一种浒苔来源真菌的表观修饰方法及其次级代谢物
阅读：900发布：2020-05-17
专利汇可以提供一种浒苔来源真菌的表观修饰方法及其次级代谢物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种浒苔来源 真菌 的表观修饰方法及其次级 代谢物 ，属于 微 生物 药物技术领域，表观修饰方法包括如下步骤：扩大培养：将浒苔来源真菌接种在培养基中扩大培养，得真菌 种子 液；表观遗传修饰调控：将所述真菌种子液接种到经脉冲 电场 和紫外线进行灭菌处理的 发酵 液中进行发酵，得到经表观修饰的海洋真菌。经表观修饰方法获得的浒苔来源真菌的次级代谢物主要包括化合物Ⅰ，化合物Ⅱ，化合物Ⅲ，化合物Ⅳ。本发明表观修饰方法能促进浒苔来源真菌的多能性相关基因表达，提高次级代谢物的多样性，同时促进浒苔来源真菌的增殖活性，提高浒苔来源真菌的生长速率，延长其对数期，提高其 次级代谢产物 的产量。化合物Ⅲ能抑制 机体 α- 葡萄糖 苷酶活性。，下面是一种浒苔来源真菌的表观修饰方法及其次级代谢物专利的具体信息内容。
1.一种浒苔来源真菌的表观修饰方法，其特征在于：包括如下步骤：
1)扩大培养：将浒苔来源真菌接种在培养基中扩大培养，得真菌种子液；
2)表观遗传修饰调控：将所述真菌种子液接种到经脉冲电场和紫外线进行灭菌处理的发酵液中进行发酵，得到经表观修饰的海洋真菌。
2.根据权利要求1所述的一种浒苔来源真菌的表观修饰方法，其特征在于：所述脉冲电场的场强为15-20kV/cm，脉冲频率为1.5-2.0kHz，脉冲宽度为1.3-1.5μs，流速为20-40mL/min。
3.根据权利要求1或2所述的一种浒苔来源真菌的表观修饰方法，其特征在于：所述紫外线的波长为150-200nm。
4.根据权利要求1所述的一种浒苔来源真菌的表观修饰方法，其特征在于：所述发酵液包括如下成分：8-15g/L葡萄糖、17-22g/L麦芽糖、18-23g/L甘露醇、9-12g/L谷氨酸单钠、
0.4-0.6g/L KH2PO4、0.2-0.5g/L MgSO4·7H2O、2-4g/L酵母抽提物、30-35g/L SEA盐、9-11μM TSA、0.8-1.3μM甘草次酸和1L自来水。
5.根据权利要求1所述的一种浒苔来源真菌的表观修饰方法，其特征在于：所述发酵液的pH为6.5-7.5。
6.根据权利要求1所述的一种浒苔来源真菌的表观修饰方法，其特征在于：所述浒苔来源真菌为Aspergillus terreus OUCMDZ-2739。
7.根据权利要求1所述的一种浒苔来源真菌的表观修饰方法，其特征在于：所述真菌种子液的接种量为3-5％。
8.根据权利要求1所述的一种浒苔来源真菌的表观修饰方法，其特征在于：所述发酵温度为22-28℃，时间为25-35天。
9.一种权利要求1-3任一项所述的表观修饰方法获得的浒苔来源真菌的次级代谢物，其特征在于：具有如下结构：
10.根据权利要求9所述的一种表观修饰方法获得的浒苔来源真菌的次级代谢物，其特征在于：所述化合物Ⅲα-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)值为24.8μM。
一种浒苔来源真菌的表观修饰方法及其次级代谢物
技术领域
背景技术
[0002] 对陆生微生物近百年的研究历史，发现了大量的化学结构多样性和生物活性显著的天然产物，极大的推动了生物素药物的发展，如：青霉素、万古霉素、链霉素等。对微生物越来越多的关注，自然导致微生物的重复研究和已知化合物重复开发、新化合物发现的机率降低。因此人们开始关注微生物蕴藏量更大、种类多样性更多的海洋来源微生物。海洋微生物由于其独特的生存环境(高压、高盐、低温、寡营养)导致其具有与陆生微生物截然不同的代谢途径，因而更易产生不同于陆生微生物的次生代谢产物，进而表现出良好的生物活性如：抑制群体感应活性、抑菌活性、抗病毒活性、蛋白激酶抑制活性、细胞毒活性、肿瘤细胞周期抑制活性等，因而日渐成为海洋药物研究工作者青睐的重要天然产物化学资源。海6 9
水中微生物的丰度达到10/mL，海底沉积物微生物丰度更是达到了10/mL。然而海洋样品采集难度高，常规实验室条件下仅有低于5％的海洋微生物被分离得到，即便获得的微生物在实验室培养条件下也不能完全表达其在海洋环境下的所有生物合成途径的代谢产物。因此如何最大程度的开发这些来之不易的海洋微生物资源，使其能最大限度的被人类利用，成为科学工作者的一个重要任务和课题。曲霉属真菌一直以来都是天然产物界研究的重要菌种，其次级代谢产物结构新颖骨架多变，除了常规的甾体、倍半萜、蒽醌等常见结构类型以外，往往还含有：生物碱类、肽类、聚酮类、二倍半萜等多种的骨架。这些结构新颖的化合物往往还含有细胞毒，抗菌，抗病毒等多种活性，成为海洋药物先导化合物的重要来源之一，引起了业内学者的广泛关注。
水中微生物的丰度达到10/mL，海底沉积物微生物丰度更是达到了10/mL。然而海洋样品采集难度高，常规实验室条件下仅有低于5％的海洋微生物被分离得到，即便获得的微生物在实验室培养条件下也不能完全表达其在海洋环境下的所有生物合成途径的代谢产物。因此如何最大程度的开发这些来之不易的海洋微生物资源，使其能最大限度的被人类利用，成为科学工作者的一个重要任务和课题。曲霉属真菌一直以来都是天然产物界研究的重要菌种，其次级代谢产物结构新颖骨架多变，除了常规的甾体、倍半萜、蒽醌等常见结构类型以外，往往还含有：生物碱类、肽类、聚酮类、二倍半萜等多种的骨架。这些结构新颖的化合物往往还含有细胞毒，抗菌，抗病毒等多种活性，成为海洋药物先导化合物的重要来源之一，引起了业内学者的广泛关注。
[0003] 表观遗传修饰学是研究DNA序列没有发生变化的可遗传的基因表达的改变。主要内容是通过组蛋白修饰、非编码RNA调控、DNA的甲基化和染色质重塑等方式达到调控基因表达的目的。在微生物中很多调控转录和翻译过程，与初级代谢产物和细胞成熟相关的机制已经被系统深入的研究。相反的，关于分子水平调节次生代谢产物生物合成机制的研究却知之甚少。已经有证据证明：表观遗传修饰过程被细胞广泛的应用于控制遗传信息的传递过程，包括调控次生代谢产物产生的基因。表观遗传修饰调控抑制的现象在那些仅仅一小部分生物合成机制被发现的真菌中表现的尤其明显。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种促进浒苔来源真菌的多能性相关基因表达，提高次级代谢物的多样性，同时促进浒苔来源真菌的增殖活性，提高浒苔来源真菌的生长速率，延长其对数期，提高其次级代谢产物的产量的浒苔来源真菌的表观修饰方法。
[0005] 本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：
[0006] 一种浒苔来源真菌的表观修饰方法，包括如下步骤：
[0008] 2)表观遗传修饰调控：将上述真菌种子液接种到经脉冲电场和紫外线进行灭菌处理的发酵液中进行发酵，得到经表观修饰的海洋真菌。浒苔来源真菌的发酵需要一个无杂菌生长的环境，因此，接种前培养基的灭菌对发酵效率及产品的技术经济指标至关重要。脉冲电场能够将部分水分子分解成OH-和H+，其中水中氧分子俘获由电场催化OH-时产生的电子后就会生成超氧阴离子自由基、过氧化氢和自由质子等，它与OH-结合后会导致细胞DNA发生氧化损伤。在微生物细胞体内，适量的超氧阴离子自由基发挥着代谢贮能转化排废及防御消毒的作用，但随着电场强度和脉冲作用时间的不断累积，过量的超氧阴离子自由基会在细胞体内积累，从而破坏脂质、损害核酸、破坏碳水化合物及蛋白质，最终对微生物细胞产生氧化损伤并危及其正常的生命活动，甚至引起死亡。而紫外线在脉冲电场的增益作用下，减弱了发酵液中很容易被介质吸收的缺陷，能够强化脉冲电场的杀菌效果，避免发酵液中亚致死损伤细菌的产生，彻底杀菌，提高杀菌效果。同时脉冲电场和紫外线的共同作用，能够软化酵母抽提物中残留的酵母细胞壁碎片，破坏细胞壁组分葡聚糖的β-1,3键而使其分解为单糖或者多糖，更易于被浒苔来源真菌吸收消化，且该灭菌是在低温条件下进行的，能够保护发酵液的蛋白质不被破坏，为浒苔来源真菌的发酵提供充足的营养物质，提高浒苔来源真菌的生长速率，延长其对数期，确保浒苔来源真菌的表观遗传修饰顺利进行，提高其次级代谢产物的产量。
[0009] 优选的，脉冲电场的场强为15-20kV/cm，脉冲频率为1.5-2.0kHz，脉冲宽度为1.3-1.5μs，流速为20-40mL/min。优选的，紫外线的波长为150-200nm。该条件下的脉冲电场和紫外线的增益共同作用最强，杀菌效果较好，浒苔来源真菌的次级代谢产物的产量较高。
[0010] 优选的，发酵液包括如下成分：8-15g/L葡萄糖、17-22g/L麦芽糖、18-23g/L甘露醇、9-12g/L谷氨酸单钠、0.4-0.6g/L KH2PO4、0.2-0.5g/L MgSO4·7H2O、2-4g/L酵母抽提物、30-35g/L SEA盐、9-11μM TSA、0.8-1.3μM甘草次酸和1L自来水。本发明表观修饰方法用发酵液中TSA和甘草次酸可以对浒苔来源真菌的发酵产生协同的促进作用，在不同的细胞信号通路作用下进行细胞质和细胞核穿梭，使高度凝聚染色质区域变松弛，去除组蛋白ε-N-乙酰赖氨酸残基上的乙酰基团，使得DNA更紧密地缠绕在组蛋白上，且能够与其他转录因子调节蛋白形成共抑制复合物，增强与酶活性位点边缘的氨基酸残基相互作用，提高抑制效果和对酶的选择性，从而抑制基因表达，增强组蛋白的乙酰化程度，促进转录激活，引起转录水平升高，在不改变基因组DNA序列的情况下调控基因的选择性表达，促进了浒苔来源真菌的多能性相关基因表达，提高次级代谢物的多样性，同时能够调控浒苔来源真菌氮代谢相关基因的表达，调节细胞内谷氨酰胺合成酶的水平，促进真菌对氮源的吸收和利用，进而促进浒苔来源真菌的增殖活性，提高其次级代谢产物的产量，为微生物医药领域提供新的途径。
[0011] 优选的，发酵液的pH为6.5-7.5。。
[0012] 优选的，浒苔来源真菌为Aspergillus terreus OUCMDZ-2739。。
[0013] 优选的，真菌种子液的接种量为3-5％。
[0014] 优选的，发酵温度为22-28℃，时间为25-35天。
[0015] 本发明还公开一种上述表观修饰方法获得的浒苔来源真菌的次级代谢物，具有如下结构：
[0016]
[0017] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0018] 本发明表观修饰方法抑制基因表达，增强组蛋白的乙酰化程度，促进转录激活，引起转录水平升高，在不改变基因组DNA序列的情况下调控基因的选择性表达，促进浒苔来源真菌的多能性相关基因表达，提高次级代谢物的多样性，同时促进浒苔来源真菌的增殖活性，提高浒苔来源真菌的生长速率，延长其对数期，提高其次级代谢产物的产量，为微生物医药领域提供新的途径；本发明化合物Ⅲα-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)值为24.8μM，对α-葡萄糖苷酶的抑制效果好于脱氧野尻霉素和阿卡波糖，抑制机体α-葡萄糖苷酶活性，减缓葡萄糖的生成和吸收，防止出现餐后高血糖，对预防和治疗糖尿病具较好的作用，尤其是2型糖尿病；同时本发明化合物Ⅲ来自于微生物的次级代谢产物，属于天然α-葡萄糖苷酶抑制剂，易于被机体吸收。
[0020] 图1为本发明化合物Ⅰ的ECD曲线；
[0021] 图2为本发明化合物Ⅲ的ECD曲线。
具体实施方式
[0022] 本申请公开一种浒苔来源真菌的表观修饰方法，包括如下步骤：
[0023] 1)真菌材料：从来自青岛石老人海水浴场浒苔样品中分离出真菌菌株土曲霉OUCMDZ-2739，浒苔样品依次用无菌海水、75％乙醇和无菌水洗涤。然后，用研钵捣碎样品，然后存放于含有100mg/mL氯霉素的PDA培养基(每升含马铃薯提取物200克，葡萄糖20克，琼脂15克，和海水1L)中，在28℃下培养至出现单一菌种，将该菌种转移到另一PDA培养基并储存于4℃，通过多相分类学研究、菌落形态及18S rRNA序列分析、菌株发育树的建立，鉴定其为土曲霉OUCMDZ-2739；
[0024] 2)扩大培养：将浒苔来源真菌Aspergillus terreus OUCMDZ-2739接种在培养基中扩大培养，得真菌种子液；
[0025] 3)表观遗传修饰调控：将上述真菌种子液按接种量为3-5％接种到经脉冲电场和紫外线进行灭菌处理的发酵液中，在温度为22-28℃的条件下进行发酵，时间为25-35天，得到经表观修饰的海洋真菌。浒苔来源真菌的发酵需要一个无杂菌生长的环境，因此，接种前培养基的灭菌对发酵效率及产品的技术经济指标至关重要。脉冲电场能够将部分水分子分解成OH-和H+，其中水中氧分子俘获由电场催化OH-时产生的电子后就会生成超氧阴离子自由基、过氧化氢和自由质子等，它与OH-结合后会导致细胞DNA发生氧化损伤。在微生物细胞体内，适量的超氧阴离子自由基发挥着代谢贮能转化排废及防御消毒的作用，但随着电场强度和脉冲作用时间的不断累积，过量的超氧阴离子自由基会在细胞体内积累，从而破坏脂质、损害核酸、破坏碳水化合物及蛋白质，最终对微生物细胞产生氧化损伤并危及其正常的生命活动，甚至引起死亡。而紫外线在脉冲电场的增益作用下，减弱了发酵液中很容易被介质吸收的缺陷，能够强化脉冲电场的杀菌效果，避免发酵液中亚致死损伤细菌的产生，彻底杀菌，提高杀菌效果。同时脉冲电场和紫外线的共同作用，能够软化酵母抽提物中残留的酵母细胞壁碎片，破坏细胞壁组分葡聚糖的β-1,3键而使其分解为单糖或者多糖，更易于被浒苔来源真菌吸收消化，且该灭菌是在低温条件下进行的，能够保护发酵液的蛋白质不被破坏，为浒苔来源真菌的发酵提供充足的营养物质，提高浒苔来源真菌的生长速率，延长其对数期，确保浒苔来源真菌的表观遗传修饰顺利进行，提高其次级代谢产物的产量。
[0026] 上述脉冲电场的场强为15-20kV/cm，脉冲频率为1.5-2.0kHz，脉冲宽度为1.3-1.5μs，流速为20-40mL/min。紫外线的波长为150-200nm。该条件下的脉冲电场和紫外线的增益共同作用最强，杀菌效果较好，浒苔来源真菌的次级代谢产物的产量较高。
[0027] 上述发酵液包括如下成分：8-15g/L葡萄糖、17-22g/L麦芽糖、18-23g/L甘露醇、9-12g/L谷氨酸单钠、0.4-0.6g/L KH2PO4、0.2-0.5g/L MgSO4·7H2O、2-4g/L酵母抽提物、30-
35g/L SEA盐、9-11μM TSA、0.8-1.3μM甘草次酸和1L自来水。上述发酵液的pH为6.5-7.5。上述表观修饰方法用发酵液中TSA和甘草次酸可以对浒苔来源真菌的发酵产生协同的促进作用，在不同的细胞信号通路作用下进行细胞质和细胞核穿梭，使高度凝聚染色质区域变松弛，去除组蛋白ε-N-乙酰赖氨酸残基上的乙酰基团，使得DNA更紧密地缠绕在组蛋白上，且能够与其他转录因子调节蛋白形成共抑制复合物，增强与酶活性位点边缘的氨基酸残基相互作用，提高抑制效果和对酶的选择性，从而抑制基因表达，增强组蛋白的乙酰化程度，促进转录激活，引起转录水平升高，在不改变基因组DNA序列的情况下调控基因的选择性表达，促进了浒苔来源真菌的多能性相关基因表达，提高次级代谢物的多样性，同时能够调控浒苔来源真菌氮代谢相关基因的表达，调节细胞内谷氨酰胺合成酶的水平，促进真菌对氮源的吸收和利用，进而促进浒苔来源真菌的增殖活性，提高其次级代谢产物的产量，为微生物医药领域提供新的途径。
35g/L SEA盐、9-11μM TSA、0.8-1.3μM甘草次酸和1L自来水。上述发酵液的pH为6.5-7.5。上述表观修饰方法用发酵液中TSA和甘草次酸可以对浒苔来源真菌的发酵产生协同的促进作用，在不同的细胞信号通路作用下进行细胞质和细胞核穿梭，使高度凝聚染色质区域变松弛，去除组蛋白ε-N-乙酰赖氨酸残基上的乙酰基团，使得DNA更紧密地缠绕在组蛋白上，且能够与其他转录因子调节蛋白形成共抑制复合物，增强与酶活性位点边缘的氨基酸残基相互作用，提高抑制效果和对酶的选择性，从而抑制基因表达，增强组蛋白的乙酰化程度，促进转录激活，引起转录水平升高，在不改变基因组DNA序列的情况下调控基因的选择性表达，促进了浒苔来源真菌的多能性相关基因表达，提高次级代谢物的多样性，同时能够调控浒苔来源真菌氮代谢相关基因的表达，调节细胞内谷氨酰胺合成酶的水平，促进真菌对氮源的吸收和利用，进而促进浒苔来源真菌的增殖活性，提高其次级代谢产物的产量，为微生物医药领域提供新的途径。
[0028] 一种上述表观修饰方法获得的浒苔来源真菌的次级代谢物，具有如下结构：
[0029]
[0030] 上述次级代谢物的制备方法为：
[0031] 1)将发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝，滤液用等效体积的乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，菌丝用80％丙酮萃取三次，丙酮溶液经减压浓缩，然后以乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，将上述两个乙酸乙酯溶液组合在一起，并在减压下浓缩，得到乙酸乙酯溶液提取物；
[0032] 2)将乙酸乙酯提取物利用减压硅胶柱色谱进行逐步洗脱，洗脱液为石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100％～0％)的屈服梯度6个主要馏分(馏分1～6)，馏分4通过Sephadex LH-20(MeOH)进一步纯化，得到馏分4.2、4.3、4.4，馏分4.2用半制备的HPLC纯化，用60％MeOH-H2O和0.15％三氟乙烯洗脱，得到目标化合物Ⅱ(tR＝13.3分钟)和化合物Ⅲ(tR＝17.6分钟)；馏分4.3用半制备的HPLC纯化，用55％MeOH-H2O和0.15％三氟乙烯洗脱，得到目标化合物Ⅳ(tR＝15.8分钟)；馏分5通过Sephadex LH-20(MeOH)进一步纯化，得到馏分5.2，馏分5.2用半制备的HPLC纯化，用60％MeOH-H2O和0.15％三氟乙烯洗脱，得到目标化合物Ⅰ(tR＝10.8分钟)。
[0033] 下面，结合具体实施例对本发明实施方式作进一步说明。
[0034] 实施例1：
[0035] 一种浒苔来源真菌的表观修饰方法的制备方法，包括，
[0036] 1)真菌材料：从来自青岛石老人海水浴场浒苔样品中分离出真菌菌株土曲霉OUCMDZ-2739，浒苔样品依次用无菌海水、75％乙醇和无菌水洗涤。然后，用研钵捣碎样品，然后存放于含有100mg/mL氯霉素的PDA培养基(每升含马铃薯提取物200克，葡萄糖20克，琼脂15克，和海水1L)中，在28℃下培养至出现单一菌种，将该菌种转移到另一PDA培养基并储存于4℃，通过多相分类学研究、菌落形态及18S rRNA序列分析、菌株发育树的建立，鉴定其为土曲霉OUCMDZ-2739；
[0037] 2)扩大培养：将浒苔来源真菌Aspergillus terreus OUCMDZ-2739接种在培养基中扩大培养，然后调节pH为6.5，得真菌种子液；
[0038] 3)发酵液配制：按如下组分：8g/L葡萄糖、17g/L麦芽糖、18g/L甘露醇、9g/L谷氨酸单钠、0.4g/L KH2PO4、0.2g/L MgSO4·7H2O、2g/L酵母抽提物、30g/L SEA盐、9μM TSA、0.8μM甘草次酸和1L自来水，取发酵液原料，搅拌均匀后在场强为15kV/cm、脉冲频率为1.5kHz、脉冲宽度为1.3μs、流速为20mL/min的脉冲电场和波长为150nm的紫外线处理250个脉冲，即得发酵液；
[0039] 4)表观遗传修饰调控：将真菌种子液按接种量为3％接种到发酵液中，在温度为22℃的条件下进行发酵，时间为25天，得到经表观修饰的海洋真菌。
[0040] 一种上述表观修饰方法获得的浒苔来源真菌的次级代谢物，具有如下结构：
[0041]
[0042] 上述次级代谢物的制备方法为：
[0043] 1)将发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝，滤液用等效体积的乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，菌丝用80％丙酮萃取三次，丙酮溶液经减压浓缩，然后以乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，将上述两个乙酸乙酯溶液组合在一起，并在减压下浓缩，得到乙酸乙酯溶液提取物；
[0044] 2)将乙酸乙酯提取物利用减压硅胶柱色谱进行逐步洗脱，洗脱液为石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100％～0％)的屈服梯度6个主要馏分(馏分1～6)，馏分4通过Sephadex LH-20(MeOH)进一步纯化，得到馏分4.2、4.3、4.4，馏分4.2用半制备的HPLC纯化，用60％MeOH-H2O和0.15％三氟乙烯洗脱，得到目标化合物Ⅱ(tR＝13.3分钟)和化合物Ⅲ(tR＝17.6分钟)；馏分4.3用半制备的HPLC纯化，用55％MeOH-H2O和0.15％三氟乙烯洗脱，得到目标化合物Ⅳ(tR＝15.8分钟)；馏分5通过Sephadex LH-20(MeOH)进一步纯化，得到馏分5.2，馏分5.2用半制备的HPLC纯化，用60％MeOH-H2O和0.15％三氟乙烯洗脱，得到目标化合物Ⅰ(tR＝10.8分钟)。
[0045] 实施例2：
[0046] 一种浒苔来源真菌的表观修饰方法的制备方法，包括，
[0047] 1)真菌材料：从来自青岛石老人海水浴场浒苔样品中分离出真菌菌株土曲霉OUCMDZ-2739，浒苔样品依次用无菌海水、75％乙醇和无菌水洗涤。然后，用研钵捣碎样品，然后存放于含有100mg/mL氯霉素的PDA培养基(每升含马铃薯提取物200克，葡萄糖20克，琼脂15克，和海水1L)中，在28℃下培养至出现单一菌种，将该菌种转移到另一PDA培养基并储存于4℃，通过多相分类学研究、菌落形态及18S rRNA序列分析、菌株发育树的建立，鉴定其为土曲霉OUCMDZ-2739；
[0048] 2)扩大培养：将浒苔来源真菌Aspergillus terreus OUCMDZ-2739接种在培养基中扩大培养，然后调节pH为7.0，得真菌种子液；
[0049] 3)发酵液配制：按如下组分：10g/L葡萄糖、20g/L麦芽糖、20g/L甘露醇、10g/L谷氨酸单钠、0.5g/L KH2PO4、0.3g/L MgSO4·7H2O、3g/L酵母抽提物、33g/L SEA盐、10μM TSA、1.0μM甘草次酸和1L自来水，取发酵液原料，搅拌均匀后在场强为18kV/cm、脉冲频率为
1.8kHz、脉冲宽度为1.4μs、流速为30mL/min的脉冲电场和波长为180nm的紫外线处理280个脉冲，即得发酵液；
1.8kHz、脉冲宽度为1.4μs、流速为30mL/min的脉冲电场和波长为180nm的紫外线处理280个脉冲，即得发酵液；
[0050] 4)表观遗传修饰调控：将真菌种子液按接种量为3-5％接种到30L发酵液中，在温度为22-28℃的条件下进行发酵，时间为30天，得到经表观修饰的海洋真菌。
[0051] 一种上述表观修饰方法获得的浒苔来源真菌的次级代谢物，具有如下结构：
[0052]
[0053] 上述次级代谢物的制备方法为：
[0054] 1)将发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝，滤液用等效体积的乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，菌丝用80％丙酮萃取三次，丙酮溶液经减压浓缩，然后以乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，将上述两个乙酸乙酯溶液组合在一起，并在减压下浓缩，得到乙酸乙酯溶液提取物；
[0055] 2)将乙酸乙酯提取物利用减压硅胶柱色谱进行逐步洗脱，洗脱液为石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100％～0％)的屈服梯度6个主要馏分(馏分1～6)，馏分4通过Sephadex LH-20(MeOH)进一步纯化，得到馏分4.2、4.3、4.4，馏分4.2用半制备的HPLC纯化，用60％MeOH-H2O和0.15％三氟乙烯洗脱，得到目标化合物Ⅱ(tR＝13.3分钟)和化合物Ⅲ(tR＝17.6分钟)；馏分4.3用半制备的HPLC纯化，用55％MeOH-H2O和0.15％三氟乙烯洗脱，得到目标化合物Ⅳ(tR＝15.8分钟)；馏分5通过Sephadex LH-20(MeOH)进一步纯化，得到馏分5.2，馏分5.2用半制备的HPLC纯化，用60％MeOH-H2O和0.15％三氟乙烯洗脱，得到目标化合物Ⅰ(tR＝10.8分钟)。
[0056] 实施例3：
[0057] 一种浒苔来源真菌的表观修饰方法的制备方法，包括，
[0058] 1)真菌材料：从来自青岛石老人海水浴场浒苔样品中分离出真菌菌株土曲霉OUCMDZ-2739，浒苔样品依次用无菌海水、75％乙醇和无菌水洗涤。然后，用研钵捣碎样品，然后存放于含有100mg/mL氯霉素的PDA培养基(每升含马铃薯提取物200克，葡萄糖20克，琼脂15克，和海水1L)中，在28℃下培养至出现单一菌种，将该菌种转移到另一PDA培养基并储存于4℃，通过多相分类学研究、菌落形态及18S rRNA序列分析、菌株发育树的建立，鉴定其为土曲霉OUCMDZ-2739；
[0059] 2)扩大培养：将浒苔来源真菌Aspergillus terreus OUCMDZ-2739接种在培养基中扩大培养，然后调节pH为7.5，得真菌种子液；
[0060] 3)发酵液配制：按如下组分：15g/L葡萄糖、22g/L麦芽糖、23g/L甘露醇、12g/L谷氨酸单钠、0.6g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、4g/L酵母抽提物、35g/L SEA盐、11μM TSA、1.3μM甘草次酸和1L自来水，取发酵液原料，搅拌均匀后在场强为20kV/cm、脉冲频率为
2.0kHz、脉冲宽度为1.5μs、流速为40mL/min的脉冲电场和波长为200nm的紫外线处理300个脉冲，即得发酵液；
2.0kHz、脉冲宽度为1.5μs、流速为40mL/min的脉冲电场和波长为200nm的紫外线处理300个脉冲，即得发酵液；
[0061] 4)表观遗传修饰调控：将真菌种子液按接种量为5％接种到发酵液中，在温度为28℃的条件下进行发酵，时间为35天，得到经表观修饰的海洋真菌。
[0062] 一种上述表观修饰方法获得的浒苔来源真菌的次级代谢物，具有如下结构：
[0063]
[0064] 上述次级代谢物的制备方法为：
[0065] 1)将发酵液通过粗棉布过滤以分离滤液和菌丝，滤液用等效体积的乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，菌丝用80％丙酮萃取三次，丙酮溶液经减压浓缩，然后以乙酸乙酯萃取三次得到乙酸乙酯溶液，将上述两个乙酸乙酯溶液组合在一起，并在减压下浓缩，得到乙酸乙酯溶液提取物；
[0066] 2)将乙酸乙酯提取物利用减压硅胶柱色谱进行逐步洗脱，洗脱液为石油醚-CH2Cl2(1:1和0:1)和CH2Cl2-MeOH(100％～0％)的屈服梯度6个主要馏分(馏分1～6)，馏分4通过Sephadex LH-20(MeOH)进一步纯化，得到馏分4.2、4.3、4.4，馏分4.2用半制备的HPLC纯化，用60％MeOH-H2O和0.15％三氟乙烯洗脱，得到目标化合物Ⅱ(tR＝13.3分钟)和化合物Ⅲ(tR＝17.6分钟)；馏分4.3用半制备的HPLC纯化，用55％MeOH-H2O和0.15％三氟乙烯洗脱，得到目标化合物Ⅳ(tR＝15.8分钟)；馏分5通过Sephadex LH-20(MeOH)进一步纯化，得到馏分5.2，馏分5.2用半制备的HPLC纯化，用60％MeOH-H2O和0.15％三氟乙烯洗脱，得到目标化合物Ⅰ(tR＝10.8分钟)。
[0067] 对比例1：
[0068] 本实施例与实施例2的技术方案的区别在于：本实施例发酵液仅经脉冲电场处理。
[0069] 对比例2：
[0070] 本实施例与实施例2的技术方案的区别在于：本实施例发酵液仅经紫外线处理。
[0071] 对比例3：
[0072] 本实施例与实施例2的技术方案的区别在于：本实施例发酵液未经脉冲电场和紫外线处理，而经高温杀菌处理。
[0073] 对比例4：
[0074] 本实施例与实施例2的技术方案的区别在于：本实施例发酵液中不含有甘草次酸。
[0075] 对比例5：
[0076] 本实施例与实施例2的技术方案的区别在于：本实施例本实施例发酵液未经脉冲电场和紫外线处理，而经高温杀菌处理，且发酵液中不含有甘草次酸。
[0077] 试验例1：
[0078] 30L发酵液中实施例2、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4、对比例5中各产物的得率，结果如表1所示。
[0079] 表1各产物的得率
[0080]
[0081]
[0082] 由表1可知，实施例2中各产物的得率远远好于对比例。对比实施例2和对比例1、对比例2、对比例3可知，脉冲电场和紫外线的共同作用，能够确保浒苔来源真菌的表观遗传修饰顺利进行，提高其次级代谢产物的产量。对比实施例2和对比例4可知，发酵液中TSA和甘草次酸可以对浒苔来源真菌的发酵产生协同的促进作用，提高其次级代谢产物的产量。对比实施例2和对比例5可知，本发明用发酵液能够大大提高次级代谢产物的产量。
[0083] 试验例2：
[0084] 次级代谢产物的表征
[0085] 化合物Ⅰ为棕绿色固体，[a]D25-18(c 0.1,CH2Cl2)；UV(MeOH)λmax(logε)：203(4.31),221(4.05),247(3.33)和285(3.76)nm；ECD(0.0026M,MeOH)λmax(△ε)231(-0.07),258(+0.07),310(+0.24)nm(如图1)；IR(KBr)νmax 3750,3673,3645,1699,1544,1505cm-1；1H和13C NMR值如表2；(calcd.for C23H25O5，381.1697)。
[0086] 化合物Ⅱ为棕黄色固体，UV(MeOH)λmax(logε)：225(3.87),256(3.54)和282(3.76)nm；IR(KBr)νmax 3750,3673,3649,1699,1540,1509cm-1；1H和13C NMR值如表2；(calcd.for C20H23O3，311.1642)。
[0087] 化合物Ⅲ为微黄色固体，[a]D25-36(c 0.1,CH2Cl2)；UV(MeOH)λmax(logε)：204(4.35),252(3.95)和376(4.25)nm；ECD(0.0022M,MeOH)λmax(△ε)207(+1.13),230(-0.13),-1 1 13252(+0.10),373(-0.63)nm(如图2)；IR(KBr)νmax 3747,3641,1696,1536,1501cm ；H和 C NMR值如表1；(calcd.for C27H28O6，449.1959)。
[0088] 化合物Ⅳ为微黄色固体，[a]D25-15.6(c 0.1,CH2Cl2)；UV(MeOH)λmax(logε)：207(4.84),257(3.68)和286(4.23)nm；ECD(0.0037M,MeOH)λmax(△ε)211(+0.79),233(-2.28),-1 1 13287(+0.49)nm(如图1)；IR(KBr)νmax 3750,3673,3641,1699,1540cm ；H和 C NMR值如表2；
(calcd.for C14H22O4N，268.1543)。
(calcd.for C14H22O4N，268.1543)。
[0089] 表2化合物在CDCl3中的1H(500MHz)and 13C(125MHz)NMR值
[0090]
[0091]
[0092] 试验例3：
[0093] 次级代谢产物的性能测试
[0094] 对α-葡萄糖苷酶的抑制性测试：
[0095] α-葡萄糖苷酶溶液的配制：将酶冻干粉用0.1％BSA溶液溶解，配成100U/mL的酶液，置于-20℃的冰箱中冻存。实验前，将100U/mL酶液用移液枪吸取少量，先用0.1％BSA溶液稀释到20U/mL，再用0.1％BSA溶液稀释到0.2U/mL备用。
[0096] PNPG溶液配制：称取一定量的PNPG固体，用0.1mol/L pH为6.8的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解，配成浓度为10mmol/L，然后用1.5mL的离心管分装备用。
[0097] 采用比色法测定α-葡萄糖苷酶的活性。用二甲基亚砜(DMSO)溶解待测活性化合物，配制质量浓度为10mg/mL的备用溶液。再用PBS稀释备用溶液，配置成所需浓度的待测溶液。在96孔板每孔中加入活性化合物溶液(实验组)、阿卡波糖溶液(阳性对照组)或PBS(阴性对照组)10μL，PBS 50μL，酶溶液20μL，摇匀，置于37℃水浴恒温10min，然后加入PNPG溶液20μL，摇匀，37℃反应10min，再加入Na2CO3终止液30μL终止反应，立即于405nm处测定吸光度值。样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率按下式计算：抑制率(％)＝[(阴性对照组吸光度－实验组吸光度)/阴性对照组吸光度]×100％。当样品对α-葡萄糖苷酶的抑制率为50％时，将样品质量浓度定为半数抑制浓度(IC50)值。测得化合物Ⅲ对α-葡萄糖苷酶的半数抑制浓度(IC50)值为24.8μM。脱氧野尻霉素和阿卡波糖的IC50值分别为191.7μM和555.1μM，说明化合物8对α-葡萄糖苷酶的抑制效果好于脱氧野尻霉素和阿卡波糖。且化合物Ⅲ的Ki值为1.42μM。这表明活性化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制效果好于阿卡波糖，抑制机体α-葡萄糖苷酶活性，减缓葡萄糖的生成和吸收，防止出现餐后高血糖，对预防和治疗糖尿病具较好的作用，尤其是2型糖尿病。而化合物Ⅰ，化合物Ⅱ，化合物Ⅳ对α-葡萄糖苷酶无抑制性。
[0098] 上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。
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