一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法
阅读：852发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活 疫苗 联合免疫效果的方法，包括以下步骤：1）细胞培养；2）细胞接种，控制细胞 密度 ；3）将伪狂犬病活疫苗与猪脾转移因子上样于细胞培养板中，培养孵育细胞；4）将细胞用MTT溶液进行反应，继续孵育，然后用DMSO进行溶解处理，最后将细胞板放置与酶标仪中测量OD值，计算细胞活性。本发明方法具有检测背景低、灵敏度高、专属性强、准确度高、重复性好等优点，尤其适用于猪脾转移因子和伪狂犬病活疫苗联合免疫时 生物 活性的检测及 质量 标准的建立。，下面是一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法专利的具体信息内容。
1.一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：其包括以下步骤：
1）取伪狂犬病活疫苗原液，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释至含200TCID50的病毒液；
取猪脾转移因子，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释，将多肽含量稀释至1 mg/mL；
2）在含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基中将pk-15细胞培养至单层；
3) 取步骤2)中的单层细胞，用含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释，调整细胞浓度为2 3×105个/mL，将稀释后的细胞接种于细胞培养板~
中，继续培养；形成细胞单层后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞板，去除培养基；
4）将步骤1）稀释后的病毒液以及稀释后的猪脾转移因子上样于步骤3）的细胞培养板中，并培养孵育细胞；上样量为100 μL/孔，具体如下：
含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基40-50μL ；
病毒液15-25μL；
猪脾转移因子30-40 μL；
5) 将步骤4）孵育的细胞用MTT溶液进行反应，继续孵育；
6) 将步骤5）孵育的细胞用二甲基亚砜进行溶解处理；
7）将步骤6）处理后的细胞板放置于酶标仪中测量OD值，测定细胞活性。
2.根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤1）中，所述伪狂犬病活疫苗为Bartha-K61株。
3.根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤3）中，所述细胞培养板为96孔细胞培养板。
4.根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤3）中，细胞稀释的具体步骤如下：将步骤2)中的单层细胞用磷酸盐缓冲液洗2-3次，然后加入胰酶消化液使其布满所有细胞表面，于37℃放置数分钟，然后弃去消化液，用含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基将细胞洗脱，将洗脱后的细胞悬液进行稀释，调整细胞浓度为2 3×105个/mL。
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5.根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤3）中，稀释后的细胞培养条件为：细胞接种量100 μL/孔，在36.5-37.5℃、4.5-5.5 % CO2条件下培养18-24 h形成细胞单层。
6.根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤4）中，上样量具体如下：
含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基45μL ；
病毒液20μL；
猪脾转移因子35 μL。
7.根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤4）中，培养孵育细胞的条件为在36.5-37.5℃、4.5-5.5 % CO2条件下培养40-48 h 。
8.根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤5）中，细胞继续孵育的时间为3.5-4.5h。
9.根据权利要求1所述的一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法，其特征在于：步骤7）中，于480-500nm波长处测量OD值。
一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的
方法
技术领域
背景技术
[0002] 转移因子（Transfer Factor，TF）能调节动物机体免疫功能，协同疫苗免疫，缩短疫苗免疫应答期，提高动物免疫水平，具有非常广阔的应用前景。转移因子是存在于人和动物白细胞中的可透析小分子物质，能将供体所具有的细胞免疫功能转移给受体，从而非特异性地增强受体的免疫功能。转移因子的成分主要包括低聚核苷酸和多肽，能诱导机体免疫细胞活化，增强机体免疫力，能转移包括病毒、细菌、寄生虫、真菌、组织相容性抗原和肿瘤抗原等多种抗原的细胞免疫。此外，转移因子具有分子质量小、无毒、无抗原性、不引起过敏反应、不产生对抗抗体且可超越种系界限应用等优点。
[0003] 由于转移因子使用安全、作用迅速、效果显著、无药物残留、无抗原性、无毒副作用，且来源广，同时，其作为免疫激发剂和辅助制剂，可显著提高对动物疾病的防控效果，市场认可度逐渐提高。因此，转移因子在兽医临床领域，将逐步地释放其应用优势，转移因子产品的开发与应用将对畜牧业的发展具有十分重要的现实意义。
[0004] 伪狂犬病是由伪狂犬病毒引起的发生在多种家畜和野生动物体内的一种急性传染病，以发热、奇痒、脑脊髓炎为主要发病症状。伪狂犬病最早在1813年发生于英国的牛群中。Aujeszky、Schmiedhoffer和Sangirg相继发现并分离出PRV。成年猪常表现为隐性感染，妊娠母猪感染后可引起流产、死胎以及呼吸系统疾病症状，无奇痒。新生仔猪感染后除了出现神经症状外，还可侵害消化系统。本病呈世界性分布。猪既是本病原的原发感染宿主，又是病毒的长期贮存者和排毒者，在伪狂犬病的传播上起着重要作用。伪狂犬病给猪养殖业造成的危害仅次于猪瘟。
[0005] 大量的试验研究表明， 转移因子对伪狂犬病活疫苗具有协同作用，能显著提高机体细胞免疫水平，缩短机体免疫应答期，促进抗体的产生，并延长抗体高峰期，使之维持更长的时间。但目前检测转移因子与伪狂犬病活疫苗联合使用效果的主要通过检测抗体及细胞因子来展现，检测成本高、周期长且生物体个体差异大，检测结果较不稳定。因此建立一种快速、方便、检验成本低且检验结果相对稳定的检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法具有重要意义。
发明内容
[0006] 本发明目的在于提供一种在细胞上展现的、检验成本低且检验结果相对稳定的检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0008] 一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法，其包括以下步骤：
[0010] 取猪脾转移因子，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释将多肽含量稀释至1 mg/mL；
[0011] 2）在含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基中将细胞培养至单层；
[0012] 3) 取步骤2)中的单层细胞，用含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释，调整细胞浓度为2 3×105个/mL，将稀释后的细胞接种于细胞培养~板中，继续培养；形成细胞单层后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞板，去除培养基；
[0013] 4）将步骤1）稀释后的病毒液以及稀释后的猪脾转移因子上样于步骤3）的细胞培养板中，并培养孵育细胞；上样量为100 μL/孔，具体如下：
[0014] 含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基40-50μL ；
[0015] 病毒液15-25μL；
[0016] 猪脾转移因子30-40 μL；
[0017] 5) 将步骤4）孵育的细胞用MTT溶液进行反应，继续孵育；
[0018] 6) 将步骤5）孵育的细胞用二甲基亚砜进行溶解处理；
[0019] 7）将步骤6）处理后的细胞板放置于酶标仪中测量OD值，测定细胞活性。
[0020] 步骤1）中，所述伪狂犬病活疫苗为Bartha-K61株。
[0021] 步骤2）中，所述细胞为pk-15细胞。
[0022] 步骤3）中，所述细胞培养板为96孔细胞培养板。
[0023] 进一步，步骤3）中，细胞稀释的具体步骤如下：将步骤2)中的单层细胞用无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液洗2-3次，然后加入1.0 mL 胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液布满所有细胞表面，于37℃放置数分钟，然后弃去消化液，用含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基将细胞洗脱，将洗脱后的细胞悬液进行稀释，调整细胞浓度为2 3×105个/mL。~
[0024] 进一步，步骤3）中，稀释后的细胞培养条件为：细胞接种量100 μL/孔，在36.5-37.5℃、4.5-5.5 % CO2条件下培养18-24 h形成细胞单层。
[0025] 优选的，步骤4）中，上样量具体如下：
[0026] 含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基45μL ；
[0027] 病毒液20μL；
[0028] 猪脾转移因子35 μL（即猪脾转移因子的浓度为350μg/mL）。
[0029] 步骤4）中，培养孵育细胞的条件为在36.5-37.5℃、4.5-5.5 % CO2条件下培养40-48 h 。
[0030] 步骤5）中，细胞继续孵育的时间为3.5-4.5h。
[0031] 步骤7）中，于480-500nm波长处测量OD值。
[0032] 本发明采用以上方法对猪脾转移因子和伪狂犬病活疫苗联合免疫效果进行检测，和现有技术不同点在于，现有技术检测均在实体动物上（猪）检测，检验成本高，周期长且生物个体差异大易导致结果不稳定，而本发明方法是在细胞上展现，快速、方便，检验成本低，结果相对稳定。附图说明
[0033] 图1为不同TF浓度对pk-15细胞体外增殖的测定结果；上标“*”表示差异显著(P<0.05)；上标“**”表示差异极显著(P<0.01)；
[0034] 图2为不同体积疫苗稀释液对pk-15细胞体外增殖的测定结果；
[0035] 图3为8批TF溶液与伪狂犬病活疫苗联合使用时，细胞增殖的测定结果；上标“*”表示差异显著(P<0.05)；上标“**”表示差异极显著(P<0.01)。
具体实施方式
[0036] 一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法，包括以下步骤：
[0037] 1）取伪狂犬病活疫苗为（Bartha-K61株）原液，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释至含200 TCID50的病毒液；
[0038] 取猪脾转移因子，用含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释将多肽含量稀释至1 mg/mL；
[0039] 2）在含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基中将pk-15细胞培养至单层；
[0040] 3) 将步骤2）中的单层细胞用无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液洗2-3次，然后加入1.0 mL 胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液布满所有细胞表面，于37℃放置数分钟，然后弃去消化液，用含8-12%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基将细胞洗脱，将洗脱后的细胞悬液进行稀释，调整细胞浓度为2 3×105个/mL，将稀释后的细胞接~种于96孔细胞培养板中，100 μL/孔，在36.5-37.5℃、4.5-5.5 % CO2条件下培养20 h左右（18-24 h）形成细胞单层，然后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞板，去除培养基；
[0041] 4）将步骤1）稀释后的病毒液以及稀释后的猪脾转移因子上样于步骤3）的细胞培养板中，在36.5-37.5℃、4.5-5.5 % CO2条件下培养40-48 h；
[0042] 其中，上样量为100 μL/孔，具体如下：
[0043] 含1.8-2.2%新生牛血清、0.8-1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基40-50μL ；
[0044] 病毒液15-25μL（优选为20μL）；
[0045] 猪脾转移因子30-40 μL（优选为35μL）；
[0046] 5) 在步骤4）的细胞培养板中加入MTT溶液，10 μL/孔，继续孵育3.5-4.5h，然后弃去上清，加入二甲基亚砜溶液，100 μL/孔，缓慢摇匀10min；在480-500nm波长处测量每孔吸光值，测定细胞活性，与对照组相比，计算细胞增值率。
[0047] 实施例1
[0048] 一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法，包括以下步骤：
[0049] 1）取伪狂犬病活疫苗为（Bartha-K61株）原液，用含2%新生牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释至含200 TCID50的病毒液；
[0050] 取猪脾转移因子，用含2%新生牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释将多肽含量稀释至1 mg/mL；
[0051] 2）在含10%新生牛血清、1.0%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基中将pk-15细胞培养至单层；
[0052] 3) 将步骤2）中的单层细胞用无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液洗2次，然后加入1.0 mL 胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液布满所有细胞表面，于37℃放置数分钟，然后弃去消化液，用含10%新生牛血清、1.0%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基将细胞洗脱，将洗脱后的细胞悬液进行稀释，调整细胞浓度为2 3×105个/mL，将稀释后的细胞接种于96孔~细胞培养板中，100 μL/孔，在37℃、5.0 % CO2条件下培养20 h左右形成细胞单层，然后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞板，去除培养基；
[0053] 4）将步骤1）稀释后的病毒液以及稀释后的猪脾转移因子上样于步骤3）的细胞培养板中，在37℃、5.0 % CO2条件下培养44 h；
[0054] 其中，上样量为100 μL/孔，具体如下：
[0055] 含2%新生牛血清、1.0%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基45μL ；
[0056] 病毒液20μL；
[0057] 猪脾转移因子35 μL；
[0058] 5) 在步骤4）的细胞培养板中加入MTT溶液，10 μL/孔，继续孵育4h，然后弃去上清，加入二甲基亚砜溶液，100 μL/孔，缓慢摇匀10min；在490nm波长处测量每孔吸光值，测定细胞活性。
[0059] 实施例2
[0060] 一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法，包括以下步骤：
[0061] 1）取伪狂犬病活疫苗为（Bartha-K61株）原液，用含1.8%新生牛血清、0.8%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释至含200 TCID50的病毒液；
[0062] 取猪脾转移因子，用含1.8%新生牛血清、0.8%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释将多肽含量稀释至1 mg/mL；
[0063] 2）在含8%新生牛血清、0.8%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基中将pk-15细胞培养至单层；
[0064] 3) 将步骤2）中的单层细胞用无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液洗2次，然后加入1.0 mL 胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液布满所有细胞表面，于37℃放置数分钟，然后弃去消化液，用含8%新生牛血清、0.8%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基将细胞洗脱，将洗脱后的细胞悬液进行稀释，调整细胞浓度为2 3×105个/mL，将稀释后的细胞接种于96孔~细胞培养板中，100 μL/孔，在36.5℃、4.5 % CO2条件下培养20 h左右形成细胞单层，然后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞板，去除培养基；
[0065] 4）将步骤1）稀释后的病毒液以及稀释后的猪脾转移因子上样于步骤3）的细胞培养板中，在36.5℃、4.5 % CO2条件下培养48 h；
[0066] 其中，上样量为100 μL/孔，具体如下：
[0067] 含1.8%新生牛血清、0.8%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基40μL ；
[0068] 病毒液20μL；
[0069] 猪脾转移因子40 μL；
[0070] 5) 在步骤4）的细胞培养板中加入MTT溶液，10 μL/孔，继续孵育3.5h，然后弃去上清，加入二甲基亚砜溶液，100 μL/孔，缓慢摇匀10min；在490nm波长处测量每孔吸光值，测定细胞活性。
[0071] 实施例3
[0072] 一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法，包括以下步骤：
[0073] 1）取伪狂犬病活疫苗为（Bartha-K61株）原液，用含2.2%新生牛血清、1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释至含200 TCID50的病毒液；
[0074] 取猪脾转移因子注射液，用含2.2%新生牛血清、1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基稀释将多肽含量稀释至1 mg/mL；
[0075] 2）在含12%新生牛血清、1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基中将pk-15细胞培养至单层；
[0076] 3) 将步骤2）中的单层细胞用无钙、镁离子的磷酸盐缓冲液洗2次，然后加入1.0 mL 胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液布满所有细胞表面，于37℃放置数分钟，然后弃去消化液，用含12%新生牛血清、1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基将细胞洗脱，将洗脱后的细胞悬液进行稀释，调整细胞浓度为2 3×105个/mL，将稀释后的细胞接种于96孔~细胞培养板中，100 μL/孔，在37.5℃、5.5 % CO2条件下培养20 h左右（18-24 h）形成细胞单层，然后用磷酸盐缓冲液洗涤细胞板，去除培养基；
[0077] 4）将步骤1）稀释后的病毒液以及稀释后的猪脾转移因子注射液上样于步骤3）的细胞培养板中，在37.5℃、5.5 % CO2条件下培养40- h；
[0078] 其中，上样量为100 μL/孔，具体如下：
[0079] 含2.2%新生牛血清、1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基50μL ；
[0080] 病毒液20μL；
[0081] 猪脾转移因子注射液30 μL；
[0082] 5) 在步骤4）的细胞培养板中加入MTT溶液，10 μL/孔，继续孵育4.5h，然后弃去上清，加入二甲基亚砜溶液，100 μL/孔，缓慢摇匀10min；在490nm波长处测量每孔吸光值，测定细胞活性。
[0083] 实施例4
[0084] 一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法，其具体步骤同实施例1，区别在于：
[0085] 步骤4）中，上样量为100 μL/孔，具体如下：
[0086] 含2.2%新生牛血清、1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基40μL；
[0087] 病毒液25μL；
[0088] 猪脾转移因子35 μL。
[0089] 实施例5
[0090] 一种检测猪脾转移因子与伪狂犬病活疫苗联合免疫效果的方法，其具体步骤同实施例1，区别在于：
[0091] 步骤4）中，上样量为100 μL/孔，具体如下：
[0092] 含2.2%新生牛血清、1.2%青霉素-链霉素双抗的完全DMEM培养基45μL ；
[0093] 病毒液15μL；
[0094] 猪脾转移因子40 μL。
[0095] 实施例6
[0096] 猪脾转移因子对细胞体外增殖的最优浓度确定
[0097] 本发明中，步骤4）中加入细胞培养板中的猪脾转移因子为每孔30-40μL，优选为35μL，即猪脾转移因子的优选浓度为350 μg/mL，该最佳浓度是通过以下方法筛选确定的：
[0098] 1、培养基配制
[0099] 取DMEM培养基，加入青霉素-链霉素双抗及新生牛血清，配置成含1 % 青霉素-链霉素双抗和10 %新生牛血清的DMEM培养基(以下简称10 % DMEM培养基)及含1 % 青霉素-链霉素双抗和2 %新生牛血清的DMEM培养基(以下简称2 % DMEM培养基)，置于4℃保存。
[0100] 2、细胞培养
[0101] 将生长旺盛的pk-15单层细胞用无钙、镁离子的PBS洗2次，加入1.0 mL 胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液布满所有细胞表面。于37℃放置数分钟。弃去消化液，用10 % DMEM培养基将细胞洗脱。将洗脱后的细胞悬液用10 % DMEM培养基进行稀释，调整细胞浓度为2~3×105个/mL。将稀释好的细胞接种于96孔细胞培养板，100 μL/孔。在37℃、5 % CO2条件下培养20 h左右形成细胞单层。
[0102] 3、待检样品稀释
[0103] 取猪脾转移因子，用含2 %血清的DMEM培养基将多肽含量稀释至1 mg/mL，作待检样品。
[0104] 取取伪狂犬病活疫苗为（Bartha-K61株）原液，用含2%血清的DMEM培养基稀释至含200 TCID50的病毒液。
[0105] 4、取猪脾转移因子（TF）对细胞体外增殖的最优浓度确定
[0106] TF浓度设计7个水平，分别是：200 μg/mL、250 μg/mL、300 μg/mL、350 μg/mL、400 μg/mL、450 μg/mL、500 μg/mL。在96 孔细胞培养板上进行细胞增殖试验。试验设2个组别，1个试验组(细胞+TF)，1个对照组(细胞)，每个样品设4个重复孔。试验结果用MTT法测定。测出OD490值后，计算出细胞增殖率，选出TF浓度最佳值。
[0107] 计算细胞增殖率公式如下：细胞增殖率=试验组OD值/对照组0D值。
[0108] 5、实验结果
[0109] 每次试验在相同培养环境下，共选用3批TF溶液，确定TF对pk-15细胞体外增殖的最优浓度，试验共进行五次。
[0110] TF浓度对pk-15细胞体外增殖率的测定结果如图1所示，由图1确定TF对pk-15细胞体外增殖的最优浓度350 μg/mL。
[0111] 实施例7
[0112] 疫苗稀释液（病毒液）对细胞体外增殖的最优体积确定
[0113] 本发明中，步骤4）中加入细胞培养板中的疫苗稀释液为每孔15-25μL，优选为20μL，该最佳体积是通过以下方法筛选确定的：
[0114] 1、培养基配制
[0115] 取DMEM培养基，加入青霉素-链霉素双抗及新生牛血清，配置成含1 % 青霉素-链霉素双抗和10 %新生牛血清的DMEM培养基(以下简称10 % DMEM培养基)及含1 % 青霉素-链霉素双抗和2 %新生牛血清的DMEM培养基(以下简称2 % DMEM培养基)，置于4℃保存。
[0116] 2、细胞培养
[0117] 将生长旺盛的pk-15单层细胞用无钙、镁离子的PBS洗2次，加入1.0 mL 胰酶消化液，轻轻摇动培养皿，使消化液布满所有细胞表面。于37℃放置数分钟。弃去消化液，用10 % DMEM培养基将细胞洗脱。将洗脱后的细胞悬液用10 % DMEM培养基进行稀释，调整细胞浓度为2~3×105个/mL。将稀释好的细胞接种于96孔细胞培养板，100 μL/孔。在37℃、5 % CO2条件下培养20 h左右形成细胞单层。
[0118] 3、猪脾转移因子稀释
[0119] 取猪脾转移因子，用含2 %血清的DMEM培养基将多肽含量稀释至1 mg/mL。
[0120] 取取伪狂犬病活疫苗为（Bartha-K61株）原液，用含2%血清的DMEM培养基稀释至含200 TCID50的病毒液。
[0121] 4、疫苗稀释液对细胞体外增殖的最优体积确定
[0122] 疫苗体积设计9个水平，分别是：10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL、35 μL、40 μL、45 μL、50 μL。在96 孔细胞培养板上进行细胞增殖试验。试验设2个组别，1个试验组(细胞+转移因子+疫苗)，1个对照组(细胞+转移因子)，每个样品设4个重复孔。试验结果用MTT法测定。测出OD490值后，计算出细胞增殖率，选出疫苗体积最适值。
[0123] 计算细胞增殖率公式如下：细胞增殖率=试验组OD值/对照组0D值。
[0124] 5、实验结果
[0125] 疫苗稀释液体积对pk-15细胞体外增殖率的测定结果如图2所示，由图2确定疫苗稀释液对pk-15细胞体外增殖的最优体积为20 μL。
[0126] 实施例8
[0127] 猪脾转移因子（TF）和伪狂犬病活疫苗联合使用对pk-15细胞的作用
[0128] 在TF浓度最佳值以及疫苗稀释液（病毒液）对细胞体外增殖的最优体积确定的条件下，取已长成单层细胞的96孔板，试验按照以下设计进行：
[0129] 对照组：80 μL 2% DMEM培养基+20 μL伪狂犬病毒液；
[0130] 试验组：45μL 2% DMEM培养基+20μL伪狂犬病毒液+35 μL 猪脾转移因子；
[0131] 每组设4孔重复。置于37℃、5% CO2条件下培养44 h，加入MTT溶液，10μL/孔，继续培养4 h，弃去上清，加入DMSO溶液，100 μL/孔，缓慢摇匀10 min。在490 nm处测量每孔吸光值，计算细胞增殖率。
[0132] 不同批次TF联合伪狂犬病活疫苗使用对pk-15的作用结果如图2。试验共选用8批TF溶液进行，根据统计学T检验，试验组与对照组比较，2017002批、2017003批、2017008批及2017011批TF联合伪狂犬病活疫苗使用时，pk-15增殖率升高，差异极显著(P<0.01)；
2017007批、2017010批、2017022批TF联合伪狂犬病活疫苗使用时，pk-15增殖率显著升高 (P<0.01)；2017008批TF与伪狂犬病活疫苗联合使用时，pk-15增殖率可达到134.59%。不同批次TF与伪狂犬病活疫苗联合使用时，pk-15增殖率平均值为125.15%±6.58%。
2017007批、2017010批、2017022批TF联合伪狂犬病活疫苗使用时，pk-15增殖率显著升高 (P<0.01)；2017008批TF与伪狂犬病活疫苗联合使用时，pk-15增殖率可达到134.59%。不同批次TF与伪狂犬病活疫苗联合使用时，pk-15增殖率平均值为125.15%±6.58%。
[0133] 本发明应用MTT法测定了TF溶液对pk-15细胞增殖的影响，结果发现，当TF浓度为350 μg/ml时，试验组pk-15细胞的增殖速度极显著高于对照组（P<0.01），且在五次重复试验中试验组pk-15细胞的增殖速度相对稳定；当TF与伪狂犬病活疫苗联合使用时，其促进pk-15细胞的增殖效应比单独使用伪狂犬病活疫苗时刺激pk-15细胞增殖效果好。说明本发明方法可增强伪狂犬病活疫苗免疫效果，本发明的检测方法在细胞上展现，检验成本低，结果相对稳定。
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