者，为使靶肽附接至VLP，VLP的L1和/或L2蛋白质还可以经过修饰以在所关注的位点处包含至少一个第一非天然氨基酸(在本文中也称作非天然氨基酸或非经典氨基酸(nnAA))，并且两个或更多个靶肽可以经过修饰以包含至少一个第二非天然氨基酸，其中第一非天然氨基酸不同于第二非天然氨基酸，并且与第二非天然氨基酸反应。参见例如2016年7月21日公布的美国公布号2016/0206715，以引用的方式并入本文中。一个第一非天然氨基酸的实例是叠氮基高丙氨酸。第二非天然氨基酸的实例是炔丙氧基苯丙氨酸。并入VLP的衣壳蛋白中的叠氮基高丙氨酸的叠氮官能团可以参与与并入靶肽中的炔丙氧基苯丙氨酸的炔官能团的(3+2)环加成点击反应，使得VLP交联至靶肽。在相同VLP内含有其它非天然氨基酸的衣壳蛋白可以类似地参与(3+2)环加成点击反应以产生具有两个或更多个靶肽的VLP。在另一个实施方案中，嵌合VLP可以展示靶肽和CpG。在另一个实施方案中，嵌合VLP可以展示靶肽和核酸或经过修饰的核酸。在另一个实施方案中，嵌合VLP可以展示两个或更多个靶肽和CpG。在一个独立的实施方案中，嵌合VLP可以展示两个或更多个靶肽和核酸或经过修饰的核酸。

[0092] 在本发明的一个实施方案中，VLP的每个衣壳单体亚单位含有至少一个或至少两个非天然氨基酸。举例来说，VLP中非天然氨基酸总数的至少二十分之一可以用于附接靶肽或核酸以产生嵌合VLP。在另一个实施方案中，VLP中非天然氨基酸总数的约四分之一可以用于附接靶肽或核酸。在另一个实施方案中，VLP中非天然氨基酸总数的约三分之一可以用于附接靶肽或核酸。在又一个实施方案中，VLP中非天然氨基酸总数的约一半可以用于附接靶肽或核酸。

[0093] 在本发明的一个方面，从乳头状瘤病毒L1蛋白质，或L1蛋白质和L2蛋白质组装VLP；然后经受足以还原VLP表面上的半胱氨酸残基的巯基的还原条件，同时维持VLP的衣壳样二十面体结构；并且靶肽经由二硫键联或马来酰亚胺键联缀合至巯基。在本发明的一个实施方案中，半胱氨酸在VLP的表面上。在本发明的一个方面，从乳头状瘤病毒L1蛋白质，或L1蛋白质和L2蛋白质组装VLP；并且靶肽经由二硫键联或马来酰亚胺键联缀合至半胱氨酸的巯基，其中缀合反应在氮气气氛下进行。在本发明的一个实施方案中，半胱氨酸在VLP的表面上。

[0094] 在本发明的一个方面，从乳头状瘤病毒L1蛋白质，或L1蛋白质和L2蛋白质组装VLP；然后经受碱性pH值的环境条件，同时维持VLP的衣壳样二十面体结构；并且在N端具有马来酰亚胺基的靶肽经由1-4加成反应缀合至VLP的赖氨酸上的伯胺和/或精氨酸残基上的胍基。在本发明的一个实施方案中，赖氨酸和/或精氨酸在VLP的表面上。

[0095] 在本发明的一个方面，从乳头状瘤病毒L1蛋白质，或L1蛋白质和L2蛋白质组装VLP；然后经受碱性pH值的环境条件，同时维持VLP的衣壳样二十面体结构；并且在N端具有二溴或二碘马来酰亚胺基的靶肽经由1-4加成反应缀合至VLP的赖氨酸残基上的伯胺基和/或精氨酸残基上的胍基。在本发明的一个实施方案中，赖氨酸和/或精氨酸在VLP的表面上。

[0096] 在本发明的一个方面，从乳头状瘤病毒L1蛋白质，或L1蛋白质和L2蛋白质组装VLP；然后经受碱性pH值的环境条件，同时维持VLP的衣壳样二十面体结构；并且在C端具有N-羟基琥珀酰亚胺酯基的靶肽经由酰胺形成缀合至赖氨酸残基上的伯胺基和/或精氨酸残基上的胍基。在本发明的一个实施方案中，赖氨酸和/或精氨酸在VLP的表面上。

[0097] 不同于使靶肽经由例如带负电荷和带正电荷氨基酸的结合或经由基于马来酰亚胺的缀合而附接至VLP，编码靶肽的核酸序列可以插入编码L1蛋白质和/或L2蛋白质的核酸中以使得在表达后，产生融合蛋白，其中靶肽插入L1多肽的环中和/或L2蛋白质中并且在VLP的表面上展示。

[0098] 而且，在本发明的一个实施方案中，在嵌合VLP中，至少十分之一的病毒外套蛋白可以展示靶肽。在另一个实施方案中，至少五分之一的病毒外套蛋白可以展示靶肽。在又一个实施方案中，约一半的病毒外套蛋白可以展示靶肽。在另一个实施方案中，约三分之二的病毒外套蛋白可以展示靶肽。在又一个实施方案中，几乎全部的病毒外套蛋白可以展示靶肽。

[0099] 在本发明的另一个实施方案中，VLP或靶肽还可以包括一种或多种来自以下组的剂：GM-CSF、IL-15、Pam3SK4、聚(I：C)、LPS、鞭毛蛋白(flagellin)、咪喹莫特(imiquimod)以及CpG-X和MPL。

[0100] 在具有或不具有编码靶肽的序列的情况下编码L1蛋白质(例如全长或部分长度的L1多肽)和任选的L2蛋白质(例如全长或部分长度的L2多肽)的基因构建体可以根据本领域普通技术人员所熟知的标准重组程序制备。编码各种多肽组分的DNA分子接合在一起以形成框内基因融合，这产生例如单一开放阅读框架，所述框架表达例如聚离子乳头状瘤病毒衣壳多肽(L1或L1/L2)或包含靶肽的乳头状瘤病毒衣壳多肽(L1或L1/L2)。编码全部或部分L1和/或L1/L2多肽的DNA编码序列或开放阅读框架可以接合至适当调控元件，所述调控元件提供由DNA分子编码的蛋白质的表达(即，转录和翻译)。这些调控序列，通常是启动子、增强子元件、前导序列、转录终止信号等等，在本领域中是众所周知的。

[0101] 在特定实施方案中，在Sf-9昆虫细胞中在使用重组杆状病毒表达L1蛋白质后形成具有或不具有靶肽的VLP。处理和制备杆状病毒载体和杆状病毒DNA的一般方法以及昆虫细胞培养程序是本领域普通技术人员已知的。参见例如Volpers等，69J.Virol.3258-64(1995)；Kirnbauer等，67(12)J.Virol.6929-36(1993)；Kool等，130Arch.Virol.1-16(1993)；Rose等，67(4)J.Virol.1936-44(1993)；以及美国公布号20140050753，各自以全文引用的方式并入本文中。

[0102] 当选择原核宿主细胞用于后续转化时，用于构建重组DNA分子的启动子区域应适于特定宿主。如本领域中众所周知，用于真核宿主细胞中的表达的真核启动子的DNA序列不同于原核启动子的那些。真核启动子和伴随的基因信号在原核系统中可能不被识别或可能不发挥功能，并且此外，原核启动子在真核细胞中不被识别并且不发挥功能。

[0103] 因此，可以使用本领域中已知的标准克隆程序将编码有待根据本发明表达的多肽产物的DNA分子克隆至适合的表达载体中，所述程序包括限制酶裂解和与DNA连接酶接合，如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Press，NY(2001)和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，N.Y.(2008)所描述，各自特此以全文引用的方式并入。可以经由转化，尤其转导、缀合、动员或电穿孔将包括质粒的重组分子引入细胞中。一旦将这些重组质粒引入包括原核生物体和真核细胞的单细胞培养物中，使细胞在组织培养物中生长并且可以复制载体。

[0104] 对于乳头状瘤病毒L1蛋白质(和任选的L2蛋白质)的重组表达和所得VLP组装，上文所产生的重组载体用于感染宿主细胞。可以采用许多载体-宿主组合，包括植物细胞载体(土壤杆菌)和植物细胞、酵母载体和酵母宿主、杆状病毒载体和昆虫宿主细胞、牛痘病毒载体和哺乳动物宿主细胞，或大肠杆菌中的质粒载体。额外哺乳动物表达载体包括来源于腺病毒腺相关病毒、诺达病毒(nodavirus)和逆转录病毒的那些。

[0105] 在替代性实施方案中，适合于乳头状瘤病毒VLP在酵母或哺乳动物细胞中的表达的重组表达载体和调控序列是众所周知的并且可以用于本发明中。参见例如Buonamassa等，293(2)Virology 335-44(2002)；Sasagawa等，2016Virology 126-95(1995)；Hagensee等，67(1)J.Virol.315-22(1993)。还参见美国专利号7,112,330和美国专利公布号2008016637，全部以引用的方式并入本文中。

[0106] 与用于衣壳粒和/或VLP的重组表达和自组装的宿主-载体系统无关，可以从宿主细胞中分离这些产物，然后使用已知技术纯化。在一个实施方案中，可以通过以CsCl或蔗糖梯度离心来纯化嵌合乳头状瘤病毒VLP。参见Sasagawa等，2016Virology 126-95(1995)；Volpers等，69J.Virol.3258-64(1995)；Rose等，75J.Gen.Virol.2445-49(1994)；
Kirnbauer等，67(12)J.Virol.6929-36(1993)；Rose等，67(4)J.Virol.1936-44(1993)。大体上纯的VLP制剂可以与靶肽缀合，然后用于本发明的方法中。

[0107] 在本文中的本发明的一个实施方案中，L1蛋白质和L2蛋白质基本上是野生型型式，不同之处在于靶肽的附接或插入以及对附接所需的L1和L2序列的改变。然而，技术工作者将认识到还可以使用L1和L2蛋白质的变体，前提条件是蛋白质可以耐受适合靶肽的插入或附接并且可以组装成VLP，或至少五聚体(衣壳粒)。已经描述了此类变体的若干实例。举例来说，可以使用截短的L1，从其N端缺乏至多10个氨基酸或从其C端缺乏至多30个氨基酸。(参见例如Chen等，J Mol Bio 2001年3月16日；307(1)：173-82，或Bishoop等(2007)Journal of Biological Chemistry 282，31803-31811，两者都以引用的方式并入用于公开制造和使用此类截短的L1蛋白质)。在另一个实施方案中，可以使用与约60个氨基酸的肽的小型融合体。(参见例如Virology 1997年7月21日；234(1)：93-111，以引用的方式并入用于公开此类融合肽)。在另一个实施方案中，可以使用杂交L1分子，其中来自第一PV株的分子的一个部分交换成来自第二PV株的L1分子。举例来说，L1分子的某些功能部分，例如蛋白质的外部暴露“环”，可以在来自不同PV株的分子之间交换。对于此类杂交L1蛋白质的实例，参见例如Christensen等，Virology 2001年12月20日：291(2)：324-34或Oroczo等(2005)J Virol 79，9503-9514，两者都以引用的方式并入用于公开此类杂交L1蛋白质。其它类型的变体将为技术工作者显而易见。参见例如Carter等，J Virol 2006年5月；80(10)：4664-72；
White等(1999)J Virology 73，4882-4889；或Roden等(1997)J Virol 71，6247-52，全部以引用的方式并入本文中用于公开L1的其它类型的适合变体。用于本发明的嵌合VLP中的L1蛋白质的另一个适合实例是经过修饰以呈现HPV16 L1的DE-表面环内的HPV16 L2氨基酸
17-36(RG1表位)的HPV 16 L1蛋白质(Schellenbacher等2013J.Invest Dermatol；133
(12)：2706-2713；Slupetzky等，2007Vaccine 25：2001-10；Kondo等2008J.Med.Virol80；
841-6；Schellenbacher等2009J.Virol83：10085-95；Caldeira等2010Vaccine 28：4384-
93，全部以全文引用的方式并入本文中)。

[0108] 靶肽可以在蛋白质的多种位点中的任一个处工程改造至L1或L2蛋白质中或L1或L2蛋白质上，前提条件是插入物在VLP的表面上展示并且插入不干扰蛋白质组装成VLP的能力。L1 HPV16 VLP的结晶已经揭示病毒衣壳的原子结构，特别是含有免疫显性和构象依赖性表位的高变表面环，所述表位由中和抗体识别并且确定病毒血清型(Chen等(2000)Molecular Cell 5，557-567，以引用的方式并入本文中)。因此，用于靶肽插入或附接至L1蛋白质中的适合位点将为技术工作者显而易见。

[0109] 靶肽可以插入或附接至乳头状瘤病毒L1多肽的环BC、CD、DE、EF、FG、HI中的任一个。在本发明的一个实施方案中，靶肽附接至或插入L1的DE环中，例如在BPV1的氨基酸133与134之间，在HPV16L1的氨基酸136与137之间，或在来自其它乳头状瘤病毒的L1分子的等效位点之间。在本发明的其它实施方案中，靶肽附接至或插入螺旋B4环中(例如在HPV16 L1的氨基酸430与433之间)。

[0110] 靶肽所附接或插入的L1蛋白质可以来自乳头状瘤病毒(PV)的多种类型(毒株/基因型)中的任一种，例如人类PV(例如HPV 1、2、3、4、5、6、8、9、11、15、16、17、18、23、27、31、33、35、38、39、45、51、52、58、66、68、70、76或92)、牛PV(例如BPV1、BPV2、BPV4、BPV6)或犬口腔PV(COPY)。

[0111] 如本文所用的术语“抗原”是能够由T细胞受体结合的分子。抗原另外能够诱导体液反应和/或细胞免疫反应，从而刺激B-淋巴细胞和/或T-淋巴细胞，并且优选地关于本文所取得的发明，抗原当与MHC I类分子复合时刺激CD8+ T淋巴细胞。引起生物反应的抗原的结构方面在本文中称作“抗原决定簇”或“表位”并且是同义的。B-淋巴细胞经由抗体产生对外来抗原决定簇有反应，而T-淋巴细胞是细胞免疫的介体。因此，抗原决定簇或表位是由抗体识别或在MHC的情形中由T细胞受体识别的抗原的那些部分。抗原决定簇或表位不需要是蛋白质的相连/连续序列或区段并且可以包括彼此不紧邻的各种序列。

[0112] 关于特定氨基酸序列，“表位”是由特定免疫球蛋白识别中所涉及的一组氨基酸残基，或在T细胞的情形中是由T细胞受体蛋白质和/或MHC受体识别所必需的那些残基。表位的氨基酸残基不需要是相连/连续的。在免疫系统设置中，即活体内或试管内，表位是分子的集体特征，例如一级、二级和三级肽结构以及电荷，其一起形成由免疫球蛋白、T细胞受体或HLA分子识别的位点。

[0113] 如本文所用的“T细胞表位”意味着肽或蛋白质的特征，与细胞表面上的MHC分子缔合的所述特征由T细胞受体识别以起始对包含那种抗原的肽的免疫反应。T细胞表位由T细胞识别一般据信是经由以下机制：其中T细胞识别结合至抗原呈递细胞上表达的MHC I类或II类分子的抗原的肽片段。在本发明的一些实施方案中，包含T细胞表位的靶肽和本文所描述的嵌合VLP应用于检测具有能够结合并展示靶肽的T细胞表位的MHC分子的抗原呈递细胞。T细胞表位通常需要结合至I类或II类MHC分子的短肽，形成可以由T细胞识别的三元复合物(MHC I类α链、β-2-微球蛋白和肽)，所述T细胞带有以适当亲和力结合至MHC/肽复合物的匹配T细胞分子。结合至MHC I类分子的肽通常是8-14个氨基酸长度，并且最通常是9个氨基酸长度。

[0114] 如本文所用的“HPV”和“人类乳头状瘤病毒”是指能够感染人类的乳头状瘤病毒科的成员。存在两大组由趋向性定义的HPV(生殖器/粘膜组和皮肤组)，每一组含有多种病毒“类型”或“毒株/基因型”(例如HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 32，等等)。

[0115] 根据世界卫生组织(World Health Organization)，“疫苗是改善对特定疾病的免疫的生物制剂。疫苗通常含有类似致病微生物，并且常常由削弱或杀灭形式的微生物、其毒素或其表面蛋白质中的一种制成的剂。所述剂刺激身体的免疫系统将剂识别为外来的，破坏其，并且“记住”其，以使得免疫系统可以更容易地识别并破坏以后所遭遇的这些微生物中的任一种。”参见www.who.int/topics/vaccines/en/。

[0116] 术语“VLP疫苗”是指含有本发明的1种、2种、3种、4种、5种或更多种嵌合VLP的配方。包含本发明的嵌合VLP的组合物将通常呈能够施用于受试者以重定向现有免疫并且抑制肿瘤的增殖、生长和/或转移的形式。通常，VLP疫苗包含本发明的组合物悬浮或溶解于其中的常规盐水或缓冲水溶液介质，不过还预期干粉的施用，例如通过吸入，以及甚至具有额外佐剂(例如明矾)的配方。本发明的组合物可以用于抑制肿瘤的增殖、生长和/或转移。在引入宿主中后，本发明的含有嵌合VLP的组合物(例如VLP疫苗)能够激发免疫反应，包括但不限于细胞因子的产生和/或细胞毒性T细胞、抗原呈递细胞、辅助T细胞、树突状细胞的活化和/或其它细胞反应。

[0117] 如本文所用的“治疗性”组合物是经过设计并且施用于患有肿瘤的患者的组合物。治疗性组合物(例如含有嵌合VLP的治疗性组合物)用于治疗良性或恶性肿瘤。在本发明的一些实施方案中，将嵌合VLP施用于先前患有肿瘤并且当前表观上无肿瘤/癌症的受试者以抑制肿瘤/癌症的复发。

[0118] 术语“抑制”、“减少”或“预防”或这些术语的任何变型当在权利要求书和/或说明书中使用时包括任何可测量的降低或完全抑制以达成所需结果，例如抑制、减少或预防肿瘤生长、增殖和/或转移。

[0119] 在本申请通篇，术语“约”用于指示值包括用于确定所述值的装置或方法的误差的标准偏差。

[0120] 如本文所用的“受试者”或“有需要的受试者”包括患有肿瘤/癌症或已经患有肿瘤/癌症的任何动物。适合的受试者(患者)包括实验动物(例如小鼠、大鼠、兔、天竺鼠或猪)、农畜(例如牛)、竞技动物(例如犬或马)、家畜或宠物(例如马、犬或猫)、非人类灵长类动物和人类。

[0121] 如本文所用的术语“蛋白质”、“多肽”和“肽”不局限于任何特定数目的氨基酸；这些术语有时在本文中可互换使用。本发明的蛋白质和编码其的核酸的特性和氨基酸序列是众所周知的并且可以常规地确定，以及从各种已知数据库下载。参见例如NCBI GenBank数据库。本文提供了一些序列。然而，常规地更新一些序列信息(例如以校正先前条目中的错误)，因此更新(校正)的关于蛋白质和编码其的核酸的信息包括于本申请中。本文所论述的序列数据库中提供的信息以引用的方式并入本申请中。

[0122] 如本文所用的术语“嵌合VLP”打算表示包含靶肽的VLP。这个术语并不打算关于靶肽与VLP结合或附接在一起的特定方式或靶肽插入VLP中的特定方式赋予任何含义。在本发明的一个实施方案中，靶肽经由二硫键联、马来酰亚胺或酰胺键联缀合至VLP。

[0123] 术语“HPV”和“人类乳头状瘤病毒”是指能够感染人类的乳头状瘤病毒科的成员。存在两大组由趋向性定义的HPV(生殖器/粘膜组和皮肤组)，每一组含有多种病毒“类型”或“毒株”(例如HPV5、HPV 16、HPV 18、HPV 31、HPV 32，等等)。

[0124] “检查点抑制剂”是一种类型的药物，其阻断由一些类型的免疫系统细胞(例如T细胞)和一些癌细胞制造的某些蛋白质，即“检查点蛋白质”。检查点蛋白质帮助保持免疫反应处于检查中并且可以阻止T细胞杀伤癌细胞。当检查点蛋白质受抑制时，免疫系统上的制动器被释放并且T细胞能够更好地杀伤癌细胞。T细胞或癌细胞上发现的检查点蛋白质的实例包括PD-1/PD-L1和CTLA-4/B7-1/B7-2、CD86、GITR、LAG3、VISTA、TIGIT和CD137L。检查点抑制剂的实例包括但不限于伊匹单抗派姆单抗和纳武单抗阿特珠单抗阿维鲁单抗德瓦鲁单
抗

[0125] “MHC”或“主要组织相容性复合物”是一组基因，其编码在细胞表面上发现的帮助免疫系统识别外来物质的蛋白质。MHC蛋白质在所有高等脊椎动物中发现。存在两种主要类型的MHC分子，即MHC I类和MHC II类。在人类中，存在编码MHC I类分子(人类的MHC分子也被指定为人类白细胞抗原(HLA))的三种不同遗传基因座：HLA-A、HLA-B和HLA-C。HLA-A*01、HLA-A*02和HLA-A*11是可以从这些基因座表达的不同MHC I类等位基因的实例。

[0126] 预期本文所提供的清单中的一个或多个成员可以特定地从所要求的发明中排除或包括于所要求的发明中。

[0127] 制造VLP的方法在本领域中是已知的，参见例如美国专利号9,149,503和美国专利号9,580,474，以引用的方式并入本文中。本发明的一个方面是一种制造本发明的嵌合VLP(或其多肽组分)的方法。在本发明的一个方面，使用如针对特定氨基酸序列加以修改的常规方法来合成T细胞表位。此类技术包括例如肽合成领域的技术人员所熟知的方法，例如溶液相合成(参见Finn等Proteins，第3版，Neurath和Hill(编)，Academic Press，NY，2，105-253，1976)，或固相合成(参见Barany等The Peptides，Gross和Meienhofer(编)，Academic Press，NY，3-284，1979)，或如Merrifield等(1963)J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154所报道的逐步固相合成，每个文献的内容以引用的方式并入本文中。关于肽合成技术的其它参考文献包括通过如Lu等(1981)J.Org.Chem.46，3433所公开的固相肽合成的Fmoc-聚酰胺模式合成的肽，使用Fmoc/tBu程序(Atherton等Solid Phase Peptide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press，Oxford，1989)合成的肽。Fmoc氨基酸可以获自各种供应商，例如Chem-Impex International(Wood Dale，Ill.，USA)、Merck Biosciences(Nottingham，UK)和Bachem UK Ltd.(St.Helens，UK)。可以使用本领域中已知的方法使所合成的肽附接至VLP。在本发明的一个实施方案中，制造本文所描述的嵌合VLP的方法包括通过本领域中已知的方法从乳头状瘤病毒L1蛋白质组装VLP，使VLP经受足以还原VLP的还原条件，但同时仍维持VLP的衣壳样二十面体结构，以及使靶肽缀合至VLP，从而形成嵌合VLP。靶肽可以经由二硫、马来酰亚胺或酰胺键联缀合至还原或活化的VLP。举例来说，在本发明的一个实施方案中，靶肽经由二硫键联或马来酰亚胺键联缀合至嵌合VLP的L1或L2蛋白质或L1和L2蛋白质两者上的半胱氨酸的巯基。靶肽可以经由二硫键联或马来酰亚胺键联缀合至嵌合VLP的L1或L2蛋白质或L1和L2蛋白质两者上的半胱氨酸的巯基。还原的半胱氨酸可以在VLP的表面上。在本发明的一个实施方案中，VLP的L1或L2蛋白质可以包含每个L1或L2蛋白质平均一个靶肽、两个靶肽、三个靶肽、四个靶肽或五个靶肽。在本发明的一个实施方案中，平均三个至五个靶肽缀合至嵌合VLP的每个L1或L2蛋白质。在本发明的一个实施方案中，VLP的至少
30％的表面半胱氨酸包含靶肽。在本发明的一个实施方案中，VLP的约35％、40％、45％、
50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的表面半胱氨酸包含靶肽。在本发明的一个实施方案中，VLP的约30％至50％的表面半胱氨酸包含靶肽。

[0128] 在本发明的一个实施方案中，靶肽可以经由酰胺键联缀合至嵌合VLP的L1或L2蛋白质或L1和L2蛋白质两者上的赖氨酸或精氨酸。缀合至靶肽的赖氨酸和/或精氨酸可以在VLP的表面上。在本发明的一个实施方案中，VLP的至少30％的表面赖氨酸和/或表面精氨酸包含靶肽。在本发明的一个实施方案中，VLP的约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的表面赖氨酸和/或表面精氨酸包含靶肽。在本发明的一个实施方案中，VLP的约30％至50％的表面赖氨酸和/或表面精氨酸包含靶肽。

[0129] 在本发明的一个实施方案中，VLP的约30％至50％的表面赖氨酸和表面半胱氨酸缀合至靶肽。在本发明的一个实施方案中，VLP的至少30％的表面赖氨酸和/或表面半胱氨酸缀合至靶肽。在本发明的一个方面，表面半胱氨酸和表面赖氨酸缀合至靶肽以使得约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％的表面半胱氨酸和赖氨酸缀合至靶肽。赖氨酸和半胱氨酸可以缀合至具有相同CD8+ T细胞表位的靶肽或缀合至具有不同CD8+ T细胞表位的靶肽以使得VLP缀合至具有不同CD8+ T细胞表位的多个靶肽。

[0130] 在本发明的一个实施方案中，VLP的约30％至50％的表面精氨酸和表面半胱氨酸缀合至靶肽。在本发明的一个实施方案中，VLP的至少30％的表面精氨酸和/或表面精氨酸缀合至靶肽。在本发明的一个方面，表面半胱氨酸和表面精氨酸缀合至靶肽以使得约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的表面半胱氨酸和表面精氨酸缀合至靶肽。精氨酸和半胱氨酸可以缀合至具有相同CD8+ T细胞表位的靶肽或缀合至具有不同CD8+ T细胞表位的靶肽以使得VLP缀合至具有不同CD8+ T细胞表位的多个靶肽。

[0131] 在本发明的一个实施方案中，缀合至VLP的所有靶肽包含相同CD8+ T细胞表位。在本发明的另一个实施方案中，VLP缀合至多个靶肽，其中所述靶肽包含不同CD8+ T细胞表位。CD8+ T细胞表位可以属于相同病原体或不同病原体。

[0132] 本发明的又一个实施方案是一种包含本文所描述的嵌合VLP的群体和药学上可接受的赋形剂的组合物。嵌合VLP的群体可以是相同嵌合VLP的群体或不同嵌合VLP的群体。

[0133] 或者，本发明的多肽(例如靶肽)和L1或L2蛋白质可以按重组方式制备。本发明提供了含有DNA的重组克隆和表达载体，以及含有重组载体的宿主细胞。包含DNA的表达载体可以用于制备由DNA编码的多肽(例如靶肽)以及L1和L2蛋白质。一种产生多肽的方法包括在促进多肽表达的条件下培养用编码多肽的重组表达载体转化的宿主细胞，然后从培养物中回收表达的多肽。技术人员将认识到纯化表达的多肽的程序将根据以下因素而变化：例如所采用的宿主细胞的类型，以及多肽是膜结合的还是从宿主细胞中分泌的可溶性形式。本发明的多肽可以包括引导运输或帮助纯化的各种前导序列。

[0134] 可以采用任何适合的表达系统。载体包括编码多肽(例如靶肽)、L1或L2蛋白质或者包含本发明的L1或L2蛋白质和靶肽的多肽的DNA，所述DNA可操作地连接至适合的转录或翻译调控核苷酸序列，例如来源于哺乳动物、微生物、病毒或昆虫基因的那些。调控序列的实例包括转录启动子、操纵子或增强子、mRNA核糖体结合位点，以及控制转录和翻译起始和终止的适当序列。当调控序列功能上与DNA序列相关时，核苷酸序列可操作地连接。因此，如果启动子核苷酸序列控制DNA序列的转录，那么启动子核苷酸序列可操作地连接至DNA序列。赋予在所需宿主细胞中复制的能力的复制起点和鉴定转化体的选择基因一般并入表达载体中。

[0135] 用于多肽表达的适合的宿主细胞包括原核生物、酵母或高等真核细胞。哺乳动物或昆虫细胞适合用作宿主细胞。用于与细菌、真菌、酵母和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当克隆和表达载体在例如Pouwels等Cloning Vectors：A Laboratory Manual，Elsevier，N.Y.，1985中描述。还可以采用无细胞翻译系统以使用来源于本文所公开的DNA构建体的RNA产生多肽。一般来说，本文所提及的分子生物学方法在本领域中是众所周知的并且在例如Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，现行版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&sons，New York，N.Y中描述。

[0136] 使多肽组装成VLP的方法是众所周知的和常规的，纯化VLP用于受试者中的方法也是如此。对于自组装的适合条件，参见例如本文的实施例中或Kirnbauer等(1993)J Virol 67，6929-6936；Volpers等(1994)Virology 200，504-512；或Chen等，J Mol Biol 2001年3月16日；307(1)：173-82中所描述的方法，所有文献以引用的方式并入用于描述此类方法。

[0137] 本发明的方法包括用有效量的本发明嵌合VLP治疗现有肿瘤。本发明的方法包括将本发明的嵌合VLP以足以抑制肿瘤生长、进展或转移的量施用于有需要的受试者。在本发明的方法的一个实施方案中，将嵌合VLP以足以刺激细胞因子产生和/或细胞免疫，尤其先天性免疫，包括刺激巨噬细胞和自然杀伤细胞的细胞毒性活性的量施用于有需要的受试者。在本发明的方面，有需要的受试者是先前已经治疗肿瘤并且当前根据医学标准被视为无癌症或无疾病的受试者。

[0138] 本发明的一个方面是一种通过将本发明的嵌合VLP施用于有需要的受试者来治疗所述受试者的癌症的方法，其中靶肽的CD8+表位属于对作为癌症来源的组织(“来源组织”)具有趋向性的病原体。所述方法包括确定来源组织，确定受试者是否已经主动地针对对来源组织具有趋向性的病原体接种疫苗或受所述病原体感染，然后向受试者施用有效量的本发明的嵌合VLP，其中靶肽的CD8+表位属于先前施用于受试者的疫苗中的抗原决定簇或感染受试者的病原体。

[0139] 本领域中已知一些病毒对特定类型的组织展示趋向性。举例来说：对脑组织展示趋向性的病毒包括但不限于JC病毒、麻疹、LCM病毒、虫媒病毒和狂犬病；对眼组织展示趋向性的病毒包括但不限于单纯疱疹病毒、腺病毒和巨细胞病毒；对鼻组织展示趋向性的病毒包括但不限于鼻病毒、副流感病毒和呼吸道合胞病毒；对口腔组织，例如口腔粘膜、齿龈、唾液腺、咽展示趋向性的病毒包括但不限于I型和II型单纯疱疹病毒、腮腺炎病毒、爱泼斯坦巴尔病毒和巨细胞病毒；对肺组织展示趋向性的病毒包括但不限于甲型和乙型流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒和SARS冠状病毒；对神经组织，例如脊髓展示趋向性的病毒包括但不限于脊髓灰质炎病毒和HTLV-1；对心脏组织展示趋向性的病毒包括但不限于柯萨奇B病毒(Coxsackie B virus)；对肝组织展示趋向性的病毒包括但不限于甲型、乙型和丙型肝炎病毒；对胃肠组织，例如胃和大肠和小肠展示趋向性的病毒包括但不限于腺病毒、轮状病毒、诺如病毒(norovirus)、星状病毒和冠状病毒；对胰腺组织展示趋向性的病毒包括但不限于柯萨奇B病毒；对皮肤组织展示趋向性的病毒包括但不限于水痘带状疱疹病毒、单纯疱疹病毒6、天花病毒、触染性软疣、乳头状瘤病毒、细小病毒B19、风疹、麻疹和柯萨奇A病毒(coxsackie A virus)；并且对生殖器组织展示趋向性的病毒包括但不限于2型单纯疱疹、乳头状瘤病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV)。

[0140] 本发明的一个方面是一种治疗肺癌的方法，所述方法包括确定受试者是否已经主动地针对感染肺细胞的病原体，例如流感病毒，例如甲型或乙型流感病毒接种疫苗，然后施用有效量的本发明的嵌合VLP，其中靶肽的CD8+ T细胞表位属于疫苗中所含的病原体的抗原决定簇并且所述T细胞表位与受试者的MHC I类分子形成复合物。在治疗肺癌的本发明的方法的一个方面包括确定受试者是否已经受感染肺细胞的病原体，例如流感病毒，例如甲型或乙型流感病毒感染，然后施用有效量的本发明的嵌合VLP，其中靶肽的CD8+ T细胞表位属于那种病原体并且所述T细胞表位与受试者的MHC I类分子形成复合物。

[0141] 本发明的一个方面是一种通过施用本发明的嵌合VLP治疗口腔癌的方法，所述口腔癌是通常称作头颈癌的癌症组的一部分，其中靶肽的CD8+表位属于对口腔组织具有趋向性的病原体，例如腮腺炎病毒、爱泼斯坦巴尔病毒、巨细胞病毒或1型单纯疱疹病毒。所述方法包括确定有需要的受试者是否已经主动地针对例如腮腺炎病毒、爱泼斯坦巴尔病毒、巨细胞病毒或1型单纯疱疹病毒接种疫苗或受所述病毒感染，以及受试者先前是否已经接种疫苗或感染，然后向受试者施用本发明的嵌合VLP，其中靶肽的CD8+表位属于腮腺炎病毒或麻疹病毒，或属于受试者已经接受的疫苗的抗原组分，或属于先前已经感染受试者的病原体，即，腮腺炎、麻疹、爱泼斯坦巴尔病毒、巨细胞病毒或1型单纯疱疹病毒。

[0142] 本发明的一个方面是一种通过向有需要的受试者施用有效量的本发明的嵌合VLP来刺激巨噬细胞和自然杀伤细胞的细胞毒性活性的方法。巨噬细胞和自然杀伤细胞可以是肿瘤微环境中存在的那些。在本发明的一个方面，将嵌合VLP以有效刺激肿瘤微环境中已经存在的巨噬细胞和自然杀伤细胞的细胞毒性活性的量施用于受试者。在本发明的一个方面，将嵌合VLP以有效吸引巨噬细胞和自然杀伤细胞至肿瘤微环境的量施用于受试者。

[0143] 在本发明的一个方面，将嵌合VLP以有效结合足够数目的针对靶肽的抗体以吸引并刺激巨噬细胞、嗜中性粒细胞和自然杀伤细胞的量施用于受试者。

[0144] 本发明的一个方面是一种通过向有需要的受试者施用有效量的本发明的嵌合VLP将现有记忆CD8+ T细胞的细胞毒性活性重定向至肿瘤细胞或肿瘤微环境的方法。优选地，嵌合VLP的靶肽的T细胞表位来自受试者已经主动地针对其接种疫苗的病原体或来自先前已经感染受试者的病原体，并且受试者具有识别与肿瘤细胞上的MHC I类分子复合的T细胞表位的记忆CD8+ T细胞。在本发明的一个方面，嵌合VLP的有效量是足以吸引记忆CD8+ T细胞至肿瘤微环境的量。在本发明的一个方面，嵌合VLP的有效量是足以刺激肿瘤微环境中存在的记忆CD8+ T细胞的量。

[0145] 本发明的一个方面是一种通过向有需要的受试者施用本发明的嵌合VLP将如本文所描述的靶肽引入肿瘤微环境中的方法。在本发明的一个方面，靶肽的CD8+ T细胞表位以足以刺激肿瘤微环境中的记忆CD8+ T细胞的量从VLP释放至所述微环境中。在本发明的一个方面，嵌合VLP和/或嵌合VLP的靶肽易于由肿瘤微环境中的蛋白水解酶裂解并且嵌合VLP或靶肽中的靶裂解位点的位置使得靶位点的裂解将包含CD8+ T细胞表位的全部或一部分靶肽从嵌合VLP释放至肿瘤微环境中。在本发明的一个方面，裂解位点由以下识别：弗林蛋白酶；基质金属蛋白酶(MMP)，例如MMP 1、2、3、7、8、9、11、13、14或19；ADAM(去整合素和金属蛋白酶)，例如ADAMS 8、9、10、15、17或28；组织蛋白酶，例如组织蛋白酶B、D，D、G或H、N；弹性蛋白酶；蛋白酶-3；天青杀素；或ADAMTS-1。嵌合VLP的足量由技术人员容易地确定并且将了解，所述量将取决于例如受试者的特征，例如受试者的年龄、体重、性别、医疗状况，以及肿瘤的特征，例如类型、体积和发展状态。

[0146] 在本发明的一个方面，嵌合VLP和/或嵌合VLP的靶肽易于由肿瘤细胞内的蛋白水解酶裂解并且VLP或靶肽中的靶裂解位点的位置使得靶位点的裂解将包含CD8+ T细胞表位的全部或一部分靶肽从嵌合VLP中释放，所述嵌合VLP与肿瘤细胞的MHC I类分子复合。嵌合VLP的足量由技术人员容易地确定并且将了解，所述量将取决于例如受试者的特征，例如受试者的年龄、体重、性别、医疗状况，以及肿瘤的特征，例如类型、体积和发展状态。

[0147] 在本发明的一个方面，为选择本发明的一种或多种适当嵌合VLP以施用于有需要的受试者，判定受试者是否已经主动地针对给定的病原体，例如寄生虫、细菌或病毒，例如麻疹或脊髓灰质炎接种疫苗，然后选择本发明的嵌合VLP并施用于受试者，其中靶肽的CD8+ T细胞表位来自受试者已经针对其进行免疫的病原体。通过复查受试者的医疗记录或询问受试者可以判定受试者是否已经主动地针对特定病原体接种疫苗。在本发明的一个方面，为选择一种或多种适当嵌合VLP以施用于有需要的受试者，判定受试者先前是否已经受给定的病原体，例如寄生虫、细菌或病毒，例如麻疹或脊髓灰质炎感染并且使感染消退，然后选择嵌合VLP并施用于受试者，其中靶肽的CD8+ T细胞表位是来自此种病原体的CD8+ T细胞表位。通过复查受试者的医疗记录或询问受试者可以判定受试者是否已经受特定病原体感染。结合至特定MHC I类分子的CD8+ T细胞表位的非限制性实例在表1和表2中列出。所述方法还可以包括确定受试者的细胞所表达的哪个(哪些)MHC I类决定簇，然后施用本发明的嵌合VLP，其中靶肽的CD8+ T细胞表位是疫苗中的病原体或先前感染受试者的病原体的抗原组分的CD8+ T细胞表位，所述表位与受试者的一个或多个MHC I类决定簇形成复合物。

[0148] 此外，在一些实施方案中，本文所描述的嵌合VLP与其它癌症治疗疗法，例如放射疗法、化学疗法、手术和/或免疫疗法联合施用。在本发明的一些方面，本文所描述的嵌合VLP与检查点抑制剂联合施用。本发明的嵌合VLP和其它疗法或治疗剂可以通过相同或不同施用途径同时或依序施用。用于本发明的方法中的一种或多种治疗剂的身份和量的确定可以由普通技能的开业医师使用本领域中已知的标准技术容易地进行。

[0149] VLP具有佐剂特性。在一些实施方案中，本发明的嵌合VLP组合物的免疫原性可以通过使用免疫反应的额外非特异性刺激剂来增强，所述刺激剂被称为佐剂。适合的佐剂包括所有可接受的免疫刺激性化合物，例如细胞因子、毒素或合成组合物，例如明矾。

[0150] 佐剂包括但不限于水包油乳液、油包水乳液、矿物盐、多核苷酸和天然物质。可以使用的特定佐剂包括IL-1；IL-2；IL-4；IL-7；IL-12；γ-干扰素；GM-CSF；BCG；铝盐，例如氢氧化铝或其它铝化合物；MDP化合物，例如thur-MDP和nor-MDP；CGP(MTP-PE)；脂质A和单磷酰脂质A(MPL)；或灭活的微生物剂。RIBI含有从细菌中提取的三种组分，于2％角鲨烯/Tween 80乳液中的MPL、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)。甚至可以使用MHC抗原。其它佐剂或方法在美国专利号6,814,971、5,084,269、6,656,462中例示，每个专利以引用的方式并入本文中。

[0151] 达成佐剂对嵌合VLP组合物的影响的各种方法包括使用如氢氧化铝或磷酸铝(明矾)的剂，通常以于磷酸盐缓冲盐水中的约0.05％至约0.1％溶液使用，与以约0.25％溶液使用的糖的合成聚合物混合，通过在约70℃至约101℃之间的范围内的温度下分别热处理30秒至2分钟的时段使组合物中的蛋白质聚集。通过用胃蛋白酶处理的针对白蛋白的(Fab)抗体再活化而聚集；与革兰氏阴性菌的细菌细胞(例如短小棒状杆菌(C.parvum))、内毒素或脂多糖组分混合；于生理上可接受的油媒剂(例如二缩甘露糖醇单油酸酯(Aracel A))中的乳液；或与用作阻断替代物的20％全氟化碳溶液
的乳液也可以用于产生佐剂作用。典型佐剂是完全弗氏佐剂
(complete Freund′s adjuvant)(含有杀灭的结核分枝杆菌(Mycobacterium
tuberculosis))、不完全弗氏佐剂(incomplete Freund′s adjuvant)和氢氧化铝。

[0152] 对于向人类施用，多种适合的佐剂将为技术工作者显而易见。这些包括例如作为佐剂的明矾-MPL；或可比的配方ASO4，其在获批准的HPV疫苗中使用；AS03；AS02；MF59；莫坦尼德(montanide)；基于皂苷的佐剂，例如GPI-0100；基于CpG的佐剂；或咪喹莫特。在本发明的实施方案中，佐剂物理上偶合至VLP，或由VLP囊封，而不是与其简单混合。

[0153] 除了佐剂以外，可能需要共同施用生物反应修饰剂(BRM)以增强免疫反应。已经显示BRM上调T细胞免疫或下调抑制细胞活性。此类BRM包括但不限于西咪替丁(Cimetidine)(CIM；1200mg/d)(Smith/Kline，PA)；或低剂量环磷酰胺(CYP；300mg/m2)(Johnson/Mead，NJ)；和细胞因子，例如γ-干扰素、IL-2或IL-12；或编码免疫辅助功能中所涉及的蛋白质的基因，例如B-7。在本发明的实施方案中，这些基因由VLP囊封以有助于将其递送至受试者中。

[0154] 含有一个或多个多肽或肽序列作为活性成分的组合物的制备一般在本领域中充分了解，如美国专利号4,608,251、4,601,903、4,599,231、4,599,230、4,596,792和4,578,770所例示，所有专利以引用的方式并入本文中。通常，将此类组合物制备为呈液体溶液或悬浮液的可注射剂：还可以制备适合于在注射前溶解或悬浮于液体中的固体形式。还可以乳化制剂。活性免疫原性成分常常与药学上可接受的并且与活性成分相容的赋形剂混合。
适合的赋形剂为例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等等，和其组合。另外，必要时，组合物可以含有一定量的辅助物质，例如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂，或增强疫苗有效性的佐剂。在特定实施方案中，疫苗与物质的组合一起配制，如美国专利号6,793,923和6,733,754中所描述，所述专利以引用的方式并入本文中。

[0155] 包含本发明的嵌合VLP的组合物呈生物学上相容的形式，其适合于活体内施用于受试者。药物组合物还包含药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的”意味着获联邦或州政府的管理机构批准或在美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其它一般公认的用于动物中并且更特别是人类中的药典中列出。术语“载体”是指与VLP一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或媒剂。此类药物载体可以是无菌液体，例如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，包括但不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等等。当经口施用药物组合物时，水可以是载体。当静脉内施用药物组合物时，盐水和右旋糖水溶液可以是载体。盐水溶液和右旋糖水溶液和甘油溶液可以用作可注射溶液的液体载体。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、甘油单硬脂酸酯、滑石、氯化钠、干脱脂奶粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等等。药物组合物还可以含有微量的湿润剂或乳化剂，或pH缓冲剂。

[0156] 包含本发明的嵌合VLP的药物组合物可以采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、持续释放配方等形式。经口配方可以包括标准载体，例如医药级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。在一个特定实施方案中，药物组合物包含有效量的本发明的嵌合VLP以及适量的药学上可接受的载体以提供适当施用于患者的形式。配方应适于施用模式。

[0157] 本发明的药物组合物可以通过任何特定的施用途径施用，包括但不限于静脉内、肌肉内、关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、大肠内、子宫颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨髓内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、大丸剂、经口、肠道外、皮下、经阴道、经直肠、经颊、舌下、鼻内、离子导入方式或经皮方式。最适合的途径是静脉内注射或经口施用。在特定实施方案中，组合物在标靶区处或附近施用，例如瘤内注射。

[0158] 对于以水溶液肠道外施用，例如，溶液在必要时应进行适当缓冲，并且液体稀释剂首先促使与足够的盐水或葡萄糖等张。这些特定的水溶液尤其适合于静脉内、肌肉内、瘤内、皮下和腹膜内施用。在这方面，可以采用的无菌水性介质鉴于本公开将为本领域技术人员所知。举例来说，一个剂量可以溶解于等张NaCl溶液中并且添加至皮下灌注流体中或在所建议的输注部位处注射(参见例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，1990)。取决于受试者的状况，剂量将必然发生一些变化。负责施用的人员将在任何情况下确定用于个别受试者的适当剂量。

[0159] 本发明的含有嵌合VLP的组合物可以通过吸入施用。在某些实施方案中，组合物可以作为气雾剂施用。如本文所用的术语“气雾剂”或“气雾化组合物”是指固体或液体颗粒于气体中的悬浮液。所述术语一般可以用于指已经汽化、雾化或以其它方式从固体或液体形式转变成可吸入形式，包括悬浮的固体或液体药物颗粒的组合物。此类气雾剂可以用于经由呼吸系统递送组合物。如本文所用的“呼吸系统”是指体内负责吸入氧气并呼出二氧化碳的器官系统。所述系统一般包括从鼻至肺泡的所有气道。在哺乳动物中，一般认为包括肺、支气管、细支气管、气管、鼻道和膈膜。出于本公开的目的，组合物递送至呼吸系统指示将药物递送至呼吸系统的气道中的一个或多个，尤其递送至肺。

[0160] 适合于其它施用模式的额外配方包括栓剂(用于肛门或阴道应用)并且在一些情况下包括经口配方。对于栓剂，传统粘合剂和载体可以包括例如聚烷二醇或甘油三酯：此类栓剂可以由含有约0.5％至约10％、优选地约1％至约2％的范围内的活性成分的混合物形成。经口配方包括通常采用的赋形剂，例如医药级甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等等。这些组合物采用溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放配方或粉末的形式并且含有约10％至约95％的活性成分，优选地约25％至约70％。

[0161] 嵌合VLP组合物可以配制成中性或盐形式的疫苗。药学上可接受的盐包括酸加成盐(与肽的游离氨基形成)和与以下酸形成的那些：无机酸，例如盐酸或磷酸；或有机酸，例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等等。与游离羧基形成的盐还可以来源于无机碱，例如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；和有机碱，例如异丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等等。

[0162] 本发明的药物组合物还可以包括有效量的额外佐剂。如本文所指出，乳头状瘤病毒VLP具有佐剂特性。适合的额外佐剂包括但不限于弗氏完全或不完全佐剂；矿物凝胶，例如氢氧化铝；表面活性物质，例如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇(pluronic polyol)、聚阴离子、肽、油乳液、二硝基苯酚；以及潜在适用的人类佐剂，例如卡介苗(Bacille Calmette-Guerin)、短小棒状杆菌(Carynebacterium parvum)和无毒霍乱毒素。

[0163] 在储存和使用的一般条件下，这些制剂含有防腐剂以防止微生物生长。在所有情况下，药物形式必须是无菌的并且必须是流体以达到可以容易地注射的程度。药物形式还应在制造和储存的条件下稳定并且必须防腐以对抗例如细菌和真菌的微生物的污染作用。

[0164] 载体还可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇，等等)、其适合的混合物和植物油的溶剂或分散介质。可以例如通过使用包衣，例如卵磷脂，在分散体的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂来维持适当流动性。防止微生物作用可以由各种抗细菌剂和抗真菌剂达成，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞(thimerosal)等等。在许多情况下，将优选地包括等张剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延迟吸收剂，例如单硬脂酸铝和明胶来达成。

[0165] 通过将嵌合VLP以所需量与上文所列举的各种成分一起并入适当溶剂中，需要时可以继之以过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。一般来说，通过将各种灭菌的活性成分并入无菌媒剂中来制备分散体，所述无菌媒剂含有基础分散介质和来自上文所列举的那些的所需其它成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，得到活性成分加上来自其先前无菌过滤的溶液的任何额外所需成分的粉末。

[0166] 本发明的不同方面涉及将有效量的包含嵌合VLP的组合物施用于有需要的受试者。在本发明的一些实施方案中，将包含含有CD8+ T细胞表位的靶肽的嵌合VLP施用于患者以治疗肿瘤或防止此种肿瘤复发。此类组合物一般将溶解或分散于药学上可接受的载体或水性介质中。

[0167] 在本发明的方法中，肿瘤可以是小细胞肺癌、肝细胞癌、肝癌、肝细胞癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、肾上腺癌、肛门癌、再生障碍性贫血、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑/CNS癌、乳癌、原发不明癌症、卡斯特莱曼病(Castleman disease)、子宫颈癌、结肠/直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、尤文氏肿瘤家族(Ewing family of tumors)、眼癌、胆囊癌、胃肠道类癌、胃肠道基质肿瘤(gist)、妊娠滋养细胞疾病、霍奇金病(Hodgkin disease)、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾癌、喉和下咽癌、白血病、肝癌、肺癌、淋巴瘤、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔和口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、阴茎癌、垂体肿瘤、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom Macroglobulinemia)、威尔姆氏肿瘤(Wilms Tumor)、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)、成淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、多发性骨髓瘤(MM)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、脾边缘区淋巴瘤、边缘区淋巴瘤(结外或结节性)、成人混合细胞型弥漫性侵袭性淋巴瘤、成人大细胞型弥漫性侵袭性淋巴瘤、成人大细胞成免疫细胞性弥漫性侵袭性淋巴瘤、成人小无裂细胞弥漫性侵袭性淋巴瘤或滤泡性淋巴瘤、头颈癌、子宫内膜或子宫癌、非小细胞肺癌、骨肉瘤、成胶质细胞瘤或转移癌。在优选的实施方案中，癌症是乳癌、子宫颈癌、卵巢癌、胰腺癌或黑色素瘤，例如B16F10黑色素瘤。

[0168] 因此，本发明的方法的特定实施方案涉及施用有效量的包含本发明的嵌合VLP的组合物。如本文所用的术语“有效”意味着足以实现所需、预期或预定的结果。更特别地，“有效量”是指单独或与另一种治疗剂(例如包含原生L1蛋白质的乳头状瘤病毒VLP、化学治疗剂或检查点抑制剂)组合的本发明的组合物(例如包含靶抗原的嵌合乳头状瘤病毒VLP)提供所需治疗作用所必需的量，例如，有效抑制肿瘤生长、进展或转移，或预防、减轻、治疗或改善例如癌症的疾病的症状，或延长正在治疗的受试者的存活期的量。本领域普通技术人员了解，所需要的精确量将因受试者而异，这取决于受试者的年龄、一般状况、正在治疗的疾患的严重性、所施用的特定化合物和/或组合物，等等。适当“治疗有效量”或“预防有效量”在任何个别情况下可以由本领域普通技术人员通过参考相关文本和文献和/或通过使用常规实验来确定。应了解，提及药物组合物(例如疫苗)、其配方、施用等等取决于情形可以指包含靶肽的嵌合乳头状瘤病毒VLP、包含原生L1蛋白质的乳头状瘤病毒VLP，或前述的混合物，包括包含不同靶肽的嵌合VLP的混合物。术语“单位剂量”或“剂量”是指适合用于受试者中的物理离散单位，每个单位含有预定量的组合物，所述量经过计算以与组合物的施用，即适当途径和方案相结合产生上文所论述的所需反应。根据治疗次数和单位剂量两者的有待施用的量取决于所需结果。

[0169] 根据本发明的组合物的施用通常将经由任何常用途径。这包括但不限于静脉内、皮内、瘤内、皮下、肌肉内、腹膜内、经呼吸道、经鼻、经口/摄入、经颊、舌下或原位施用。在某些实施方案中，可以吸入含有VLP的组合物(例如美国专利号6,651,655，以引用的方式特别并入)。本发明的含有嵌合VLP的组合物还可以直接施用于肿瘤或肿瘤附近以便将VLP引入肿瘤微环境中。此类组合物通常将以包括生理上可接受的载体、缓冲剂或其它赋形剂的药学上可接受的组合物施用。组合物的剂量将取决于施用途径并且将根据例如受试者的体型和健康以及疾患的严重性而变化。

[0170] 一般来说，本发明的含有嵌合VLP的组合物可以单独或与其它治疗剂配合以通过常规测试所定义的适当剂量使用以获得最佳功效，同时使任何潜在毒性降至最低。其它治疗剂包括例如但不限于化学治疗剂和检查点抑制剂。利用本发明的药物组合物的给药方案可以根据多种因素而选择，包括患者的类型、物种、年龄、体重、性别、医疗状况；有待治疗的疾患的严重性；预定的治疗目标(症状减轻对比治愈)；施用途径；患者的肾和肝功能；以及所采用的特定药物组合物，和特定组合物的效力、稳定性和毒性。普通技能的医师可以容易地确定并开立预防、抗衡或遏制例如肿瘤/癌症的疾患的进展所需要的药物组合物(和潜在其它剂，包括治疗剂)的有效量。

[0171] 达成在最小毒性下产生最大功效的范围内的治疗方案的浓度的最佳精度可能需要基于药物组合物对一个或多个靶位点的可利用性的动力学的方案。当确定用于治疗方案的最佳浓度时可以考虑药物组合物的分布、平衡和消除。当组合达成所需作用时可以调整本文所公开的药物组合物的剂量。另一方面，可以独立地优化药物组合物和各种治疗剂的剂量并组合以达成协同结果，其中病变相比单独使用的情况更大程度地减少。

[0172] 特别地，药物组合物的毒性和治疗功效可以通过细胞培养物或实验动物中的标准医药程序来确定，所述程序例如用于确定LD50(使50％群体致死的剂量)和ED50(对50％群体治疗有效的剂量)。毒性作用与治疗作用之间的剂量比是治疗指数并且可以表示为比率LD50/ED50。展现大治疗指数的药物组合物是优选的，例外的是当组合物的细胞毒性是所需的活性或治疗结果时。尽管可以使用展现毒性副作用的药物组合物，但递送系统可以将此类组合物靶向受影响组织的部位以使对未受影响细胞的潜在损害降至最低并且从而减少副作用。一般来说，本发明的药物组合物可以按使功效达到最大并且使毒性降至最低的方式施用。

[0173] 在许多情况下，将需要多次施用含有VLP的组合物，通常至多、至少或不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15次或更多次接种疫苗，包括之间的所有范围。接种疫苗将通常按1、2、3、4、5、6至5、6、7、8、9、10、11至12周/月/年的时间间隔，包括之间的所有值和范围，更通常是三周至五周的时间间隔。

[0174] 获自细胞培养物测定和动物研究的数据可以用于配制用于人类中的剂量范围。此类组合物的剂量优选地处于循环浓度的范围内，所述范围包括具有极少或无毒性的ED50。取决于所采用的剂型和所利用的施用途径，剂量可以在这个范围内变化。对于本发明的方法中所用的任何组合物，可以从细胞培养物测定初始地估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量以达成循环血浆浓度范围，所述范围包括如在细胞培养物中所确定的IC50(测试组合物达成症状的半最大抑制的浓度)。此种信息可以用于精确地确定人类中的适用剂量。血浆中的水平可以例如通过高效液相色谱法测量。

[0175] 配制后，溶液将以与剂量配方相容的方式并且以如治疗或预防有效的量施用。配方以多种剂型容易地施用，例如本文所描述的可注射溶液的类型。

[0176] 本发明的另一个方面是一种根据本发明的用于治疗的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括小瓶并且任选地包括具有施用说明书的包装插页，所述小瓶包括含有嵌合VLP的组合物用于根据本发明的方法施用。

[0177] 本文所描述的组合物中的任一种可以包括于试剂盒中。在一个非限制性实例中，用于制备VLP和/或通过用VLP接种疫苗而施用VLP的试剂可以包括于试剂盒中。试剂盒还可以包括用于试管内与活体内评估VLP的活性的试剂。试剂盒将因此在适合的容器中包括VLP组合物。在某些方面，试剂盒可以包括用于施用的试剂和/或装置，例如注射器、吸入器或喷雾器。试剂盒还可以包括用于制备供施用的组合物的一种或多种缓冲液、化合物或装置。

[0178] 试剂盒的组分可以在水性介质中或呈冻干形式封装。试剂盒的容器构件一般将包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器构件，组分可以放置于其中并且优选地适当地进行等分。在试剂盒中存在多于一种组分的情况下，试剂盒一般还将容纳第二个、第三个或其它额外容器，额外组分可以独立地放置于其中。然而，小瓶中可以包括组分的各种组合。本发明的试剂盒通常还将包括用于容纳严密封闭以供商业销售的容器的构件。此类容器可以包括注塑或吹塑的塑料容器，所需小瓶保留于其中。

[0179] 当试剂盒的组分在一种和/或多种液体溶液中提供时，液体溶液是水溶液，其中无菌水溶液是特别优选的。然而，试剂盒的组分可以作为一种或多种干粉提供。当试剂和/或组分作为干粉提供时，粉末可以通过添加适合的溶剂而复原。设想溶剂还可以在另一个容器中提供。试剂盒还可以包括关于采用试剂盒组分以及使用试剂盒中不包括的任何其它试剂的说明书。说明书可以包括可以实施的变化。预期此类试剂是本发明的试剂盒的实施方案。

[0180] 然而，此类试剂盒不限于上文所鉴定的特定项目并且可以包括用于制备和/或施用本发明的嵌合VLP组合物的任何试剂。

[0181] 在其它用途当中，本发明的试剂盒可以用于实验应用中。技术工作者将识别适合于执行本发明的方法的试剂盒的组分。

[0182] 提供以下实施例以作说明并且不作限制。应了解，在不脱离本发明的精神的情况下可以作出各种修改，并且将易于为技术人员所知。

[0183] 实施例

[0184] 实施例I.VLP的产生

[0185] A.HPV L1蛋白质的杆状病毒表达和VLP的产生。通过本领域中已知的方法产生HPV颗粒(VLP)。简单地说，在昆虫细胞中从表达乳头状瘤病毒主要衣壳L1蛋白质的重组杆状病毒产生HPV颗粒。在无血清培养基的无血清条件下在Express Five或SF900-III培养基中用高效价重组杆状病毒感染粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)(High FiveTM)细胞或草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)(SF9细胞)。在27℃下孵育96小时后，采集细胞，并且使细胞团块再悬浮于含有蛋白酶抑制剂的萃取缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液pH 6.5、0.5M NaCl、10mM MgCl2)中。通过冻融释放颗粒。通过在高盐活性核酸酶存在下孵育来消化核酸。通过以8,000×g离心30分钟使裂解物澄清并且通过Vertrel萃取进行脱脂。将澄清的裂解物加载至
40％蔗糖的衬垫上并且在4℃下在SW-28 转子中以27,000rpm离心90分钟。使团块再悬浮于
20mM磷酸盐缓冲液pH 6.5、1M NaCl、10mM DTT和0.03％Tween 80中，并且在4℃下储存。通过SDS-PAGE确定纳米颗粒制剂的纯度并且通过电子显微术(EM)确定颗粒的形态。典型制剂是＞90％纯的并且通过EM呈现为完全组装的衣壳样50nm颗粒。

[0186] 在哺乳动物细胞中通过本领域中已知的方法也产生HPV颗粒。简单地说，将密码子优化的乳头状瘤病毒仅L1或L1和L2衣壳基因共转染至293TT细胞(用SV40大T抗原转染的人胚肾细胞(Pastrana等，2004))中。将用L1和/或L1/L2表达载体共转染的细胞维持24小时，然后采集。简单地说，通过洗涤剂裂解从293TT细胞中释放HPV颗粒。在37℃下将细胞裂解物孵育过夜。通过将氯化钠添加至裂解物中使成熟的HPV颗粒溶解并且通过低速离心使裂解物澄清。根据制造商的说明书通过高盐萃取继之以经Optiprep(碘克沙醇(iodixanol))步长梯度的超速离心使衣壳与细胞碎片和洗涤剂分离。通过SDS-PAGE确定制剂的纯度并且通过电子显微术(EM)确定颗粒的形态。典型制剂是＞90％纯的并且通过EM呈现为完全组装的衣壳样50nm颗粒。

[0187] 经由乳头状瘤病毒仅L1或L1和L2衣壳基因转染至293EXPI细胞中也产生HPV颗粒。将用L1和/或L1/L2表达载体共转染的细胞维持72小时，然后采集。通过洗涤剂裂解从
293EXPI细胞中释放HPV颗粒，并且在37℃下将裂解物与温和洗涤剂(例如Brij58或Triton X-100)一起孵育过夜。然后通过添加氯化钠使过夜孵育的裂解物中的颗粒溶解。然后通过低速离心使裂解物澄清。根据制造商的说明书通过高盐萃取继之以经Optiprep(碘克沙醇)步长梯度的超速离心使衣壳与细胞碎片和洗涤剂分离。通过SDS-PAGE确定纳米颗粒制剂的纯度并且通过电子显微术(EM)确定颗粒的形态。典型制剂是＞90％纯的并且通过EM呈现为完全组装的衣壳样50nm颗粒。

[0188] B.靶肽附接至HPV VLP

[0189] 通过经由马来酰亚胺缀合使靶肽缀合至实施例1.A的HPV16(K)-L1 VLP来制备包含靶肽的嵌合VLP，所述靶肽包含末端半胱氨酸，具有序列FMYSDFHFI(SEQ ID NO：136)(流感)或GILGFVFTL SEQ ID NO：119(流感)或KLWESPQEI(SEQ ID NO：6)(麻疹)或FLPSDFFPSV(SEQ ID NO：69)(乙型肝炎)或SLPRSRTPI(SEQ ID NO：218)(水痘病毒)或SAPLPSNRV(SEQ ID NO：219)(水痘病毒)的CD8+ T细胞表位中的一个，和在半胱氨酸与T细胞表位之间的酶裂解位点(例如RRRR或RVKR)(例如C-RRRR-表位)。简单地说，将含HPV VLP的50mM NaHCO3 pH 8.4以14mM的L1蛋白质浓度与商业异双功能交联剂4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-甲酸酯(sSMCC)(Pierce Endogen，Rockfort，IL)混合达到约100的最终sSMCC/L1蛋白质(mol/mol)比率。反应在2-8℃下进行1小时，然后通过针对含有10mM组氨酸、0.5M NaCl、
0.015％聚山梨醇酯80的pH 6.2缓冲液透析来脱盐以产生sSMCC活化的HPV VLP。通过DTNB测定来确定马来酰亚胺当量(参见Fan等，Vaccine(2004)第22卷：2993-3003；Ionescu等J.Pharmaceutical Sciences，第95(1)卷：70-79(2006年1月))。将靶肽溶解于N2喷射的缓冲液中并且各自与sSMCC活化的HPV VLP混合达到约3的硫/马来酰亚胺(mom/mol)比率。反应在2-8℃下进行约15小时。然后用β-巯基乙醇处理两种样品以淬灭任何过量的马来酰亚胺。最后，针对0.5M NaCl和0.015％聚山梨醇酯80透析样品(Dispodialyser MWCO
300000Spectrum Industries Inc.，Rancho Dominguez，CA)。

[0190] 实施例2.由BMDC和巨噬细胞对细胞因子进行VLP诱导

[0191] 将包含靶肽的实施例1的嵌合HPV VLP(20μg)或不具有靶肽的HPV VLP(20μg)或磷酸盐缓冲盐水(PBS，20μl)添加至骨髓源性树突状细胞(BMDC，106个细胞/孔)和原代巨噬细胞的试管内培养物中。BMDC和巨噬细胞从C57BL6小鼠采集。在37℃下培养24小时后，从细胞培养物采集上清液并且使用小鼠32plex luminex测定来定量细胞因子谱。

[0192] 结果：暴露于具有或不具有靶肽的VLP的BMDC和巨噬细胞与仅暴露于PBS的对照BMDC和巨噬细胞相比试管内产生水平升高的促炎性细胞因子。

[0193] 实施例3.由与T细胞共同培养的BMDC对细胞因子产生进行VLP诱导

[0194] 在如上述实施例1中所描述而产生的包含靶肽的嵌合VLP(10μg/ml)、HPV16(K)-L1 VLP(10μg/ml)或rIFN-γ(1000U/ml)存在下在37℃下将BMDC与高度纯化的同基因T细胞(比率1∶1)共同培养48小时。作为对照，将BMDC在单独的培养基中培养或在不存在T细胞的情况下在实施例1的嵌合VLP(10μg/ml)、HPV16(K)-L1 VLP(10μg/ml)或rIFN-γ存在下培育。每种培养条件至少一式两份进行。使用标准程序对于每种培养条件确定IL-12p70产生。

[0195] 实施例4.VLP活体内结合肿瘤细胞

[0196] A.方法：向具有或不具有SHIN-3 DSR卵巢肿瘤的小鼠施用1X108IU的HPV16-Luc(荧光素酶)假病毒(PsV)(如Buck等Journal of Virology，(2004)，78：751-757或Hung等PLoS One(2012)；7(7)：e40983所描述而制备，以引用的方式并入本文中)于100μl PBS或含有1％i-角叉菜胶(角叉菜胶抑制HPV结合至细胞)的PBS中的腹膜内注射液。48小时后，施用荧光素底物并且测量生物发光。围绕腹膜腔绘出所关注的区域并且计算平均辐射率。所有数据代表n＝5/组。

[0197] 结果：HPV16-Luc PsV活体内结合至SHIN-3 DSR卵巢肿瘤。

[0198] B.方法：将仅在免疫受损的动物中传代的人类卵巢肿瘤皮下植入小鼠中。当肿瘤直径在7mm与15mm之间时，动物接受50μl PBS或50μl HPV16-Luc PsV(约1μg/ul)的瘤内注射。不具有肿瘤的动物在其后胁中接受50μl PBS或50μl HPV16-Luc PsV(约1μg/ul)的皮下注射。在HPV-16/LucPsV注射后一天记录发光图像。2分钟的积分时间用于发光图像撷取。发光值以平均辐射率报告。

[0199] 结果：HPV16-Luc PsV活体内结合并感染已建立的异种移植人类卵巢肿瘤而不是健康组织。

[0200] 实施例5.肿瘤微环境的VLP免疫调节

[0201] 方法：在第1天至第8天中的每一天，将100μg具有或不具有靶肽的实施例1的HPV VLP施用于带有肿瘤的小鼠中。作为对照，持续8天每天向带有肿瘤的小鼠施用100μl PBS。

[0202] 最后一次注射后24小时(第9天)处死小鼠并且采集肿瘤并均化。收集上清液并且使用小鼠32plex luminex测定进行细胞因子谱分析。

[0203] 结果：用实施例1的VLP处理的小鼠的肿瘤与用PBS处理的小鼠的肿瘤相比展现水平升高的促炎性细胞因子和化学引诱物。

[0204] 实施例6.肿瘤微环境的VLP免疫调节

[0205] 方法：在第1天至第8天中的每一天，将HPV VLP以及实施例1的嵌合VLP中的每一种(100μg)施用于带有肿瘤的小鼠组。作为对照，在第1天至第8天中的每一天向带有肿瘤的小鼠施用100μl PBS。

[0206] 24小时后(第9天)，处死小鼠并且采集肿瘤并解离为单细胞悬浮液。使用RBC裂解缓冲液从悬浮液中去除红血球。使用BD Facscaliber以对CD45、MHC II、CD86、CD11b、F4/80和Ly6G具有特异性的抗小鼠抗体进行流式细胞术并且比较肿瘤的细胞组成。

[0207] 结果：具有或不具有靶肽的实施例1的VLP的施用与来自用PBS处理的小鼠的肿瘤相比诱导肿瘤免疫细胞组成的巨大变化。

[0208] 实施例7.VLP免疫疗法诱导全身持久抗肿瘤免疫.

[0209] 方法：将HPV VLP以及实施例1的嵌合VLP中的每一种(100μg)直接注射至小鼠的B16F10黑色素瘤中。肿瘤坏死中心在肿瘤内快速形成并且一些经过处理的小鼠完全消除肿瘤。

[0210] 完全消除肿瘤的小鼠在确认其原发性肿瘤完全消失之后4周通过将B16F10细胞注射至其对侧胁中进行再激发。先前通过瘤内注射嵌合VLP治愈原发性B16F10胁肿瘤的小鼠展现对二次再激发的抗性增加。这指示用嵌合VLP纳米颗粒直接注射原发性肿瘤诱导对抗B16F10肿瘤的保护性全身免疫反应。

[0211] 结果：具有靶肽的嵌合VLP诱导全身持久抗肿瘤免疫。

[0212] 实施例8.嵌合VLP能够将无关T细胞免疫重定向至肿瘤并且促进清除

[0213] 方法：将过度表达荧光素酶的鼠类ID8卵巢癌细胞系与对卵白蛋白肽表位SIINFEKL(SEQ ID NO：220)具有特异性的OT-1 CD8+ T细胞共同培养。然后将具有或不具有含有SIINFEKL(SEQ ID NO：220)的靶肽的VLP添加至共同培养物中。

[0214] 结果：预期无细胞死亡(呈减小的荧光素酶信号的形式)将伴随与OT-1 CD8+ T细胞和鼠类ID8卵巢癌细胞系共同培养的不具有靶肽的VLP发生。相比之下，预期呈减小的荧光素酶信号的形式的肿瘤细胞死亡将在接受包含含有SIINFEKL(SEQ ID NO：220)的靶肽的嵌合VLP(“OVA-嵌合VLP”)的ID8/OT-1T细胞共同培养物中观测到。

[0215] 活体内方法：通过将ID8鼠类卵巢癌细胞系注射至小鼠中来产生具有卵巢肿瘤的10周龄C57/BL6小鼠。将100μg OVA-嵌合VLP腹膜内注射至每只小鼠中。对照是(a)用100微克/小鼠的不具有靶肽的实施例1的VLP腹膜内注射的小鼠和(b)用100微克/小鼠的实施例1的嵌合VLP腹膜内注射的小鼠。持续四周每周将VLP施用于小鼠，并且将2.5x106个上述OT-1的CD8+ T细胞两次，即隔周一次腹膜内注射至小鼠中。在用VLP最后一次处理后1周处死每组中的小部分小鼠。采集卵巢肿瘤用于测量大体组织学和浸润性T细胞。

[0216] 结果.预期用OVA-嵌合VLP处理的小鼠的肿瘤相比用不具有靶肽的VLP处理的小鼠的肿瘤和用实施例1的嵌合VLP处理的小鼠的肿瘤具有更小的肿瘤块。通过使用SIINFEKL(SEQ ID NO：220)加载的H-2Kb四聚体染色评估肿瘤浸润性淋巴细胞中对SIINFEKL(SEQ ID NO：220)具有特异性的CD8+ T细胞。还分析总TIL中SIINFEKL(SEQ ID NO：220)特异性CD8+ T细胞的百分比(平均值±SD)。

[0217] 实施例9.嵌合VLP能够将无关人类儿童疫苗T细胞免疫重定向至肿瘤

[0218] 向HLA-A*0201(AAD)转基因C57BL/6小鼠的组以一周时间间隔三次皮下注射十分之一剂量的实施例1的嵌合VLP。在最后一次免疫后一周对小鼠施以无痛致死术，并且收集脾细胞以使用FMYSDFHF(SEQ ID NO：136)、KLWESPQEI(SEQ ID NO：6)或FLPSDFFPSV(SEQ ID NO：69)或SLPRSRTPI(SEQ ID NO：218)或SAPLPSNRV(SEQ ID NO：219)肽经由免疫荧光染色和干扰素-γCD*+T细胞活化测定来分析HLA-A2限制的儿童疫苗抗原特异性反应。在接种疫苗时程结束后，将脾细胞与包含含有FMYSDFHF(SEQ ID NO：136)、KLWESPQEI(SEQ ID NO：6)或FLPSDFFPSV(SEQ ID NO：69)或SLPRSRTPI(SEQ ID NO：218)或SAPLPSNRV(SEQ ID NO：219)的靶肽的实施例1的嵌合VLP共同培养，并且利用免疫荧光染色和干扰素-γCD*+ T细胞活化测定来评估T细胞的再活化。裸VLP，即，不包含靶肽的VLP用作对照。经由发光成像测试VLP的结合和抗肿瘤作用以测量试管内细胞毒性。将若干荧光素酶表达HLA-A2阳性肿瘤系，例如ID8/A2(卵巢)、B16/A2(黑色素瘤)、TC-1/A2(子宫颈癌)与来自用嵌合VLP接种疫苗的HLA-A*0201(AAD)转基因小鼠的脾细胞共同培养。因为这些肿瘤细胞系抗原上与靶肽的CD8+ T细胞表位无关，所以未观测到肿瘤杀伤。同样地，裸VLP的添加不具有或具有极少肿瘤杀伤作用。

[0219] 结果：预期包含含有FMYSDFHF(SEQ ID NO：136)、KLWES PQEI(SEQ ID NO：6)或FLPSDFFPSV(SEQ ID NO：69)、SLPRS RTPI(SEQ ID NO：218)或SAPLPSNRV(SEQ ID NO：219)的靶肽的实施例1的嵌合VLP添加至这种共同培养物中促使肿瘤易于被脾细胞培养物中的细胞毒性T细胞杀伤。

[0220] 实施例10.嵌合VLP能够将无关人类儿童疫苗T细胞免疫重定向至肿瘤用于清除.[0221] 方法：肿瘤的建立：向HLA-A*0201(AAD)转基因小鼠腹膜内(IP)注射荧光素酶表达ID8/A2肿瘤细胞。

[0222] 儿童疫苗反应的产生：在肿瘤细胞注射之后，如实施例8中所描述以一周时间间隔将HLA-A*0201(AAD)转基因小鼠主动地用十分之一的人类儿童疫苗针对流感病毒、麻疹、乙型肝炎或水痘进行免疫。疫苗的抗原组分包含CD8+ T细胞表位FMYSDFHFI(SEQ ID NO：136)(流感)或GILGFVFTL SEQ ID NO：119(流感)或KLWESPQEI(SEQ ID NO：6)(麻疹)或FLPSDFFPSV(SEQ ID NO：69)(乙型肝炎)或SLPRSRTPI(SEQ ID NO：218)(水痘病毒)或
SAPLPSNRV(SEQ ID NO：219)(水痘病毒)。如实施例8中所描述将每一组小鼠的子组隔离并且施以无痛致死术以表征并确保对儿童疫苗的已有免疫的建立。

[0223] 抗肿瘤作用的处理和分析：向带有肿瘤的小鼠每周腹膜内注射嵌合VLP或裸VLP(不具有靶肽)(100微克/小鼠)持续3次。未处理的小鼠充当对照。通过发光成像监测肿瘤生长。

[0224] 结果：预期用嵌合VLP处理的带有肿瘤的小鼠展示超过施用裸VLP的小鼠和对照小鼠所获得的作用的治疗性抗肿瘤作用。具体地说，预期嵌合VLP能够将对靶肽的T细胞表位具有特异性的CD8+ T细胞重定向至肿瘤并且抑制肿瘤生长并且在一些情况下消除肿瘤，而用裸VLP腹膜内注射或完全未接受VLP的对照小鼠并不重定向对嵌合VLP的T细胞表位具有特异性的CD8+T 细胞。预期用裸VLP腹膜内注射或完全未接受VLP的对照小鼠抑制肿瘤生长并消除肿瘤远低于用具有靶肽的嵌合VLP所达成的程度。

[0225] 实施例11.表位缀合的VLP的设计和合成

[0226] 基本上如实施例1中所描述在粉纹夜蛾(High FiveTM)细胞中产生VLP。简单地说，TM在用表达嵌合乳头状瘤病毒L1基因的重组杆状病毒感染的粉纹夜蛾(High Five )细胞中产生VLP。使用40％蔗糖离心，继之以CsCl步长梯度上的另一轮纯化来纯化VLP。通过SDS-PAGE确定VLP制剂的纯度并且通过透射电子显微术(TEM)确定颗粒的形态。典型制剂是＞
90％纯的并且通过TEM呈现为完全组装的衣壳样50nm颗粒(图2，左图TEM)。合成靶肽
(FMYSDFHFI(SEQ ID NO：136)(流感)或GILGFVFTL SEQ ID NO：119(流感)或KLWESPQEI(SEQ ID NO：6)(麻疹)或FLPSDFFPSV(SEQ ID NO：69)(乙型肝炎)或SLPRSRTPI(SEQ ID NO：218)(水痘病毒)或SAPLPSNRV(SEQ ID NO：219)(水痘病毒))达到＞85％纯度，呈聚阳离子(N端马来酰亚胺-Arg4RVKR-表位)17聚体肽，也称为MAL-肽。对于缀合，使空的未缀合的VLP经受使用50mM磷酸钠pH 6.5、500mM NaCl、2mM EDTA反应缓冲液与TCEP(最终68μM)(TCEP∶VLP蛋白质(mol∶mol)＝10∶1)的还原条件。在21℃下每15分钟缓缓搅拌混合物(体积＝625μl)1小时。还原1小时后，将含MAL-肽(170μM，625μl)的反应缓冲液添加至TCEP预处理的VLP中达到肽：RG-1蛋白质(mol∶mol)的比率＝25∶1。在21℃下以约250rpm缓缓搅拌混合物1小时，随后立即进入纯化过程。在缀合之后，在PBS pH 7、500mM NaCl中透析包含缀合的VLP的组合物，继之以透滤步骤以去除过量的肽。通过TEM分析缀合的VLP(“AIR VLP”)。多个AIR VLP批次的TEM结果是一致的，显示与空的非缀合VLP(50nM)相比稍大的VLP(60-70nM)。这个结果与AIR-VLP的SDS-PAGE分析相结合显示大量的肽结合至缀合的VLP。可以对不同VLP进行这种缀合过程并且进行以形成如图3中所见缀合至许多不同种类的儿童疫苗表位的HPV 16RG-1 VLP和野生型HPV16 VLP。图3是缀合至来源于流感、乙型肝炎、麻疹和水痘病毒的表位的HPV
16RG-1 VLP(左图)或野生型HPV 16L1 VLP(右图)的SDS PAGE分析。

[0227] 实施例12.由不同VLP的肿瘤特异性结合

[0228] 为确认本文所描述的嵌合VLP的广泛肿瘤结合能力，我们用0.3μg/ml嵌合VLP试管内处理鼠类子宫颈癌(TC-1)、卵巢癌(ID8)、乳癌(4T1)和黑色素瘤癌(B16)细胞系24小时，将细胞染色以供分析肿瘤结合的VLP的存在，然后通过流式细胞术分析来分析染色的细胞。

[0229] 图4描绘了展示VLP结合至所有测试的肿瘤细胞系的细胞群体的偏移。图4，顶行示出了空HPV16 RG-1 VLP结合至各种肿瘤细胞系的结果并且底行示出了具有以重组方式插入一个L1环中的肽的牛乳头状瘤病毒(BPV)VLP的结果。

[0230] 为证实VLP的肿瘤结合能力不因缀合VLP表面上的肽而受损，我们用缀合的VLP重复上文所描述的肿瘤结合研究。与用非缀合VLP获得的结果一致，缀合的AIR-VLP维持其结合至肿瘤细胞的能力(参见图5)。

[0231] 实施例13.由缀合的VLP的抗原特异性抗肿瘤免疫重定向引起试管内结合、CD8+表位的加载以及由包覆的表位特异性CTL的抗肿瘤杀伤。

[0232] 为评价本文所描述的缀合的VLP作为抗肿瘤免疫重定向剂的可行性，我们首先使用模型抗原OVA(SIINFEKL，SEQ ID NO：220)。我们将具有弗林蛋白酶裂解位点的这种鼠类H2-KB限制的OVA表位(SIINFEKL，SEQ ID NO：220)缀合至HPV 16RG-1 VLP以产生嵌合VLP(AIR-VLP)。然后将肿瘤细胞与不同量(浓度1.00pM至0.02nM)的AIR-VLP或例如空的非缀合VLP或模拟的AIR VLP(非缀合VLP和未缀合至VLP的肽的组合物)的对照VLP一起试管内孵育24小时，然后将经过处理的肿瘤细胞与1x105个OT1特异性CTL一起孵育。经由表面CD8和细胞内IFN-γ染色继之以流式细胞术分析来评估OT-1特异性CTL活化。与AIR-VLP处理的肿瘤细胞一起孵育之后检测到显著更多的CD8+IFN-γ+T细胞，指示AIR-VLP处理用OVA肽成功地包覆非OVA表达肿瘤细胞，使得随后由OT-1特异性CTL识别并且活化所述CTL(参见图6)。

[0233] 为评价缀合至病毒CD8+表位的VLP作为抗肿瘤免疫重定向剂的可行性，我们将鼠类H2-DB限制的HPV16-E7表位(aa49-57)缀合至具有弗林蛋白酶裂解位点的牛乳头状瘤病毒VLP以产生嵌合VLP-R-E7。我们然后将ID8肿瘤细胞与0.3μg/ml空的非缀合VLP或嵌合5
VLP-R-E7一起试管内孵育24小时，然后将经过处理的肿瘤细胞与2x10个E7aa49-57特异性CTL一起孵育。

[0234] 经由表面CD8和细胞内IFN-γ染色继之以流式细胞术分析来评估E7特异性CTL活化。与嵌合VLP-R-E7处理的ID8肿瘤细胞一起孵育之后检测到显著更多的CD8+ IFN-γ+ T细胞，指示嵌合VLP-R-E7处理用E7肽成功地包覆非E7表达ID8肿瘤细胞，使得随后由E7特异性CTL识别并且活化所述CTL(参见图7)。

[0235] 为证实嵌合VLP诱导的免疫重定向可以引起包覆的肿瘤细胞的细胞毒性杀伤，我们证实了AIR-VLP结合至肿瘤细胞引起CTL释放，这促使肿瘤细胞更易于被OVA特异性CD8+ T细胞杀伤。如图8中所示，孵育AIR-VLP而不是空的非缀合VLP引起最大量的由OVA特异性CD8+ T细胞杀伤介导的肿瘤细胞死亡，这由发光活性的显著降低而证实(参见图8)。

[0236] 用0.3μg/ml空的非缀合VLP或嵌合VLP-R-E7试管内处理ID8/luc肿瘤细胞24小时，然后将经过处理的肿瘤细胞与2x104个E7aa49-57特异性CTL一起孵育。我们然后基于由活的ID8/luc细胞的荧光素酶表达经由生物发光成像来评估肿瘤细胞活力。对于用嵌合VLP-R-E7处理并且与E7特异性CTL一起孵育的ID8肿瘤细胞观测到显著更低的荧光素酶活性，指示在处理之后ID8肿瘤细胞活力的显著降低。总之，这个数据证实与靶肽缀合的嵌合VLP包覆肿瘤细胞并且用靶肽加载肿瘤细胞的表面MHC-I的能力，使得随后由活化的CTL杀伤包覆的肿瘤细胞(参见图9)。

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[0249]

[0250] HPV16(114K)L1蛋白质序列SEQ ID NO：205

[0251]

[0252]

[0253]

[0254] HPV16 L1 1114K)核酸序列(SEQ ID NO：206)

[0255]

[0256]

[0257] HPV L2蛋白质序列(SEQ ID NO：207)

[0258]

[0259]

[0260]

[0261] HPV16 L2核酸序列(SEQ ID NO：208)

[0262]

[0263]

[0264] 弗林蛋白酶裂解位点

[0265] R X R/K R(SEQ ID NO：209)

[0266] 弗林蛋白酶裂解位点

[0267] Arg Val Lys Arg(SEQ ID NO：210)

[0268] MMP可裂解肽底物

[0269] Glu Pro Cit Gly HofTyr Leu(SEQ ID NO：211)

[0270] MMP可裂解肽底物

[0271] Gly Pro Leu Gly Ile Ala Gly Gln(SEQ ID NO：212)

[0272] MMP可裂解肽底物

[0273] Pro Val Gly Leu Ile Gly(SEQ ID NO：213)

[0274] 聚谷氨酸停泊位点

[0275] EEEEEEEEC(SEQ ID NO：214)

[0276] 聚谷氨酸停泊位点

[0277] CEEEEEEEEC(SEQ ID NO：215)

[0278] EBNA3C肽aa 284-293结合HLA-A2.01

[0279] LLDRVRFMGV(SEQ ID NO：216)

[0280] EBV肽

[0281] (K)GILGFVFTL(T)(V)(SEQ ID NO：217)

[0282] 水痘病毒CD8+ T细胞表位

[0283] SLPRSRTPI(SEQ ID NO：218)

[0284] 水痘病毒CD8+ T细胞表位

[0285] SAPLPSNRV(DEQ ID NO：219)

[0286] OVA肽

[0287] SIINFEKL(SEQ ID NO：220)

[0288] RG-1 VLP序列

[0289]

[0290] HPV L2蛋白质源性肽

[0291] QLYKTCKQAG TCPPDIIPKV(SEQ ID NOO：222)

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