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一种玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1及其应用

阅读：625发布：2020-05-21

专利汇可以提供一种玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1及其应用，所述的玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1已于2019年01月03日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：60497，该菌株次级代谢产物发酵液对马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)引起的病毒病害具有显著拮抗作用，且材料来源广泛，成本低，对环境安全。，下面是一种玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1，其特征在于，所述的玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1已于2019年01月03日保藏在广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：
60497。
2.根据权利要求1所述的一种玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1，其特征在于，该菌的16S rRNA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.权利要求1所述的玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1在植物病害生物防治中的应用。
4.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的植物病害为PVY引起的病害，所述的植物为烟草或马铃薯。
5.权利要求1所述的玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1的次级代谢产物发酵液在植物病害生物防治中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的发酵液的制备方法为：在培养3d后的菌落边缘取少许菌苔接种到有100ml ATCC213改良培养液的培养瓶中，每瓶接一菌针，28℃、200r/min-1培养7d。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的ATCC213改良培养液为：MgSO4·7H2O
10g，CaCl2·2H2O 0.2g，KCl 5g，蛋白胨2.5g，酵母膏10g，NaCl 30g，琼脂粉12g，蒸馏水至
1000ml，pH 7.2-7.4。
8.权利要求1所述的玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1在作为制备防治作物病害药物中的应用。
9.权利要求1所述的玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1的次级代谢产物发酵液在作为制备防治作物病害药物中的应用。

说明书全文

一种玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，涉及一株来源于察尔汗盐湖的嗜盐菌及其生防应用，具体为一种玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1及其应用。

背景技术

[0002] 马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯Y病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的典型成员，病毒粒体呈微弯曲线状，长680-900nm，宽11-12nm。PVY的基
因组是单一RNA正链，相对分子质量为3.1×106-3.5×106，长约10000个氨基酸。在基因组的
5’端为以共价键结合的基因组结合蛋白(VPg)和一段非编码区域，大约180个碱基；基因组
的3’端有poly(A)尾巴，整个基因组只有一个阅读框，翻译后产生一个大的多聚蛋白，通过
自身编码的蛋白酶加工形成成熟的外壳蛋白和至少7种非结构蛋白。

[0003] 近年来马铃薯Y病毒属功能基因组学取得了重要进展，对病毒基因功能研究取得很大进展，PVY的寄主范围很广，是重要的世界性分布病毒，能够侵染34个属170余种植物，
以茄科植物为主，其次是藜科和豆科植物。在我国，PVY除为害烟草以外，还严重危害马铃
薯、番茄和辣椒等作物。马铃薯感染PVY，一般减产50％左右，当其与马铃薯X病毒(Potato
virus X,PVX)或马铃薯A病毒(Potato virus A,PVA)复合侵染时，使马铃薯产生严重的皱
缩花叶症状，植株矮小，叶片皱缩，减产可达80％。目前有关马铃薯Y病毒病的研究主要是针
对烟草马铃薯Y病毒病。烟草马铃薯Y病毒病又称脉坏死病、褐脉病、黄斑坏死病等，是由PVY
引起的一种系统侵染的病害，广泛分布于世界各地，是世界烟草产区的重要病害之一。PVY
可以侵染自幼苗至成株期的烟草，宏观症状大致分为花叶症，脉坏死症，点刻条斑症及茎坏
死症四种类型。

[0004] 目前防治烟草马铃薯Y病毒病的主要措施有以下几点：培育和利用抗病品种；在栽烟前铲除病毒的野生寄主，以减少初侵染源；避免将烟田安排在茄科作物附近，在烟田与毒
源植物之间种植隔离作物，如玉米、向日葵等，以阻止蚜虫向烟田传播病毒；加强田间管理，
合理追肥，及时培土、浇水以促使烟株生长健壮，提高抗病能力，避免遮荫和低洼地栽烟，农
事操作时必须将手和工具进行消毒处理；在苗床和烟田用银色反光薄膜驱蚜防病，栽烟前
使用药剂喷杀烟田附近的茄科作物以及杂草上的蚜虫，避免有翅蚜迁飞传毒。

[0005] 嗜盐菌是一类有着重要的研究价值和广阔的应用前景的微生物类群。其应用价值主要包括利用嗜盐菌生产食品添加剂、生产酶制剂、应用于食品、包装、粘合剂和医药等领
域、应用于环境生物治理方面处理工业废水等。申请人还发现一株嗜盐菌菌株对辣椒疫霉
菌具有较高的抑制活性。但有关利用嗜盐菌菌株来进行马铃薯病毒病的生物防治，尤其是
利用该类微生物资源进行马铃薯Y病毒抗病毒制剂的研发及作用机理方面的研究还属于空
白领域。

发明内容

[0006] 有鉴于此，本发明的目的提供一种玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1及其应用，该菌株从察尔汗盐湖湖水中分离纯化得到，并将其运用于马铃薯Y病毒病害生物防治的研究，使
得生物防治马铃薯Y病毒病害成为可能，同时为盐湖等极端环境资源的利用提供了依据，奠
定了基础。

[0007] 为了实现上述技术目的，本发明具体通过以下技术方案实现：

[0008] 本发明提供了菌株E40208a1，该菌株从察尔汗盐湖湖水中采用稀释平板富集培养法进行分离和纯化得到。

[0009] 本发明所述的菌株E40208a1的分子学特性，提取该菌株DNA进行PCR扩增，得到该菌的16S rRNA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将GenBank核酸序列库与所获得序
列进行同源性比对，发现菌株E40208a1与Oceanobacillus manasiensis的同源性最高，达
到99％。根据16S rDNA序列同源性和形态分析将该菌鉴定为玛纳斯海洋芽孢杆菌
(Oceanobacillus manasiensis)，因此将本发明的得到的菌株E40208a1命名为玛纳斯海洋
芽孢杆菌(Oceanobacillus manasiensis)E40208a1。

[0010] 将所述的纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1进行了保藏，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期：2019年01月03日，保
藏编号为GDMCC NO：60497。

[0011] 本发明所述的玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1在植物病害生物防治中的应用，所述的植物病害为PVY引起的病害，所述的病害具体为马铃薯Y病毒病，所述的植物为茄科作物，
优选为烟草或马铃薯。

[0012] 优选的，所述的玛纳斯海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus manasiensis)E40208a1的次级代谢产物发酵液在植物病害生物防治中的应用也在本发明的保护范围内。

[0013] 所述的玛纳斯海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus manasiensis)E40208a1发酵液的制备方法为：在培养3d后的菌落边缘取少许菌苔接种到有100mlATCC213改良培养液的培养
瓶中，每瓶接一菌针，28℃、200r/min-1培养7d。

[0014] 所述的ATCC213改良培养液为：MgSO4·7H2O 10g，CaCl2·2H2O0.2g，KCl 5g，蛋白胨2.5g，酵母膏10g，NaCl 30g，琼脂粉12g，蒸馏水至1000ml，pH 7.2-7.4。

[0015] 本发明所述的玛纳斯海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus manasiensis)E40208a1在作为制备防治作物病害药物中的应用。

[0016] 通过常规的液体或固体培养，获得包括细菌菌体培养物，通过常规的液体发酵生产，然后加入表面活性剂如分散剂、稳定剂、湿润剂、粘结剂、消泡剂、崩解剂、抗冻剂等中的
一种或几种，或吸附载体按一定比例混合后，制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳
剂、水乳剂或微乳剂；所述的作物包括茄科作物，优选为烟草和马铃薯。

[0017] 当然本发明所述的玛纳斯海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus manasiensis)E40208a1的次级代谢产物发酵液在作为制备防治作物病害药物中的应用也在本发明的保
护范围内。

[0018] 本发明玛纳斯海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus manasiensis)E40208a1防治作物病害的方法也属于本发明的保护范围，该方法是在植物生长过程中进行喷雾处理；所述喷
雾为该玛纳斯海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus manasiensis)E40208a1的菌悬液或发酵液
或代谢产物制备的农药制剂。

[0019] 本发明的有益效果为：

[0020] 本发明针对烟草和马铃薯农业生产过程中严重影响烟草和马铃薯品质和产量的PVY为靶标，从察尔汗盐湖湖水中分离筛选到一种玛纳斯海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus
manasiensis)E40208a1，其本身可显著拮抗马铃薯Y病毒，且次级代谢产物发酵液对马铃薯
Y病毒有较好的防效，同时对烟草安全。本发明能够有效拮抗和控制马铃薯Y病毒病害，且原
料来源广泛，成本低，对环境安全。
附图说明

[0021] 图1是本发明玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1的系统发育树；

[0022] 图2是本发明实施例玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1处理后寄主三生烟总RNA的提取结果；

[0023] 图3是本发明实施例目的基因PVY在不同处理中的表达量；a、b分别代表阳性对照和菌株E40208a1处理；

[0024] 图4是本发明实施例目的基因CPIP在不同处理中的表达量；a、b、c分别代表空白对照、阳性对照和菌株E40208a1处理；

[0025] 图5是本发明实施例目的基因Cullin在不同处理中的表达量；a、b、c分别代表空白对照、阳性对照和菌株E40208a1处理；

[0026] 图6是本发明实施例目的基因GST在不同处理中的表达量；a、b、c分别代表空白对照、阳性对照和菌株E40208a1处理；

[0027] 图7是本发明实施例目的基因PSII在不同处理中的表达量；a、b、c分别代表空白对照、阳性对照和菌株E40208a1处理；

[0028] 图8是本发明实施例目的基因OEE3在不同处理中的表达量；a、b、c分别代表空白对照、阳性对照和菌株E40208a1处理；

[0029] 图9是本发明实施例马铃薯Y病毒属功能蛋白相关基因的表达。

具体实施方式

[0030] 下面结合实施例对本发明技术方案作进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用
上述揭示的技术内容加以变更或改型为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内
容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与改型，均落在本
发明的保护范围内。

[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0032] 实施例1菌株E40208a1的分离与鉴定

[0033] 1)菌株E40208a1的分离

[0034] 取适量盐湖湖泥样品，风干(7d左右)，120℃处理1h。称取10g处理好的湖泥样品，加入90m L无菌海水，放入已灭菌好的装有玻璃球的三角瓶内，充分振荡30min，静置后吸取
上清液，此上清液为10-1土样。将上述10-1样品依次稀释为10-2和10-3倍，吸取150μL各梯度样
品，分别涂布于各培养基平板上，每个样品重复3次。涂布后的平板倒置于培养箱中，分别于
28℃和37℃下倒置培养，观察到有菌落出现，挑取单菌落，纯化。纯化后的菌株保存于试管
斜面，并放置在4℃冰箱中。培养基为ATCC213改良培养基：MgSO4·7H2O10g，CaCl2·2H2O
0.2g，KCl 5g，蛋白胨2.5g，酵母膏10g，NaCl 30g，琼脂粉12g，蒸馏水至1000ml，pH 7.2-
7.4。置于37℃光照培养箱中3d后，挑取单菌落培养。

[0035] 2)菌株E40208a1的鉴定

[0036] 提取菌株E40208a1的DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系：10×Buffer 2.5μL，模板DNA 1μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，dNTP(2.5mmol/μL)2μL，引物F27(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-
3')和引物P1541(5'-AAGGAGGTGGTGATCCAGCCGCA-3')(10pmol/μL)各1μL，补水至25μL。反应
条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃80s，共30个循环；72℃10min。PCR反应条件：94℃
变性45s，50℃退火45s，72℃延伸75s，50μL反应体系30个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳
检测，经克隆测序得到序列结果。

[0037] 得到该菌的16S rRNA基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将GenBank核酸序列库与所获得序列进行同源性比对，发现菌株E40208a1与Oceanobacillus manasiensis的
同源性最高，达到99％。所得到的16S rDNA全序列与从GenBank等数据库中获得的16S rDNA
序列进行比对，进行系统发育树的构建(图1)。根据16S rDNA序列同源性和系统发育将该菌
鉴定为玛纳斯海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus manasiensis)，因此将本发明的得到的菌株
E40208a1命名为玛纳斯海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus manasiensis)E40208a1。

[0038] 将得到的玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1进行了保藏，保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏日期：2019年01月03日，
保藏编号为GDMCC NO：60497。

[0039] 实施例2菌株活化、发酵液制备及抑制PVY抗性评价

[0040] 1.1供试培养基、菌株活化及发酵液制备

[0041] 1.1.1嗜盐菌活化发酵培养基如下：

[0042] ATCC213改良培养基：MgSO4·7H2O 10g，CaCl2·2H2O 0.2g，KCl 5g，蛋白胨2.5g，酵母膏10g，NaCl 30g，琼脂粉12g，蒸馏水至1000mL，pH 7.2-7.4。

[0043] 1.1.2嗜盐菌是由青藏高原生物技术教育部重点实验室从青海察尔汗盐湖中分离纯化保存。将保存菌株在ATCC213改良培养基的固体培养基中划线，并于37℃恒温培养箱中
培养24h备用。

[0044] 1.1.3发酵液制备：将活化完成的嗜盐菌菌株以20％的接种量接种于装液量为80％的1000mL锥形瓶中，并在28℃、180r/min的条件下进行震荡培养7d得发酵液备用。

[0045] 1.2菌株抑制PVY抗性评价

[0046] 1.2.1 Real-time PCR法评价

[0047] 三生烟于日光温室中进行苗盆种植，待植株4-5片叶完全扩展时，按照钝化模式，将菌株发酵液与等体积PVY病毒液混合30min作为处理，以磷酸缓冲液混合PVY病毒液为阳
性对照，以只接种磷酸缓冲液作为空白对照，以宁南霉素混合PVY病毒液作为参照，用传统
的摩擦接种法接种三生烟，实验重复3次。

[0048] 1.2.2 Real-time PCR定量检测PVY含量体系建立

[0049] (1)总RNA的提取

[0050] 接种1周后采集幼嫩的顶部叶片进行总RNA的提取，烟草叶片总RNA的提取参照TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(TaKaRa)说明书进行。为保证荧光定量PCR
检测的准确性，需对提取烟草总RNA的质量和浓度进行检测。

[0051] 本试验所提取样品RNA的1％琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示：28S rRNA和18S rRNA两条主带很清晰，并且前者较后者亮。同时，用仪器检测RNA的浓度和质量，OD260/OD280
比值均在1.8～2.0之间，满足反转录实验要求。

[0052] (2)反转录

[0053] 反转录参照PrimeScriptTM RT Master Mix(Perfect Real Time)(TaKaRa)说明书进行。反应体系如下：5×PrimeScript RT Master Mix(Perfect Real Time)2μl，Total
RNA体积等于500除以RNA浓度，用RNase Free ddH2O补足到10μl，总体积10μl。反应条件：37
℃15min，55℃5sec，4℃无限循环。

[0054] 按照标准荧光定量PCR引物设计的原则，利用DNAMAN6.0 软件(LynnonBiosoft，Quebec，Canada)对GenBank中已有的PVY及烟草Actin基因全序列进行序列比对，选择每个
序列最为保守的区域进行引物设计，然后利用Oligo6.0软件和在线分析软件OligoCalc(h
ttp://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html)对所设计的引物进行评
价，并通过在线BLSAT程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)进行验证，以避免病毒
特异性引物序列与烟草基因组任何序列同源。引物由上海生物工程有限公司合成(表1)。

[0055] 表1引物序列

[0056]

[0057] (3)PVY抑制率计算方法

[0058] 根据Real Time qPCR原始检测结果，按照2-△△ct相对定量计算公式：

[0059] F＝2-{[待测组目的基因平均CT值-待测组管家基因平均CT值]-[对照组目的基因平均CT值-对照组管家基因平均CT值]}，计算出各处理中目的基因PVY的表达量。菌株对PVY抑制率＝(对照中PVY的表达量-处理中PVY的表达量)/对照中PVY的表达量×100％。结果如表2和图3所示。

[0060] 表2菌株E40208a1对PVY的抑制有作用

[0061]

[0062] 实施例3三生烟中相关抗逆基因的响应表达

[0063] 1)模板准备

[0064] 实施例2中所提取总RNA以及反转所得到的cDNA直接作为模板。

[0065] 2)三生烟中相关抗逆基因引物设计

[0066] 参照实施例2中引物设计方法，设计寄主三生烟中相关抗性基因的荧光引物(表3)。

[0067] 表3抗逆基因序列

[0068]

[0069] 3)三生烟中相关抗逆基因的响应表达

[0070] PVY侵染三生烟一周后，通过Real-time PCR对寄主三生烟5种抗逆基因表达量进行定量检测。其中，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、PVY壳体蛋白交互作用蛋白-3(CpIp)、Cullin
蛋白-1(Cullin)、与PVY胁迫响应相关；光合系统II(PSII)与光合作用相关；放氧增强蛋白-
3(OEE3)与呼吸作用相关。

[0071] 与空白对照相比，PVY侵染系统寄主三生烟后，与抗逆相关的基因谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、PVY壳体蛋白交互作用蛋白-3(C pIp)、Cullin蛋白-1(Cullin)、光合系统II
(PSII)和放氧增强蛋白-3(OEE3)的表达上调(如图4-8)。经玛纳斯海洋芽孢杆菌(Oce
anobacillus manasiensis)E40208a1发酵液处理后，三生中抗逆基因的表达量较阳性对照
分别上调表达1.06、2.82、3.16、1.15和2.47(表4)。

[0072] 表4三生烟中相关抗逆基因的表达量

[0073]

[0074] 实施例4马铃薯Y病毒属功能蛋白相关基因的表达

[0075] 1)总RNA的提取

[0076] 2)马铃薯Y病毒属功能蛋白相关基因的引物设计

[0077] 参照实施例1中引物设计方法，设计马铃薯Y病毒属功能蛋白相关基因的普通引物(表5)。

[0078] 表5马铃薯Y病毒(PVY)所编码主要蛋白相关基因引物序列

[0079]

[0080]

[0081] 3)马铃薯Y病毒属功能基因的表达

[0082] 通过普通RT-PCR对PVY侵染三生烟一周后，PVY病毒所编码的主要蛋白相关基因的表达量进行半定量检测。

[0083] 检测结果表明，PVY经玛纳斯海洋芽孢杆菌(Oceanobacillus m anasiensis)E40208a1钝化处理后，PVY在寄主三生烟中的扩增繁殖得到抑制，PVY蛋白相关基因CP、P1、
P3、N1a、N1b、HC-pro的表达较阳性对照相比均明显得到抑制(如图9)。

[0084] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和
变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

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一种玛纳斯海洋芽孢杆菌E40208a1及其应用

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