用于视网膜疾病的核糖开关调节的基因治疗
阅读：1034发布：2020-05-22
专利汇可以提供用于视网膜疾病的核糖开关调节的基因治疗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了包含经修饰的核糖 开关 以调节受试者中转基因表达的构建体。还考虑了 治疗 疾病 ，特别是眼病的方法。，下面是用于视网膜疾病的核糖开关调节的基因治疗专利的具体信息内容。
1.通过调控转基因的mRNA来调节转基因表达的外源核酸构建体，该核酸编码：
(a)目标靶基因，
(b)至少一个位于转基因非翻译区内的smiRNA开关，其中至少一个smiRNA开关包含能够与以下结合的适体结构域：配体，和初miRNA，
(c)与初miRNA的至少一部分互补的至少一个miRNA靶序列，
其中至少一个smiRNA开关通过以下两者调节转基因的表达：(1)调节转基因mRNA的切割，(b)调节初miRNA从smiRNA的切割，其中至少一部分切割的初miRNA与至少一个使转基因表达沉默的miRNA靶基因结合。
2.如权利要求1所述的构建体，其中在不存在配体的情况下，所述初miRNA被从转录物上切割下来，并与至少一个miRNA靶序列结合，
其中初mRNA的部分与至少一种miRNA靶序列的结合使转基因沉默。
3.如权利要求1或2所述的构建体，其中所述配体和所述适体结构域的结合改变了smiRNA的构象，其中构象变化抑制了初miRNA从转录本上切割的能力，其中转基因能够被翻译。
4.如前述任一个权利要求所述的构建体，其中所述smiRNA开关由核酸序列SEQ ID NO：
1编码。
5.如前述任一个权利要求所述的构建体，其中所述至少一个miRNA靶序列由核酸序列GAGAGAATCTTCTTTCTGTCTATAAAA(SEQ ID NO：10)编码。
6.如前述任一个权利要求所述的构建体，其中所述构建体编码三个miRNA靶序列，其中至少三个miRNA靶序列由SEQ ID NO：2编码。
7.如前述任一个权利要求所述的构建体，其中所述构建体包含一个或多个选自SEQ ID NO：21-35和37-51的smiRNA开关。
8.如前述任一个权利要求所述的构建体，其中所述smiRNA位于3'UTR内，至少一个miRNA靶序列位于5'UTR。
9.如前述任一个权利要求所述的构建体，其中所述构建体包含至少两个miRNA靶序列。
10.如前述任一个权利要求所述的构建体，其中与(c)的初miRNA的至少一部分互补的至少一个miRNA靶序列是构建体内转基因的一部分，至少一部分切割的初miRNA与其结合。
11.如前述任一个权利要求所述的构建体，其中所述转基因编码VEGF抑制剂。
12.如权利要求11所述的构建体，其中所述VEGF抑制剂是阿柏西普，并由SEQ ID NO：8编码。
13.如权利要求11所述的构建体，其中所述VEGF抑制剂是由SEQ ID NO：36编码的sFLT1。
14.如前述任一个权利要求所述的构建体，其中所述适体与能够穿过血液视网膜屏障的配体结合。
15.如权利要求14所述的构建体，其中所述配体选自四环素、茶碱、鸟嘌呤、半乳糖醇、孕酮、甘露醇、雌二醇、多巴胺、奎尼丁、尿素、地高辛、尿嘧啶、维拉帕米、硫脲、莫西沙星、胸腺嘧啶、左氧氟沙星、皮质酮、乙酰唑胺、睾酮、多四环素及其组合。
16.如权利要求12或13所述的构建体，其中所述配体选自四环素、茶碱、和鸟嘌呤。
17.如权利要求1所述的构建体，其中所述转基因包含参与前列腺素合成的基因。
18.如权利要求17所述的构建体，其中所述转基因包含由SEQ ID NO：52编码的前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)。
19.如权利要求18所述的构建体，其还包含由SEQ ID NO：53编码的PTGFR。
20.如权利要求17或18所述的构建体，其还包含SEQ ID NO：54。
21.如前述任一个权利要求所述的构建体，其中所述构建体是腺相关病毒(AAV)载体。
22.如权利要求21所述的构建体，其中序列是SEQ ID NO：81。
23.一种减轻有需要的受试者中年龄相关性黄斑变性的至少一种症状的方法，该方法包括：
(a)将外源核酸构建体给药至受试者的眼睛，其编码：
(i)抗VEG抑制剂；
(ii)位于非翻译区内的smiRNA开关，其中该smiRNA开关包含核糖开关，该核糖开关包含能够与以下结合的适体结构域：配体，和初miRNA；和
(b)对受试者给药治疗有效量的配体，以调节抗VEGF抑制剂的表达并减轻年龄相关性黄斑变性的至少一种症状。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述构建体是腺相关病毒载体。
25.如权利要求23-24中任一项所述的方法，其中所述转基因是阿柏西普。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述配体可以穿过血液视网膜屏障。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述配体选自四环素、茶碱、鸟嘌呤、半乳糖醇、孕酮、甘露醇、雌二醇、多巴胺、奎尼丁、尿素、地高辛、尿嘧啶、维拉帕米、硫脲、莫西沙星、胸腺嘧啶、左氧氟沙星、皮质酮、乙酰唑胺、睾酮、多四环素及其组合。
28.如权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述构建体包含一个或多个选自SEQ ID NO：21-35和37-51的SLIM。
29.如权利要求23-28中任一项所述的方法，其中所述构建体通过前房内注射而被给药至眼睛。
30.如权利要求23-29中任一项所述的方法，其中所述配体通过眼药水或口服给药。
31.如权利要求23-29中任一项所述的方法，其中所述外源核酸构建体在非翻译区内包含一个或多个miRNA靶序列。
32.一种减轻有需要的受试者中青光眼的至少一种症状的方法，该方法包括：
(a)将外源核酸构建体给药至受试者的眼睛，该外源核酸构建体编码：
(i)调节前列腺素2α合成的转基因；
(ii)位于转基因的非翻译区内的smiRNA开关，其中smiRNA开关包含至少两个侧接初miRNA的核糖开关，每个核糖开关包含操作性地连接至表达平台的适体，
其中转基因被整合到受试者的细胞内并表达转基因，并且
(b)给药治疗有效量的能够与适体结合的配体，以调节转基因在眼内的表达。
33.如权利要求32所述的方法，其中所述至少一种症状是受试者眼睛内的眼内压降低。
34.如权利要求32或33所述的方法，其中所述构建体通过前房内注射而被给药至眼睛。
35.如权利要求32-34中任一项所述的方法，其中所述配体可以穿过血液视网膜屏障。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述配体选自四环素、茶碱、鸟嘌呤、半乳糖醇、孕酮、甘露醇、雌二醇、多巴胺、奎尼丁、尿素、地高辛、尿嘧啶、维拉帕米、硫脲、莫西沙星、胸腺嘧啶、左氧氟沙星、皮质酮、乙酰唑胺、睾酮、多四环素及其组合。
37.如权利要求31-36中任一项所述的方法，其中所述外源核酸构建体还包含(iii)与初miRNA的至少一部分互补的至少一个miRNA靶序列。
37.如权利要求31-37中任一项所述的方法，其中所述smiRNA开关包含TC40(SEQ ID NO：59)、TC45(SEQ ID NO：63)或两个smiRNA开关的组合。
38.通过调控转基因的mRNA来调节转基因表达的外源核酸构建体，该核酸编码：
(a)目标靶基因，
(b)位于转基因非翻译区内的smiRNA开关，其中smiRNA开关包含能够与以下结合的适体结构域：配体，和初miRNA，
其中smiRNA开关通过以下两者调节转基因的表达：(1)调节转基因mRNA的切割，(b)调节初miRNA从smiRNA的切割，其中被切割的初miRNA的至少一部分结合至转基因的一部分，作为沉默该转基因表达的miRNA靶向序列。
39.如权利要求38所述的构建体，其中不存在配体的情况下，初miRNA被从转录物上切割下来，并与miRNA靶序列结合，其中初mRNA的部分与至少一种miRNA靶序列的结合使转基因沉默。
40.如权利要求38或39所述的构建体，其中所述配体和所述适体结构域的结合改变了smiRNA的构象，其中构象变化抑制了初miRNA从转录本上切割的能力，其中转基因能够被翻译。
41.如前述任一个权利要求所述的构建体，其中smiRNA开关由选自SEQ ID NO：21-35和
37-51的核酸序列编码。
42.如权利要求38-41中任一项所述的构建体，其中smiRNA位于3'UTR内，至少一个miRNA靶序列位于5'UTR。
43.如权利要求38-42中任一项所述的构建体，其中所述构建体还包含至少一个miRNA靶序列。
44.如权利要求38-43中任一项所述的构建体，其中所述转基因编码VEGF抑制剂。
45.如权利要求44所述的构建体，其中所述VEGF抑制剂是阿柏西普，并由SEQ ID NO：8编码。
46.如权利要求44所述的构建体，其中所述VEGF抑制剂是由SEQ ID NO：36编码的sFLT1。
47.如权利要求38-46中任一项所述的构建体，其中所述适体与能够穿过血液视网膜屏障的配体结合。
48.如权利要求47所述的构建体，其中所述配体选自四环素、茶碱、鸟嘌呤、半乳糖醇、孕酮、甘露醇、雌二醇、多巴胺、奎尼丁、尿素、地高辛、尿嘧啶、维拉帕米、硫脲、莫西沙星、胸腺嘧啶、左氧氟沙星、皮质酮、乙酰唑胺、睾酮、多四环素及其组合。
49.如权利要求48所述的构建体，其中所述配体选自四环素、茶碱、和鸟嘌呤。
50.如权利要求38所述的构建体，其中所述转基因包含参与前列腺素合成的基因。
51.如权利要求50所述的构建体，其中所述转基因包含由SEQ ID NO：52编码的前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)和由SEQ ID NO：53编码的PTGFR。
52.如权利要求38-51中任一项所述的构建体，其中所述构建体是腺相关病毒(AAV)载体。
用于视网膜疾病的核糖开关调节的基因治疗
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2017年3月10日提交的美国临时申请第62/469,705号的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。
[0004] 无
背景技术
[0005] 年龄相关性黄斑变性(AMD)和青光眼全世界视力丧失的主要原因。AMD在50岁以及以上年龄的人群中是常见眼病。在AMD中，存在黄斑的损伤，其是由数百万个感光细胞组成的小区域，在视网膜中央附近，并且其是获得清晰的中央视力、并能够看到正前方的物体所需的眼睛部分。黄斑损伤是由被称为玻璃膜疣的沉积物的形成导致的，在某些情况下，还可能是视网膜下的异常血管的生长。
[0007] AMD和青光眼都无法预防。对于没有症状或视力丧失的早期AMD，没有治疗方法。晚期的AMD用生物制剂治疗。青光眼经常用前列腺素眼药水治疗。当前的治疗是侵入性的、昂贵的、且对患者和诊所而言是繁重的，需要每月一次的眼部注射(AMD)或每天的眼药水给药。
[0008] 眼基因治疗有可能深刻改善遗传性视网膜疾病患者的生活质量。几个因素使眼睛成为进行基因置换治疗的理想器官。眼睛是可及的，其是分开的、特殊的部位。反过来，这意味着从免疫学角度来说，眼睛能够耐受外来蛋白质/抗原的引入而不会引起炎症性免疫反应。临床试验可以利用对侧对照。因此，正在开发用于眼病的基因治疗。
[0009] 在这方面，重组腺相关病毒(rAAV)载体已成为介导视网膜疾病的基因治疗的有前途的工具。载体递送后有效控制基因表达水平是潜在基因治疗成功的关键，而治疗性转基因的不受控的过度表达会导致毒性。传统上，采用诱导型启动子系统。不幸的是，由于AAV的编码能力有限、以及使此类系统有效运行所需的大尺寸调节元件，将传统的启动子纳入其中是不可行的。
[0010] 核糖开关是可能的选择。核糖开关是mRNA分子的特定调控成分，其结合并靶向小靶分子，从而以顺式方式调控含核糖开关的mRNA蛋白产物的表达。因此，响应于其靶分子的浓度，含有核糖开关的mRNA会直接参与调节自身的活性。一些核糖开关是“自靶向”的，这意味着其可以调节自身的表达。开关包括一个RNA元件，其可以适应两个互斥的二级结构之一。这些结构中的一个是基因表达为“打开”的信号，另一个构象则是基因“关闭”的信号。
[0011] 然而，往往必须是有毒的配体浓度才会“按动开关”以打开或关闭基因表达。因此，当前研究的目标是改善这些调节装置的效率、改进调节参数和临床适用性。本发明的主题是可以打开或关闭视网膜中的基因表达的、用于视网膜基因治疗的核糖开关。
[0012] 发明概述
[0013] 本发明通过提供使用经修饰的核糖开关来调节转基因表达的构建体、试剂盒和方法，克服了上述缺点，该经修饰的核糖开关通过基因沉默的双重机制起作用。本发明提供与现有的核糖开关相比独特和改进的设计，其具有基因沉默的双重机制，从而允许更好地控制转基因的表达。本文更详细地描述了新的经修饰的核糖开关，包括自靶向配体失活的微RNA(SLIM)开关，其是一种在配体的存在下介导基因表达增加的打开型开关。本文提供了使用该技术治疗AMD的组合物和方法。具体地，该SLIM开关可被用于间歇性打开转基因(例如，VEGF抑制剂)的表达。SLIM开关的进一步实施方式可被用于治疗青光眼。考虑到该技术的组合物和方法的用于治疗青光眼的用途，间歇性关闭或降低患者眼中前列腺素的表达将是有益的。
[0014] 通过以下描述可以清楚地了解本发明的上述和其他方面和优势。在以下说明书中，参照构成说明书的一部分的附图，其中以说明性方式显示了本发明的优选实施方式。这类实施方式不必然代表本发明的全部范围，而是作为参考，由此对权利要求进行说明并在本文中解释本发明的范围。
[0015] 附图简要说明
[0017] 图1是说明OFF-开关和ON-开关核糖开关的示意图。
[0018] 图2A是表示使用初miRNA和适体的SLIM开关(例如可切换的miRNA)的开发的示意图。
[0019] 图2B是示出具有和不具有配体的SLIM开关的设计和功能的示意图。
[0020] 图2C是表示编码阿柏西普(VEGF抑制剂)的rAAV载体的示意图，其具有修饰的开关(smiRNA)和靶miRNA序列(miRT)。
[0021] 图3是可用于SLIM开关设计的打开型适体的示意图。
[0022] 图4描绘了Theo-SLIM构建体的组件。
[0023] 图5是包含阿柏西普(VEGF抑制剂)、Theo-SLIM和三个miRNA靶位点的示例性构建体的序列。
[0024] 图6A是描绘在感染后4周在小鼠的视网膜中GFP表达的荧光成像。C57BL6/J小鼠玻璃体内注射了1.0×1010载体基因组(vg)的rAAV2.smCBA-hGFP-3x-L2Bulge9。
[0025] 图6B是饲喂@10mg/kg茶碱(活化配体)后两个小时的GFP荧光成像。
[0026] 图7是使用SLIM开关(组成性关闭转基因)的响应建议，表明配体的每月给药导致转基因(例如阿柏西普)表达水平的峰值。
[0027] 图8A是用于确定每个核糖开关的最佳拷贝数的测试方案的示意图。
[0028] 图8B是用于评估每个核糖开关的动态范围的测试方案的示意图。
[0029] 图9A是L2Bulge18tc核糖开关构建体的mRNA的示意图。
[0030] 图9B是柱状图，描绘了L2Bulge18tc核糖开关的不同拷贝数在转基因(GFP)的表达水平上的结果。
[0031] 图9C是描绘了包含3个拷贝的L2Bulge18tc核糖开关的构建体的动态范围的线图。
[0032] 图9D是经0-100μM四环素处理的细胞的荧光成像。
[0033] 图10A是含有K19核糖开关的构建体的mRNA的示意图。
[0034] 图10B是柱状图，描绘了K19核糖开关的不同拷贝数在转基因的表达水平上的结果。
[0035] 图10C是描绘K19核糖开关的最佳拷贝数的动态范围的线图。
[0036] 图10D是用10A的K19核糖开关构建体转导的经0-100μM四环素处理的细胞的荧光成像。
[0037] 图11A描述了包含L2Bulge9核糖开关的构建体的mRNA。
[0038] 图11B是柱状图，描绘了L2Bulge9核糖开关的不同拷贝数在转基因的表达水平上的结果。
[0039] 图11C是描绘L2Bulge9核糖开关的最佳拷贝数的动态范围的线图。
[0040] 图11D是用11A的L2Bulge9核糖开关构建体转导的经0-100μM茶碱处理的细胞的荧光成像。
[0041] 图12A描绘了包含四环素SLIM开关(打开型开关)的构建体的mRNA。
[0042] 图12B描绘了图12A的tet-SLIM开关的动态范围。
[0043] 图12C是用12A的tet-SLIM核糖开关构建体转导的经0-100μM四环素处理的细胞的荧光成像。
[0044] 图13A描绘了包含茶碱SLIM开关(打开型开关)的构建体的mRNA。
[0045] 图13B描绘了图13A的theo-SLIM开关的动态范围。
[0046] 图13C是用13A的theo-SLIM核糖开关构建体转导的经0-100μM四环素处理的细胞的荧光成像。
[0047] 图14A-14L是CNV病变的代表性荧光素血管造影图像。激光损伤后7天评估来自CNV病变的泄漏。注射了(A-C)rAAV2[MAX].smCBA-Eylea、(D-F)rAAV2[MAX].smCBA-Eylea-1x-TC45+标准饮食、(G-I)rAAV2[MAX].smCBA-Eylea-1x-TC45+四环素饮食或PBS(n＝每组16-20处病变)的小鼠在荧光素注射5分钟后的代表性FA图像。每组3只小鼠的图像，带有红色箭头，指示激光损伤的部位。
[0048] 图15A-15B表明眼内Eylea浓度与CNV病变的严重程度密切相关。(A)由三位盲法科学家独立评估的病变分布。每组N＝16-20个病变，p＜0.0001，卡方检验)。(B)通过ELISA测定的非复合Eylea的眼内水平。N＝每组5只眼。
[0049] 图16是重组VEGF抑制剂cDNA(SEQ ID NO：18)、和包含SLIM Eylea的完整的AAV载体(SEQ ID NO：19)的示例性序列。
[0050] 图17A-17C是6S-亚叶酸响应性SLIM(A)(SEQ ID NO：21)、茶碱响应性SLIM(B)(SEQ ID NO：26)和四环素响应性SLIM(C)(SEQ ID NO：31)的示意图。
[0051] 图18是示例性的6-S-亚叶酸响应性miRNA开关(Eylea CDS靶标)(SEQ ID NO：21-25)、茶碱响应性miRNA开关(Eylea CDS靶标)(SEQ ID NO：26-30)、四环素响应性miRNA开关(Eylea CDS靶标)(SEQ ID NO：31-35)和可与SLIM开关一起使用以治疗AMD的可溶性fms样酪氨酸激酶1(sFLT1)VEGF抑制剂cDNA(SEQ ID NO：36)。
[0052] 图19示出了包含SEQ ID NO：37-41的6S-亚叶酸响应性miRNA SLIM开关(sFLT1 CDS靶标)、包含SEQ ID NO：42-46的茶碱响应性miRNA SLIM开关(sFLT1-CDS靶标)、和四环素响应性miRNA开关(sFLT1-CDS靶标)SEQ ID NO：47-51的示例性序列。
[0053] 图20显示了PGF2α生物合成途径的酶。
[0055] 图22是描绘在用具有SLIM核糖开关的AAV治疗和给药配体四环素后，小鼠中眼内压(IOP)相对于基线的变化的图。
[0056] 图23是用于本发明的示例性序列，包括密码子优化的PTGS2序列(SEQ ID NO：52)、密码子优化的PTGFR(SEQ ID NO：53)、PTGS2-P2-PTGFR序列(SEQ ID NO：54)和用于PDG2α生物合成的完整AAV表达盒(SEQ ID NO：58)。还包括可用于实施本发明的其他核糖开关(SEQ ID NO：64-67)。
[0057] 发明详述
[0058] 本公开提供用于治疗疾病、特别是眼病、更特别是AMD和青光眼的经修饰的核糖开关(例如，经修饰的miRNA开关)和包含所述经修饰的核糖开关的系统。本发明目的在于提供调节眼中基因表达的新的系统，其作为调节工具使用新的经修饰的微RNA(核糖开关)。这样的基因构建体以及使用其的试剂盒或方法可用于控制基因表达，例如用于涉及调节特定化合物、例如眼中的前列腺素的重组蛋白或转基因的生产。
[0059] 这种基于RNA的系统(核糖开关)与诱导型启动子系统相比具有三个独特的优势。首先，它们的基因足迹较小(～100bp)，因此可以轻松整合到rAAV载体基因组中，而不会牺牲大量的编码能力。第二，这些装置以顺式的方式作用，限制了免疫响应的可能性，因为功能上不需要蛋白质辅因子。最后，可以将核糖开关的适体结构域改造成对几乎任何激活的配体(包括蛋白质、小分子药物或离子)都响应。
[0060] 该技术的一个实施方式是调控与前列腺素F2α合成有关的转基因在眼中的表达，以调节青光眼患者的眼内压。第二个实施方式是调控抗VEGF重组融合蛋白、即阿柏西普(Eylea)在眼中的表达，以防止脉络膜新血管形成(CNV)。
[0061] 在一些实施方式中，该技术使用包括经修饰的核糖开关的构建体，它们是配体控制的基因调节元件，其允许打开或关闭目标转基因以调节转基因表达。核糖开关起作用的机制包括但不限于：如果存在足够浓度的其配体、则具有充当核酶和切割自身的能力，以无法接触核糖体结合位点并防止翻译发生的方式折叠mRNA的能力，和/或影响前mRNA分子剪接的能力。包含经修饰的核糖开关的实施方式和包含这样的核糖开关的构建体或盒包括在本文中。
[0062] 微RNA是一类非编码RNA，在基因表达的调节中起关键作用。在转录后水平上起作用，微RNA(miRNA)基因被RNA聚合酶II转录为较大的初级转录物(初-mRNA)，然后被含有RNA酶III酶Drosha的蛋白质复合物加工，以形成前体微RNA(微RNA前体)。在本发明中，已将初微RNA设计为可被加工成可作为沉默RNA使基因表达沉默的前mRNA。
[0063] 核糖开关分为两部分：适体和表达平台。适体是靶小分子配体结合的“传感器”；表达平台随着适体传感器的变化而发生结构变化。适体结构域的结合引起表达平台内的构象变化，该构象变化通过打开或关闭基因来调节基因表达。这示于图1。适体以蓝色显示；表达平台以红色显示；配体以绿色显示。通常必须要有毒的配体浓度才能“按动开关”。然而，本发明提供了经修饰的核糖开关，其可以打开或关闭视网膜中的基因表达，以用于使用无毒水平的配体的眼基因治疗。
[0064] 本文描述了许多示例性的核糖开关、即自靶向配体失活的微RNA(SLIM)实施方式。自靶向配体失活的微RNA(SLIM)是在配体存在下介导基因表达增加的打开型开关(参见例如图2A和2B)。本文提供了使用该技术治疗AMD和青光眼的组合物和方法。具体地，该SLIM系统可被用于间歇性打开VEGF抑制剂的表达。考虑到该技术的组合物和方法的用于治疗青光眼的用途，间歇性关闭或降低患者眼中前列腺素的表达将是有益的。两者都在下面更详细地描述。
[0065] SLIM：用于修饰基因表达的打开型经修饰的核糖开关
[0066] 在一个实施方式中，本发明提供了一种自靶向配体失活的微RNA(SLIM)开关，它是一种打开型核糖开关，可以被整合到表达构建体中，以调节目标转基因的表达。SLIM开关(图2A和B中的smiRNA)需要将初miRNA的基础区域替换为可以与目标配体结合的适体。该序列被克隆到表达构建体的3’-或5’非翻译区。配体的结合改变了适体和初miRNA的构象，导致初miRNA没有被Drosha切割。靶miRNA序列被克隆到3'或5'非翻译区，从而可以允许第二级调控，其中在不存在配体的情况下将初miRNA切割后，将其加工成可与目标miRNA序列结合并阻止转录的miRNA。一旦将SLIM开关整合到表达构建体中，当不存在配体时，转基因表达就关闭，一旦配体与适体结合，转基因表达就打开。
[0067] SLIM通过在转录后水平调节基因表达来切换功能。在缺少活化配体的条件下，初miRNA会被Drosha从新生转录本上切割下来。通过互补靶点的结合，该miRNA将被加工并作为基因沉默的第二种机制。当存在活化配体时，基因表达不变并且基因被表达。
[0068] 在一个实施方式中，提供了一种用于调节转基因表达的外源核酸构建体。该构建体编码(a)转基因，(b)位于转基因非翻译区内的smiRNA开关(SLIM开关)，其中该smiRNA开关包含能够与以下结合的适体结构域：配体，和初miRNA序列，(c)与初miRNA的至少一部分互补的至少一个miRNA靶序列。miRNA开关通过以下两者调节转基因的表达：(1)调控mRNA的切割(去除使RNA不稳定的多聚A尾或5'帽)，(2)调节初miRNA从smiRNA的切割，其中被切割的初miRNA的至少一部分被加工并结合至使转基因表达沉默的至少一个miRNA靶序列。
[0069] 如上所述，在不存在配体的情况下，初miRNA被从转录物上切割下来，并与使转基因沉默的至少一个miRNA靶序列结合。这示于图2。在一些实施方式中，与以上讨论的初miRNA(c)的至少一部分互补的至少一个miRNA靶序列被包含在转基因中(如图2B的底部图所示)。换句话说，可以针对转基因本身产生SLIM开关。
[0070] 在一个优选的实施方式中，异源自靶向配体失活的微RNA(SLIM)开关包含(a)目标靶基因，(b)至少一个位于转基因非翻译区内的smiRNA开关，其中该smiRNA开关包含能够与以下结合的适体结构域：配体，和初miRNA，其中smiRNA开关通过以下两者调节转基因的表达：(1)调节转基因mRNA的切割，(b)调节初miRNA从smiRNA的切割，其中被切割的初miRNA的至少一部分结合至转基因的一部分(换句话说，一部分转基因作为miRNA靶向序列)以使转基因表达沉默。合适的核糖开关描述于图18和19，其中也包括每个核糖开关靶向的Eylea转基因或Flt1转基因的部分(例如针对靶向Eylea靶标1中发现的Eylea的一部分(SEQ ID NO：70)的Eylea靶标1(例如，SEQ ID NO：21、或26或31)的SLIM开关，针对靶向Eylea靶标2(SEQ ID NO：71)的靶标2(例如SEQ ID NO：22、27、32)的SLIM开关等，以此类推(例如针对靶向Eylea靶标3的Eylea3的SLIM开关，针对靶向Eylea靶标4的Eylea4的SLIM开关，针对靶向Eylea靶标5的Eylea靶标5的SLIM开关，针对靶向Flt1靶标1的Flt1靶标1的SLIM开关等)。可以将一种或多种SLIM开关组合在外源表达构建体中，以用于本文(针对Elyea或Sflt1的靶标1、靶标2、靶标3、靶标4和靶标5的SLIM开关可以任意组合方式组合，以构建针对图18-19中的SLIM的靶标(例如SLIM1和2；SLIM1和3；SLIM1和4；SLIM1和5；SLIM2和3；SLIM2和4；
SLIM2和5；SLIM3和4；SLIM3和5；SLIM4和5；SLIM1、2、和3；SLIM1、2和4；SLIM1、2和5；SLIM1、
3、和4；SLIM1、3和5；SLIM1、4和5；SLIM2、3和4；SLIM2、3和5；SLIM2、4和5；SLIM3、4和5；
SLIM1、2、3、和4；SLIM1、2、3和5；SLIM2、3、4和5；和SLIM1、2、3、4和5)。
SLIM2和5；SLIM3和4；SLIM3和5；SLIM4和5；SLIM1、2、和3；SLIM1、2和4；SLIM1、2和5；SLIM1、
3、和4；SLIM1、3和5；SLIM1、4和5；SLIM2、3和4；SLIM2、3和5；SLIM2、4和5；SLIM3、4和5；
SLIM1、2、3、和4；SLIM1、2、3和5；SLIM2、3、4和5；和SLIM1、2、3、4和5)。
[0071] 在一个实施方式中，提供了一种通过调节转基因的mRNA来调节转基因表达的外源核酸构建体。核酸编码：(a)目标靶基因，(b)至少一个位于转基因非翻译区内的smiRNA开关，其中该smiRNA开关包含能够与以下结合的适体结构域：配体，和初miRNA，其中smiRNA开关通过以下两者调节转基因的表达：(1)调节转基因mRNA的切割，(b)调节初miRNA从smiRNA的切割，其中至少一部分切割的初miRNA结合至转基因的一部分(作为miRNA靶向序列)以使转基因表达沉默。在一个优选的实施方式中，外源核酸构建体是AAV病毒载体。
[0072] 在一些实施方式中，如图18和19所示的序列所示，针对Eylea或sFlt1生成的SLIM开关被用于治疗AMD。
[0073] 在一个实施方式中，一种外源核酸构建体编码：SLIM开关、转基因和至少一个靶miRNA序列。这样的SLIM开关的设计示于图2A。在一个实例中，合适的SLIM开关(smiRNA)编码适体结构域和初miRNA。合适的适体结构域改编自本领域已知的打开型核糖开关的适体结构域，并且包括但不限于例如L2Bulge18tc(例如包括但不限于SEQ ID NO：12)、K19(例如SEQ ID NO：15)、L2Bulge9(例如SEQ ID NO：11)等。合适的适体结构域描述于图3并且之后的说明书中描述。
[0074] 合适的SLIM开关包括但不限于图3中描述的我们开发的Theo-SLIM(SEQ ID NO：1)(smiRNA)和本文所述的Tet-SLIM(SEQ ID NO：17)。这些SLIM开关经过设计，不会与人类基因组中的任何基因发生交叉反应，因此不会引起脱靶效应。
[0075] 其他SLIM开关描绘于图18-23。
[0076] 术语“外源的”是指对原核宿主细胞来说是异源的(自然界中通常不存在的)核酸，或原核宿主细胞中通常不存在的重组核酸。在一些实施方式中，外源核酸序列是异源序列，其包含来自许多不同来源或生物的序列。术语“外源的”还包括构建体，其包括来自与将使用该构建体的物种不同的物种的序列。例如，本发明的rAAV构建体将不仅包括内源AAV序列，而且还包括来自人或其他非AAV病毒天然来源的外源序列。
[0077] 本文提供的核酸构建体是包含非天然存在序列的合成工程构建体。
[0078] 术语“转基因”和“目标靶基因”可互换使用，是指通过使用本发明的构建体在所需细胞中表达的外源基因。
[0079] 此外，可以针对各种配体设计合适的适体，并通过将适体连接至初miRNA序列而整合到SLIM开关中(参见例如图2A)。
[0080] 在一些实施方式中，构建体包含转基因和SLIM开关。在这些实施方式的一些中，转基因作为SLIM开关的miRNA靶序列。在其他实施方式中，构建体还包含SLIM开关，该SLIM开关在3'或5'UTR中还包含至少一个靶miRNA序列，优选约1-4个靶miRNA序列。例如，图2B(顶图)示出了这样的构建体的合适设计。合适的配体将在下文中进一步讨论，具体包括能够穿过血液视网膜屏障的配体，例如四环素、茶碱和鸟嘌呤。
[0081] 在一些实施方式中，构建体包含至少一个靶miRNA序列，或者至少两个，或者至少三个，或者至少四个靶miRNA序列。添加的靶miRNA序列的数量可以取决于所使用的载体，例如，在使用rAAV载体时，合适的靶miRNA数目包括例如1-5。添加更多的靶位点会限制可用的编码序列，因为rAAV载体的大小存在限制，因此，取决于转基因的大小和序列，也可能会改变添加的靶miRNA序列的数量。
[0082] 在一个实施方式中，当smiRNA是SEQ.ID NO.1时，靶miRNA序列被编码为SEQ ID NO：10(GAGAGAATCTTCTTTCTGTCTATAAAA)。在一个合适的实施方式中，该构建体包含至少三个靶miRNA序列，例如，如SEQ ID NO：2所示。
[0083] 在一个实施方式中，构建体包含合适的转基因，其中可以通过给药配体来诱导转基因的表达。例如，如下文进一步详细描述的，转基因可以是VEGF抑制剂，特别地可以是能够诱导在眼中表达以治疗AMD的VEGF抑制剂。具体地，合适的VEGF抑制剂是阿柏西普，其由SEQ ID NO：8所示的cDNA编码。
[0084] 在另一个实施方式中，适体结构域和初miRNA被编码在SEQ ID NO：1内。在一些实施方式中，构建体包含在构建体中发现的其他序列，例如启动子、增强子、WPRE元件等。本领域技术人员将能够整合由核酸构建体表达转基因所必需的其他已知元件。
[0085] 在一些实施方式中，构建体是腺相关病毒(rAAV)、慢病毒、腺病毒、质粒、单纯疱疹病毒、杆状病毒、噬菌体等。优选地，该构建体是腺相关病毒。在图2中示出了合适的rAAV构建体，其整合了阿柏西普的转基因、Theo-SLIM开关和3个miRNA靶序列，例如，以SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：19编码的序列。
[0086] 在一些实施方式中，SLIM开关需要将初miRNA的基础区域替换为适体。该序列被克隆到表达盒的3’-或5’非翻译区。此外，与成熟miRNA序列互补的miRNA靶位点可在盒的5'或3'非翻译区中以一个或多个拷贝的形式被包含。
[0087] 自靶向配体失活的miRNA(SLIM)开关通过在转录后水平调节基因表达来切换功能。在缺少活化配体的条件下，初miRNA会被Drosha从新生转录本上切割下来。通过互补靶点的结合，该miRNA将被加工并作为基因沉默的第二种机制。当提供活化配体时，基因表达不变。
[0088] 每个核糖开关的多个拷贝可被包含在目标基因的3'非翻译区中。如表1所示，每个核糖开关似乎具有最佳拷贝数。此外，在一些实施方式中，miRNA靶位点的多个拷贝可被包含在3'或5'非翻译区中。合成核糖开关包含适体和表达平台，并依赖于表达平台活性的变化来调节基因表达。miRNA靶位点是治疗盒(构建体)中的被成熟miRNA/siRNA识别的序列。如下文所讨论，miRNA靶位点可被包含在转基因内。换句话说，切割并加工自核糖开关的siRNA与转基因结合并抑制其表达。
[0089] 或者，可以用Eylea和sFlt1产生用于转基因本身的SLIM开关，用于治疗AMD，该序列见于图16-18、19和23。
[0090] 在一实施方式中，核酸构建体包含目标靶基因，例如VEGF抑制剂(例如Eylea(SEQ ID NO：20)或sFLT1(SEQ ID NO：36))和位于靶基因非翻译区内的至少一个miRNA SLIM开关(例如，分别选自VEGF抑制剂的SEQ ID NO：21-35或SEQ ID NO：37-51中的至少一种)。
[0091] 在一些实施方式中，核酸构建体是包含Eylea基因的rAAV载体(例如SEQ ID NO：19)。例如，SEQ ID NO：19提供了用于用SLIM开关表达Eylea的完整AAV表达载体。在SEQ ID NO：19内，X标记是可以插入SLIM序列的位置。可以插入的合适的SLIM序列可以在图18中找到，并且包括但不限于，6S-亚叶酸响应性SLIM(miRNA)开关，包括例如SEQ ID NO：21、22、
23、24、和25(被配体6S-亚叶酸活化)，茶碱响应性SLIM，例如SEQ ID NO：26、27、28、29和30(被配体茶碱活化)，或四环素响应性SLIM，例如SEQ ID NO：31、32、33、34、和35(被配体四环素活化)。在一些实施方式中，1-5个SLIM序列被插入AAV表达载体内，或者1-3个SLIM序列被插入。例如，SEQ ID NO：19可包含1-5个SEQ ID NO：21的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：22的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：23的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：24的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：25的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：26的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：27的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：28的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：29的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：30的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：31的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：32的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：33的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：34的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：35的拷贝。
23、24、和25(被配体6S-亚叶酸活化)，茶碱响应性SLIM，例如SEQ ID NO：26、27、28、29和30(被配体茶碱活化)，或四环素响应性SLIM，例如SEQ ID NO：31、32、33、34、和35(被配体四环素活化)。在一些实施方式中，1-5个SLIM序列被插入AAV表达载体内，或者1-3个SLIM序列被插入。例如，SEQ ID NO：19可包含1-5个SEQ ID NO：21的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：22的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：23的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：24的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：25的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：26的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：27的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：28的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：29的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：30的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：31的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：32的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：33的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：34的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：35的拷贝。
[0092] 在另一个实施方式中，核酸构建体包含目标靶基因，例如，VEGF抑制剂sFLT1(SEQ ID NO：36)和位于靶基因的非翻译区内的至少一个smiRNA SLIM开关(例如选自SEQ ID NO：37-51的至少一种)。
[0093] 在一些实施方式中，核酸构建体包含sFLT1基因(SEQ ID NO：36)。sFLT1可被插入到载体中、例如rAAV载体中、并插入在X(可插入SLIM序列的位置)标记的位置的侧面。可以插入的合适的SLIM序列可以在图18中找到，并且包括但不限于，6S-亚叶酸响应性SLIM(miRNA)开关，包括例如SEQ ID NO：37、38、39、40、和41(被配体6S-亚叶酸活化)，茶碱响应性SLIM，例如SEQ ID NO：42、43、44、45和46(被配体茶碱活化)，或四环素响应性SLIM，例如SEQ ID NO：47、48、49、50、和51(被配体四环素活化)。在一些实施方式中，1-5个SLIM序列被插入构建体内，或者1-3个SLIM序列被插入。例如，SEQ ID NO：36可包含1-5个SEQ ID NO：37的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：38的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：39的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：40的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：41的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：42的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：43的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：44的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：45的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：46的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：47的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：48的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：49的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：50的拷贝，或者1-5个SEQ ID NO：51的拷贝。设想了SLIM序列的替代组合(例如，选自SEQ ID NO：36、37、38、39、40和41的1-5个SLIM序列)。合适的是，优选在构建体中使用由相同配体激活的SLIM序列，例如由四环素配体活化的1-5个SLIM序列。
[0094] 在图21中描绘的另一个实施方式中，核酸构建体包含PTGS2(SEQ ID NO：52)和PTGFR(SEQ ID NO：53)(在SEQ ID NO：54中组合表示为PTGS2-P2A-PTGFR)。合适的核酸构建体在图23中作为SEQ ID NO：81描绘，AAV表达载体，其包含PGF2α生物合成调节基因(PTGS2(SEQ ID NO：60)和PTGFR(SEQ ID NO：62)，其包括两个合成的核糖开关TC40(SEQ ID NO：59)和TC45(SEQ ID NO：63)。这种构建体的合适用途是青光眼的治疗。
[0095] 配体
[0096] 所要使用的具体配体取决于具体应用和SLIM开关中包含的适体。为了治疗眼病和病症，优选能够穿过血液视网膜屏障的配体。可以穿过血液视网膜屏障的合适的适体包括但不限于例如四环素、茶碱、鸟嘌呤、半乳糖醇、孕酮、甘露醇、雌二醇、多巴胺、奎尼丁、尿素、地高辛、尿嘧啶、维拉帕米、硫脲、莫西沙星、胸腺嘧啶、左氧氟沙星、皮质酮、乙酰唑胺、睾酮、多四环素及其组合。
[0097] 在一个优选的实施方式中，配体选自四环素、茶碱和鸟嘌呤。
[0098] 配体的合适给药途径是本领域已知的，包括口服给药、通过眼睛(例如滴眼剂)给药等。
[0099] 眼病的治疗
[0100] 本技术的构建体对于治疗眼病的基因疗法特别有用。出于多种原因，眼睛是此类基因治疗的特别好的靶标。眼睛是高度专门化的器官，其已经进化为将光刺激转换为电信号并将这些信号中继到视觉皮层。光感应和图像形成是通过位于神经感觉视网膜最外层的感光细胞的激活来介导的，其中通过角膜和晶状体聚焦的入射光会导致信号级联的激活和电脉冲的传播。尽管眼睛很复杂，但它具有许多特性，使其成为基因治疗的有吸引力的器官：它具有相对较高的免疫特权，隔室尺寸小，易于观察和检查，并且易于接受，对手术患者的风险最小。视网膜(AND)或角膜(青光眼)是基因治疗的主要目标。载体递送通常通过向邻近靶细胞的解剖学受限的空间注射包含治疗性颗粒的流体悬浮液来实现。如果rAAV.SLIM.αVEGF或rAAV.SLIM.sFLT1载体靶向内部视网膜细胞(包括视网膜神经节细胞和Müller胶质细胞)，则将是最有益的，因此将通过玻璃体内注射给药。如果将rAAV.SLIM.PTGS2-P2-PTGFR载体靶向角膜和前房的细胞(包括角膜内皮细胞)，则将是最有益的，因此将通过前房内注射给药。使用rAAV在眼基因治疗中的许多rAAV临床试验已经成功完成；然而，迄今为止，所有试验都采用了针对感光体的视网膜下递送方法。当前的I/II期临床试验(NCT01494805)正在利用rAAV介导的可溶性fms样酪氨酸激酶-1(sFLT)(一种VEGF的可溶性受体)的过度表达来治疗AMD。与本文所述的描述的rAAV.SLIM.αVEGF和rAAV.SLIM.sFLT1技术不同，该试验中sFLT的表达是组成性的，无法调节。目前尚无基于rAAV的基因治疗青光眼的临床试验。
[0101] AMD的治疗
[0102] 本发明提供了通过抑制、减少或减轻AMD的至少一种症状来治疗年龄相关性黄斑变性的方法。AMD是一种涉及眼内多个组织层的疾病，包括脉络膜、视网膜色素上皮和神经感觉视网膜，并以两种形式发生。干性AMD是一种非增生性疾病，其特征是中央视网膜进行性地图样萎缩。在大约10-15％的患者中，疾病发展为湿润形式，其特征是血管从脉络膜到视网膜下腔的异常生长。脉络膜新血管形成(CNV)主要是由于眼内VEGF浓度增加而引起的，并且是AMD的主要威胁视力的症状。已知抗VEGF剂的给药可显著降低CNV的发生率，是当前的金标准治疗AMD。然而，该治疗方案是侵入性的，需要重复(例如每月或每两个月)进行玻璃体内纯化的重组抗VEGF蛋白的注射。
[0103] 提出的rAAV.SLIM.αVEGF技术将显著降低AMD患者中CNV形成的发生率，从而预防视力丧失。至关重要的是，包括SLIM技术将允许通过激活配体的剂量控制抗VEGF的表达。
[0104] 本发明的rAAV.SLIM.αVEGF载体技术将显著降低AMD患者中CNV形成的发生率，从而预防视力丧失。至关重要的是，包括SLIM技术将允许通过激活配体的剂量控制抗VEGF的表达。
[0105] 本发明提供了治疗、减少、减轻、或抑制AMD的至少一种症状的方法，该方法包括向受试者的眼睛给药如本文所述的包含VEGF抑制剂和SLIM核糖开关的构建体(包括例如rAAV.SLIM.αVEGF或rAAV.SLIM.sFLT1载体)，并进一步给予治疗有效量的配体。如本文中进一步详细描述的，SLIM核糖开关可以确定使用哪种配体。合适地，该治疗导致AMD的一种或多种症状的减少，减轻或抑制，例如CNV发展的减少或抑制。
[0106] 在一个实施方式中，治疗、抑制或减轻AMD的至少一种症状的方法包括给予构建体，并给予治疗有效量的配体，其中所述构建体包含与编码VEGF抑制剂的转基因操作性地连接的一种或多种打开型核糖开关。合适的打开型核糖开关在本领域中是已知的，包括但不限于例如，L2Bulge18tc(SEQ ID NO：12)、K19(SEQ ID NO：15)和L2Bulge 9(SEQ ID NO：11)。此外，该构建体可以编码最佳拷贝数的打开型核糖开关，其可被整合到该构建体中。表
1详细列出了核糖开关的最佳拷贝数。例如，用于治疗AMD的构建体可以包含1-3个L2Bulge18tc核糖开关和VEGF抑制剂。
1详细列出了核糖开关的最佳拷贝数。例如，用于治疗AMD的构建体可以包含1-3个L2Bulge18tc核糖开关和VEGF抑制剂。
[0107]
[0108] 表1：打开型开关和SLIM开关
[0109] SLIM核糖开关可被整合到本发明的构建体中，以通过给药治疗有效量的配体来改变转基因的基因表达。“治疗有效量”是指能够改变细胞中转基因产物表达水平的配体的量或剂量。本领域技术人员将能够滴定并确定治疗有效量以产生适当的响应并获得期望的待治疗疾病的症状的减轻。治疗有效量还维持配体水平对受试者是无毒的。合适地，可以每天、每周或每月给予剂量，这取决于在受试者中表达的具体要求。
[0110] 青光眼的治疗
[0111] 本发明首次在视网膜模型中提供了功能更高的遗传开关，其可用于调节眼内的转基因以治疗眼病。与传统的核糖开关相比，如上所述的SLIM开关具有增加动态范围的潜力，可被用于治疗、抑制或改善一种或多种青光眼的症状，包括高眼内压。前列腺素的合成将通过口服摄取活化的配体来调节。活化的配体的剂量将通过使用回弹式眼压计的患者的眼内压(IOP)读数来确定。
[0112] 本公开提供了治疗青光眼的方法，其包括使用编码构建体的腺相关病毒进行基因治疗，所述构建体包含如本文所述的SLIM开关、和一个或多个调节前列腺素合成的基因。在另一个实施方式中，本公开提供了一种治疗青光眼的方法，该方法包括给予编码构建体的腺相关病毒，该构建体包含一个或多个调节前列腺素合成的基因、和至少一个打开型核糖开关(SLIM)。图21和23提供了这样的AAV载体的一个实例，该AAV载体编码调节前列腺素合成所必需的基因和适用于本发明的SLIM核糖开关。
[0113] 青光眼的典型特征是眼内压(IOP)升高，导致视网膜神经节细胞逐渐丧失，最终导致严重的视力障碍。眼后房内的睫状体产生的房水与前房中的小梁网的引流之间的不平衡会导致IOP增加。青光眼可根据小梁网的引流是完全(闭角)还是部分(开角)阻塞而分类。开角型青光眼是最常见的，除了缓慢的进行性视力丧失外，通常没有其他症状。闭角型青光眼较为非常见，被认为是医疗急症，表现为急性眼痛、头痛、视力模糊、流泪过多、恶心和呕吐。
[0114] 由于其慢性特性，提出的rAAV.SLIM.PTGS2-P2-PTGFR(SEQ ID NO：81)技术将适用于青光眼的治疗。
[0115] 在一个实施方式中，提供了一种减轻、抑制或改善青光眼的至少一种症状的方法。该方法包括将外源核酸构建体给药至受试者的眼睛。在一个实施方式中，外源核酸构建体编码一种调节前列腺素2α合成的转基因和至少一种smiRNA核糖开关。在另一个实施方式中，外源核酸构建体编码：(i)调节前列腺素合成的转基因(例如，前列腺素内过氧化物合酶
2(PTGS2))；(ii)位于转基因的非翻译区内的smiRNA开关，其中smiRNA开关包含至少两个侧接初miRNA的核糖开关，每个核糖开关包含操作性地连接至表达平台的适体；和(iii)与初miRNA的至少一部分互补的至少一个miRNA靶序列，其中转基因被整合到受试者的细胞内并表达转基因，并且(b)给药治疗有效量的能够与适体结合的配体，以调节转基因在眼内的表达，从而减轻、抑制或改善青光眼的至少一种症状。在一个实施方式中，所述症状是高眼内压。
2(PTGS2))；(ii)位于转基因的非翻译区内的smiRNA开关，其中smiRNA开关包含至少两个侧接初miRNA的核糖开关，每个核糖开关包含操作性地连接至表达平台的适体；和(iii)与初miRNA的至少一部分互补的至少一个miRNA靶序列，其中转基因被整合到受试者的细胞内并表达转基因，并且(b)给药治疗有效量的能够与适体结合的配体，以调节转基因在眼内的表达，从而减轻、抑制或改善青光眼的至少一种症状。在一个实施方式中，所述症状是高眼内压。
[0116] 合适的配体包括可以穿过血液视网膜屏障的配体，如本文所述。
[0117] 合适地，调节前列腺素2α合成的转基因包括但不限于例如PTGS2(SEQ ID NO：52)等。其它合适的转基因是本领域已知的。
[0118] 试剂盒
[0119] 本公开提供了试剂盒。该试剂盒可适用于本文所述的方法。在一个方面，试剂盒可包括rAAV载体，其包含本文所述的构建体，例如，包含构建体的SLIM开关。在一些方面，试剂盒可包括包含编码如本文所述的VEGF抑制剂的rAAV载体的构建体。在其他方面，试剂盒可包括包含rAAV载体的构建体，该rAAV载体编码一个或多个如本文所述的参与前列腺素合成的调节的基因。此外，试剂盒可包含一种或多种剂量的在rAAV载体初次给药后给药的配体。可以提供有关给药时间和正确给药方法的说明。
[0120] 术语“受试者”和“患者”可互换使用地指任何动物(例如哺乳动物)，包括但不限于人类、非人类灵长类动物、啮齿动物等，其将成为特定治疗的接受者。通常，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用地指人类受试者。
[0121] 术语“治疗”包括但不限于减少、抑制或预防与疾病或病症有关的一种或多种体征或症状。例如，治疗青光眼包括例如降低眼内压(例如，被治疗的青光眼的症状是高眼内压)。
[0122] 术语“有效量”或“治疗有效量”指足以产生有益或所需生物和/或临床结果的量。
[0123] “表达平台”在本公开的上下文中，介导对核酸表达的影响的经修饰的核糖开关的部分被称为表达平台。优选地，表达平台被操作性地与核糖开关的适体结构域连接，优选地在结构上连接，最优选地通过核酸接头连接。最优选的是，适体结构域通过核酸序列被连接至表达平台。优选地，表达平台部分的茎构型(stem configuration)在配体结合后改变构型，使得茎结构的构型改变导致表达平台结构在增强核酸序列的表达的第一构型与抑制核酸序列的表达的第二构型之间的相应改变。
[0124] “基因构建体”可以包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列。实例包括但不限于将外源DNA带入细胞的质粒、粘粒、噬菌体或病毒。遗传构建体还可包括其他选择标记基因和本领域已知的其他遗传元件。遗传构建体可以优选地转导、转化或感染细胞，从而使细胞表达由载体编码的核酸和/或蛋白质。
[0125] “操作性地连接”在第一元件与第二元件具有功能关系时，第一元件与第二元件操作性地连接。例如，当适体与其配体的结合引起表达平台的改变表达平台功能的构象变化时，适体与表达平台被操作性地连接(例如，如果表达平台是核酶，则适体与配体的结合可以活化核酶活性)。通常，操作性地连接的DNA序列是连续的，并且在需要加入两个蛋白质编码区的情况下，其在同一阅读框中。
[0126] 应理解本发明并不限于本文所述的具体实施方式。还应当理解本文所使用的术语仅为了描述特定的实施方式而不是限制性的目的。本发明的范围仅受权利要求的限制。如本文所用，单数形式的“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数实施方式，除非文中另有明确说明。
[0127] 对本领域技术人员显而易见的是，除了已描述的那些外，在不背离所述发明理念的前提下可以进行更多的改良。在解释本公开时，所有术语应以与上下文一致的最广义的方式解释。术语“包含”的变体应该被解释为以非排他的方式引用元件，组件或步骤，因此引用的元件，组件或步骤可以与不明确引用的其他元件，组件或步骤组合。被称为“包含”某些元件的实施方式也被认为是“基本上由(这些元件)组成”和“由(这些元件)组成”。在值的范围是给定时，本公开明确考虑了未明确列举的那些范围的上限和下限的其他组合。例如，叙述1至10或2至9的值也考虑1至9或2至10之间的值。认定为“至”两个值之间的范围包括端点值。例如，1至10的值的叙述包括值1和10。
[0128] 术语“基本上由......组成”和“由...组成”应根据MPEP和相关联邦巡回法院的解释进行解释。过渡术语“基本由……组成”将权利要求的范围限制到指定的物质或步骤以及要求保护的发明的“本质上不影响基本和新特征的那些”。“由......组成”是一个封闭的术语，不包括权利要求中未指定的任何元件、步骤或成分。例如，关于序列“由……组成”是指在SEQ ID NO.中列出的序列，并且确实是指可能包含SEQ ID作为其一部分的更大的序列。
[0129] 关于方法描述的本公开的各方面可以在本公开中讨论的物质组成或试剂盒的背景下使用。类似地，可以在方法和试剂盒的背景下利用关于物质组成描述的本公开的方面，并且可以在方法和物质组成的背景下利用关于试剂盒描述的本公开的方面。
[0131] 在考虑以下非限制性实施例的基础上，能够更完整地理解本发明。实施例
[0132] 实施例1：调节体内眼内基因表达的能力
[0133] 该实施例证实了六个核糖开关在递送至小鼠视网膜时对细胞培养物中和体内的配体有响应。
[0134] 六个小的(～100bp)核糖开关(K19、Tc40x45、GuaM8HDV、L2Bulge18tc、L2Bulge9和Theo6HDV)对细胞培养物中的配体、以及在使用rAAV2载体被递送至小鼠视网膜时对体内的配体有响应。
[0135] 使用双荧光素酶测定法，在HEK293T细胞中评估了核糖开关，以确定最佳拷贝数(最大动态范围)和对其活化配体的剂量响应性。使用的配体是四环素和茶碱。
[0136] 细胞培养实验表明，响应于适当配体的给药，萤火虫发光发生了显著变化(p＜0.01，单因子方差分析，N＝4，所有组)。
[0137] 接下来，将最佳拷贝数的每个核糖开关克隆到rAAV GFP报告盒中，并包装在AAV2衣壳中。将每个GFP-核糖开关盒与含有不可诱导的mCherry报道基因的AAV2对照载体一起注射到C57Bl/6j小鼠玻璃体内。注射后四周，使用定制的“Multiline”共焦扫描激光检眼镜(cSLO)在体内对mCherry和GFP荧光水平进行定量。随后，小鼠接受剂量为1000mg/kg的活化配体(四环素、茶碱)，并在饲喂后2小时和24小时对荧光水平进行定量。
[0138] 体内结果表明，与治疗前水平相比，用每个核糖开关的活化配体对小鼠给药后2小时，GFP荧光可以实现非常显著的变化(p＜0.01，配对t检验，N＝6)(图6A和6B)。重要的是，在接受活化配体后24小时，GFP荧光恢复到治疗前水平。这表明基因可以在眼的视网膜中传递和表达。
[0139] 实施例2：核糖开关的最佳拷贝数和动态范围的评估
[0140] 实施例2A：已知的核糖开关的测试
[0141] 该实施例说明了可用于构建体的核糖开关的最佳数以及相关的动态范围。两种测定的方案概述于图8A和8B中。为了确定最佳拷贝数，创建了包含0-4个拷贝的每种核糖开关的质粒，并为了读出，将绿色荧光蛋白(GFP)作为转基因。将HEK293T细胞接种在12孔板中，并在第2天用1μg的每种质粒DNA进行转染。在第3天，通过荧光显微镜(激发467-498nm)观察细胞，并使用读板器(488nm激发520nm发射)对荧光进行定量。
[0142] 为了确定动态范围，制备了含有萤火虫荧光素酶的构建体，该萤火虫荧光素酶具有最佳拷贝数的核糖开关。在第1天将HEK293T细胞铺板，并在第2天用1μg的质粒DNA转染。用0-100μM的对应于核糖开关的配体处理细胞，并在第3天使用读板器对发光进行定量。结果如表2所示。
[0143] 如图9A所示，L2Bulge18tc核糖开关是一种被测试的打开型核糖开关。用0μM、25μM、50μM、75μM和100μM的四环素(配体)处理细胞，荧光显微镜检查结果如图9D所示。荧光被定量并且结果显示在图9B中，证明3个拷贝提供了最佳的动态范围，如图3C所示。
[0144] 如上所述，还测试了K19核糖开关(图10)，结果示于图9B-D，表明1个拷贝是最佳拷贝数。
[0145] 还测试了L2Bulge 9(使用活化配体茶碱)，确定了最佳拷贝数为3。
[0146] 上面表1中总结了许多打开型核糖开关的结果。
[0147] 实施例2B：新的SLIM开关的测试
[0148] 还使用新设计的包括靶miRNA序列的Tet-SLIM和Theo-SLIM开关进行实施例2A中所述的实验，分别如图12A和13A所示。图12B和13B示出了两个开关的动态范围，而图12C和13C示出了在用0-100μM的它们各自的配体处理的细胞中看到的荧光。与本领域已知的类似核糖开关相比，两个SLIM核糖开关均具有增加的动态范围。
[0149] 实施例3：使用含抗VEGF化合物的SLIM的小鼠研究
[0150] 从认可的供应商(例如Jackson实验室)购买成年(>2个月大)野生型(例如C57Bl/6j品系)小鼠(n＝20)，并以标准条件分组安置在威斯康星医学院(Medical College of Wisconsin)。在适应一段时间后，每只动物将进行双侧玻璃体内注射。一只眼睛将接受2μl无菌缓冲液(HBSS+0.014％吐温20)，其中包含纯化的重组腺相关病毒(rAAV)，包装了在SLIM基因开关控制下生物合成血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂(例如Aflibercept(Eylea))所需的cDNA序列(本文命名为rAAV.SLIM.αVEGF)。对侧眼将仅注射缓冲液以作为手术干预效果的对照。将允许四周的时间将rAAV.SLIM.αVEGF载体整合到视网膜细胞中；根据初步数据，我们期望神经节细胞和Müller胶质细胞被有效转导。使用共焦扫描激光检眼镜，通过荧光素血管造影(FA)对所有眼睛成像，以建立视网膜和脉络膜血管的基线完整性。
随后将动物随机分配至治疗组(接受活化配体)或对照组(无活化配体)。通过聚焦的红外激光束在Bruch膜上开一个小孔，在所有眼中诱发急性脉络膜新血管形成(CNV)。之后，通过FA在7天和14天后评估CNV形成的程度。
随后将动物随机分配至治疗组(接受活化配体)或对照组(无活化配体)。通过聚焦的红外激光束在Bruch膜上开一个小孔，在所有眼中诱发急性脉络膜新血管形成(CNV)。之后，通过FA在7天和14天后评估CNV形成的程度。
[0151] 预计对照组(无配体＝低水平的αVEGF表达)的动物将证明注射了rAAV.SLIM.αVEGF的眼睛中CNV的形成，其程度与对侧注射了缓冲液的眼睛相似。相比之下，可以预计，与对侧注射了缓冲液的眼睛相比，实验组的动物(配体＝高水平的αVEGF表达)在注射了rAAV.SLIM.αVEGF的眼睛中将表现出明显减少的CNV的形成。这将证明rAAV介导的VEGF抑制剂的过度表达是预防CNV形成的有效方法，并且可以通过补充活化配体来调节(即增加)VEGF抑制剂的表达水平，从而导致CNV形成的减少。随后将所有动物安乐死，以允许收集眼睛进行生化分析，从而直接定量治疗(有配体)和对照(无配体)眼睛中的αVEGF蛋白水平。
[0152] 实施例4：使用rAAV.SLIM.αVEGF载体的AMD的治疗
[0153] 由于AMD的进展缓慢的性质，因此在初始诊断与严重视力障碍发作之间存在治疗窗口。诊断后，患者将接受玻璃体内单次注射悬浮于生理学相关缓冲液中的rAAV.SLIM.αVEGF载体。当前针对AMD患者的治疗范例涉及每月或每两个月玻璃体内注射抗VEGF蛋白；因此，单剂量给药rAAV.SLIM.αVEGF代表了一种侵入性明显较小的治疗选择。作为门诊流程，抗VEGF蛋白的玻璃体内注射目前是在局部麻醉下进行的；预计对于rAAV.SLIM.αVEGF载体的玻璃体内给药也将是这种情况。允许四到八周的时间将rAAV.SLAM.F2α载体整合到内部视网膜细胞中。在这段时间内，患者可以继续接受常规的抗VEGF治疗。SLIM技术是一种打开型开关；因为这样的抗VEGF蛋白在提供激活配体之前不会在患者的眼睛中表达。可以通过口服施用活化配体(例如以片剂形式)来调节患者眼睛中的抗VEGF蛋白表达水平。SLIM技术是剂量依赖性的，允许患者/医师精确调节眼内抗VEGF的表达水平。作为该过程一部分的靶标视网膜细胞不会分裂。结果，在将载体整合到那些细胞中之后，预计rAAV.SLIM.αVEGF载体将在患者的整个生命中持续存在。因此，通过给药活化配体，可以在患者的一生中的任何时间诱导抗VEGF表达，从而无需重复眼内注射。
[0154] 实施例5：用于治疗AMD的AAV核糖开关
[0155] 目前用于治疗AMD的治疗方法集中于给药针对VEGF-A蛋白的可溶性受体或中和抗体，以抑制其促血管生成功能。Eylea(阿柏西普)是一种重组融合VEGF阱，于2011年获得美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration)批准用于治疗湿性AMD，被发现在治疗湿性AMD患者的CNV方面非常有效。尽管这种方法在预防CNV形成方面已经取得了很大的成功，但它需要在患者的一生中每月一次大剂量玻璃体内注射抗VEGF药物，从而造成巨大的金融和经济负担。而且，已经证明，连续多年推注给药Eylea和雷珠单抗(Lucentis)都可以加快视网膜和脉络膜萎缩率。患者也有增加注射相关并发症如眼内炎和白内障形成的风险。在该实例中，我们结合了我们实验室内开发的几种技术，以创建一种基于rAAV的可诱导基因治疗方法，可以在单次玻璃体内给药后治疗湿性AMD。
[0156] 我们评估了rAAV介导的Eylea过度表达是否能够预防激光损伤Bruch膜后造成的CNV形成。通过在表达盒的3'-UTR中整合四环素响应性核糖开关(1xTC45)核糖开关，我们还能够解决调节Eylea的眼内浓度是否会导致观察到的CNV病变严重程度改变的问题。为此，向年龄匹配的C57BL/6J小鼠单方面注射PBS(n＝10)，1.0×1010vg的rAAV2/2[MAX].smCBA-10
Eylea(n＝10)或1.0×10 vg rAAV2/2[MAX].smCBA-Eylea-1x-TC45(n＝20)。注射后，立即使注射了rAAV2/2[MAX].smCBA-Eylea-1x-TC45的一半小鼠(n＝10)接受含50mg/g四环素的饮食。注射后六周，CNV的形成是通过使用红外激光二极管破裂Bruch膜而开始的(请参见方法)。激光损伤后7天，使用cSLO成像通过荧光素血管造影评估新生血管病变的大小和渗漏。
大多数普遍表达Eylea的小鼠(smCBA-Eylea)甚至在5分钟后都没有在激光损伤的部位发展出病变，或者发展出泄漏少量荧光素的1型或2A型小病变。(图14A-C)。注射了“关闭型”smCBA-Eylea-1x-TC45载体并接受常规饮食的小鼠也主要只发生了轻微病变，尽管观察到
2B病变的数量与不可诱导的Eylea构建体相比有少量增加(图14D-F)。通过TC45核糖开关的活化降低Eylea表达，大大增加了CNV病变的严重程度(图14G-I)，其程度与注射PBS-sham的小鼠相似(图14L-J)。
Eylea(n＝10)或1.0×10 vg rAAV2/2[MAX].smCBA-Eylea-1x-TC45(n＝20)。注射后，立即使注射了rAAV2/2[MAX].smCBA-Eylea-1x-TC45的一半小鼠(n＝10)接受含50mg/g四环素的饮食。注射后六周，CNV的形成是通过使用红外激光二极管破裂Bruch膜而开始的(请参见方法)。激光损伤后7天，使用cSLO成像通过荧光素血管造影评估新生血管病变的大小和渗漏。
大多数普遍表达Eylea的小鼠(smCBA-Eylea)甚至在5分钟后都没有在激光损伤的部位发展出病变，或者发展出泄漏少量荧光素的1型或2A型小病变。(图14A-C)。注射了“关闭型”smCBA-Eylea-1x-TC45载体并接受常规饮食的小鼠也主要只发生了轻微病变，尽管观察到
2B病变的数量与不可诱导的Eylea构建体相比有少量增加(图14D-F)。通过TC45核糖开关的活化降低Eylea表达，大大增加了CNV病变的严重程度(图14G-I)，其程度与注射PBS-sham的小鼠相似(图14L-J)。
[0157] 病变图像由三位盲法科学家使用Krzystolik等人描述的分级系统进行分级(具体参见方法)。重要的是，每个治疗组的等级分布差异显著，接受假注射的小鼠中具有明显临床意义的“2B级”病变发生率最高，而普遍过度表达Eylea(smCBA-Eylea)的小鼠“2B级”病变发生率最低。
[0158] 值得注意的是，与接受标准饮食的注射rAAV2[MAX].smCBA-Eylea-1x-TC45的小鼠相比，通过活化TC45核糖开关来下调Eylea的表达导致“2B级”病变的发生率显著增加(图15A)。最后，我们使用Eylea特异性ELISA(鹰生物科技公司(Eagle Biosciences))确定了每个样品中非复合Eylea的水平。如预期的那样，注射了不可诱导构建体(smCBA-Eylea)的眼睛含有最高水平的游离Eylea(438ng/mL)。而且，在注射了含有可调构建体(395ng/mL)的载体的动物中检测到高水平的游离Eylea，尽管其水平低于注射了不可诱导构建体的动物。重要的是，四环素介导的TC45核糖开关活化导致非复合Eylea显著降低1.75倍(p＜0.05)。(图
15B)游离Eylea的水平与临床上显著的病变的发生密切相关。
15B)游离Eylea的水平与临床上显著的病变的发生密切相关。
[0159] 实施例6：用于人类的AMD治疗的自靶向配体失活的miRNA
[0160] SLIM开关需要将初miRNA的基础区域替换为适体。该序列被克隆到表达盒的3’-或5’非翻译区。此外，与成熟miRNA序列互补的miRNA靶位点可在盒的5'或3'非翻译区中以一个或多个拷贝的形式被包含。
[0161] 自靶向配体失活的miRNA(SLIM)开关通过在转录后水平调节基因表达来切换功能。在缺少活化配体的条件下，初miRNA会被Drosha从新生转录本上切割下来。通过互补靶点的结合，该miRNA将被加工并作为基因沉默的第二种机制。当提供活化配体时，基因表达不变。
[0162] 每个核糖开关(SLIM)的多个拷贝可被包含在目标基因的3'非翻译区中。如表2所示，每个核糖开关似乎具有最佳拷贝数。此外，miRNA靶位点的多个拷贝可被包含在3'或5'非翻译区中。
[0163] 由于AMD的进展缓慢的性质，因此在初始诊断与严重视力障碍发作之间存在治疗窗口。诊断后，患者将接受玻璃体内单次注射悬浮于生理学相关缓冲液中的rAAV.SLIM.αVEGF载体。当前针对AMD患者的治疗范例涉及每月或每两个月玻璃体内注射抗VEGF蛋白。因此，单剂量给药rAAV.SLIM.αVEGF代表了一种侵入性明显较小的治疗选择。作为门诊流程，抗VEGF蛋白的玻璃体内注射目前是在局部麻醉下进行的；预计对于rAAV.SLIM.αVEGF载体的玻璃体内给药也将是这种情况。在这段时间内，患者可以继续接受常规的抗VEGF治疗。SLIM技术是一种打开型开关；因为这样的抗VEGF蛋白在提供激活配体之前不会在患者的眼睛中表达。可以通过口服施用活化配体(例如以片剂形式)来调节患者眼睛中的抗VEGF蛋白表达水平。SLIM技术是剂量依赖性的，允许患者/医师精确调节眼内抗VEGF的表达水平。作为该过程一部分的靶标视网膜细胞不会分裂。结果，在将载体整合到那些细胞中之后，预计rAAV.SLIM.αVEGF载体将在患者的整个生命中持续存在。因此，通过给药活化配体，可以在患者的一生中的任何时间诱导抗VEGF表达，从而无需重复眼内注射。
[0164] 用包含核糖开关的载体治疗青光眼
[0165] 原发性开角型青光眼(POAG)是世界范围内不可逆性失明的第二大主要原因，其特征是视网膜神经节细胞逐渐丧失和视神经萎缩，导致视野缺损。POAG的主要危险因素是房水外流的减少导致眼内压(IOP)升高。青光眼的金标准临床疗法是通过局部药物给药和晚期疾病的手术的组合来降低IOP。不幸的是，由于青光眼的大部分症状(即非疼痛性)和维持终生每日治疗方案的必要性，患者对药物疗法的依从性极差(＜20％)，导致甚至在早期诊断的患者中也发展出严重的威胁视力的并发症。
[0166] AAV-核糖开关实验–治疗青光眼的模型
[0167] 前列腺素类似物(例如拉坦前列腺素)以酯化的前药的形式在临床上给药，其在角膜上皮中吸收并在穿过基质和角膜内皮时水解成活性形式，然后扩散到房水中。可溶性PGF2α类似物与PTGFR的结合会触发睫状肌中基质金属蛋白酶(MMP)产生的上调，从而促进细胞外基质的重塑和葡萄膜巩膜水外流的增加。天然PGF2α酶促地衍生自花生四烯酸，花生四烯酸通过多步骤过程以高水平存在于角膜中。
[0168] PGF2α的从头开始生物合成和PGF2α从角膜到前房的分泌有望成为降低IOP的有效策略，并在当前的金标准临床治疗方法上有所改善。我们已经证明，前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2)、PGF2α生物合成中的限速酶、和PTGFR的过度表达会在三个月内导致IOP显著降低。将这两种酶的cDNA序列(如下)整合到AAV表达构建体(完整序列如下)中，该序列既没有整合核糖开关(不可诱导)，也没有整合3'TC40和5'TC45四环素可诱导核糖开关。小鼠接受PBS(N＝10)，rAAV.smCBA-PTGFR.P2A.PTGFR(N＝10，不可诱导)或rAAV.smCBA-TC40-PTGFR.P2A.PTGFR-TC45(可诱导)的前房内注射。在注射之前和之后12周通过回弹眼压法测量IOP。在此期间，使一半的可诱导小鼠接受含四环素的饮食。接受饮食(PGF2α表达关闭)的小鼠在12周内眼内压没有下降。正常饮食(PGF2α表达打开)的小鼠IOP显著降低，类似于PGF2α组成型表达时(无开关)。
[0170] 本申请在整个说明书中以及随附的序列表声明中包括序列表。下面列出了一些序列，但不应视为完整列表。
[0171] L2bulge9(茶碱关闭开关)(SEQ ID NO：11)
[0172] CTCGAGGCGATCGCAAACAAACAAAGCTGTCACCGGATGTGCTTTCCGGTCTGATGAGTCCGTTGTCCAATACCAGCATCGTCTTGATGCCCTTGGCAGTGGATGGGGACGGAGGACGAAACAGCAAAAAGAAAAATAAAAATTTTTTTTTTAATTAATCTTGGGCCC
[0173] L2bulge18tc(四环素打开开关)(SEQ ID NO：12)
[0174] CTCGAGGCGATCGCAAACAAACAAAGCTGTCACCGGATGTGCTTTCCGGTCTGATGAGTCCGTTGTCCAAAACATACCAGATTTCGATCTGGAGAGGTGAAGAATTCGACCACCTGGACGAGGACGGAGGACGAAACAGCAAAAAGAAAAATAAAAATTAATTAATCTTGGGCCC
[0175] Theo6HDV(茶碱关闭开关)(SEQ ID NO：13)
[0176] ATGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAACCACATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGGTGGGCGAATGGGACGCACAAATCTCTCTAGCTTCCCAGAGAGAAGCGAGAGAAAAGTGGCTCTC[0177] GuaM8HDV(鸟嘌呤关闭开关)(SEQ ID NO：14)
[0178] ATGGCCGGCATGGTCCCAGCCTCCTCGCTGGCGCCGGCTGGGCAATGCTATAATCGCGTGGATATGGCACGCAAGTTTCTACCGGGCACCGTAAATGTCCGACTAGTAGCGAATGGGACGCACAAATCTCTCTAG
[0179] K19(四环素打开开关)(SEQ ID NO：15)
[0180] CAAACAAACAAAGGCGCGTCCTGGATTCGTGGTAAAACATACCAGATTTCGATCTGGAGAGGTGAAGAATACGACCACCTGTAGTATCCAGCTGATGAGTCCCAAATAGGACGAAACGCGCTAAACAAACAAAC
[0181] TC40(四环素关闭开关)(SEQ ID NO：16)
[0182] CTGAGGTGCAGGTACATCCAGCTGACGAGTCCCAAATAGGACGAAAGGGAGAGGTGAAGAATACGACCACCTAGGCTCGAAAGAGCCTAAAACATACCTTTCCTGGATTCCACTGCTATCCAC
[0183] Tet-SLIM(SEQ ID NO：17)
[0184] CTAGCACGGGTCCCTAAAACATACCGTGAGCGCGAAAGCGCCCCCATTTTGAGTTAGTGAAGCCACAGATGTAACTCAAAATGGGGGCGCTTTCCCGCCTACGGAGAGGTGAAGAATACGACCACCTAGAAGCTTATTGGTACATGATAACACCCCAAAATCGAAGCACTTCAAAAACACCCCAAAATCGAAGCACTTCAAAAACACCCCAAAATCGAAGCACTTCAAAAACACCCCAAAATCGAAGCACTTCAGTCTCAGGCATCGTACGATGTCGACCTGCAGG
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