一株产抗癌活性物质的公牛链霉菌菌株发酵方法及其次级代谢产物的提取方法
阅读：1032发布：2020-05-28
专利汇可以提供一株产抗癌活性物质的公牛链霉菌菌株发酵方法及其次级代谢产物的提取方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株产抗癌活性物质的公 牛 链霉菌菌株 发酵 方法及其 次级代谢产物 的提取方法，所述放线菌为 公牛 链霉菌(Streptomyces tauricus)，命名为公牛链霉菌FGR-015，保藏单位为中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年6月14日，保藏编号为CGMCC No 15942。与 现有技术 相比，本发明的有益效果是：公牛链霉菌FGR-015的次级代谢产物不仅仅是一种色素，还是有较强活性地 抑菌剂 和抗癌物质，且经过本发明发酵、提取方法的优化后，产量可达1.124g/L，产量是以前的5.5倍。，下面是一株产抗癌活性物质的公牛链霉菌菌株发酵方法及其次级代谢产物的提取方法专利的具体信息内容。
1.一株产抗癌活性物质的公牛链霉菌菌株，其特征在于，所述放线菌为公牛链霉菌，命名为公牛链霉菌(Streptomyces tauricus)FGR-015，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间为2018年6月14日，保藏编号为CGMCC No.15942。
2.根据权利要求1所述的一株产抗癌活性物质的公牛链霉菌菌株的发酵方法，其特征在于，包括有种子发酵和扩大培养发酵：
所述种子培养基组成为：马铃薯淀粉15g，葡萄糖5g，大豆粉10g，氯化钠1g，酵母提取物
5g，碳酸钙5g，蒸馏水1000mL；pH值调节为7.1；种子的发酵方法为：接种量为5％～25％，装瓶量为20％～70％，摇床转速为120～170r/min，摇床温度为22～32℃，发酵时间为4～5d；
所述扩大培养基组成为：可溶性淀粉20g，KNO3 0.1g，K2HPO4 0.05g，MgSO4·7H2O
0.05g，NaCl 0.05g，FeSO4·7H2O 0.001g，蒸馏水1000mL，pH值调节为7.1；扩大发酵方法为：
种子接种量为12.61％，装瓶量为48.65％，摇床转速为150r/min，摇床温度为28℃，发酵时间为7.5d。
3.公牛链霉菌(Streptomyces tauricus)FGR-015菌株次级代谢产物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将权利要求2所述的发酵方法制备得到的扩大发酵产物，以离心转速为10000r/min，
4℃离心20min，弃沉淀物；
2)将步骤1)得到的离心上清液以乙酸乙酯为萃取剂萃取；具体为，以30℃水浴超声
30min，然后移入梨型分液漏斗中，静置2h；以乙酸乙酯为萃取剂，料液比为1:5，超声温度为
44℃，提取时间为16h；用乙酸乙酯萃取3次；分离有机相，直至待测溶液为无色，将有机相保留并经过60℃旋转蒸发、-20℃结冰及-80℃冷冻干燥3d；
3)将步骤1)得到的离心上清液以丙酮为萃取剂萃取；具体为，于4000r/min的离心机中将上清液与等量的丙酮充分混匀，用丙酮萃取3次；分离有机相，直至待测溶液为无色，将有机相保留并经过60℃旋转蒸发、-20℃结冰及-80℃冷冻干燥3d。
一株产抗癌活性物质的公牛链霉菌菌株发酵方法及其次级代
谢产物的提取方法
技术领域
背景技术
[0002] 恶性肿瘤是全世界一个主要的致死病种，据世界卫生组织报道，2012年全世界因恶性肿瘤死亡的人次 达820万，预计恶性肿瘤病例将持续迅猛增长，将逐年递增至2025年1900万人，2035年达2400万人。 肿瘤严重威胁人类生命健康，而现有大多化学药物在治疗疾病的同时，不仅仅杀伤肿瘤细胞，正常细胞也 收到严重的伤害，从而使患者产生了严重的不良反应。因此，寻求一类高效、低毒的抗肿瘤药物迫在眉睫， 将有助于提高用药安全性和有效性。
[0003] 放线菌是一类次级代谢产物功能丰富的菌属，其次级代谢产物不仅可作为色素、抗生素等，放线菌还 是一类具有开发利用潜质的抗癌药物，在生命科学领域、食品行业、饲料添加剂、医学科学及化工工业等 行业具有潜在的应用价值。但是产量受发酵、提取等各个不确定因素的制约，而无法大量生产。
发明内容
[0005] 为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一株产抗癌活性物质的公牛链霉菌菌株，所述放线菌 为公牛链霉菌，命名为公牛链霉菌(Streptomyces tauricus)FGR-015，保藏单位为中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编 100101)，保藏时间为2018年6月14日，保藏编号为CGMCC No.15942。
[0007] 所述种子培养基组成为：马铃薯淀粉15g，葡萄糖5g，大豆粉10g，氯化钠1g，酵母提取物5g，碳 酸钙5g，蒸馏水1000mL；pH值调节为7.1；种子的发酵方法为：接种量为5％～25％，装瓶量为20％～ 70％，摇床转速为120～170r/min，摇床温度为22～32℃，发酵时间为4～5d；
[0008] 所述扩大培养基组成为：可溶性淀粉20g，KNO3 0.1g，K2HPO4 0.05g，MgSO4·7H2O 0.05g，NaCl 0.05 g，FeSO4·7H2O 0.001g，蒸馏水1000mL，pH值调节为7.1；扩大发酵方法为：种子接种量为12.61％， 装瓶量为48.65％，摇床转速为150r/min，摇床温度为28℃，发酵时间为7.5d。
[0009] 本发明的第三个目的是提供了公牛链霉菌(Streptomyces tauricus)FGR-015菌株次级代谢产物的提 取方法，包括以下步骤：
[0010] 1)将以上述发酵方法制备得到的扩大发酵产物，以离心转速为10000r/min，4℃离心20min，弃沉淀 物；
[0011] 2)将步骤1)得到的离心上清液以乙酸乙酯为萃取剂萃取；具体为，以30℃水浴超声30min，然后移入 梨型分液漏斗中，静置2h；以乙酸乙酯为萃取剂，料液比为1:5，超声温度为44℃，提取时间为16h； 用乙酸乙酯萃取3次；分离有机相，直至待测溶液为无色，将有机相保留并经过60℃旋转蒸发、-20℃结 冰及-80℃冷冻干燥3d；
[0012] 3)将步骤1)得到的离心上清液以丙酮为萃取剂萃取；具体为，于4000r/min的离心机中将上清液与等 量的丙酮充分混匀，用丙酮萃取3次；分离有机相，直至待测溶液为无色，将有机相保留并经过60℃旋转 蒸发、-20℃结冰及-80℃冷冻干燥3d。
[0013] 本发明涉及菌株公牛链霉菌FGR-015在固体高氏1号培养基生长过程中，随着时间的推移，菌龄也逐 渐成熟，菌落的外观形态由最初的白色逐渐变为粉红色、红色，最后为紫红色，甚至扩散整个培养基。放 线菌素FGR(公牛链霉菌FGR-015次级代谢产物的暂时命名)为紫红色颗粒，有一定粘度，天然红色素有 广泛且宝贵的应用价值。
[0015] 图1显示为碳源对产物产量的影响。
[0016] 图2显示为氮源对产物产量的影响。
[0017] 图3显示为pH对产物产量的影响。
[0018] 图4显示为接种量对产物产量的影响。
[0019] 图5显示为装瓶量对产物产量的影响。
[0020] 图6显示为转速对产物产量的影响。
[0021] 图7显示为温度对产物产量的影响。
[0022] 图8显示为发酵时间对产物产量的影响。
[0023] 图9显示为Y＝F(接种量，装瓶量)响应曲面图与等高线(7.5)。
[0024] 图10显示为Y＝F(接种量，发酵时间)响应曲面图与等高线(45％)。
[0025] 图11显示为Y＝F(装瓶量，发酵时间)响应曲面图与等高线(12.5％)。
[0026] 图12显示为离心转速对产物产量的影响。
[0027] 图13显示为萃取剂对产物产量的影响。
[0028] 图14显示为料液比对产物产量的影响。
[0029] 图15显示为超声温度对产物产量的影响。
[0030] 图16显示为提取时间对产物产量的影响。
[0031] 图17显示为Y＝F(料液比，超声温度)响应曲面图与等高线(12)。
[0032] 图18显示为Y＝F(料液比，提取时间)响应曲面图与等高线(42.5)。
[0033] 图19显示为Y＝F(提取时间，超声温度)响应曲面图与等高线(3.5)。
具体实施方式
[0034] 实施例1：
[0035] 公牛链霉菌FGR-015次级代谢产物按如下步骤进行发酵和提取：
[0036] 公牛链霉菌FGR-015的液态发酵：当平板中菌落长势良好，挑取的单个菌落，接种于种子培养基中， 置于摇床中发酵，140r/min，26℃培养3d。然后以10％的比例接种到发酵培养基中，置于140r/min摇 床中26℃发酵6d。
[0037] 公牛链霉菌FGR-015次级代谢产物的提取：将发酵液取出并摇匀，于4000r/min的离心机中4℃离 心20min，弃沉淀，将上清液与等量的丙酮充分混匀，30℃水浴超声30min，然后移入梨型分液漏斗中， 静置2h，用丙酮萃取3次、分离有机相，直至待测溶液为无色，将有机相保留并经过60℃旋转蒸发、 -20℃结冰及-80℃冷冻干燥3d，从而得到粗提物，为紫红色小颗粒。
[0038] 1公牛链霉菌FGR-015液态发酵条件的优化
[0039] 1.1单因素试验优化发酵条件：
[0040] 1.1.1碳源对产物产量的影响：
[0041] 以种子培养基为基础发酵培养基，首先固定培养基其他成分不变，葡萄糖5g，大豆粉10g，碳酸钙 5g，氯化钠1g，酵母提取物5g，用蒸馏水1000mL溶解，然后按照表1设计分别选取可溶性淀粉、马 铃薯淀粉、小麦淀粉、玉米淀粉、蔗糖和麦芽糖15g作为碳源，调节pH＝7.1，完成后续试验，比较探 究最佳碳源。表1为发酵条件的单因素试验设计表。
[0042] 结果见图1，得各碳源最终产量由高到低依次为马铃薯淀粉＞可溶性淀粉＞玉米淀粉＞小麦淀粉＞蔗 糖淀粉＞麦芽糖淀粉，其中马铃薯淀粉不仅仅是最高产量(＞0.5g)的碳源，产量远远高于其他来源的 碳源，而且马铃薯淀粉廉价易得，结合试验结果，当属放线菌FGR-015发酵的最优碳源。
[0043] 表1发酵条件的单因素试验设计表
[0044]
[0045]
[0046] 1.1.2氮源对产物产量的影响：
[0047] 以种子培养基为基础发酵培养基，保持葡萄糖5g，氯化钠1g，酵母提取物5g，碳酸钙5g，蒸馏 水1000mL，然后按照表1设计分别选取蛋白胨、酵母膏、黄豆粉、大豆粉、硝酸钾和尿素10g作为氮 源，调节pH＝7.1，完成后续试验，比较探究最佳氮源。
[0048] 结果见图3，得各氮源最终产量由高到低依次为黄豆粉＞大豆粉＞酵母膏＞尿素＞硝酸钾＞蛋白胨， 前两种、第3和4种、最后两种碳源分别两两之间的最终产量不显著，但是黄豆粉确是最高产量(＞0.5g) 的氮源，且黄豆粉同最佳碳源马铃薯淀粉一样廉价易得，综合试验结果，黄豆粉为放线菌FGR-015液态发 酵的最优氮源。
[0049] 1.1.3初始pH对产物产量的影响：
[0050] 以种子培养基为基础发酵培养基，保持葡萄糖5g，氯化钠1g，酵母提取物5g，碳酸钙5g，蒸馏 水1000mL，然后按照表1设计分别调节培养基pH为6.5，6.8，7.1，7.4，7.7和8.0，完成后续试验， 比较探究最佳pH。
[0051] 结果如图4所示，随着pH的升高，产物产量呈现先增加再减少的趋势，在6.5～7.1范围内，产物含 量随着pH的升高同比例的增加(P＜0.05)，在pH为7.1时，产量最高(接近0.5g)，当pH超过7.1时， 产物含量随着pH的继续升高增加逐渐下降(P＞0.05)，即偏酸偏碱时产量都会下降，可知只有在7.1的 中性环境，次级代谢产物才会累积，放线菌不适合偏酸偏碱环境，因此发酵最优pH为7.1。
[0052] 1.1.4接种量对产物产量的影响：
[0053] 以种子培养基为基础发酵培养基，保持葡萄糖5g，氯化钠1g，酵母提取物5g，碳酸钙5g，蒸馏 水1000mL，按照表1设计，分别以5％、8％、10％、15％、20％及25％的接种量完成后续试验，比较探究最 佳接种量。
[0054] 结果如图5所示，随着接种量的增加，产物产量几乎同比例增加然后又逐渐下降的趋势。当接种量为 5～10时，产物含量随着接种量的增加而增加不断增加(P＜0.05)，当接种10％，产物含量达到最高值， 当接种量为10％～25％时，产量又随着接种量的增加而下降(P＞0.05)，接种过多使菌球与培养基接触不充 分引起营养不充分，从而导致产量下降，即最佳接种量在10％左右。
[0055] 1.1.5装瓶量对产物产量的影响：
[0056] 以种子培养基为基础发酵培养基，保持葡萄糖5g，氯化钠1g，酵母提取物5g，碳酸钙5g，蒸馏 水1000mL，按照表1设计，分别以20％、30％、40％、50％、60％及70％的装瓶量完成后续试验，比较探究 最佳装瓶量。
[0057] 结果如图6所示，产物产量随着装瓶量的增加呈先增加后减少的趋势，即当装瓶量为20％～50％时，产 物含量随着接种量的增加不断增加(P＞0.05)，当装瓶量为50％时，产物含量达到最高值，但当接种量为 50％～70％时，产物产量又随着接种量的增加而下降(P＜0.05)，接种量过多使得瓶内氧气不充足，导致产 量下降，因此试验的最佳装瓶量应在50％左右。
[0058] 1.1.6转速对产物产量的影响：
[0059] 以种子培养基为基础发酵培养基，保持葡萄糖5g，氯化钠1g，酵母提取物5g，碳酸钙5g，蒸馏 水1000mL，按照表1设计，分别设定摇床转速为120、130、140、150、160及170r/min，完成后续试 验，比较探究最佳转速。
[0060] 结果如图7所示，产物产量随着转速的增加呈先平缓再急速最后平缓不变的趋势，即当转速为120～ 150r/min时，产物含量随着转速的升高不断增加(P＜0.05)，且当转速为150r/min时，产物含量达到 最高值，但当转速为150～170r/min时，产物产量又随着转速的增加基本平缓不再增加(P＞0.05)，接 种量过多使得瓶内氧气不充足，导致产量下降，因此试验发酵的最佳转速应在150r/min左右。
[0061] 1.1.7培养温度对产物产量的影响：
[0062] 保持其他条件不变，按照表1设计，分别设定摇床温度为22、24、26、28、30及32℃，设计转速为 150r/min，完成后续试验，比较探究最佳培养温度。
[0063] 结果如图8所示，产物产量随着温度的增加呈同比例的增加又急速减少的趋势，即当摇床温度为22～ 28℃时，产物含量随着温度的增加而不断增加(P＞0.05)，当温度为28℃时，产物含量达到最高值，但当 摇床温度为28～32℃时，产物产量又随着温度的上升而下降(P＜0.05)，放线菌不适合再过高的温度下生 长，高温使一些活性成分失活，最终导致产量下降，因此试验的最佳发酵温度应在28℃左右。
[0064] 1.1.8发酵时间对产物产量的影响：
[0065] 保持其他条件不变，按照表1设计，分别发酵4、5、6、7、8及9d，并完成后续试验，比较探究最 佳发酵时间。
[0066] 由图9可知，产物产量随着发酵时间的延长呈基本同比例的增加又逐渐减少的趋势，即当发酵时间为 4～7d时，产物含量随着时间的增加而不断增加(P＜0.05)，当发酵时间为7d时，产物含量达到最高值， 但当发酵时间为7～9d时，产物产量又随着时间的增加而下降(P＞0.05)，放线菌发酵时间过长时，培 养基营养成分不足，代谢垃圾累积，发生菌体自溶，最终导致产量下降，因此试验的最佳发酵时间应在7d 左右。
[0067] 1.2响应面试验优化发酵条件：
[0068] 在单因素试验结果基础上，采用Box-Benhnken中心组合原理，得到中心点：接种量12.5％，装瓶量 45％，发酵时间7.5％，以-1，0，+1来表示A接种量(％)、B装瓶量(％)和C发酵时间(d)这三个自变 量因素的低、中、高水平，以产物的产量(g/L)为试验的响应值(Y)，设计发酵条件的拟合二阶响应面3 因素3水平试验，见表2，确定放线菌FGR-015的最佳发酵条件。表2为发酵条件的三因素三水平设计表。
[0069] 表2发酵条件的三因素三水平设计表
[0070]
[0071] 1.2.1发酵条件BBD响应面法试验结果：
[0072] 利用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验设计和数据分析，采用SPSS 19.0统计软件、Excel 软件对实验数据进行分析，探讨放线菌FGR-015次级代谢产物的最佳发酵条件，结果见表3。表3为发酵 条件BBD响应面法试验结果。
[0073] 表3发酵条件BBD响应面法试验结果
[0074]
[0075] 1.2.2发酵条件响应面方差分析：
[0076] 由表3，对试验数据进行二元回归拟合，得出回归方程(1)：
[0077] Y(g/L)＝0.85+0.055A+0.052B+0.025C+0.013AB+0.017AC+0.018BC-0.14A2-2 2
0.082B-0.037C。
0.082B-0.037C。
[0078] 响应面方差分析见表4，可得出，模型极显著，失拟项不显著；模型回归方程的系数显著性检验如下： 一次项A、B均显著；二次项A2、B2均达到极显著水平。表明接种量和装瓶量对放线菌FGR-015次级代谢 产物的提取量影响极显著。表4为放线菌FGR-015发酵条件BBD响应面方差分析。
[0079] 表4放线菌FGR-015发酵条件BBD响应面方差分析
[0080]来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
模型 0.1800 9 0.0200 10.1400 0.0029**
A-接种量 0.0240 1 0.0240 12.0800 0.0103*
B-装瓶量 0.0220 1 0.0220 11.0100 0.0128*
C-发酵时间 0.0050 1 0.0050 2.5000 0.1581
AB 0.0006 1 0.0006 0.3100 0.5938
AC 0.0012 1 0.0012 0.6100 0.4598
BC 0.0012 1 0.0012 0.6100 0.4598
A2 0.0850 1 0.0850 42.2400 0.0003**
B2 0.0280 1 0.0280 14.0500 0.0072**
C2 0.0057 1 0.0057 2.8400 0.1359
残差 0.0140 7 0.0020
失拟项 0.0079 3 0.0026 1.7200 0.3001
误差值 0.00612 4 0.00153
模型 0.1800 9 0.0200 10.1400 0.0029**
A-接种量 0.0240 1 0.0240 12.0800 0.0103*
B-装瓶量 0.0220 1 0.0220 11.0100 0.0128*
C-发酵时间 0.0050 1 0.0050 2.5000 0.1581
AB 0.0006 1 0.0006 0.3100 0.5938
AC 0.0012 1 0.0012 0.6100 0.4598
BC 0.0012 1 0.0012 0.6100 0.4598
A2 0.0850 1 0.0850 42.2400 0.0003**
B2 0.0280 1 0.0280 14.0500 0.0072**
C2 0.0057 1 0.0057 2.8400 0.1359
残差 0.0140 7 0.0020
失拟项 0.0079 3 0.0026 1.7200 0.3001
误差值 0.00612 4 0.00153
[0081] 其中：P＞0.05表明模型影响不显著；P＜0.05表明模型具有显著影响(*)；P＜0.01表明模型影响极 显著(**)。
[0082] 1.2.3响应面交互作用分析与优化：
[0083] 通过对Design-Expert 8.0.6软件绘制响应面曲线图与等高线图(图10、11、12)来进行可视化的分 析，用来进一步研究相关变量之间的交互作用以及确定最优点。
[0084] 由图10、11、12可知，接种量、装瓶量、发酵时间3因素两两相互影响时，对产物含量的影响均成 抛物线形，即随着因素的增大，产物含量呈先增大后降低的趋势，且各因素影响强弱顺序为：接种量>装 瓶量>发酵时间。优化后可得其最佳提取条件为：接种量13.1％、装瓶量46.96％、发酵时间7.75d，产物 含量预测值高达0.87g/L。
[0085] 1.3发酵条件优化验证试验：
[0086] 根据优化后的最优发酵条件，即选择马铃薯淀粉为碳源、大豆粉为氮源、培养基起始pH调节至7.1、 接种量13.1％、装瓶量47％、转速为150r/min、发酵温度为28℃、7.75d后结束发酵，完成后续试验进 行验证，验证试验做3次，平均值为0.85g/L粗品，基本符合预期值，产率是以前的4.3倍。
[0087] 2放线菌FGR-015次级代谢提取条件的优化
[0088] 2.1单因素试验优化提取条件：
[0089] 2.1.1离心转速对产物含量的影响：
[0090] 将发酵液摇匀，按照表5设计，分别设定2000、4000、6000、8000、10000及12000r/min的离心 机，将发酵液离心20min，保证其他条件固定不变，上清液与丙酮混匀，30℃水浴超声30min，静置2h， 完成后续试验，比较探究最佳离心转速。表5为次级代谢产物提取条件的因素水平表。
[0091] 表5次级代谢产物提取条件的因素水平表
[0092]
[0093] 结果如图13，产物产量随着离心转速的增加呈平缓增加又略微减少甚至不变的趋势，即当离心转速为 2000～10000r/min时，产物含量随着转速的增加而不断增加(P＜0.05)，当转速为10000r/min时，产 物含量达到最高值，但当摇床温度为10000～12000r/min时，产物产量基本不再变化(P＞0.05)，随着 转速的升高基本已确定最佳离心转速，再升高转速的话，不仅不能提高产物产量，并且损伤仪器。因此选 取最优转速10000r/min。
[0094] 2.1.2萃取剂对产物含量的影响：
[0095] 将发酵液摇匀，按照表5设计，分别选取丙酮、氯仿、石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷及正丁醇6种萃 取剂与上清液混匀，保证其他条件固定不变，30℃水浴超声30min，静置2h，完成后续试验，比较探究 最佳萃取剂。
[0096] 结果如图14所示，各萃取剂最终产量由高到低依次为乙酸乙酯＞石油醚＞正丁醇＞氯仿＞二氯甲烷 ＞丙酮，乙酸乙酯萃取剂时得到产物含量最高，且远远高于其他5种萃取剂，综合试验结果，乙酸乙酯为 提取的的最优萃取剂。
[0097] 2.1.3料液比对产物含量的影响：
[0098] 将发酵液摇匀，然后按照表5设计，将上清分别与0.5、1、2、3、4及5倍体积的乙酸乙酯混匀，保 证其他条件固定不变，30℃水浴超声30min，静置2h，完成后续试验，比较探究最佳料液比，即发酵液 与萃取剂的体积比(V:V)。
[0099] 结果如图15所示，产物产量随着料液比的增加呈先急速再平缓再急速的增加的趋势，即当料液比为 1:0.5～1:3时，产物含量随着料液比的增加而不断增加(P＜0.05)，当料液比为1:3时，产物含量达到最 高值，但当料液比为1:3～1:5时，产物产量基本不再变化(P＞0.05)，试验中乙酸乙酯量过多并不利于 次级代谢产物的累积，还会造成浪费，因此较佳的料液比条件应在1:4左右。
[0100] 2.1.4超声温度对产物含量的影响：
[0101] 将发酵液摇匀，按照表5设计，分别在35、40、45、50、55及60℃的超声(Ultrasound)清洗仪中 超声30min，然后保证其他条件固定不变，静置2h，完成后续试验，比较探究最佳超声温度(Ultrasound temperature，US)。
[0102] 结果如图16所示，产物产量随着超声温度的增加呈先急剧增加又缓慢减少的趋势，即当超声温度为 35～45℃时，产物含量随着超声温度的增加而不断增加(P＜0.05)，当超声温度45℃时，产物含量达到最 高值，但当超声温度为45～60℃时，产物产量又逐渐减少(P＞0.05)，适当的温度有利于提取有效成分， 但是过高的温度会抑制过程，因此选取最优超声温度为45℃左右。
[0103] 2.1.5提取时间对产物含量的影响：
[0104] 将发酵液摇匀，按照表5设计，然后保证其他条件固定不变，分别静置1、2、4、8、16及32h，完 成后续试验，比较探究最佳提取时间，即静置时间。
[0105] 结果如图17所示，产物产量随着提取时间(静止时间)的增加呈先急剧增加又缓慢减少的趋势，即 当提取时间为1～16h时，产物含量随着超声温度的增加而不断增加(P＜0.05)，当提取时间为16h时， 产物含量达到最高值，但当提取时间超过16h时，产物产量又逐渐减少(P＞0.05)，充足的静置时间有 利于提取有效成分，但是时间过长浪费时间，且不利于提取有效成分，因此选取最优提取时间为16h左 右。
[0106] 2.2提取条件响应面试验：
[0107] 根据以上单因素试验结果，在此基础上，采用Box-Benhnken中心组合原理，得到中心点：料液比(V:V) 1:3.5、超声温度42.5℃、提取时间12h，以-1，0，+1来表示A料液比(V:V)、B超声温度(℃)和C 提取时间(h)这三个自变量因素的低、中、高水平，以产物的产量(g/L)为试验的响应值(Y)，设计发 酵条件的拟合二阶响应面3因素3水平L17(33)中心组合试验，见表6，探讨放线菌FGR-015次级代谢产物 的最佳提取条件。表6为提取条件的三因素三水平设计表。
[0108] 表6提取条件的三因素三水平设计表
[0109]
[0110] 2.2.1响应面法试验结果：
[0111] 根据提取条件单因素试验设计以产物含量为响应值，料液比、超声温度、提取时间三因素的拟合二阶 响应面3因素3水平L17(33)中心组合试验响应面法，结果见表7。表7为提取条件BBD响应面法试验结果。
[0112] 表7提取条件BBD响应面法试验结果
[0113]
[0114]
[0115] 2.2.2提取条件响应面方差分析：
[0116] 对响应面法提取试验数据进行二元回归拟合，并得出回归方程(2)：
[0117] Y(g/L)＝0.95+0.081A+0.068B+0.026C-0.0075AB-0.02AC+0.047BC-0.1A2-0.17B2-0.091C2
[0118] 响应面方差分析见表8，可得出，模型极显著，失拟项不显著；模型回归方程的系数显著性检验如下： 一次项A、B和二次项A2、B2、C2均达到极显著水平。表明料液比、超声温度、提取时间对放线菌FGR-015 次级代谢产物的提取量影响极显著。表8为提取条件BBD响应面方差分析。
[0119] 表8提取条件BBD响应面方差分析
[0120]来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
模型 0.3300 9 0.0370 13.98 0.0011**
A-料液比 0.0530 1 0.0530 20.15 0.0028**
B-超声温度 0.0360 1 0.0360 13.91 0.0074**
C-提取时间 0.0055 1 0.0055 2.1 0.1903
AB 0.0002 1 0.0002 0.086 0.778
AC 0.0016 1 0.0016 0.61 0.4602
BC 0.0090 1 0.0090 3.44 0.1059
A2 0.0430 1 0.0430 16.23 0.005**
B2 0.1300 1 0.1300 48.08 0.0002**
2 **
C 0.0340 1 0.0340 13.16 0.0084
残差 0.0180 7 0.0026
失拟项 0.0078 3 0.0026 0.99 0.4818
误差值 0.0110 4 0.0026
模型 0.3300 9 0.0370 13.98 0.0011**
A-料液比 0.0530 1 0.0530 20.15 0.0028**
B-超声温度 0.0360 1 0.0360 13.91 0.0074**
C-提取时间 0.0055 1 0.0055 2.1 0.1903
AB 0.0002 1 0.0002 0.086 0.778
AC 0.0016 1 0.0016 0.61 0.4602
BC 0.0090 1 0.0090 3.44 0.1059
A2 0.0430 1 0.0430 16.23 0.005**
B2 0.1300 1 0.1300 48.08 0.0002**
2 **
C 0.0340 1 0.0340 13.16 0.0084
残差 0.0180 7 0.0026
失拟项 0.0078 3 0.0026 0.99 0.4818
误差值 0.0110 4 0.0026
[0121] 其中：P＞0.05表明模型影响不显著；P＜0.05表明模型具有显著影响(*)；P＜0.01表明模型影响极 显著(**)。
[0122] 2.2.3响应面交互作用分析与优化：
[0123] 通过对Design-Expert 8.0.6软件绘制响应面曲线图与等高线图(图17、18、19)来进 行可视化的分析，用来进一步研究相关变量之间的交互作用以及确定最优点。
[0124] 由图17、18、19可知，超声温度、料液比、提取时间3因素两两相互影响时，对产物 含量的影响均成抛物线形，即随着因素的增大，产物含量呈先增大后降低的趋势。料液比、 超声温度、提取时间对放线菌FGR-015次级代谢产物的提取量影响均显著，且各因素影响强 弱顺序为：料液比>超声温度>提取时间。优化后可得其最佳提取条件为：料液比1:3.7、超 声温度43℃、提取时间12.63h，产物含量预测值高达0.97g/L。
[0125] 2.3提取条件优化验证试验：
[0126] 根据3.2.1和3.2.2所得最优发酵、提取条件，选择马铃薯淀粉为碳源、黄豆粉为氮源、培养基起始 pH调节至7.1、接种量13.1％、装瓶量47％、转速为150r/min、发酵温度为28℃、发酵7.75d，离心转 速为10000r/min，43.02℃超声30min、静置12.63h用3.7倍体积的乙酸乙酯来萃取，60℃旋转蒸发 后-80℃冷冻干燥的粗品来验证试验，验证试验做3次，平均值为0.98g/L粗品，基本符合预期值，产率 是以前的5倍。
[0127] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施 例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方 案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、 等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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