一种防治油菜菌核病的复合微生物制剂及其制备方法
专利汇可以提供一种防治油菜菌核病的复合微生物制剂及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种防治油菜菌核病的复合 微 生物 制剂及其制备方法。该复合微生物制剂的原料由拒霉素链霉菌 发酵 液，不枝链霉菌发酵液，特基拉芽孢杆菌发酵液，西姆芽孢杆菌发酵液，子座木霉发酵液组成；本发明的菌种能够全面的利用微生物种间或种内的抗生、竞争、 重寄生 、溶菌作用，以及通过 次级代谢产物 诱导油菜产生抗病性，能产生多种抗菌素如拒霉素，醋霉素和大环内酯菌素，能对油菜菌核病病原菌产生超强抑制效果；本发明中所使用的这5株菌株都是可从 土壤 中直接分离得到，都具有根迹促生作用，可在作物表面、植株内部或土壤中繁殖生长的同时，并定向 植物 根际 分泌某些次生代谢产物，能够提高植物对养分的吸收、刺激植株生长起到 肥料 的效果。，下面是一种防治油菜菌核病的复合微生物制剂及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种防治油菜菌核病的复合微生物制剂，其特征在于，该微生物制剂的原料配比为：
拒霉素链霉菌发酵液20-40份，不枝链霉菌发酵液10-30份，特基拉芽孢杆菌发酵液20-40份，西姆芽孢杆菌发酵液10-30份，子座木霉发酵液20-40份。
2.根据权利要求1所述的一种防治油菜菌核病的复合微生物制剂，其特征在于，其制备方法，包括以下步骤：
步骤一、拒霉素链霉菌发酵液的制备
取出拒霉素链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为拒霉素链霉菌种子液；
发酵：将上述制备的拒霉素链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的拒霉素链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-32℃，开搅拌200r/min，前24小时，通气量为每分钟为200L空气，24-36小时，通气量为400L，36小时后，通气量为600L，培养40-48小时，待菌体含量达到60g/L，即可停罐，即得到拒霉素链霉菌发酵液；
其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0.5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7.2～7.4；
其中，所述的拒霉素链霉菌发酵培养基：菜粕粉3%，玉米淀粉1%，石粉1%，大豆糖蜜2%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.05%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
步骤二：不枝链霉菌发酵液的制备
取出不枝链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为不枝链霉菌种子液；
发酵：将上述制备的不枝链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的不枝链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-30℃，开搅拌200r/min，前18小时，通气量为每分钟为300L空气，18-32小时，通气量为500L，32小时后，通气量为700L，培养40-48小时，待菌体含量达到80g/L，即可停罐，即得到不枝链霉菌发酵液；
其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0.5克，硫酸镁：0.5克，氯化钠：0.5克，硫酸亚铁：0.01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7.2～7.4；
其中，所述的不枝链霉菌发酵培养基：豆粉3%，棉粕粉1%，玉米淀粉2%，石粉1%，甘蔗糖蜜2%，硫酸锰0.002%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-
0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
步骤三，特基拉芽孢杆菌发酵液的制备
取出特基拉芽孢杆菌保藏管，用LB固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时，在平板下挑取单个菌落接种至装有LB固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L特基拉芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前12小时通气量为200L/min，12小时后通气量为320L/min ，30℃培养26-36小时，待总芽孢含量不低于40亿cfu/ml，即可作为特基拉芽孢杆菌发酵液；
其中，所述LB固体培养基：酵母提取物5.0 g，蛋白胨10.0，NaCl10.0 g，琼脂20 g，水
1000mL，pH7.2；
其中，所述特基拉芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖5g/L，木薯淀粉25 g/L， 花生粕粉30 g/L，玉米浆干粉5 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，碳酸钙5 g/L， pH7.0，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
步骤四，西姆芽孢杆菌发酵液的制备
取出西姆芽孢杆菌保藏管，用营养肉汤固体培养基分别划平板进行复苏，30℃培养48小时，在平板下挑取单个菌落接种至装有营养肉汤固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L西姆芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前8小时通气量为200L/min，8小时后通气量为300L/min ，30℃培养24-36小时，待总芽孢含量不低于80亿cfu/ml，即可作为西姆芽孢杆菌发酵液；
其中，所述营养肉汤固体培养基：蛋白胨10.0 g/L, 牛肉膏3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，琼脂20 g/L ，pH 7.2 ± 0.2；
其中，所述西姆芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖8g/L，玉米粉20 g/L， 菜粕粉30 g/L，鱼粉10 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2 g/L，碳酸钙5 g/L， pH7.0，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟；
步骤五，子座木霉发酵液的制备
取出子座木霉菌种保藏管，用PDA固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天，在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升PDA固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.05亿cfu/ml，即为子座木霉种子液；
发酵：将上述制备的子座木霉种子液以1%的接种量接种至装有300L子座木霉发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为120L/min，8-24小时后通气量为
240L/min ，24小时后通气量为360L/min ，30℃培养32-48小时，待菌体含量达到100g/L，即可停罐，即可作为子座木霉发酵液；
其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；
其中，所述的子座木霉发酵培养基：菜粕2%，棉粕2%，玉米淀粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸锰0.001%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，
121℃灭菌30分钟；
步骤六，混合发酵液
将前五个步骤制备的发酵液按拒霉素链霉菌发酵液20-40份，不枝链霉菌发酵液10-30份，特基拉芽孢杆菌发酵液20-40份，西姆芽孢杆菌发酵液10-30份，子座木霉发酵液20-40份，混匀，即得到防治油菜菌核病的复合微生物制剂。
3.根据权利要求1所述的一种防治油菜菌核病的复合微生物制剂，其特征在于，该复合微生物制剂在防治油菜菌核病的方法为在油菜初花期与盛花期各喷施一次，每次叶面喷施用量为1-2L复合微生物制剂/亩，其稀释的倍数为100-200倍。
一种防治油菜菌核病的复合微生物制剂及其制备方法
技术领域
背景技术
发明内容
取出拒霉素链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为拒霉素链霉菌种子液；
发酵：将上述制备的拒霉素链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的拒霉素链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-32℃，前24小时，通气量为每分钟为200L空气，24-36小时，通气量为400L，36小时后，通气量为600L，开搅拌200r/min，培养40-48小时，待菌体含量达到60g/L，即可停罐，即得到拒霉素链霉菌发酵液；
其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0﹒5克，硫酸镁：0﹒5克，氯化钠：0﹒5克，硫酸亚铁：0﹒01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7﹒
2～7﹒4；
其中，所述的拒霉素链霉菌发酵培养基：菜粕粉3%，玉米淀粉1%，石粉1%，大豆糖蜜2%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.05%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为不枝链霉菌种子液；
发酵：将上述制备的不枝链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的不枝链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-30℃，前18小时，通气量为每分钟为300L空气，
18-32小时，通气量为500L，32小时后，通气量为700L，开搅拌200r/min，培养40-48小时，待菌体含量达到80g/L，即可停罐，即得到不枝链霉菌发酵液；
其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0﹒5克，硫酸镁：0﹒5克，氯化钠：0﹒5克，硫酸亚铁：0﹒01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7﹒
2～7﹒4；
其中，所述的不枝链霉菌发酵培养基：豆粉3%，棉粕粉1%，玉米淀粉2%，石粉1%，甘蔗糖蜜2%，硫酸锰0.002%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-
0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
在平板下挑取单个菌落接种至装有LB固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L特基拉芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前12小时通气量为200L/min，12小时后通气量为320L/min ，30℃培养26-36小时，待总芽孢含量不低于40亿cfu/ml，即可作为特基拉芽孢杆菌发酵液；
其中，所述LB固体培养基：酵母提取物5.0 g,蛋白胨10.0，NaCl10.0 g，琼脂20 g，水
1000mL，pH7.2；
其中，所述特基拉芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖5g/L，木薯淀粉25 g/L， 花生粕粉30 g/L，玉米浆干粉5 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，碳酸钙5 g/L， pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
其中，所述营养肉汤固体培养基：蛋白胨10.0 g/L, 牛肉膏3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，琼脂20 g/L ，pH 7.2 ± 0.2；
其中，所述西姆芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖8g/L，玉米粉20 g/L， 菜粕粉30 g/L，鱼粉10 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2 g/L，碳酸钙5 g/L， pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
发酵：将上述制备的子座木霉种子液以1%的接种量接种至装有300L子座木霉发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为120L/min，8-24小时后通气量为
240L/min ，24小时后通气量为360L/min ，30℃培养32-48小时，待菌体含量达到100g/L，即可停罐，即可作为子座木霉发酵液；
其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；
其中，所述的子座木霉发酵培养基：菜粕2%，棉粕2%，玉米淀粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸锰0.001%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，
121℃灭菌30分钟。
具体实施方式
取出拒霉素链霉菌菌种保藏管，用高氏一号固体培养基划平板进行复苏，30℃培养7天。在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为拒霉素链霉菌种子液；
发酵：将上述制备的拒霉素链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的拒霉素链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-32℃，前24小时，通气量为每分钟为200L空气，24-36小时，通气量为400L，36小时后，通气量为600L，开搅拌200r/min，培养44小时，检测其菌体含量为65g/L，停罐，即得到拒霉素链霉菌发酵液；
其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0﹒5克，硫酸镁：0﹒5克，氯化钠：0﹒5克，硫酸亚铁：0﹒01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7﹒
2～7﹒4；
其中，所述的拒霉素链霉菌发酵培养基：菜粕粉3%，玉米淀粉1%，石粉1%，大豆糖蜜2%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.05%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
在平板下挑取单个菌落划线接种装有150毫升高氏一号固体培养基的茄子瓶中，在培养箱中30℃培养6-8天，待菌苔长满茄子瓶，产生大量孢子粉即可用500毫升的无菌生理盐水洗脱，调节孢子浓度为0.1亿cfu/ml，即为不枝链霉菌种子液；
发酵：将上述制备的不枝链霉菌种子液以1%的接种量接种至装有灭菌的600L的不枝链霉菌发酵培养基的1000L发酵罐中，控温28-30℃，前18小时，通气量为每分钟为300L空气，
18-32小时，通气量为500L，32小时后，通气量为700L，开搅拌200r/min，培养42小时，检测其菌体含量为82g/L，停罐，即得到不枝链霉菌发酵液；
其中，所述的高氏一号固体培养基：硝酸钾：1克，可溶性淀粉：20克，磷酸氢二钾：0﹒5克，硫酸镁：0﹒5克，氯化钠：0﹒5克，硫酸亚铁：0﹒01克，琼脂：20克，蒸馏水补足1000ml ，PH7﹒
2～7﹒4；
其中，所述的不枝链霉菌发酵培养基：豆粉3%，棉粕粉1%，玉米淀粉2%，石粉1%，甘蔗糖蜜2%，硫酸锰0.002%，磷酸氢二钾0.01%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-
0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
在平板下挑取单个菌落接种至装有LB固体培养基，在30℃培养箱中培养48小时，用3000ml无菌水将三个茄子瓶中的菌苔洗脱，接种至装有300L特基拉芽孢杆菌发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌120r/min，前12小时通气量为200L/min，12小时后通气量为320L/min ，30℃培养32小时，检测其总芽孢含量为42亿cfu/ml，即可作为特基拉芽孢杆菌发酵液；
其中，所述LB固体培养基：酵母提取物5.0 g,蛋白胨10.0 , NaCl10.0 g，琼脂20 g，水
1000mL，pH7.2；
其中，所述特基拉芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖5g/L，木薯淀粉25 g/L， 花生粕粉30 g/L，玉米浆干粉5 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.5 g/L，碳酸钙5 g/L， pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
其中，所述营养肉汤固体培养基：蛋白胨10.0 g/L, 牛肉膏3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，琼脂20 g/L，pH 7.2 ± 0.2；
其中，所述西姆芽孢杆菌发酵培养基：葡萄糖8g/L，玉米粉20 g/L， 菜粕粉30 g/L，鱼粉10 g/L，硫酸镁0.4 g/L，硫酸锰0.5 g/L，磷酸二氢钾0.2 g/L，碳酸钙5 g/L， pH7.0。各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，121℃灭菌30分钟。
发酵：将上述制备的子座木霉种子液以1%的接种量接种至装有300L子座木霉发酵培养基的500L发酵罐中，开搅拌200r/min，前8小时通气量为120L/min，8-24小时后通气量为
240L/min ，24小时后通气量为360L/min ，30℃培养39小时，检测其菌体含量为108g/L，停罐，即可作为子座木霉发酵液；
其中，所述的PDA固体培养基：土豆200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g；
其中，所述的子座木霉发酵培养基：菜粕2%，棉粕2%，玉米淀粉2%，石粉1%，大豆糖蜜3%，硫酸锰0.001%，磷酸氢二钾0.04%，硫酸镁0.02%，各培养基灭菌的条件为：0.10-0.15MPa，
121℃灭菌30分钟。
喷施之前调查已经在田埂上发现子囊盘。设置初花期喷施一次、盛花期喷施一次和初花期
和盛花期各喷施一次3个不同的处理，于2015年3月中旬油菜的初花期将实施例1制备的本发明复合微生物制剂稀释200倍均匀喷施于油菜花朵及叶片上，用量复合微生物制剂
1L/亩，l0d后盛花期喷施第二次，每个小区66.7m2，每个处理3个重复，以喷施多菌灵50%可湿性粉剂500倍稀释液作为对照。于收获初期调查植株发病情况，五点取样，记录发病株数及病害严重度，计算防治效果；
病情指数=[Σ(各级病株数×代表数值)/(调查总株数×发病最重级的代表数值)〕×
100
防治效果(%)=[(对照组病情指数一处理组病情指数)/对照组病情指数]× 100
试验结果如表1，将本发明的复合微生物制剂稀释200倍以后，在初花期和盛花期各喷施一
次的防治效果最好，防治效果达到90. 83%，于初花期喷施一次的防治效果和盛花期喷施一
次的防治效果也达到了75.35%以上。
初花期一次 2.09 1.03 85.24 26.8 26.42
盛花期一次 2.96 1.72 75.35 24.6 16.04
初花+盛花期 1.78 0.64 90.83 28.4 33.96
对照组 9.67 6.98 21.2
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