紫色红曲菌mokH基因过表达菌株的构建方法
专利汇可以提供紫色红曲菌mokH基因过表达菌株的构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种紫色红曲菌mokH基因过表达菌株的构建方法，包括下列步骤：（1）设计引物，2)通过PCR扩增紫色红曲菌基因组中的mokH基因；3)将扩增得到的mokH基因连接到pBC-hygro原核表达载体上，构建pBC-hygro-mokH高表达质粒，4)制备红曲菌原生质体，将过表达质粒导入到红曲菌原生质体中，得到mokH过表达菌株。本发明成功的克隆出了紫色红曲菌中的调控基因mokH，将得到的mokH基因在紫色红曲菌中进行过表达，从而探究mokH基因在紫色红曲菌中的功能。通过HPLC检测和潮霉素基因组的扩增，筛选出mokH基因过表达的目的工程菌株。对筛选出的工程菌株 次级代谢产物 、菌丝体形态及基因表达量进行检测，从而探究mokH基因在紫色红曲菌M1中对代谢、生长及基因表达的作用。，下面是紫色红曲菌mokH基因过表达菌株的构建方法专利的具体信息内容。
1.紫色红曲菌mokH基因过表达菌株的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：
1) 设计了一对引物mokH-F和mokH-R，具体如下：
mokH-F：5’-GCTCTAGAATGGCCCTATCGCCAGT-3’(XbaI)；
mokH-R：5’-CCCAAGCTTTTAGGAGGCCAGGTTGTGTT-3’(HindIII)；
2) 通过PCR扩增紫色红曲菌基因组中的mokH基因；
3) 将扩增得到的mokH基因连接到pBC-hygro原核表达载体上，构建pBC-Hygro-mokH高表达质粒；
构建重组质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳得到的片段条带大小对重组质粒进行初步验证，再用QuickCut ClaⅠ和XbaⅠ进行双酶切验证，经过双酶切后得到大小在6800bp左右和
1400bp左右的两段目的片段，与预期大小一致，证明过表达质粒构建成功；
4)制备红曲菌原生质体，并通过电击转化的方法将过表达质粒导入到红曲菌原生质体中，得到mokH过表达菌株；
制备红曲菌原生质体的具体步骤是：
（1）将红曲菌M1接种于试管斜面培养基，30 ℃培养7-10 d；
（2）加0.9%无菌生理盐水用接种环轻轻刮菌体表面，释放并收集孢子，制备成均一浓度的孢子悬液（1×108 -1×109个/mL）；
（3）取200 μL均一孢子悬液涂布于铺有玻璃纸的PDA固体培养基上，30 ℃培养36-40 h；
（4）用涂布棒刮取玻璃纸上的菌丝体并收集到500目尼龙布上，用0.6 M MgSO4溶液洗1-
2次；
（5）取约0.3 g菌丝体于100 mL三角瓶中，并加入30 mL裂解酶液，于30 ℃，60 r/ min酶解2.5 h，然后用500目尼龙布过滤；
（6）滤液于4 ℃，7000 r/min 离心5 min，弃上清；
（7）将收集的原生质体沉淀用1.2 mol/L预冷的山梨醇溶液洗涤2次，然后将其分成2份；一份用预冷的1.2 mol/L山梨醇溶液重悬后，于-80 ℃保存；另一份则用1.2 mol/L山梨醇溶液重悬后置于冰上备用。
紫色红曲菌mokH基因过表达菌株的构建方法
由于对红曲菌中次级代谢产物Monacolin K生物合成途径的研究起步较晚，所以很多细节尚未清楚。但由于与土曲霉中Monacolin K的结构相似，因此根据土曲霉中Monacolin K的生物合成途径来推测红曲菌中Monacolin K的生物合成途径。经过研究初步推测，红曲菌中Monacolin K的生物合成基因簇中有9个功能域与土曲霉中Monacolin K生物合成酶基因高度同源，即mokA-mokI。基因过表达技术是分子生物学中十分重要的一项技术，主要是通过将完整的强启动子与目的基因融合，使目的基因能在宿主中进行表达，从而构建过表达载体，通过转化受体菌，获得该目的基因产物大量积累的菌株。曾有相关实验对红曲霉CG-6中的mokE基因进行过表达，最后发现mokE的过表达对红曲霉的菌体生长、孢子形态及生殖方式均有影响。而对于mokH基因在紫色红曲菌中的调节机制，目前未有研究，通过比较，发现mokH基因与lovE基因、mlcR基因具有同源性，因此推测mokH基因在Monacolin K合成过程中起到转录因子的作用，调控特异性途径上的基因，其表达量可能会直接影响其余8段基因的表达，从而影响Monacolin K的合成。
发明内容
mokH-F：5’-GCTCTAGAATGGCCCTATCGCCAGT-3’(XbaI)；
mokH-R：5’-CCCAAGCTTTTAGGAGGCCAGGTTGTGTT-3’(HindIII)；
2) 通过PCR扩增紫色红曲菌基因组中的mokH基因；
3) 将扩增得到的mokH基因连接到pBC-hygro原核表达载体上，构建pBC-Hygro-mokH高表达质粒；
构建重组质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳得到的片段条带大小对重组质粒进行初步验证，再用QuickCutClaⅠ和XbaⅠ进行双酶切验证，经过双酶切后得到大小在6800bp左右和
1400bp左右的两段目的片段，与预期大小一致，证明过表达质粒构建成功。
本实施例提供一种紫色红曲菌mokH基因过表达菌株的构建方法，包括下列步骤：
1) 设计了一对引物mokH-F和mokH-R，具体如下：
mokH-F：5’-GCTCTAGAATGGCCCTATCGCCAGT-3’(XbaI)。
构建重组质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳得到的片段条带大小对重组质粒进行初步验证，再用QuickCutClaⅠ和XbaⅠ进行双酶切验证，经过双酶切后得到大小在6800bp左右和
1400bp左右的两段目的片段，与预期大小一致，证明过表达质粒构建成功。
构建重组质粒后，通过琼脂糖凝胶电泳得到的片段条带大小对重组质粒进行初步验证，再用QuickCutClaⅠ和XbaⅠ进行双酶切验证。结果如图1所示，经过双酶切后得到大小在
6800bp左右和1400bp左右的两段目的片段，与预期大小一致，证明过表达质粒构建成功。
将 M1 菌株在发酵培养基中培养 12 天后，对菌株中的 RNA 进行提取，通过琼脂糖凝胶电泳检测提取的 RNA 质量，电泳结果如图3所示，有清晰的条带出现，且 28s 条带的亮度是 18s 的2倍，说明 RNA 提取成功，且未降解。然后检测 RNA 的 OD260/280 比值、浓度，RNA 的浓度在 300-500ng/μL之间，OD260/280 比值在 1.8-2.1 之间，说明 RNA 提取成功，且未被污染。综上结果，该 RNA 可以作为反转录扩增的模板，并进行后续实验。
mokH基因缺失菌株的色素产量最高。
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