技术领域
[0001] 本
发明属于
微生物技术领域，具体涉及一株防治果蔬采后病害的生防真菌黑附球菌H5及其代谢产物的应用。
[0002] 背景介绍
[0003] 目前，我国每年采后约有8000万吨的果蔬腐烂，造成近800亿元的经济损失。因此，通过发展贮藏或防腐技术以延长或保持果蔬品质，已成为重要的食品科学研究课题。采后病原微生物的侵染是造成采后腐烂损失的最主要原因。其中，
植物病原真菌引起的病害占有较高比例，包括镰刀菌属、
灰葡萄孢属、青霉属、链格孢属等。
[0004] 目前，控制果蔬采后病害最有效的措施仍是化学
杀菌剂处理，但长期使用不但容易引起抗药性导致的防效降低，而且果蔬上
农药残留量增加容易带来
食品安全问题。果蔬采后
生物防治技术是利用微生物之间的拮抗作用，选择对农产品不造成危害的微生物或产物来抑制引起采后腐烂的病原微生物的生长，从而减少采后损失，是非常有发展潜
力的一种保鲜方法。采后病害生物防治的拮抗机理主要表现为抗生、竞争、寄生及诱导抗性等，其中，生防菌利用自身分泌的抗菌物质抑制病原菌生长是一种广谱高效的途径。
[0005] 要利用生物防治技术进行果蔬保鲜，关键是获得具有显著拮抗效果的微生物或其产物。黑附球菌属于半知菌亚
门附球菌属（Epicoccum Link），广泛存在于空气、
土壤及衰老或幼嫩的植物组织表面，能够在衰老的或刚死亡的植物组织表面迅速产生分生孢子，并能产生抗菌化合物，因此被广泛应用于防治
农作物病害。此外，针对黑附球菌属次生代谢产物的分离和提取、以及降解亚麻提取其中的
纤维素用于生产都是其应用领域研究的热点，但针对用于果蔬采后生物防治的应用，目前研究较少。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一株用于果蔬采后病害生物防治的黑附球菌H5，该菌株对镰刀菌属（Fusarium. spp）、灰葡萄孢属（Botrytis. spp）及链格孢属（Alternaria. spp）等真菌有较强拮抗作用，该菌株的分离为微生物源保鲜剂的研发提供了优秀的原材料。本发明提供的黑附球菌H5，属半知菌亚门附球菌属，分离自储藏期哈密瓜病变的表皮，于2014年10月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，分类命名为黑附球菌（Epicoccum nigrum），菌种保藏编号为CGMCC NO.9713，保藏日期为2014年10月8日，该菌株ITS基因序列如SEQ ID NO:1所示。
[0007] 本发明提供的黑附球菌H5的主要生物学特征为：在PDA培养基上生长时有气生菌丝，菌落呈土黄色，边缘不规则，有V形分支；分生孢子单生，球形或梨形，一般多胞，深金黄褐色，老熟后
颜色变深，通常成熟孢子直径15～25 μm，有时可达50 μm。
[0008] 本发明还提供了黑附球菌H5次生代谢产物及其制备方法。
[0009] 所述黑附球菌H5的次生代谢产物通过以下方法制得：黑附球菌H5菌株活化后接种至PD液体培养液，避光培养30天，过滤除菌，上清液即为含有次生代谢产物的生防菌液。
[0010] 所述黑附球菌H5的次生代谢产物还可通过以下方法制得：将活化后的黑附球菌H5接种至PD液体培养液中，25℃、200 rpm避光培养30天。将
发酵液过滤除去菌丝，加入等体积乙酸乙酯，在分液漏斗中萃取三次，合并萃取液，旋转
蒸发浓缩获得膏状物即为活性代谢产物，用蒸馏
水、甲醇或乙酸乙酯溶解。
[0011] 本发明提供的黑附球菌H5采用常规的菌种斜面保藏方法，采用培养基首选为
马铃薯琼脂培养基，即PDA固体培养基：马铃薯200 g/L，
葡萄糖20 g/L，琼脂粉16 g/L。在发酵培养时，可将斜面菌种直接接种至发酵培养基中，即PD液体培养液：马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L。25℃，175 rpm条件下避光摇培30天。
[0012] 本发明还提供了黑附球菌H5或其次生代谢产物在防治果蔬采后病害中的应用，所述的采后病害包括但不限于由镰刀菌属（Fusarium. spp）、灰葡萄孢属（Botrytis. spp）等真菌引起的果蔬灰霉病、腐败病等，如番茄灰霉病、莲蓬腐烂病、辣椒灰霉病等。
[0013] 本发明同时还提供了一种利用黑附球菌H5防治果蔬采后病害的方法，具体的应用方法如下：将黑附球菌H5活化、摇培，过滤离心得到含有活性代谢产物的生防菌液，将果蔬放入菌液中，浸泡30 s后取出、
风干，再置于
包装材料中，于室温或冷藏条件下贮藏。
[0014] 本发明同时还提供了一种利用黑附球菌H5次生代谢产物防治果蔬采后病害的方法，具体的应用方法如下：将水果放入制备好的生防菌液，或经水溶解的含有次生代谢产物的膏状提取物中，浸泡30 s后取出、风干，再置于
包装材料中，于室温或冷藏条件下贮藏。
[0015] 本发明提供的黑附球菌H5及其次生代谢产物可以明显抑制果蔬采后腐败病菌的生长，防止发生腐烂，并且绿色、无污染，对人畜及环境友好。
[0016] 本发明所述的用于植物病害生物防治的黑附球菌H5，相对于现有的菌株，具有如下优势（或特点）：黑附球菌H5培养简便，代谢产物产量较高；代谢产物对多种采后病原真菌均有显著抑制效果，表现出广谱高效的特点。
附图说明
[0017] 图1为本发明所述的黑附球菌菌株H5的菌落、菌丝形态及分生孢子图片；
[0018] 图2为本发明所述的黑附球菌菌株H5的进化关系图。
具体实施方式
[0019] 以下
实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的
修改或替换，均属于本发明的范围。
[0020] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0021] 实施例1黑附球菌菌株H5的分离和鉴定
[0022] 分离方法为：选取哈密瓜果实病斑处及周围的
果皮，加入到含有无菌水的250 mL三
角瓶中，同时加入3000单位的
链霉素，25℃于200 rpm摇培48 h。采用稀释平板法，吸取1 mL富集培养液加入到9 mL无菌水试管中，混匀后再次稀释，直至10-7稀释度，分别取10-5、10-6、10-7浓度的稀释液各100 µL涂布于PDA平板（PDA平板配方：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉16 g，蒸馏水1 L）上，置于25℃恒温
培养箱中培养48 h，挑取单菌落真菌至PDA平板上培养，单孢分离后于PDA斜面上4℃保存。其菌落、菌丝及孢子形态如图1所示：在PDA培养基上生长时有气生菌丝，菌落呈土黄色，边缘不规则，有V形分支；分生孢子单生，球形或梨形，一般多胞，深金黄褐色，老熟后颜色变深，通常成熟孢子直径15～25 μm，有时可达50 μm。该菌株ITS序列见SEQ ID NO:1，进化关系如图2所示。
[0023] 综合菌株H5的培养特征、形态特征及ITS基因序列，该菌株被鉴定为黑附球菌（Epicoccum nigrum），已于2014年10月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），菌种保藏编号为CGMCC NO.9713。
[0024] 实施例2：利用黑附球菌H5的发酵液进行番茄的采后病害防治方法
[0025] 将活化后的黑附球菌H5接种至PD液体培养液（马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L）中，25℃、200 rpm避光培养30天。无菌条件下将发酵液过滤除去菌丝即为生防菌发酵液。在番茄腰部用打孔器打3个直径为3 mm×3 mm的孔，每孔注入30 μL生防菌发酵液，对照组注入
30 μL无菌水，放置2 h后分别接种病原菌灰葡萄孢霉（Botrytis cinerea）的孢子悬液30 μ
6
L（1×10 CFU）。晾干后将果实置于铺有湿
滤纸的托盘上，保鲜膜封口保持95%的湿度，室温下贮藏3天后统计番茄果实的腐烂率。每个处理40个果实，实验重复3次。3天后统计番茄果实的腐烂率结果见下表1。
[0026] 表1黑附球菌H5发酵液对番茄灰霉病的抑制效果
[0027]
[0028] 评价：该生防真菌的发酵液对番茄灰霉病菌引起的腐烂有明显的抑制效果。
[0029] 实施例3：利用黑附球菌H5的发酵液进行莲蓬的采后病害防治方法
[0030] 将活化后的黑附球菌H5接种至PD液体培养液中，25℃、200 rpm避光培养30天。无菌条件下将发酵液过滤除去菌丝。将新鲜莲蓬浸入发酵液中30 s后取出晾干，对照组用无菌
水处理，分别往莲蓬上均匀喷洒30 μL镰刀菌分生孢子液（1×106 CFU）。晾干后将莲蓬置于铺有湿滤纸的托盘上，保鲜膜封口保持95%的湿度，室温下贮藏3天后统计莲蓬表面的发病情况，根据腐烂面积计算病情指数（1级：腐烂面积小于1/4；2级：腐烂面积约1/4—1/2；3级：腐烂面积约1/2—3/4；4级：腐烂面积超过3/4）。每个处理30个果实，实验重复3次。5天后统计莲蓬的病情指数结果见下表2。
[0031] 表2黑附球菌H5发酵液对莲蓬腐烂病的抑制效果
[0032]
[0033] 评价：该生防真菌的发酵液对莲蓬腐烂病菌引起的腐烂有明显的抑制效果。
[0034] 实施例4：从黑附球菌H5的发酵液中提取有效代谢产物的方法
[0035] 将活化后的黑附球菌H5接种至PD液体培养液中，25℃、200 rpm避光培养30天。将发酵液过滤除去菌丝，加入等体积乙酸乙酯，在分液漏斗中萃取三次，合并萃取液，
旋转蒸发浓缩获得膏状物即为活性代谢产物，产量可达336.2 mg/L。代谢产物可用蒸馏水、甲醇或乙酸乙酯溶解。
