一种非整合李斯特菌疫苗及抗肿瘤免疫应答方法
阅读：12发布：2020-05-15
专利汇可以提供一种非整合李斯特菌疫苗及抗肿瘤免疫应答方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开涉及一种非整合李斯特菌 疫苗 及抗 肿瘤 免疫应答方法。具体来说，本公开涉及一种重组核酸分子，含有所述重组核酸分子的重组质粒或重组表达载体、重组蛋白和重组李斯特菌。与此同时，本公开还涉及含有上述成分的药物组合物、疫苗及其应用，并且进一步提供了缓慢持续杀伤细胞的方法和在受试者中诱导免疫应答的方法。本公开采用的质粒在李斯特菌的多次传代过程中十分稳定。本公开得到的载体，可以不受异源性 抗原 上酶切位点的影响，操作方便，插入效率高，插入准确，极大地提高了非整合李斯特菌肿瘤疫苗抗原肽的表达，使其在抗肿瘤免疫应答上的作用更为显著。，下面是一种非整合李斯特菌疫苗及抗肿瘤免疫应答方法专利的具体信息内容。
1.一种重组核酸分子，其包含编码重组多肽的开放阅读框，所述重组多肽包含融合至衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的异源性抗原，所述重组核酸分子还包含第一启动子序列；
其中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽选自：
如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有或部分具有如SEQ ID NO:1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的活性的多肽。
2.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其特征在于，编码所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列与编码如SEQ ID NO：1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列相比，具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少97％的同一性。
3.根据权利要求1或2所述的重组核酸分子，其中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽为如SEQ ID NO:3所示的多肽。
4.根据权利要求1或2所述的重组核酸分子，其中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原；可选的，所述非肿瘤抗原选自OVA或具有OVA功能的片段。
5.根据权利要求4所述的重组核酸分子，其中，所述具有OVA功能的片段中，所述OVA的氨基酸的长度为2-40个；优选的，所述OVA的氨基酸的长度为5-35个；更优选的，所述OVA的氨基酸的长度为8-28个。
6.根据权利要求4或5所述的重组核酸分子，其中，所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段选自包含如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；优选的，编码所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段的核苷酸包含如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求1所述的重组核酸分子，其特征在于，其还包含连接序列，所述连接序列连接编码所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的核苷酸序列和编码所述异源性抗原的核苷酸序列；
其中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原；可选的，所述非肿瘤抗原选自OVA或具有OVA功能的片段。
8.根据权利要求7所述的重组核酸分子，其中，所述连接序列包含编码如SEQ ID NO:16所示的序列的核苷酸序列；可选的，所述连接序列包含如SEQ ID NO:16所示的序列的一个、二个、或三个以上的重复。
9.根据权利要求7或8所述的重组核酸分子，其中，和所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的核苷酸序列相连接的，包含所述异源性抗原的连接序列所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示。
10.根据权利要求1-9任一项所述的重组核酸分子，其中，所述启动子序列选自编码Phly基因的序列；可选的，所述重组核酸分子还包含用于检测的标签序列或编码代谢产物的基因；优选的，所述代谢产物选自次级代谢产物。
11.一种重组质粒或重组表达载体，其包含权利要求1-10任一项所述的重组核酸分子的序列。
12.一种重组蛋白，其由权利要求1-10任一项所述的重组核酸分子编码，或由权利要求
11所述的重组质粒或重组表达载体形成。
13.一种重组李斯特菌，其含有如权利要求1-10任一项所述的重组核酸分子，或含有权利要求11所述的重组质粒或重组表达载体，或表达如权利要求12所述的重组蛋白。
14.一种药物组合物，其含有治疗有效量的，根据权利要求13中所述的重组李斯特菌。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其中，所述药物组合物进一步包含第二治疗试剂；优选的，所述第二治疗试剂选自第二抗癌试剂；更优选的，所述第二抗癌试剂选自第二重组李斯特菌、放疗剂、化疗剂或免疫治疗剂。
16.一种预防或治疗性疫苗，其特征在于，该疫苗包含预防或治疗有效量的，根据权利要求13所述的重组李斯特菌。
17.根据权利要求16所述的疫苗，其特征在于，其还可以包含免疫刺激剂；可选的，所述免疫刺激剂选自佐剂。
18.权利要求13所述的重组李斯特菌，权利要求14-15任一项所述药物组合物或权利要求16-17任一项所述的疫苗在制备用于杀死细胞的药物中的应用。
19.根据权利要求18所述的应用，其中，所述细胞被包含在患者体内。
20.根据权利要求18-19任一项所述的应用，其中，所述细胞选自增生性的、瘤性的、前癌性的或转移性的细胞；优选的，所述细胞选自转移性的细胞；更优选的，所述转移性的细胞选自转移性的肿瘤细胞。
21.权利要求14-15任一项所述药物组合物或权利要求16-17任一项所述的疫苗在制备用于治疗肿瘤患者的药物中的应用。
22.一种缓慢持续杀伤细胞的方法，包括将所述细胞与权利要求13所述的重组李斯特菌、权利要求14-15任一项所述药物组合物或权利要求16-17任一项所述的疫苗接触。
23.根据权利要求22所述的方法，其中，所述的细胞被包含在患者体内。
24.根据权利要求22-23任一项所述的方法，其中，所述细胞选自增生性的、瘤性的、前癌性的或转移性的细胞；优选的，所述细胞选自转移性的细胞；更优选的，所述转移性的细胞选自转移性的肿瘤细胞。
25.根据权利要求22-23任一项所述的方法，其将所述细胞与权利要求13所述的重组李斯特菌、权利要求14-15任一项所述药物组合物或权利要求16-17任一项所述的疫苗施用至患者体内。
26.根据权利要求22-23任一项所述的方法，其中，权利要求13所述的重组李斯特菌、权利要求14-15任一项所述药物组合物或权利要求16-17任一项所述的疫苗可以通过口服、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、经皮、鼻腔、经直肠，肿瘤体内注射、肿瘤腔内留置、神经鞘内注射、蛛网膜下腔注射或系统性施用；可选的，所述系统性施用包括通过血管内施用；优选的，所述血管内施用选自注射、灌注。
27.根据权利要求22-23任一项所述的方法，所述方法进ー步包括施用第二抗癌疗法；
优选的，所述第二种抗癌疗法可以是化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术疗法或上述疗法的一种或多种的组合。
28.一种在受试者中诱导免疫应答的方法，其特征在于该方法包含对受试者施用：权利要求13所述的重组李斯特菌、权利要求14-15任一项所述药物组合物或权利要求16-17任一项所述的疫苗。
29.一种分离的肽，其由氨基酸序列组成，所述氨基酸序列选自存在保守突变的，并且包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少97％同一性的序列；或所述氨基酸序列选自如SEQ ID NO：3所示的序列。
30.一种用于编码权利要求29所述分离的肽的核苷酸序列。
一种非整合李斯特菌疫苗及抗肿瘤免疫应答方法
技术领域
背景技术
[0002] 单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes，Lm)是一种重要的食源性病原菌，广泛存在于生鲜或即食食品中，对老人、儿童、孕妇及免疫抑制人群可能引起严重的李斯特菌病。李斯特菌作为一种革兰氏阳性的胞内寄生菌，可在上皮细胞及吞噬细胞内存活并繁殖。在寄生及繁殖的不同阶段中，Lm有多个毒力因子来协助其进行机体的感染继而发挥致病作用，目前已发现多个与Lm致病性与毒力相关因子其中多是表面蛋白或者是分泌蛋白。编码这些蛋白的毒力基因(hly，plcA，plcB，mpl，actA，inlA和inlB)主要位于细菌染色体上的两个毒力岛上。其中hly基因编码的溶菌素(Listeriolysion O，LLO)是一个主要毒力因子。
[0003] 急性感染李斯特菌会诱发强烈的TLR介导的天然免疫应答，并产生大量促炎因子的释放。当李斯特菌被吞噬到溶酶体中，被吞噬的外源性蛋白也可直接被MHC-II分子所递呈，从而激活Lm特异的CD4+T细胞免疫应答。此外，李斯特菌能够通过其特有的李斯特菌溶血素O(LLO)从溶酶体中逃脱进入胞浆存活并繁殖，表达分泌的蛋白被宿主细胞蛋白酶降解，产生的多肽片段可被MHC-I类分子所递呈，从而激活CD8+T细胞应答，诱导稳定的Lm特异的CTL(cytotoxic T lymphocyte)反应，并保护随后的细菌感染。其中Lm的两个重要的毒力因子LLO和P60都能够诱导强烈的特异性CD8+T细胞免疫应答。因此，这种能够同时诱导炎症反应和激活MHC I型和II型抗原呈递途径的组合，使得李斯特菌成为一个具有很大应用前景的疫苗载体。
[0004] 为了将李斯特菌应用到临床上，一些高度减毒的Lm突变株被发展成为疫苗候选株。通过敲除其主要的毒力基因簇prfA/plcA/hly(LLO)/mpl/actA和plcB，或其中最主要的毒力基因actA进行减毒，例如敲除actA的菌株Lm-ΔactA的LD50为(0.5-1)x 108，相比野生型菌株的1x 104，被证明是高度减毒的。随着减毒李斯特菌研究的深入，以其为基础载体的肿瘤疫苗也在如火如荼的进行，其运送的肿瘤抗原包括人乳头瘤病毒HPV16E7抗原、黑色素瘤抗原Mage-b、高分子量的黑色素瘤相关抗原HMW-MAA、前列腺特异抗原PSA、间皮素mesothelin、抑癌蛋白P53，肝癌抗原等[1]。研究显示重组李斯特菌疫苗免疫小鼠均能够诱导特异性CTL应答，在小鼠肿瘤模型中显示良好的抗肿瘤效果，且不产生明显的副作用。研究显示重组减毒李斯特菌具有很好的应用前景。
[0005] 目前，国际上利用减毒Lm菌株为载体构建肿瘤疫苗的方式主要分为两大类：其一为质粒携带肿瘤抗原肽转化减毒Lm制备肿瘤疫苗，如最常见的平衡致死互补系统，即将多拷贝重组质粒pGG-55转化至LMΔprfA，pGG-55携带prfA基因与宿主菌构成互补系统，其携带hly或actA启动子驱动LLO或ActA与外源抗原实现融合表达[2]；然而此方法将整个prfA毒力基因簇敲除后部分回补LLO功能基因，对菌株的特异性T细胞免疫功能有所削弱。其二为将肿瘤抗原肽整合至减毒LM基因组中制备肿瘤疫苗，如采用温敏型质粒pKSV7，利用同源重组技术将目标抗原定点整合至LM基因组，该重组菌不需要抗生素维持，在临床应用方面具有明显优势[3]。或者，还可以利用整合型载体pPL1或pPL2将外源抗原定点整合至LM基因组的非必需区域(comK或tRNA Arg基因片段处)，但该方法需抗生素维持筛选菌株[4]。
[0006] 综上所述，现有技术中的李斯特菌疫苗主要是通过同源重组整合抗原基因到染色体上表达，这种方式虽然可以避免引入新的抗性基因，但存在构建周期长，整合筛选流程复杂等缺点。而非整合型李斯特菌疫苗尽管相比整合型李斯特菌疫苗在构建上存在周期短，操作简单等优点，但存在抗原肽表达量以及表达稳定性问题，导致利用上述方法构建的李斯特菌疫苗存在功效差等问题。
[0007] 由于现有方案中仍然存在以上问题，因此，需要开发一种新的构建步骤简单，耗时短，整合成功率高，更有实际应用价值的李斯特菌疫苗。
[0008] 现有技术文献
[0009] [1]Singh R,Wallecha A.Cancer immunotherapy using recombinant Listeria monocytogenes:transition from bench to clinic.[J].Human Vaccines,2011,7(5):497-505.
[0010] [2]Hernández-Flores K G,Vivanco-Cid H.Biological Effects of Listeriolysin O:Implications for Vaccination[J].Biomed Research
International,2015,2015(10).
International,2015,2015(10).
[0011] [3]Azizoglu R O,Elhanafi D,Kathariou S.Mutant construction and integration vector-mediated gene complementation in Listeria monocytogenes[J].Methods in Molecular Biology,2014,1157(1):201-11.
[0012] [4]Brockstedt D G,Dubensky T W.Promises and challenges for the development of Listeria monocytogenes-based immunotherapies[J].Expert Review of Vaccines,2008,7(7):1069.发明内容
[0013] 发明要解决的问题
[0014] 基于现有技术中存在的缺陷，本公开利用高度减毒的Lm菌株为载体，采用一个独立复制的质粒表达抗原基因，极大减少了载体构建的成本及时间，并通过改造分泌肽片段提高了载体表达肿瘤抗原肽的表达效率。
[0015] 用于解决问题的方案
[0016] 在一个技术方案中，本公开涉及一种重组核酸分子，其包含编码重组多肽的开放阅读框，上述重组多肽包含融合至李斯特菌溶血素(LLO)多肽的异源性抗原，上述重组核酸分子还包含第一启动子序列；其中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽选自如SEQ ID NO:1所示的多肽。
[0017] 在一个技术方案中，本公开涉及一种重组核酸分子，其包含编码重组多肽的开放阅读框，上述重组多肽包含融合至李斯特菌溶血素(LLO)多肽的异源性抗原，上述重组核酸分子还包含第一启动子序列；其中，所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽选自如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列经过取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸，且具有或部分具有如SEQ ID NO:1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的活性的多肽。
[0018] 在一个技术方案中，本公开涉及一种重组核酸分子，其中，编码所述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列与编码如SEQ ID NO：1所示的李斯特菌溶血素(LLO)多肽的氨基酸序列相比，具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少97％的同一性。
[0019] 在一个技术方案中，本公开涉及一种重组核酸分子，其中，上述由(1)衍生的多肽为如SEQ ID NO:3所示的多肽。
[0020] 在一个技术方案中，本公开涉及一种重组核酸分子，其中，上述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原；可选的，上述非肿瘤抗原选自OVA或具有OVA功能的片段。
[0021] 在一个技术方案中，本公开涉及一种重组核酸分子，其中，上述具有OVA功能的片段中，上述OVA的氨基酸的长度为2-40个；优选的，上述OVA的氨基酸的长度为5-35个；更优选的，上述OVA的氨基酸的长度为8-28个。
[0022] 在一个技术方案中，本公开涉及一种重组核酸分子，其中，上述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段选自包含如SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；优选的，编码所述OVA或具有OVA功能的氨基酸片段的核苷酸包含如SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。
[0023] 在另一个技术方案中，本公开涉及一种重组核酸分子，其还包含连接序列，上述连接序列连接编码上述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的核苷酸序列和编码上述异源性抗原的核苷酸序列；其中，上述异源性抗原选自肿瘤抗原或非肿瘤抗原；可选的，上述非肿瘤抗原选自OVA或具有OVA功能的片段。
[0024] 在一个技术方案中，本公开涉及一种重组核酸分子，其中，上述连接序列包含编码如SEQ ID NO:16所示的序列的核苷酸序列；可选的，上述连接序列包含如SEQ ID NO:16所示的序列的一个或二个或三个以上的重复。
[0025] 在一个技术方案中，本公开涉及一种重组核酸分子，其中，和上述衍生李斯特菌溶血素(LLO)多肽的核苷酸序列相连接的包含上述异源性抗原的连接序列所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15所示。
[0026] 在一个技术方案中，本公开涉及一种重组核酸分子，其中，上述启动子序列选自Phly基因编码的序列；可选的，上述重组核酸分子还包含用于检测的标签序列或编码代谢产物的基因；优选的，上述代谢产物选自次级代谢产物。
[0027] 在另一个技术方案中，本公开涉及一种重组质粒或重组表达载体，其包含本公开中上述的重组核酸分子的序列。
[0028] 在另一个技术方案中，本公开涉及一种重组蛋白，其由本公开上述的重组核酸分子编码，或由本公开上述的重组质粒或重组表达载体形成。
[0029] 在另一个技术方案中，本公开涉及一种重组李斯特菌，其含有本公开中上述的重组核酸分子，或含有本公开中上述的重组质粒或重组表达载体，或表达如本公开中上述的重组蛋白。
[0030] 在另一个技术方案中，本公开涉及一种药物组合物，其含有治疗有效量的，如本公开上述的重组李斯特菌。
[0031] 在一个技术方案中，本公开涉及一种组合物，上述组合物进一步包含第二治疗试剂；优选的，上述第二治疗试剂选自第二抗癌试剂；更优选的，上述第二抗癌试剂选自第二重组李斯特菌、放疗剂、化疗剂或免疫治疗剂。
[0033] 在一个技术方案中，本公开涉及一种预防或治疗性疫苗，其还可以包含免疫刺激剂；可选的，上述免疫刺激剂选自佐剂。
[0034] 在另一个技术方案中，本公开涉及上述重组李斯特菌、药物组合物或疫苗在制备用于杀死细胞的药物中的应用。
[0035] 在一个技术方案中，本公开涉及制备用于杀死细胞的药物中的应用，其中，上述细胞被包含在患者体内。
[0036] 在一个技术方案中，本公开涉及用于杀死细胞的药物中的应用，上述细胞选自增生性的、瘤性的、前癌性的或转移性的细胞；优选的，上述细胞选自转移性的细胞；更优选的，上述转移性的细胞选自转移性的肿瘤细胞。
[0037] 在另一个技术方案中，本公开涉及上述药物组合物或疫苗在制备用于治疗肿瘤患者的药物中的应用。
[0038] 在另一个技术方案中，本公开涉及—种缓慢持续杀伤细胞的方法，包括将上述细胞与本公开涉及的重组李斯特菌、药物组合物或疫苗接触。
[0039] 在一个技术方案中，本公开涉及一种缓慢持续杀伤细胞的方法，其中，上述的细胞被包含在患者体内。
[0040] 在一个技术方案中，本公开涉及一种缓慢持续杀伤细胞的方法，上述细胞选自增生性的、瘤性的、前癌性的或转移性的细胞；优选的，上述细胞选自转移性的细胞；更优选的，上述转移性的细胞选自转移性的肿瘤细胞。
[0041] 在一个技术方案中，本公开涉及一种缓慢持续杀伤细胞的方法，其将上述细胞与本公开涉及的重组李斯特菌、药物组合物或疫苗施用至患者体内。
[0042] 在一个技术方案中，本公开涉及一种缓慢持续杀伤细胞的方法，其中，本公开涉及的重组李斯特菌、药物组合物或疫苗可以通过口服、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、经皮、鼻腔、经直肠，肿瘤体内注射、肿瘤腔内留置、神经鞘内注射、蛛网膜下腔注射或系统性施用；可选的，所述系统性施用包括通过血管内施用；优选的，所述血管内施用选自注射、灌注。
[0043] 在一个技术方案中，本公开涉及一种缓慢持续杀伤细胞的方法，上述方法进ー步包括施用第二抗癌疗法；优选的，上述第二种抗癌疗法可以是化学疗法、放射疗法、免疫疗法、手术疗法或上述疗法的一种或多种的组合。
[0044] 在另一个技术方案中，本公开涉及一种在受试者中诱导免疫应答的方法，其特征在于该方法包含对受试者施用如本公开所涉及的的重组李斯特菌、药物组合物或疫苗。
[0045] 在另一个技术方案中，本公开涉及一种分离的肽，其由氨基酸序列组成，上述氨基酸序列选自存在保守突变的，并且包含与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％，最优选至少97％同一性的序列；或上述氨基酸序列选自如SEQ ID NO：3所示的序列。
[0046] 在另一个技术方案中，本公开涉及一种用于编码上述分离的肽的核苷酸序列。
[0047] 发明的效果
[0048] 本公开采用的质粒pAM401在李斯特菌的多次传代过程中十分稳定，经过10-20次传代未发现质粒丢失或突变的现象，可以安全用于疫苗的构建。抗原基因的表达转录选用了李斯特菌LLO自带的启动子Phly，该启动子稳定高效，可以很好的启动转录翻译构建的编码异源性抗原的基因。同时以LLO自身的信号肽序列，在疫苗侵染细胞逃逸出溶酶体后，将表达的蛋白分泌到细菌外胞浆内，诱导细胞免疫应答。可选的，在质粒中加入了蛋白检测标签，例如Flag或His标签，用于蛋白表达分泌的检测。
[0049] 可选的，本公开采用的载体构建的方法以及通过前述方法得到的载体，可以不受异源性抗原上酶切位点的影响，操作方便，插入效率高，插入准确。
[0050] 可选的，本公开采用的技术方案在抗原肽设计优化上，根据大肠杆菌密码子偏好性作为优化标准符合李斯特菌表达特点，采用该方法优化设计的抗原肽可以在李斯特菌中表达，并具有良好的稳定性。与此同时，利用如SEQ ID NO:3所示的LLO信号肽作为分泌信号，可获得和如SEQ ID NO:5所示的含有28个氨基酸长度的LLO信号肽相比，更好的分泌蛋白表达效果，使得李斯特菌携带的异源性抗原能够高效的分泌至宿主细胞内，以充分激活特异性肿瘤免疫反应，从理论上获得更好的治疗效果。
[0051] 可选的，本公开采用的技术方案极大提高了非整合李斯特菌肿瘤疫苗抗原肽的表达，使其在抗肿瘤免疫应答上作用更为突出。示例性的，当最低有效疫苗剂量降低至104数量级时，仍然获得良好的动物药效和抗肿瘤免疫反应，因此本方法构建的肿瘤疫苗在有功效的同时，又极大的保证了安全性。示例性的，以105剂量和整合型李斯特菌作对比，在本公开所采用的方法下制备的肿瘤疫苗在105剂量下，较整合型李斯特菌具有更好的消瘤及激活体内特异性免疫应答效果。附图说明
[0052] 图1所示的是本公开采用的用做表达抗原基因的质粒结构示意图。
[0053] 图2所示的是培养温度对蛋白表达分泌的影响。其中，M：180KDa蛋白梯状标准参照物；泳道1:37℃培养条件下Lm 10403SΔactA(pAM401-hly-LLO540-Flag)菌株上清蛋白沉淀浓缩样；泳道2:30℃培养条件下Lm 10403SΔactA(pAM401-hly-LLO540-Flag)菌株上清蛋白沉淀浓缩样。
[0054] 图3所示的是LLO全长和常规LLO信号肽对于外源蛋白表达的影响。其中，M：250KDa蛋白梯状标准参照物；泳道1：Lm 10403SΔactA菌株上清蛋白沉淀浓缩样；泳道2：Lm 10403SΔactA(pAM401-hly-LLO540-His)菌株上清蛋白沉淀浓缩样；泳道3：Lm 10403SΔactA(pAM401-hly-LLO28-His)菌株上清蛋白沉淀浓缩样。
[0055] 图4所示的是不同大小的抗原肽及有无G4S序列对表达载体的影响。其中，M：250KDa蛋白梯状标准参照物；泳道1：Lm10403SΔactA(pAM401-hly-LLO540-His)菌株上清蛋白沉淀浓缩样；泳道2：Lm10403SΔactA(pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)菌株上清蛋白沉淀浓缩样；泳道3：Lm10403SΔactA(pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA8-(G4S)2-His)菌株上清蛋白沉淀浓缩样；泳道4：Lm 10403SΔactA(pAM401-hly-LLO540-OVA28-His)菌株上清蛋白沉淀浓缩样。
[0056] 图5所示的是EG7肿瘤模型疫苗注射后治疗效果。
[0057] 图6所示的是t检验分析20、22、24天三组间显著性差异的结果。
[0058] 图7所示的是ELISPOT实验进行功能学检测的结果。
[0059] 图8所示的是四聚体实验功能学检测的结果。
[0060] 图9所示的是ELISPOT功能学检测的结果。
[0061] 图10所示的是EG7肿瘤模型不同剂量注射后治疗效果。
[0062] 图11所示的是ELISPOT功能学检测的结果。
[0063] 图12所示的是EG7肿瘤模型不同剂量注射后治疗效果。
[0064] 图13所示的是ELISPOT功能学检测的结果。
[0065] 图14所示的是本公开的肿瘤疫苗与整合OVA李斯特菌肿瘤药效对比。
[0066] 图15所示的是疫苗注射7天后ELISPOT功能学检测的结果。
[0067] 图16所示的是疫苗注射12天后ELISPOT功能学检测的结果。
[0068] 图17所示的是电转化pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His菌株后的涂CM抗性平板培养结果。其中，图A显示未电转化的pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His质粒的LM感受态涂板CM抗性平板；图B显示电转化pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His质粒的LM感受态涂板CM抗性平板。
[0069] 图18所示的是纯化的pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His菌株的基因组DNA和质粒DNA的PCR结果。其中，M显示15000bp DNA梯状标准参照物；泳道1显示LM 10403SΔactA菌株基因组DNA；泳道2-3分别显示LM10403SΔactA(pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)菌株全DNA；泳道4显示pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His质粒DNA。
[0070] 图19所示的是纯化的pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His菌株的基因组DNA和质粒DNA的PCR结果。其中，M显示500bp DNA梯状标准参照物；泳道1-2显示LM 10403SΔactA(pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)菌株基因组DNA为模板PCR产物；泳道3-4显示LM 10403SΔactA(pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)菌株质粒DNA为模板PCR产物。
具体实施方式
[0071] 定义
[0073] 如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
[0074] 在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
[0075] 虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
[0076] 当用于权利要求书或说明书时，选择/可选/优选的“数值范围”既包括范围两端的数值端点，也包括相对于前述数值端点而言，所述数值端点中间所覆盖的所有自然数。
[0077] 当用于权利要求和/或说明书中时，术语“抑制”、“降低”或“防止”或这些术语的任何变形，包括为实现期望结果(例如癌症治疗)的任何可测量的减少或完全抑制。期望结果包括但不限于癌症或增生性病症或癌症相关症状的缓解、降低、减慢或根除，以及改善的生活质量或生命延长。
[0079] 本公开中的术语“哺乳动物”是指人以及非人类哺乳动物。
[0080] 本公开的所述方法包括将表达哺乳动物对之具有预存免疫力的肿瘤抗原的疫苗给予哺乳动物。本公开使用的术语“预存免疫力”意指包括通过用抗原接种诱导的免疫力以及哺乳动物内天然存在的免疫力。
[0081] 本公开中的术语“OVA”是指鸡卵白蛋白(Ovalbumin)，也称鸡卵清白蛋白，由386个氨基酸组成，其分子量约45kD。
[0082] 本公开中的术语“Phly”是编码LLO(溶菌素，Listeriolysion O)基因的启动子。
[0085] 本公开中的术语“化疗剂”是可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的类别包括，但不限于：烷化剂、抗代谢产物、激酶抑制剂、纺锤体毒物植物生物碱、细胞毒/抗肿瘤抗生素、拓扑异构酶抑制剂、光敏剂、抗-雌激素和选择性雌激素受体调节剂、抗-孕酮、雌激素受体下调剂、雌激素受体拮抗剂、促黄体激素释放激素激动剂、抗-雄激素类、芳香化酶抑制剂、EGFR抑制剂、VEGF抑制剂、抑制涉及异常细胞增殖或肿瘤生长的基因表达的反义寡核苷酸。可用于本公开的治疗方法的化疗剂包括细胞生长抑制剂和/或细胞毒性剂。
[0086] 本公开中的术语“免疫治疗剂”包括“免疫调节剂”和促进或介导促进细胞介导的免疫应答的抗原呈递的试剂。其中，“免疫调节剂”包含免疫检查点调节剂，例如免疫检查点蛋白受体及其配体介导T细胞介导的细胞毒性的抑制，并且通常由肿瘤或在肿瘤微环境中的无反应性T细胞上表达，并允许肿瘤逃避免疫攻击。免疫抑制检查点蛋白受体及其配体的活性的抑制剂可以克服免疫抑制性肿瘤环境，以允许肿瘤的细胞毒性T细胞攻击。免疫检查点蛋白质的实例包括但不限于PD-1、PD-L1、PDL2、CTLA4、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103。此类蛋白质的活性的调节(包括抑制)可以通过免疫检查点调节剂完成，其可以包括例如靶向检查点蛋白质的抗体、适体、小分子和检测点受体蛋白质的可溶性形式，等等。PD-1靶向抑制剂包括经批准的药物试剂派姆单抗(pembrolizumab)和纳武单抗(nivolumab)，而易普利姆玛(ipilimumab)是经批准的CTLA-4抑制剂。对PD-L1、PD-L2、LAG3、TIM3、TIGIT和CD103特异性的抗体是已知的和/或商品化的，并且也可以由本领域技术人员产生。
[0087] 本公开中的术语“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸”包括“保守突变”。本公开中的术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的保守突变。保守突变的代表性例子为保守置换。保守置换是指，例如，在置换部位为芳香族氨基酸的情况下，在Phe、Trp、Tyr间相互置换的突变；在置换部位为疏水性氨基酸的情况下，在Leu、Ile、Val间相互置换的突变；在为极性氨基酸的情况下，在Gln、Asn间相互置换的突变；在为碱性氨基酸的情况下，在Lys、Arg、His间相互置换的突变；在为酸性氨基酸的情况下，在Asp、Glu间相互置换的突变；在为具有羟基的氨基酸的情况下，在Ser、Thr间相互置换的突变。作为被视作保守置换的置换，具体而言，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。
[0088] 本公开中的“本领域的常规生物学方法”，可以参见“最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology，Wiley出版)”，“分子克隆实验指南(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，冷泉港实验室出版)”等公开出版物中记载的相应方法。
[0089] 技术方案
[0091] SEQ ID NO:1所示的是野生型李斯特菌溶血素LLO的核苷酸序列(LLO529)[0092] SEQ ID NO:2所示的是野生型李斯特菌溶血素LLO的氨基酸序列(LLO529)[0093] SEQ ID NO:3所示的是重组型李斯特菌溶血素LLO的核苷酸序列(LLO540)[0094] SEQ ID NO:4所示的是重组型李斯特菌溶血素LLO的氨基酸序列(LLO540)[0095] SEQ ID NO:5所示的是LLO28的氨基酸序列
[0096] SEQ ID NO:6所示的是LLO28的核苷酸序列
[0097] SEQ ID NO:7所示的是OVA28的未优化的核苷酸序列
[0098] SEQ ID NO:8所示的是OVA28优化后的核苷酸序列
[0099] SEQ ID NO:9所示的是OVA28优化后的氨基酸序列
[0100] SEQ ID NO:10所示的是OVA8的氨基酸序列
[0101] SEQ ID NO:11所示的是OVA8的核苷酸序列
[0102] SEQ ID NO:12所示的是5’端同源核苷酸序列
[0103] SEQ ID NO:13所示的是3’端同源核苷酸序列
[0104] SEQ ID NO:14所示的是连接序列的氨基酸序列
[0105] SEQ ID NO:15所示的是OVA8和连接序列相连的氨基酸序列
[0106] SEQ ID NO:16所示的是OVA28和连接序列相连的氨基酸序列
[0107] 在本公开的一个实施方案中，所述李斯特菌溶血素(LLO)多肽和如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比，具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％(包括这些数值之间所有范围和百分数)的氨基酸同一性的李斯特菌溶血素(LLO)多肽。上述李斯特菌溶血素(LLO)多肽具有特定百分数的同一性指的是，李斯特菌溶血素(LLO)多肽存在可正常维持蛋白质的功能的保守突变。
[0108] 在本公开的一个实施方案中，所述李斯特菌溶血素(LLO)多肽为如SEQ ID NO:3所示的多肽。
[0109] 在本公开的一个技术方案中，为了建立预存免疫力，本公开的方法包括用适于诱导针对目标癌细胞的免疫反应的异源性抗原给哺乳动物接种疫苗的步骤。在一个实施例中，所述异源性抗原选自肿瘤抗原。例如，肿瘤抗原可以是肿瘤相关抗原(TAA)，例如在引发哺乳动物的免疫应答的肿瘤细胞中产生的物质。这类抗原的实例包括癌胚抗原(oncofetal antigen)(例如甲胎蛋白，AFP)和癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、表面糖蛋白(例如CA125)、癌基因(例如Her2)、黑素瘤相关抗原(例如多巴色素互变异构酶(DCT))、GP100和MART1、癌-睾丸抗原(cancer-testes antigen)(例如MAGE蛋白和NY-ESO1)、病毒癌基因(例如HPV E6和E7)、在通常限于胚胎组织或胚外组织的肿瘤中异位表达的蛋白质(例如PLAC1)。正如本领域技术人员应理解的一样，可根据待采用本公开的方法治疗的癌症的类型选择抗原，因为一种或多种抗原可能特别适用于治疗某些癌症。例如对于治疗黑素瘤，可以使用黑素瘤相关抗原，例如DCT。在另一个实施例中，所述异源性抗原选自非肿瘤抗原。例如，非肿瘤抗原选自OVA。
[0110] 可以给予抗原本身，或者优选通过载体给予抗原，例如腺病毒(Ad)载体、痘病毒载体或反转录病毒载体、质粒或荷载的抗原呈递细胞，例如树突细胞。将抗原引入载体的方法为本领域技术人员所知。一般而言，可对载体进行修饰以表达抗原。在这一方面，使用广为接受的重组技术，将编码选定抗原的核酸整合到选定载体上。
[0111] 用以下若干方法的任一种将抗原或疫苗给予哺乳动物，包括但不限于静脉内、肌内或鼻内。正如本领域技术人员应理解的一样，可在合适的溶媒(例如盐水或其它合适的缓冲液)中给予抗原或掺有抗原的载体。在用选定肿瘤抗原接种后，在免疫应答间隔期内，例如约4天内并延长达数月、数年或可能终身，哺乳动物产生免疫应答。
[0113] 另一方面，所述组合物是药学上可接受的组合物。所述组合物还可包括第二抗癌剂，例如化学治疗剂、放射治疗剂或免疫治疗剂。
[0114] 本公开的另一个技术方案涉及杀死增生性细胞的方法，该方法包括将该细胞与本公开所述的分离的疫苗组合物接触。
[0115] 本公开的另一个技术方案涉及癌症患者的治疗，包括施用有效量的本公开所述的疫苗组合物。
[0116] 在本公开的某些方面，可将细胞包括在患者体内，该细胞可为增生性的、瘤性的、前癌性的、转移性的细胞。施用可为口服、腹膜内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、皮下、经皮、鼻腔或经直肠施用。在某些方面，组合物被系统性施用，特别是通过血管内施用，包括注射、灌注等施用方式。
[0117] 本公开的一个技术方案中，分子克隆和载体构建方法是本领域公知的，任何这种方法都可用于产生构建体以提供元件如双链断裂诱导酶，人工靶位点，靶向载体，细胞增殖因子或任何其它的有用元件。使用标准分子生物学技术进行载体构建。可以使用任何转化方法，载体构建和/或插入制品可以据此修饰。
[0118] 本公开的另一个技术方案，异源性抗原可以插入如SEQ ID NO:1所示的野生型李斯特菌溶血素O(LLO)多肽中的任意位点。可选的，本公开的异源性抗原可以插入如SEQ ID NO:1所示的野生型李斯特菌溶血素O(LLO)多肽的第514、515、516、517、518、519、520、521、522、523、524、525、526、527、528、529位氨基酸位点之前。在一个实施例中，本公开的异源性抗原可以插入如SEQ ID NO:1所示的李斯特菌溶血素O(LLO)多肽的第523位和第524位氨基酸之间。
[0119] 本公开的另一个技术方案中，异源性抗原可以插入如SEQ ID NO:3所示的重组李斯特菌溶血素O(LLO)多肽中的任意位点。在一个实施例中，本公开的编码异源性抗原的氨基酸序列可以替换如SEQ ID NO:3所示的重组李斯特菌溶血素O(LLO)多肽的第533位至第534位氨基酸序列。
[0120] 本公开的另一个技术方案中，异源性抗原为鸡卵白蛋白(OVA)。在一个技术方案中，重组至LLO多肽中的OVA长度为2-40个氨基酸；在另一个技术方案中，重组至LLO多肽中的OVA长度为5-35个氨基酸；在另一个技术方案中，重组至LLO多肽中的OVA长度为8-28个氨基酸。在一个技术方案中，重组至LLO多肽中的OVA的序列为OVA248-275(即本公开中的OVA28)，在另一个技术方案中，重组至LLO多肽中的OVA的序列为OVA258-265(即本公开中的OVA8)。
[0121] 在一个实施例中，本公开还包括重组至载体(疫苗)中的连接肽。在一个实施例中，所述连接肽的序列选自连接至融合蛋白的(G4S)2序列。在另一个技术方案中，所述融合蛋白的两端均连接有连接肽；可选的，所述连接肽的序列选自(G4S)2序列。
[0122] 实施例
[0123] 本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
[0124] 除非有明确的具体相反表述，否则本公开的所有实施例涉及的技术方案中，OVA的插入位点均位于相对于如SEQ ID NO:1所示的野生型LLO多肽的氨基酸序列的第523位和第524位氨基酸之间。
[0125] 除非有特别说明，否则本公开中采用的所有试剂和原料均可以通过商业渠道购买。
[0126] 本公开采用的主要试剂如下：质粒小量提取试剂盒(AXYGEN)，胶回收试剂盒(AXYGEN)，Q5PCR高保真酶(NEB)，T4DNA ligase(NEB)，Ezmax One-Step克隆试剂盒(tolo bio)，Human IFN-γELISPOT Set(BD)，电穿孔仪(Bio-Rad)。
[0127] 实施例1：减毒李斯特菌的质粒的构建
[0128] 本公开中采用减毒的李斯特菌作为制备疫苗的载体菌株。示例性的，本公开用做疫苗的菌株采用的是Lm 10403SΔactA(前述菌株的构建方法可以示例性的参考下述文献：Shen H et.al.，PNAS，92(9):3987-91，1995)，该菌缺失actA基因，使得侵染宿主细胞的菌体不能通过其特有的肌动蛋白尾向临近细胞传播扩散，从而大大减弱其毒性及致病性。相
4 8
比野生型菌株Lm10403S(LD50为1x 10)，Lm-ΔactA的LD50为0.5-1x10 ，被证明是高度减毒的。同时该菌保留了完整的LLO逃逸出溶酶体的能力，进入宿主细胞胞浆中快速增殖，并表达蛋白激活特异的T细胞免疫应答。
4 8
比野生型菌株Lm10403S(LD50为1x 10)，Lm-ΔactA的LD50为0.5-1x10 ，被证明是高度减毒的。同时该菌保留了完整的LLO逃逸出溶酶体的能力，进入宿主细胞胞浆中快速增殖，并表达蛋白激活特异的T细胞免疫应答。
[0129] 本公开用做表达抗原基因的质粒基本构成如下：
[0130] (1)维持质粒复制稳定的基本序列：示例性的，本公开采用了pAM401作为质粒的基本序列；
[0131] (2)转录抗原基因的启动子：示例性的，本公开采用了Phly，即Lm染色体上毒力岛LLO的启动子；
[0132] (3)表达分泌抗原蛋白到李斯特菌外的信号肽序列：示例性的，本公开采用了LLO信号肽序列，例如LLO1-28所示的序列，及LLO22-529，用于增加外源蛋白的表达量；
[0133] (4)李斯特菌属于原核细胞，而通常需要用作肿瘤疫苗的抗原肽属于真核细胞，需要进行相应密码子优化方能在原核细胞中表达真核细胞蛋白。示例性的，本公开采用了如SEQ ID NO:8所示的优化序列；
[0134] (5)检测分泌蛋白的标签序列：示例性的，本公开采用了His tag作为标签序列；
[0135] (6)用于抗原肽插入的酶切位点：示例性的，本公开采用了PstI作为酶切位点。
[0136] 示例性的，本公开构建质粒pAM401-Phly-LLO1-28-BamHI-LLO22-523-PstI-LLO524-529-His的方法如下：在质粒pAM401-Phly-LLO1-28-BamHI基础上，以BamHI为酶切位点，将基因合成的BamHI-LLO22-529-His-BamHI序列通过酶切酶连反应构建在该载体上，得到pAM401-Phly-LLO1-28-BamHI-LLO22-529-His-BamHI，为添加外源基因插入位点，选择在LLO523-524位置设计上下游引物，通过PCR反应，在LLO523和LLO524之间插入PstI酶切位点。
[0137] 通过上述方法构建的用做表达抗原基因的质粒结构示意图如图1所示。
[0138] 实施例2：用于疫苗的减毒李斯特菌的质粒的构建
[0139] 构建李斯特菌疫苗质粒需要将抗原基因插入到质粒载体中，载体上已设计有酶切位点，目的抗原的基因序列通过公司进行基因密码子优化后合成。
[0140] 可选的，OVA28密码子优化过程如下：
[0141] 进行相应密码子优化前的小鼠OVA28核苷酸序列(SEQ ID NO:7)：
[0142] GATGAAGTCTCAGGCCTTGAGCAGCTTGAGAGTATAATCAACTTTGAAAAACTGACTGAATGGACCAGTTCTAATGTTATGGAA
[0143] 进行相应密码子优化后的OVA28核苷酸序列(SEQ ID NO:8)：
[0144] GATGAAGTGAGCGGCCTGGAGCAGCTGGAGAGCATTATCAACTTCGAAAAACTGACCGAGTGGACCAGCAGCAATGTGATGGAA
[0145] 使用基于一定同源序列的同源重组技术将产物克隆到pAM401-phly-LLO1-28-BamHI-LLO22-523-PstI-LLO524-540-His载体(简称PstI载体质粒)上的PstI位点，其同源序列为：5’端同源序列(CCGAAATATAGTAATAAACTGCAG，SEQ ID NO:12)；3’端同源序列(CTGCAGGTAGATAATCCAATCGAA，SEQ ID NO:13)
[0146] 主要步骤如下：
[0147] PstI载体质粒20μl PstI单酶切体系：
[0148]PstI质粒 2μg
PstI限制性内切酶 2μl
10x NEB缓冲液3.1 2μl
去离子水 补齐至20μl
PstI限制性内切酶 2μl
10x NEB缓冲液3.1 2μl
去离子水 补齐至20μl
[0149] 37℃水浴锅，反应10min。
[0150] 将酶切产物进行DNA回收纯化，即酶切线性化PstI载体
[0151] 由以下(1)-(5)组份，得到同源重组20μl体系：
[0152] (1)酶切线性化的PstI载体
[0153] (2)外源PCR片段，两端含同源序列
[0154] (3)5x缓冲液：4μl
[0155] (4)反应酶：2μl
[0156] (5)ddH2O：补齐至20μl
[0157] 37℃水浴30分钟后转化E.coli感受态，涂布抗性平板，筛选单克隆进行测序验证。
[0158] 实施例3：减毒的李斯特菌疫苗的制备
[0159] 将测序验证正确的用于疫苗的减毒李斯特菌的质粒通过电转化技术，转化到减毒李斯特菌株中，挑选单克隆进行后续质粒及表达验证。
[0160] 上述电转化的具体步骤如下：
[0161] (1)电转化感受态的制备
[0162] (i)过夜培养的李斯特菌以1:50-1:200的比例转接到100-250ml的脑-心浸出液肉汤培养基(BHI)中，37℃振荡培养至OD600值0.2-0.25；
[0163] (ii)加入盘尼西林(PNG)至终浓度10μg/ml，继续培养约两个小时；
[0164] (iii)4℃高速离心5-10分钟收集菌体；
[0165] (iv)用200ml 10％甘油重悬菌体，洗涤两次；
[0166] (v)用45ml 10％甘油重悬菌体，并加入无菌的溶菌酶溶液，终浓度10μg/ml，常温20分钟，每隔10分钟颠倒混匀一次；
[0167] (vi)在4℃环境下，高速离心10分钟收集菌体，再用20ml 10％甘油洗涤菌体一次；
[0168] (vii)用1ml 10％甘油重悬菌体，50μl/管分装，-80℃保存。
[0169] (2)确定最适电转化条件：
[0170] (i)取一管感受态细胞，化冻，置于冰上；
[0171] (ii)将1μg待转的质粒加入感受态细胞中，混匀。
[0173] (iv)用BHI培养基重悬，常温静置1小时；
[0174] (v)将菌体涂布BHI+抗性平板，37℃倒置培养过夜，挑取单菌落验证。
[0175] 验证通过的菌株/菌落可以作为减毒的李斯特菌疫苗。
[0176] 实施例4：减毒李斯特菌外源蛋白表达的改进及检测
[0177] 经BHI液体培养基常温培养过夜的李斯特菌，离心去除菌体，上清加入TCA(三氯乙酸)/丙酮溶液，在-20℃条件下进行沉淀。超高速离心收集沉淀蛋白，丙酮洗涤两次，去除残留TCA。用含0.01N NaOH的蛋白上样缓冲液溶解沉淀。煮沸变性蛋白后上样，通过蛋白所接的tag，进行Western blot检测蛋白表达量。在一个技术方案中，上述tag选自flag tag或His tag。
[0178] 实施例5：培养温度对蛋白表达分泌的影响
[0179] 在实施例2得到的质粒的基础上，通过本领域的常规生物学方法，得到实施例5所采用的相应质粒。将转染pAM-hly-LLO540-Flag质粒的减毒Lm按照1:100接种至含氯霉素抗性的10ml BHI(脑心浸液肉汤)液体培养基，分别在30℃和37℃恒温摇床230rpm摇培12-14h。随后将菌液高速离心10min，取上清后加入TCA(三氯乙酸)/丙酮溶液，混匀后-20℃沉淀。随后超高速离心收集蛋白，去上清，沉淀用丙酮洗涤两次。最后使用含0.01N NaOH的蛋白Loading Buffer重悬沉淀，98℃金属浴变性5min，-80℃冰箱保存。蛋白检测使用Western blot实验检测，使用Anti-Flag-HRP抗体检测。
[0180] 实验结果如图2所示。实验结果显示，培养温度对蛋白表达有比较明显的影响，37℃培养明显比30℃培养表达量高，因此李斯特菌后续实验采用37℃为培养条件。
[0181] 实施例6：LLO全长和常规LLO信号肽对于外源蛋白表达的影响
[0182] 在实施例2得到的质粒的基础上，通过本领域的常规生物学方法，得到实施例6所采用的相应质粒。为进一步提高外源蛋白表达量，通过对比使用LLO28信号肽区段(pAM401-hly-LLO28-His)或含信号肽的全LLO540区段(pAM401-hly-LLO540-His)对于其后外源蛋白表达的影响，检测LLO全长是否比常规LLO信号肽更利于外源蛋白表达。
[0183] 将构建的pAM401-hly-LLO28-His或pAM401-hly-LLO540-His载体质粒电转化至减毒Lm菌株，将菌株按照1:100接种至含氯霉素抗性的10ml BHI(脑心浸液肉汤)液体培养基，于37℃恒温摇床230rpm摇培12-14h。随后将菌液高速离心10min，取上清后加入TCA(三氯乙酸)/丙酮溶液，混匀后-20℃沉淀。随后超高速离心收集蛋白沉淀，沉淀用丙酮洗涤两次。最后使用含0.01N NaOH的蛋白Loading Buffer重悬沉淀，98℃金属浴变性5min，-80℃冰箱保存。蛋白检测使用western blot实验检测，使用Anti-His-HRP抗体检测。
[0184] 实验结果如图3所示。结果显示LLO540实验组表达量明显高于LLO28实验组，因此此后实验采用LLO540全长序列带动外源蛋白表达，可获得理想的表达效果。
[0185] 实施例7：不同大小的抗原肽及有无G4S序列对表达载体的影响
[0186] 在实施例2得到的质粒的基础上，通过本领域的常规生物学方法，得到实施例7所采用的相应质粒。将分别构建的含有pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His、pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA8-(G4S)2-His、pAM401-hly-LLO540-OVA28-His质粒的减毒Lm菌株按照1:100接种至含氯霉素抗性的10ml BHI(脑心浸液肉汤)液体培养基，并以含pAM401-hly-LLO540-His载体的减毒Lm菌株为对照，于37℃恒温摇床230rpm摇培12-14h。随后将菌液高速离心10min，取上清后加入TCA(三氯乙酸)/丙酮溶液，混匀后-20℃沉淀。随后超高速离心收集蛋白沉淀，沉淀用丙酮洗涤两次。最后使用含0.01N NaOH的蛋白Loading Buffer重悬沉淀，98℃金属浴变性5min，-80℃冰箱保存。蛋白检测使用western blot实验检测，使用Anti-His-HRP抗体检测。
[0187] 实验结果如图4所示。结果显示含有(G4S)2-OVA28-(G4S)2、(G4S)2-OVA8-(G4S)2、OVA28序列的减毒Lm菌株均具有较高的表达量，其中含(G4S)2序列未对抗原肽表达产生影响，并且具有相对更高的蛋白表达水平；与此同时，不同大小的OVA抗原肽对表达影响也不大，均具有较高水平的表达量。表明本实验体系可适用于外源抗原肽的分泌表达。在本公开的一个技术方案中，可以使用(G4S)2做为连接肽。
[0188] 实施例8：用EG7-OVA皮下接种小鼠产生肿瘤，再用肿瘤疫苗治疗，检测抗肿瘤效果[0189] 在实施例2得到的质粒的基础上，通过本领域的常规生物学方法，得到实施例8所采用的相应质粒。对小鼠进行EG7-OVA肿瘤皮下接种，接种后第6天开始进行肿瘤测量，实验分成三组(pAM401对照组、pAM401-LLO540对照组、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2实验组)，第9天进行pAM401、pAM401-LLO540、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2三组肿瘤疫苗的尾静脉注射，注射剂量为107cfu(LmΔactA减毒李斯特菌小鼠半致死量LD50：108，因此选用0.1倍半致死量做为最高注射剂量)并持续跟踪测量。肿瘤大小跟踪测量24天，得到肿瘤曲线。与此同时，通过图基多重比较检验，分析第20、22、24天三组数据。
[0190] 肿瘤曲线结果如图5所示。可见OVA28治疗组相比pAM401、pAM401-LLO540两组在疫苗注射后肿瘤大小明显出现消除趋势。T检验分析结果如图6所示，显示实验组pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28与对照组pAM401、pAM401-LLO540相比均呈显著性差异，而pAM401-LLO540组与pAM401组无显著性差异。
[0191] 综合上述实验结果，可以通过李斯特菌携带抗原肽OVA28激活机体免疫系统，进而实现对EG7-OVA肿瘤的特异性抗肿瘤反应，而单独表达的LLO540并未参与抗原肽抗肿瘤免疫反应。
[0192] 实施例9：通过ELISPOT检测Lm OVA疫苗对小鼠体内特异性免疫反应的激活情况[0193] 在实施例2得到的质粒的基础上，通过本领域的常规生物学方法，得到实施例9所采用的相应质粒。实验分组为：pAM401对照组、pAM401-LLO540对照组、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2实验组以及阳性对照组OT1。OT1转基因小鼠其具有编码OVA特异性T细胞抗原受体的完整基因，因此选来做阳性对照，实验首先进行pAM401、pAM401-LLO540、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2三组肿瘤疫苗的尾静脉注射，疫苗注射第6天通过颌下取血分离外周血单个核细胞进行ELISPOT相关实验，取血过程通过加入EDTA作为抗凝剂，随后通过红细胞裂解液裂解红细胞，PBS洗两次400xg离心5min获得外周血单个核细胞，最终分别使用100μl的1640完全培养基(含10％FBS及1％双抗)重悬细胞加入ELISPOT预处理孔板中。随后通过在ELISPOT孔板中加入OVA多肽刺激外周血单个核细胞产生IFN-γ，最终通过酶联反应定量斑点数量以指示各组响应OVA多肽的特异性免疫反应情况(具体ELISPOT实验流程参照BDTM ELISPOT Mouse IFN-γELISPOT Set说明书，产品货号551083)。
[0194] 实验结果如图7所示。结果显示OT1阳性对照组出斑明显，表明实验操作没有问题，pAM401以及pAM401-LLO540对照组出斑数均在10以内，表明未出现明显特异性免疫反应，而相比之下pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2实验组出斑数均在200以上有明显ELISPOT反应，表明注射的LM-OVA28肿瘤疫苗可激活小鼠免疫系统的肿瘤特异性免疫应答，证明疫苗的功能性。
[0195] 实施例10：四聚体实验验证OVA28肿瘤疫苗在小鼠体内特异性免疫反应
[0196] 在实施例2得到的质粒的基础上，通过本领域的常规生物学方法，得到实施例10所采用的相应质粒。实验分组为：pAM401对照组、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2实验组以及OT1阳性对照组。将pAM401和pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2两组分别进行疫苗注射后第7天，颌下取血，进行OVA四聚体染色及流式抗体CD8-PB和CD3-PE染色，通过流式细胞仪进行检测。
[0197] 实验结果如图8所示。通过流式检测发现：OT1阳性对照组OVA特异性识别的CD8+T+细胞比例为95.34％，符合OT1特性表明实验操作无误，pAM401对照组OVA特异性识别的CD8T细胞比例为0.45％，pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2实验组OVA特异性识别的CD8+T细胞比例为25.96％明显高于对照组。表明通过注射高表达OVA28的Lm疫苗可激活C57小鼠体内特异性免疫反应，且有效提高OVA特异性识别的CD8+T细胞比例，增强OVA特异性肿瘤免疫反应。
[0198] 实施例11：检测B16-M30肿瘤疫苗对黑色素瘤的治疗效果
[0199] 在实施例2得到的质粒的基础上，通过本领域的常规生物学方法，得到实施例11所采用的相应质粒。首先通过在C57小鼠皮下接种B16细胞进行肿瘤模型建立。在肿瘤生长至第7天将B16-M30肿瘤疫苗通过小鼠尾静脉进行注射，实验共分三组：pAM401对照组、pAM401-LLO540对照组、pAM401-LLO540-(G4S)2-B16-M30-(G4S)2实验组，疫苗注射剂量为7
1x10cfu。在疫苗注射后第7天通过颌下取血，并通过红细胞裂解液裂解红细胞最终获得外周血单个核细胞进行ELISPOT实验，ELISPOT实验流程与实施例9一致。通过在ELISPOT孔板中加入B16-M30多肽刺激外周血单个核细胞产生IFN-γ，最终通过酶联反应定量斑点数量以指示各组响应B16-M30多肽的特异性免疫反应情况。
1x10cfu。在疫苗注射后第7天通过颌下取血，并通过红细胞裂解液裂解红细胞最终获得外周血单个核细胞进行ELISPOT实验，ELISPOT实验流程与实施例9一致。通过在ELISPOT孔板中加入B16-M30多肽刺激外周血单个核细胞产生IFN-γ，最终通过酶联反应定量斑点数量以指示各组响应B16-M30多肽的特异性免疫反应情况。
[0200] 实验结果如图9所示。结果显示pAM401对照组、pAM401-LLO540对照组均无明显B16-M30特异性免疫应答，而pAM401-LLO540-(G4S)2-B16-M30-(G4S)2实验组均产生较多IFN-γ特异性斑点，表明通过静脉注射B16-M30肿瘤疫苗可以激起小鼠体内产生B16-M30特异性抗肿瘤免疫应答，证明本方法构建的非整合减毒李斯特菌肿瘤疫苗有效性。
[0201] 实施例12：检测OVA28肿瘤疫苗的有效剂量和对小鼠体内肿瘤特异性免疫应答激活情况
[0202] 在实施例2得到的质粒的基础上，通过本领域的常规生物学方法，得到实施例12所采用的相应质粒。使用EG7-OVA细胞皮下接种20只C57小鼠进行肿瘤模型建立。通过将OVA28肿瘤疫苗以107为标准设立多个梯度剂量进行实验。实验共分四组：pAM401-LLO540 (107)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (107)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (106)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (105)。EG7-OVA肿瘤模型建立后第6天开始进行肿瘤测量，第7天进行疫苗尾静脉注射，并持续跟踪测量肿瘤大小生长曲线。
[0203] 在疫苗注射后第7天通过颌下取血，并通过红细胞裂解液裂解红细胞最终获得外周血单个核细胞进行ELISPOT实验。ELISPOT分组：以OT1小鼠为阳性对照，pAM401-LLO540组为实验对照组，实验组pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (107)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (106)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (105)各随机选取三只小鼠取血，每只小鼠取出的外周血单个核细胞均分成两份，一份使用OVA多肽刺激，一份未加入OVA多肽刺激，其余ELISPOT实验流程与实施例一一致。
[0204] 肿瘤大小生长曲线结果如图10所示。结果显示实验组pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (107)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (106)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (105)在第12天均开始出现肿瘤大小下降趋势，在第15天均出现肿瘤明显消除7 6 5
现象。实验表明OVA28肿瘤疫苗在注射剂量10cfu、10cfu、10cfu均具有明显消瘤功效。
现象。实验表明OVA28肿瘤疫苗在注射剂量10cfu、10cfu、10cfu均具有明显消瘤功效。
[0205] ELISPOT实验结果如图11所示。结果显示各组中未加入OVA多肽对照组均无ELISPOT反应，阳性对照组OT1加入OVA多肽刺激出现明显ELISPOT反应，pAM401-LLO540对照组加入多肽刺激未出现ELISPOT反应表明单独表达LLO不能激活机体OVA特异性免疫应答，7
而实验组pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (10)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (106)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (105)加入OVA刺激后均出现强烈的ELISPOT反应。实验表明OVA28肿瘤疫苗在注射剂量107cfu、106cfu、105cfu均能够激活小鼠体内OVA特异性肿瘤免疫反应。
而实验组pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (10)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (106)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (105)加入OVA刺激后均出现强烈的ELISPOT反应。实验表明OVA28肿瘤疫苗在注射剂量107cfu、106cfu、105cfu均能够激活小鼠体内OVA特异性肿瘤免疫反应。
[0206] 实施例13：检测OVA28肿瘤疫苗的最低有效剂量
[0207] 在实施例2得到的质粒的基础上，通过本领域的常规生物学方法，得到实施例13所采用的相应质粒。使用EG7-OVA细胞皮下接种25只C57小鼠进行肿瘤模型建立。本次实验通过将OVA28肿瘤疫苗以105为标准设立多个梯度剂量进行实验。实验共分五组：pAM401-LLO540(107)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (105)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (104)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (103)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)22
(10)。EG7-OVA肿瘤模型建立后第6天开始进行肿瘤测量，第8天进行疫苗尾静脉注射，并持续跟踪测量，测定肿瘤生长曲线。
(10)。EG7-OVA肿瘤模型建立后第6天开始进行肿瘤测量，第8天进行疫苗尾静脉注射，并持续跟踪测量，测定肿瘤生长曲线。
[0208] 在疫苗注射后第7天通过颌下取血，并通过红细胞裂解液裂解红细胞最终获得外周血单个核细胞进行ELISPOT实验，ELISPOT实验流程与实施例一一致。通过在ELISPOT孔板中加入OVA多肽刺激外周血单个核细胞产生IFN-γ，最终通过酶联反应定量斑点数量以指示各组响应OVA多肽的特异性免疫反应情况。
[0209] 肿瘤生长曲线实验结果如图12所示。结果显示实验组pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (105)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (104)在第13天开始出现肿瘤大小7
下降趋势，在第18天出现明显消瘤现象。而pAM401-LLO540 (10)对照组及pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (103)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (102)实验组肿瘤大小均呈现增长趋势并持续至第18天。实验表明OVA28肿瘤疫苗在注射剂量104cfu仍具有明显消瘤功效，而降低至103cfu、102cfu则没有抑制肿瘤药效。表明本实验方法下OVA28肿瘤疫苗最低有效剂量为104cfu。
下降趋势，在第18天出现明显消瘤现象。而pAM401-LLO540 (10)对照组及pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (103)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (102)实验组肿瘤大小均呈现增长趋势并持续至第18天。实验表明OVA28肿瘤疫苗在注射剂量104cfu仍具有明显消瘤功效，而降低至103cfu、102cfu则没有抑制肿瘤药效。表明本实验方法下OVA28肿瘤疫苗最低有效剂量为104cfu。
[0210] ELISPOT实验结果如图13所示。结果显示实验组pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (105)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (104)均出现强烈的ELISPOT反应，而pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (103)、pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2 (102)实验组则相对较弱。实验表明OVA28肿瘤疫苗在注射剂量104cfu也能够明显激活小鼠体内OVA特异性肿瘤免疫反应。
[0211] 实施例14：OVA28肿瘤疫苗与整合OVA的李斯特菌疫苗进行药效对比
[0212] 在实施例2得到的质粒的基础上，通过本领域的常规生物学方法，得到实施例14所采用的相应质粒。使用EG7-OVA细胞皮下接种20只C57小鼠进行肿瘤模型建立。实验共分四组：LMΔactA(pAM401)对照组(非整合型)、LMΔactA(pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2)实验组(非整合型)；LMΔactA对照组(整合型)、LM-OVAΔactA实验组(整合型)。EG7-OVA肿瘤模型建立后第6天开始进行肿瘤测量，第7天进行疫苗尾静脉注射(注射剂量105cfu)，并持续跟踪测量，测定肿瘤生长曲线。
[0213] 同样的采用ELISPOT进行功能学验证，在疫苗注射后第7天通过颌下取血，并通过红细胞裂解液裂解红细胞最终获得外周血单个核细胞进行ELISPOT实验，ELISPOT实验流程与实施例1一致。通过在ELISPOT孔板中加入OVA多肽刺激外周血单个核细胞产生IFN-γ，最终通过酶联反应定量斑点数量以指示各组响应OVA多肽的特异性免疫反应情况。接下来在12天分别摘眼球取血和取脾脏组织进行ELISPOT实验，外周血单个核细胞和之前实验一样接种细胞量为1～10x105，脾脏组织研磨后过75μm过滤器离心收集实验接种量为1x105以及
1x106。
1x106。
[0214] 肿瘤生长曲线实验结果如图14所示。LMΔactA(pAM401)对照组及LMΔactA对照组肿瘤大小均处于持续增长状态。LMΔactA(pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2)实验组在第11天肿瘤大小开始下降，在第17天肿瘤明显消除。LM-OVAΔactA实验组在疫苗注射后直到第19天肿瘤大小均得到控制，无明显生长也无明显消除。实验结果表明本实验方法下构建的OVA28非整合肿瘤疫苗较整合型OVA李斯特菌疫苗具有更好的消瘤功效。
[0215] 7天后ELISPOT实验结果如图15所示。对照组LMΔactA(pAM401)、LMΔactA及实验组LM-OVAΔactA均无明显ELISPOT反应，而LMΔactA(pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2)实验组有明显强烈ELISPOT反应。表明本实验方法下构建的OVA28非整合肿瘤疫苗较整合型OVA李斯特菌疫苗能更好的激活体内肿瘤特异性免疫反应。
[0216] 12天后ELISPOT实验结果如图16所示。与7天ELISPOT结果一致，实验组LM-OVAΔactA无明显ELISPOT反应，而LMΔactA(pAM401-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2)实验组在外周血单个核细胞及脾脏中均有明显强烈ELISPOT反应。
[0217] 实施例15：OVA28肿瘤疫苗为非整合型OVA李斯特菌疫苗
[0218] 取本公开前述实施例中得到的LM菌株，例如在一个技术方案中，取LM10403SΔactA(pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)菌株，摇菌过夜后，提取质粒并电转化至新的LM感受态中涂布CM抗性平板，并以未电转化的LM感受态菌株涂板为阴性对照。电转化的方法参见本公开实施例3中的相关方案。
[0219] 通过质粒电转化LM感受态方法，只有电转化质粒的LM才能在CM抗性下存活。前述涂布平板的结果如图17所示。
[0220] 对于涂布平板后得到的LM菌落，通过本领域的常规生物学方法，提取上述菌落中的菌株的全DNA，并以LM 10403SΔactA菌株为阴性对照，以质粒pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His为阳性对照，通过1％琼脂糖凝胶电泳，随后通过对凝胶上LM的基因组DNA和质粒DNA进行切胶回收，从而获得纯化的LM基因组DNA和质粒DNA。再分别以上述得到的纯化DNA为模板对OVA28序列通过PCR反应扩增后，通过琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。
[0221] 琼脂糖凝胶电泳的鉴定结果如图18-19所示。通过分子实验证明，以LM10403SΔactA(pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)菌株基因组DNA为模板PCR无目的基因序列，而以LM 10403SΔactA(pAM401-hly-LLO540-(G4S)2-OVA28-(G4S)2-His)菌株质粒DNA为模板PCR有大小正确的目的基因条带(目的条带大小为200bp，50bp处为引物二聚体)。上述实验结果表明目的基因只存在于质粒上而不会整合至基因组DNA中。因此证明利用本公开的方法构建得到的LM疫苗为非整合型LM疫苗。
[0222] 本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。
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