技术领域
[0001] 本
发明属于
微生物领域，涉及一株新的产达托霉素的链霉菌菌株及其应用。
背景技术
[0002] 达托霉素是自玫瑰孢链霉菌(S.reseosporus)
发酵液中提取得到的一种全新结构的环脂肽类抗生素，20世纪80年代由美国礼来公司发现，1997年由Cubist制药公司研发成功，它不仅具有新颖的化学结构，而且其作用模式也与任何一个已获批准的抗生素都不同：它通过扰乱细胞膜对
氨基酸的转运，从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，改变
细胞质膜的性质，能在多个方面破坏细菌细胞膜功能，并迅速杀死
革兰氏阳性菌。达托霉素除了能作用于大多数临床相关革兰氏阳性菌外，更重要的是它在体外对已呈现甲
氧西林(methicillin)、万古霉素和利奈唑烷等耐药性质的分离菌株具有强
力活性。
[0003] 2003年9月美国食品药品监督管理局首次批准达托霉素用于严重
皮肤感染的
治疗， 2006年3月批准用于感染性
疾病。
[0004] 2006年1月获欧盟委员会批准用于治疗由某些革兰阳性菌所致复杂性皮肤和软组织感染。
[0005] 2007年9月6日Cubist制药公司宣布，欧盟已经批准其抗菌药物注射用达托霉素 (daptomycin for injection，Cubicin)用于治疗金黄色葡球菌所致右心感染性心内膜炎以及与右心感染性心内膜炎或复杂性皮肤和软组织感染相关的金黄色葡球菌菌血症。
[0006] 长期以来，达托霉素发酵生产所用的菌株为玫瑰孢链霉菌，其
次级代谢产物复杂，副产物色素积累较多，对后期分离纯化达托霉素带来了困难。
发明内容
[0007] 本发明提供一株新的产达托霉素的链霉菌菌株，和传统的达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌相比，最大的优势是传代和发酵过程中不会产生色素类物质，从而为后续的分离纯化操作减少了难度。
[0008] 本发明提供的链霉菌菌株的命名为灰色链霉菌L340(Streptomyces griseus L340)。该菌基因组16S rDNA序列(SEQ ID No.1)与灰色链霉菌同源性极高，但表型截然不同。本发明提供的菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：2019.6.12，保藏号： CGMCC17921，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0009] 本发明提供的链霉菌培养方法为：(1)固体培养：把菌株接种于斜面培养基上，于30℃
培养箱中培养5～8天；
(2)液体培养：把菌种接种于
种子培养基中，在30℃
温度下，转速250rpm的摇床上培养
36h，按4％转接量接种于发酵培养基中，在30℃温度下，转速250rpm的摇床上培养4～6 天。
[0010] 其中固体培养所用的培养基(R5)：链霉菌的斜面培养基为R5培养基，每升培养基中含有：
蔗糖103g，
葡萄糖10g，
酵母提取物5g，
酪蛋白水解物0.1g，
硫酸钾0.25g，六水合氯化镁10.12g，微量元素溶液2mL，TES buffer 5.73g，脯氨酸0.3g，加水定容至1L(固体培养基加22g琼脂)。115℃灭菌25min。灭菌后，依次加入以下溶液：5％KH2PO4 10mL，5M CaCl2·2H2O 4mL，10M NaOH 700μL，摇匀后倒平板，
凝固备用。微量元素储存液：ZnCl2 40mg，FeCl3·6H2O 200mg，CuCl2·2H2O 10mg，MnCl·4H2O 10mg，Na2B4O7·10H2O 10mg，(NH4)Mo7O24·4FH2O 10mg，加水定容至1L，备用。
[0011] 所述种子培养基(TSB，Tryptic Soy Broth，胰酪大豆胨培养基)：TSB 2％，PEG 6000 5％，加水定容至1L,所述百分含量均为
质量百分含量。115℃灭菌25min，备用。
[0012] 所述发酵培养基(YEME(4％)，Yeast Extract,Malt Extract,Tryptone,4％葡萄糖, 酵母麦芽培养基)：酵母提取物0.3％，麦芽提取物0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖4％，定容至1 L,所述百分含量均为质量百分含量。115℃灭菌25min，备用。
[0013] 发明的另一个目的是提供所述链霉菌菌株在产达托霉素中的应用。本发明提供的一株
土壤来源的链霉菌，可以通过发酵得到次级代谢产物达托霉素，优点在于没有色素积累的干扰，代谢谱更加干净，在后期分离纯化中优势明显。本链霉菌产达托霉素的发酵流程为：
[0014] (1)从斜面培养基(R5)划取孢子接入种子培养基中，在30℃温度下，转速250rpm 的摇床上培养36h，至菌液粘稠无颗粒状；
[0015] (2)按4％体积从种子培养基(TSB，Tryptic Soy Broth，胰酪大豆胨培养基)中接出菌液，接种至发酵培养基中。在30℃温度下，转速250rpm的摇床上培养。从48h开始，每12h进行一次0.1％体积的癸酸补料；癸酸补料：油酸甲酯按照体积比1：1混合制成。
[0016] (3)144h后，用等体积甲醇处理发酵液，将离心后的上清经分离纯化得达托霉素。
[0017] 以上所述的斜面培养基、种子培养基、发酵培养基的定义同上述链霉菌培养方法。
[0018] 本发明的主要优点在于：
[0019] (1)与传统的达托霉素生产菌玫瑰孢链霉菌相比，本链霉菌在传代和发酵过程中均未产生色素类物质。由于色素类物质在分离纯化中通常需要额外步骤进行处理，经常会导致终产物样品分离纯化得率降低，甚至样品不纯。本发明由土壤中分离纯化而来的链霉菌，菌株在R5琼脂培养基培养5～8d后，基内菌丝和气生菌丝发育良好，孢子呈白色，培养过程中不产生有色物质。菌株在YEME液体培养基中生长情况良好，不产生有色物质，代谢谱比较简单。因此，本发明的无色素菌株在工业生产中的后期分离纯化上有明显优势。
[0020] (2)由于没有产生色素类物质，本链霉菌在传代和发酵过程中能有效降低发酵过程中各种前体物质消耗，从而减少培养基中
碳氮源消耗水平，从而减少工业培养中的补料用量，使得工业生产更加高效。
[0021] (3)没有色素类物质的干扰，使相关代谢产物的检测及菌体的镜检更加方便直接，从而减少了工业发酵过程中的工作水平。
[0022] (4)无色素菌株可作为一个良好的出发菌株，在后续的菌株诱变和筛选中能够清晰观察表型的变化。由于很多次级代谢产物均具有可见光吸收，因此亦可作为异源表达宿主进行遗传操作。
附图说明
[0023] 图1：链霉菌在R5平板培养基上培养7d后的菌落单克隆形态。单克隆整体呈不规则圆形，表面轻微凸起，有放射状裂纹产生，孢子呈灰白色，易脱落，集中于单克隆边缘部位。
[0024] 图2：本发明提供的链霉菌发酵液中菌体形态。
[0025] 图3：在产达托霉素传统培养基YEME(4％)液体培养基中，该链霉菌与传统达托霉素生产菌株玫瑰孢链霉菌发酵液形态的对比。其中图3-A：144h发酵后菌液形态，红色为玫瑰孢链霉菌，白色为本
申请链霉菌，右同；图3-B：离心后发酵液上清及菌体形态。可见玫瑰孢链霉菌发酵过程中产生了大量红色素，而本发明
声明链霉菌无论是菌体还是上清液中均无色素类物质产生(上清液的浅黄色为培养基底色)。
[0026] 图4：16s rDNA序列进化树表明与灰色链霉菌的同源性为99.41％，与天蓝色链霉菌的同源性为96.9％，表明本链霉菌与灰色链霉菌有相近的亲缘关系。
[0027] 图5：本申请链霉菌在YEME(4％)发酵实验144h发酵液经过HPLC检测得到的代谢谱。
具体实施方式
[0028] 本发明结合附图和
实施例作进一步的说明。
[0029] 下述实施例中的实验方法如无特殊说明均为常规方法。
[0030] 实施例中使用的培养基：
[0031] 1.斜面R5琼脂培养基：每升培养基中含有：蔗糖103g，葡萄糖10g，酵母提取物 5g，酪蛋白水解物0.1g，
硫酸钾0.25g，六水合氯化镁10.12g，微量元素溶液2mL，TES buffer 5.73g，脯氨酸0.3g，加水定容至1L(固体培养基加22g琼脂)。115℃灭菌25min。灭菌后，依次加入以下溶液：5％KH2PO4 10mL，5M CaCl2·2H2O 4mL，10M NaOH 700μL，摇匀后倒平板，凝固备用。微量元素储存液：ZnCl2 40mg，FeCl3·6H2O 200mg，CuCl2·2H2O 10mg，MnCl·4H2O
10mg，Na2B4O7·10H2O 10mg，(NH4)Mo7O24·4H2O 10mg，加水定容至1L，备用。
[0032] 2.种子培养基(TSB)：TSB 2％，PEG 6000(聚乙二醇)5％，加水定容至1L,所述百分含量均为质量百分含量。115℃灭菌25min，备用。
[0033] 3.发酵培养基(YEME)：酵母提取物0.3％，麦芽提取物0.3％，蛋白胨0.5％，葡萄糖 4％，定容至1L,所述百分含量均为质量百分含量。115℃灭菌25min，备用。
[0034] 实施例1本发明提供一株新的产达托霉素的链霉菌菌株，和传统的达托霉素产生菌玫瑰孢链霉菌相比，最大的优势是传代和发酵过程中不会产生色素类物质，从而为后续的分离纯化操作减少了难度。本发明提供的菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期：
2019.6.12，保藏号：CGMCC17921。
[0035] 在各种不同的培养基中的表观特征，结果见表1，其中在R5培养基上的菌落形态见图1，在YEME培养基中的菌丝形态见图2；L10的生理生化特性见表2。
[0036] 本发明声明的链霉菌16s rDNA测序结果(见附)与其他17株链霉菌比对(进化树图见图4)发现，与灰色链霉菌的同源性为99.41％，与天蓝色链霉菌的同源性为96.9％，表明本链霉菌与灰色链霉菌有相近的亲缘关系。表1：菌株的培养特性：
培养基 可溶性色素 气生菌丝 培养基
反面颜色YEME 无 白色 微黄
ISP4 无 白色 微黄
MM 灰色 白色 白色
R5 无 白色 微黄
表2：菌株的生理生化特性：
注：“W”表示弱阳性结果，“+”表示阳性结果，“—”表示阴性结果
[0037] 实施例2产达托霉素的链霉菌菌株的培养方法，通过以下步骤实现：
[0038] (1)固体培养：把菌株接种于斜面培养基中，于30℃培养箱中培养5～7天；待其产生孢子，保存备用。
[0039] (2)液体培养：把菌种接种于种子培养基TSB中，在30℃温度下，转速250rpm的摇床上培养36h，按4％转接量接种于发酵培养基YEME(4％)中，在30℃温度下，转速250rpm 的摇床上培养4-6天。从48h开始，每12h补加0.1％体积的癸
酸溶液。
[0040] 实施例3按实施例2进行摇瓶发酵，144h取样，此时菌液颜色见图3，可见与传统达托霉素产生菌相比完全消除了色素，有利于后续分离。按照体积1：1加入甲醇，震荡离心后对上清液进行HPLC(高效液相色谱)鉴定，如附图5所示，在21min前后可检测到达托霉素，通过达托霉素标准曲线计算产量为31.5mg/L。
[0041] HPLC检测方式为：HPLC用色谱柱：XDB-C18
[0042] A相：H2O+0.05％
甲酸；B相：乙腈+0.05％甲酸；B相梯度5％-100％，35min。
[0043] 21min处可见达托霉素的吸收峰。
