一种丝状真菌的筛选培养基及其制备方法与应用
阅读：775发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种丝状真菌的筛选培养基及其制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种丝状 真菌 的筛选培养基及其制备方法与应用，属于 微 生物 技术领域。本发明的丝状真菌的筛选培养基包括 自下而上 依次设置的显色培养基、酶解培养基和营养培养基；所述显色培养基含有琼脂糖和 钙 离子指示剂，所述酶解培养基含有琼脂糖和植酸钙。本发明的筛选培养基具有独特的三层结构，采用该筛选培养基，筛选目标广，筛选效率高，能筛选出酶活更佳的丝状真菌。，下面是一种丝状真菌的筛选培养基及其制备方法与应用专利的具体信息内容。
1.一种丝状真菌的筛选培养基，其特征在于：包括自下而上依次设置的显色培养基、酶解培养基和营养培养基；所述显色培养基含有琼脂糖和钙离子指示剂，所述酶解培养基含有琼脂糖和植酸钙。
2.如权利要求1所述的丝状真菌的筛选培养基，其特征在于：所述显色培养基的制备原料含有：
(a)钙离子指示剂溶液，由钙离子指示剂和缓冲溶液组成，钙离子指示剂的质量与缓冲溶液的体积的比为0.1～2g：100mL；和
(b)琼脂糖溶液，由琼脂糖和缓冲溶液组成，琼脂糖的质量与缓冲溶液的体积的比为
0.2～1.0g：100mL；
所述(a)与(b)的体积比为1～10：100。
3.如权利要求2所述的丝状真菌的筛选培养基，其特征在于：所述钙离子指示剂为铬黑T。
4.如权利要求1所述的丝状真菌的筛选培养基，其特征在于：所述酶解培养基的制备原料含有：
(c)植酸钙悬浮液，所述植酸钙悬浮液中植酸钙的含量为0.02-0.2g/mL；和(b)琼脂糖溶液，由琼脂糖和缓冲溶液组成，琼脂糖的质量与缓冲溶液的体积的比为
0.2～1.0g：100mL；
所述(c)与(b)的体积比为1：10。
5.如权利要求2～4任一项所述的丝状真菌的筛选培养基，其特征在于：所述缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液的pH值为7.1-8.9。
6.如权利要求1所述的丝状真菌的筛选培养基，其特征在于：所述营养培养基含有无机盐和下述含量的组分：
7.如权利要求6所述的丝状真菌的筛选培养基，其特征在于：所述无机盐包括硝酸钾、硫酸铵、氯化钠和氯化镁；所述营养培养基中，2-脱氧葡萄糖的浓度为5-30mmol/L，植酸钙的含量为0.3-0.6％w/v。
8.如权利要求1所述的丝状真菌的筛选培养基，其特征在于：所述显色培养基的厚度为所述筛选培养基厚度的1/6-1/3；所述酶解培养基的厚度为所述筛选培养基厚度的1/4-1/
3；所述营养培养基的厚度为所述筛选培养基厚度的1/3-7/12。
9.一种如权利要求1～8任一项所述丝状真菌的筛选培养基的制备方法，其特征在于：
包括以下步骤：
显色培养基的制备：按照每100mL缓冲溶液加入0.1～2g钙离子指示剂的比例，将钙离子指示剂溶解于缓冲溶液中，过滤除菌，得到钙离子指示剂溶液；按照每100mL缓冲溶液加入0.2～1.0g琼脂糖的比例，将琼脂糖溶解于缓冲溶液中，灭菌后冷却，再加入制得的钙离子指示剂溶液，摇匀后倒板，得到显色培养基；
酶解培养基的制备：将植酸钙加入水中，浸泡过夜后，灭菌，冷却至室温，离心弃上清，得到植酸钙沉淀，加入水分散植酸钙沉淀，得到植酸钙悬浮液；按照每100mL缓冲溶液加入
0.2～1.0g琼脂糖的比例，将琼脂糖溶解于缓冲溶液中，灭菌后冷却，再加入制得的植酸钙悬浮液，摇匀后倒板，得到酶解培养基；
营养培养基的制备：将植酸钙溶解于水中，边搅拌边加入乳酸，得到混合溶液A；将2-脱氧葡萄糖溶解于水中，过滤后除菌，得到2-脱氧葡萄糖水溶液；将硝酸钾和氯化镁溶于水中，过滤除菌，得到混合溶液B；向混合溶液A中加入木糖、氯化钠和硫酸铵，定量、搅拌均匀，调节pH值后再加入琼脂糖，灭菌，冷却，得到混合溶液C；向混合溶液C中加入2-脱氧葡萄糖水溶液和混合溶液B，摇匀后倒板，得到营养培养基；
将酶解培养基加至冷却后的显色培养基上，得到预筛选培养基；
待酶解培养基冷却后，将营养培养基加至预筛选培养基中的酶解培养基上，得到所述丝状真菌的筛选培养基。
10.如权利要求1～8任一项所述丝状真菌的筛选培养基在筛选丝状真菌中的应用。
一种丝状真菌的筛选培养基及其制备方法与应用
技术领域
背景技术
[0002] 丝状真菌在食品加工业中用途十分广泛，许多酿造发酵食品及食品原料的制造，如豆腐乳、豆豉、酱、酱油、柠檬酸等都是在其参与下生产加工出来的。绝大多数丝状真菌能把所用加工原料中的淀粉、糖类等碳水化合物、蛋白质等含氮化合物及其它种类的化合物进行转化，制造出多种多样的食品、调味品及食品添加剂。在工业生产中，在不增加人力财力等投入情况下、而达到更高的效益，其中一个最直接有效的措施就是进行菌种改造。通过菌种选育，可以达到提高原料利用率、缩短发酵周期、增强发酵食品风味等目的，满足企业产品生产需求。
[0003] 目前对于丝状真菌的菌株改造有两个大的方向：一个是基因工程的方法；一种是传统育种方法，包括化学诱变、物理诱变、原生质体融合等技术。目前由于基因工程育种应用于发酵食品行业颇有争议，传统育种对于食品行业的菌种改造来说就显得非常重要。对于传统育种，诱变手段多种多样，但筛选方法却非常有局限。菌种筛选过程就是要依照生产要求和菌种特性，采用不同的筛选策略，快速、准确的把所需目标菌株筛选出来，最常见有效的方法就是琼脂平板观察法，包括透明圈法和显色圈法。
[0004] 丝状真菌在长期进化过程中外分泌酶系非常丰富，例如，蛋白酶、淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、果胶酶等，对于对应这些酶系菌株的诱变和筛选，已建立详细的透明圈和颜色圈平板筛选方法(蛋白酶用干酪素、淀粉酶用淀粉和碘液等)。申请号：201510130064.8用米曲霉发酵花生粕制备呈味肽和呈味氨基酸的方法及其应用的专利中，就是通过酪蛋白培养基来筛选获得蛋白酶提高的突变株。
[0005] 现有针对这些丝状真菌酶系的筛选技术普遍存在下述缺点：筛选酶活目标单一，筛选培养基的组成基本都是单一底物，不能对获得菌株进行综合酶系考察；而且长期使用这些诱导底物培养基，造成较高的抗性饱和以及菌株自身酶系分布失衡，使得无法快速有效的筛选出符合生产要求的生产菌株。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种丝状真菌的筛选培养基及其制备方法，采用该筛选培养基可快速、高效筛选出性能更佳的丝状真菌菌株。
[0007] 另外，本发明还提供了上述筛选培养基在筛选丝状真菌中的应用。
[0008] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种丝状真菌的筛选培养基，其包括自下而上依次设置的显色培养基、酶解培养基和营养培养基；所述显色培养基含有琼脂糖和钙离子指示剂，所述酶解培养基含有琼脂糖和植酸钙。
[0009] 本发明的筛选培养基具有独特相互关联的三层结构，分别是显色培养基，设于显色培养基上的酶解培养基和设于酶解培养基上的营养培养基。营养培养基用于培养驯育和筛选丝状真菌，丝状真菌产生的植酸酶渗透至酶解培养基，可分解植酸钙，游离出钙离子；钙离子渗透至显色培养基中与钙离子指示剂显色，即可通过透明显色圈来挑选菌株。
[0010] 采用本发明的筛选培养基，可筛选出性能更佳的丝状真菌，且该筛选培养基通过多层形式，可缩短观察挑菌时间至48小时内；也更加接近模拟菌种扩培阶段的真正产酶情况，能够显著提高筛选效率。
[0011] 作为本发明所述丝状真菌的筛选培养基的优选实施方式，所述显色培养基的制备原料含有：
[0012] (a)钙离子指示剂溶液，由钙离子指示剂和缓冲溶液组成，钙离子指示剂的质量与缓冲溶液的体积的比为0.1～2g：100mL；和
[0013] (b)琼脂糖溶液，由琼脂糖和缓冲溶液组成，琼脂糖的质量与缓冲溶液的体积的比为0.2～1.0g：100mL；
[0014] 所述(a)与(b)的体积比为1～10：100。
[0015] 作为本发明所述丝状真菌的筛选培养基的更优选实施方式，所述钙离子指示剂为铬黑T。铬黑T是一种金属指示剂，其能与钙离子络合形成络合物，在pH值为7-11范围内，铬黑T为蓝色，其与钙离子的络合物为红色。
[0016] 作为本发明所述丝状真菌的筛选培养基的优选实施方式，所述酶解培养基的制备原料含有：
[0017] (c)植酸钙悬浮液，所述植酸钙悬浮液中植酸钙的含量为0.02-0.2g/mL；和[0018] (b)琼脂糖溶液，由琼脂糖和缓冲溶液组成，琼脂糖的质量与缓冲溶液的体积的比为0.2～1.0g：100mL；
[0019] 所述(c)与(b)的体积比为1：10。
[0020] 作为本发明所述丝状真菌的筛选培养基的优选实施方式，所述缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液，所述缓冲液的pH值为7.1-8.9。在此pH值范围内，丝状真菌生长状态最好，且显色反应达到最佳。
[0021] 作为本发明所述丝状真菌的筛选培养基的优选实施方式，所述营养培养基含有无机盐和下述含量的组分：
[0022]
[0023] 本发明的筛选培养基中，营养培养基的碳源采用2-脱氧葡萄糖和木糖，其中，2-脱氧葡萄糖是葡萄糖的结构类似物，木糖是戊糖，主要作用是解除六碳糖等糖源代谢产物抑制，并提升丝状真菌对于木糖的利用，从而达成提高筛选菌株参与发酵过程中的重要酶类(蛋白酶、淀粉酶、谷氨酰胺酶)的生成。
[0024] 上述营养培养基中同时添加了植酸钙，植酸钙的主要作用是调控培养基的营养组成，改变培养基的状态，便于缩短筛选培养周期，即能够在48小时内简单、直观、准确的挑选目标突变菌株。并且，营养培养基含有乳酸，这样有助于提高植酸钙的水溶性。
[0025] 作为本发明所述丝状真菌的筛选培养基的更优选实施方式，所述无机盐包括硝酸钾、硫酸铵、氯化钠和氯化镁；所述营养培养基中，2-脱氧葡萄糖的浓度为5-30mmol/L，植酸钙的含量为0.3-0.6％(w/v)。
[0026] 作为本发明所述丝状真菌的筛选培养基的优选实施方式，所述显色培养基的厚度为所述筛选培养基厚度的1/6-1/3；所述酶解培养基的厚度为所述筛选培养基厚度的1/4-1/3；所述营养培养基的厚度为所述筛选培养基厚度的1/3-7/12。
[0027] 另外，本发明还提供了上述丝状真菌的筛选培养基的制备方法，其包括以下步骤：
[0028] 显色培养基的制备：按照每100mL缓冲溶液加入0.1～2g钙离子指示剂的比例，将钙离子指示剂溶解于缓冲溶液中，过滤除菌，得到钙离子指示剂溶液；按照每100mL缓冲溶液加入0.2～1.0g琼脂糖的比例，将琼脂糖溶解于缓冲溶液中，灭菌后冷却，再加入制得的钙离子指示剂溶液，摇匀后倒板，得到显色培养基；
[0029] 酶解培养基的制备：将植酸钙加入水中，浸泡过夜后，灭菌，冷却至室温，离心弃上清，得到植酸钙沉淀，加入水分散植酸钙沉淀，得到植酸钙悬浮液；按照每100mL缓冲溶液加入0.2～1.0g琼脂糖的比例，将琼脂糖溶解于缓冲溶液中，灭菌后冷却，再加入制得的植酸钙悬浮液，摇匀后倒板，得到酶解培养基；
[0030] 营养培养基的制备：将植酸钙溶解于水中，边搅拌边加入乳酸，得到混合溶液A；将2-脱氧葡萄糖溶解于水中，过滤后除菌，得到2-脱氧葡萄糖水溶液；将硝酸钾和氯化镁溶于水中，过滤除菌，得到混合溶液B；向混合溶液A中加入木糖、氯化钠和硫酸铵，定量、搅拌均匀，调节pH值后再加入琼脂糖，灭菌，冷却，得到混合溶液C；向混合溶液C中加入2-脱氧葡萄糖水溶液和混合溶液B，摇匀后倒板，得到营养培养基；
[0031] 将酶解培养基加至冷却后的显色培养基上，得到预筛选培养基；
[0032] 待酶解培养基冷却后，将营养培养基加至预筛选培养基中的酶解培养基上，得到所述丝状真菌的筛选培养基。
[0033] 另外，本发明还提供了上述丝状真菌的筛选培养基在筛选丝状真菌中的应用。优选地，所述丝状真菌为米曲霉、黑曲霉或李氏木霉。
[0034] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0035] (1)采用本发明的筛选培养基，筛选目标广：其营养培养基的主要成分有脱氧葡萄糖、木糖、植酸钙等，可保证筛选出的突变菌种的谷氨酰胺酶、氨肽酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶等多种酶活的综合能力较好，还能保各酶系间的平衡。
[0036] (2)采用本发明的筛选培养基，筛选效率高：本发明的筛选培养基通过多层显色培养基形式，可缩短观察挑菌时间至48小时内；也更加接近模拟菌种扩培阶段的真正产酶情况，能够显著提高筛选效率。
[0037] (3)本发明的筛选培养基溶解均匀、混合性好：培养基中添加了乳酸，也有助于提高植酸钙的水溶性。
[0039] 图1为本发明效果例3中感官鉴评的雷达图。
具体实施方式
[0040] 为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
[0042] 下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
[0043] 实施例1
[0044] 本发明丝状真菌的筛选培养基的一种实施例，本实施例所述丝状真菌的筛选培养基包括自下而上依次设置的显色培养基、酶解培养基和营养培养基；
[0045] 所述显色培养基的制备原料含有钙离子指示剂溶液和琼脂糖溶液，所述钙离子指示剂溶液和琼脂糖溶液的体积比为2：100；其中，所述钙离子指示剂溶液由钙离子指示剂和pH值为8.0的Tris-HCl的缓冲溶液组成，所述钙离子指示剂溶液中，钙离子指示剂的质量与缓冲溶液的体积的比为0.5g：100mL；所述琼脂糖溶液由琼脂糖和pH值为8.0的Tris-HCl缓冲溶液组成，所述琼脂糖溶液中，琼脂糖的质量与缓冲溶液的体积的比为0.3g：100mL；
[0046] 所述酶解培养基的制备原料含有植酸钙悬浮液和琼脂糖溶液，所述植酸钙悬浮液和琼脂糖溶液的体积比为1：10；其中，所述植酸钙悬浮液中植酸钙的含量为0.05g/mL；所述琼脂糖溶液由琼脂糖和pH值为7.5的Tris-HCl缓冲溶液组成，所述琼脂糖溶液中，琼脂糖的质量与缓冲溶液的体积的比为0.2g：100mL；
[0047] 所述营养培养基含有下述含量的组分：2-脱氧葡萄糖5mmol/L、植酸钙0.1％(w/v)、乳酸20mmol/L、木糖1％(w/v)、硝酸钾1.5％(w/v)、硫酸铵0.5％(w/v)、氯化钠0.5％(w/v)、氯化镁0.05％(w/v)和pH值为6.5的琼脂糖1％(w/v)；
[0048] 其中，所述钙离子指示剂为铬黑T。
[0049] 进一步地，本实施例的丝状真菌的筛选培养基中，所述显色培养基的厚度为所述筛选培养基厚度的1/4；所述酶解培养基的厚度为所述筛选培养基厚度的1/4；所述营养培养基的厚度为所述筛选培养基厚度的1/2。
[0050] 本实施例丝状真菌的筛选培养基的制备方法为：
[0051] (1)显色培养基的制备：称取0.5g铬黑T溶解于100mL pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液，过滤除菌，得到钙离子指示剂溶液；称取0.3g琼脂糖，溶解于100mL pH值为8.0的Tris-HCl缓冲液，121℃，15min灭菌，冷却至45℃左右，加入2mL无菌的钙离子指示剂溶液，摇匀后倒板，得到显色培养基；其中,Tris-HCl缓冲液中Tris和HCl试剂为分析纯以上，同时使用的水纯度为去离子水及其以上级别；
[0052] (2)待步骤(1)中的显色培养基冷却后，再加入酶解培养基，酶解培养基的制备过程如下：按1g植酸钙加入10mL水的比例称取植酸钙，浸泡过夜后，使用121℃，15min灭菌；待灭菌的植酸钙溶液冷却到室温后，使用离心法离心弃上清，用无菌水洗涤植酸钙沉淀3次后，再次加入适量的无菌水分散植酸钙沉淀，制成无菌的植酸钙悬浮液；称取0.2g琼脂糖，溶于100mL pH值为7.5的Tris-HCl缓冲液，121℃，15min灭菌，冷却至45℃左右，加入10mL植酸钙悬浮液，该菌悬液含植酸钙0.5g，摇匀可倒板，得到酶解培养；其中Tris-HCl缓冲液中Tris和HCL试剂为分析纯以上，同时使用的水纯度为去离子水及其以上级别；
[0053] (3)待步骤(2)中的酶解培养基冷却后，再加入营养培养基，得到本实施例的丝状真菌的筛选培养基；其中，营养培养基的配置过程如下：称取植酸钙溶解于去离子水中，并放入3-5粒转子，后通过磁力搅拌器磁力搅拌5h以上，搅拌溶解过程中缓慢加入乳酸，并不断搅拌获得混合溶液A；称取2-脱氧葡萄糖，溶解于去离子水中，将溶解好的2-脱氧葡萄糖溶液通过0.22um的滤膜除菌，获得无菌的2-脱氧葡萄糖水溶液；按比例称取硝酸钾、氯化镁，溶于去离子水中，过滤除菌，获得混合溶液B；向混合溶液A中依次加入木糖、氯化钠、硫酸铵，定量后搅拌均匀，调节pH至6.5，再加入琼脂糖，121℃，15min灭菌，得到混合溶液C；向混合溶液C中加入无菌的2-脱氧葡萄糖水溶液和混合溶液B，摇匀后倒板，得到营养培养基。
[0054] 实施例2
[0055] 本发明丝状真菌的筛选培养基的一种实施例，本实施例所述丝状真菌的筛选培养基包括自下而上依次设置的显色培养基、酶解培养基和营养培养基；
[0056] 所述显色培养基的制备原料含有钙离子指示剂溶液和琼脂糖溶液，所述钙离子指示剂溶液和琼脂糖溶液的体积比为10：100；其中，所述钙离子指示剂溶液由钙离子指示剂和pH值为7.1的Tris-HCl的缓冲溶液组成，所述钙离子指示剂溶液中，钙离子指示剂的质量与缓冲溶液的体积的比为0.1g：100mL；所述琼脂糖溶液由琼脂糖和pH值为7.1的Tris-HCl缓冲溶液组成，所述琼脂糖溶液中，琼脂糖的质量与缓冲溶液的体积的比为1.0g：100mL；
[0057] 所述酶解培养基的制备原料含有植酸钙悬浮液和琼脂糖溶液，所述植酸钙悬浮液和琼脂糖溶液的体积比为1：10；其中，所述植酸钙悬浮液中植酸钙的含量为0.2g/mL；所述琼脂糖溶液由琼脂糖和pH值为7.1的Tris-HCl缓冲溶液组成，所述琼脂糖溶液中，琼脂糖的质量与缓冲溶液的体积的比为1.0g：100mL；
[0058] 所述营养培养基含有下述含量的组分：2-脱氧葡萄糖18mmol/L、植酸钙0.3％(w/v)、乳酸5mmol/L、木糖3％(w/v)、硝酸钾1.5％(w/v)、硫酸铵0.5％(w/v)、氯化钠0.5％(w/v)、氯化镁0.05％(w/v)和pH值为6.5的琼脂糖2％(w/v)；
[0059] 其中，所述钙离子指示剂为铬黑T。
[0060] 进一步地，本实施例的丝状真菌的筛选培养基中，所述显色培养基的厚度为所述筛选培养基厚度的1/3；所述酶解培养基的厚度为所述筛选培养基厚度的1/3；所述营养培养基的厚度为所述筛选培养基厚度的1/3。
[0061] 本实施例丝状真菌的筛选培养基的制备方法中，步骤(3)同实施例1的步骤(3)，其他步骤如下：
[0062] (1)显色培养基的制备：称取0.1g铬黑T溶解于100mL pH值为7.1的Tris-HCl缓冲液，过滤除菌，得到钙离子指示剂溶液；称取1.0g琼脂糖，溶解于100mL pH值为7.1的Tris-HCl缓冲液，121℃，15min灭菌，冷却至45℃左右，加入10mL无菌的钙离子指示剂溶液，摇匀后倒板，得到显色培养基；其中,Tris-HCl缓冲液中Tris和HCl试剂为分析纯以上，同时使用的水纯度为去离子水及其以上级别；
[0063] (2)待步骤(1)中的显色培养基冷却后，再加入酶解培养基，酶解培养基的制备过程如下：按1g植酸钙加入10mL水的比例称取植酸钙，浸泡过夜后，使用121℃，15min灭菌；待灭菌的植酸钙溶液冷却到室温后，使用离心法离心弃上清，用无菌水洗涤植酸钙沉淀3次后，再次加入适量的无菌水分散植酸钙沉淀，制成无菌的植酸钙悬浮液；称取1.0g琼脂糖，溶于100mL pH值为7.1的Tris-HCl缓冲液，121℃，15min灭菌，冷却至45℃左右，加入10mL植酸钙悬浮液，该菌悬液含植酸钙2g，摇匀可倒板，得到酶解培养；其中Tris-HCl缓冲液中Tris和HCL试剂为分析纯以上，同时使用的水纯度为去离子水及其以上级别。
[0064] 实施例3
[0065] 本发明丝状真菌的筛选培养基的一种实施例，本实施例所述丝状真菌的筛选培养基包括自下而上依次设置的显色培养基、酶解培养基和营养培养基；
[0066] 所述显色培养基的制备原料含有钙离子指示剂溶液和琼脂糖溶液，所述钙离子指示剂溶液和琼脂糖溶液的体积比为1：100；其中，所述钙离子指示剂溶液由钙离子指示剂和pH值为8.9的Tris-HCl的缓冲溶液组成，所述钙离子指示剂溶液中，钙离子指示剂的质量与缓冲溶液的体积的比为2g：100mL；所述琼脂糖溶液由琼脂糖和pH值为8.9的Tris-HCl缓冲溶液组成，所述琼脂糖溶液中，琼脂糖的质量与缓冲溶液的体积的比为0.2g：100mL；
[0067] 所述酶解培养基的制备原料含有植酸钙悬浮液和琼脂糖溶液，所述植酸钙悬浮液和琼脂糖溶液的体积比为1：10；其中，所述植酸钙悬浮液中植酸钙的含量为0.02g/mL；所述琼脂糖溶液由琼脂糖和pH值为8.9的Tris-HCl缓冲溶液组成，所述琼脂糖溶液中，琼脂糖的质量与缓冲溶液的体积的比为0.2g：100mL；
[0068] 所述营养培养基含有下述含量的组分：2-脱氧葡萄糖30mmol/L、植酸钙0.6％(w/v)、乳酸30mmol/L、木糖0.5％(w/v)、硝酸钾1.5％(w/v)、硫酸铵0.5％(w/v)、氯化钠0.5％(w/v)、氯化镁0.05％(w/v)和pH值为6.5的琼脂糖0.5％(w/v)；
[0069] 其中，所述钙离子指示剂为铬黑T。
[0070] 进一步地，本实施例的丝状真菌的筛选培养基中，所述显色培养基的厚度为所述筛选培养基厚度的1/6；所述酶解培养基的厚度为所述筛选培养基厚度的1/4；所述营养培养基的厚度为所述筛选培养基厚度的7/12。
[0071] 本实施例丝状真菌的筛选培养基的制备方法中，步骤(3)同实施例1的步骤(3)，其他步骤如下：
[0072] (1)显色培养基的制备：称取2g铬黑T溶解于100mL pH值为8.9的Tris-HCl缓冲液，过滤除菌，得到钙离子指示剂溶液；称取0.2g琼脂糖，溶解于100mL pH值为8.9的Tris-HCl缓冲液，121℃，15min灭菌，冷却至45℃左右，加入1mL无菌的钙离子指示剂溶液，摇匀后倒板，得到显色培养基；其中,Tris-HCl缓冲液中Tris和HCl试剂为分析纯以上，同时使用的水纯度为去离子水及其以上级别；
[0073] (2)待步骤(1)中的显色培养基冷却后，再加入酶解培养基，酶解培养基的制备过程如下：按1g植酸钙加入10mL水的比例称取植酸钙，浸泡过夜后，使用121℃，15min灭菌；待灭菌的植酸钙溶液冷却到室温后，使用离心法离心弃上清，用无菌水洗涤植酸钙沉淀3次后，再次加入适量的无菌水分散植酸钙沉淀，制成无菌的植酸钙悬浮液；称取0.2g琼脂糖，溶于100mL pH值为8.9的Tris-HCl缓冲液，121℃，15min灭菌，冷却至45℃左右，加入10mL植酸钙悬浮液，该菌悬液含植酸钙0.2g，摇匀可倒板，得到酶解培养；其中Tris-HCl缓冲液中Tris和HCL试剂为分析纯以上，同时使用的水纯度为去离子水及其以上级别。
[0074] 实施例4
[0075] 本发明丝状真菌的筛选培养基的一种实施例，本实施例所述丝状真菌的筛选培养基与实施例1所述丝状真菌的筛选培养基的不同之处仅在于：本实施例中，所述营养培养基含有下述含量的组分：2-脱氧葡萄糖5mmol/L、植酸钙0.45％(w/v)、乳酸20mmol/L、木糖1％(w/v)、硝酸钾1.5％(w/v)、硫酸铵0.5％(w/v)、氯化钠0.5％(w/v)、氯化镁0.05％(w/v)和pH值为6.5的琼脂糖1％(w/v)。
[0076] 本实施例丝状真菌的筛选培养基的制备方法同实施例1。
[0077] 实施例5
[0078] 本发明丝状真菌的筛选培养基的一种实施例，本实施例所述丝状真菌的筛选培养基与实施例1所述丝状真菌的筛选培养基的不同之处仅在于：本实施例中，所述营养培养基含有下述含量的组分：植酸钙1％(w/v)、乳酸20mmol/L、木糖1％(w/v)、硝酸钾1.5％(w/v)、硫酸铵0.5％(w/v)、氯化钠0.5％(w/v)、氯化镁0.05％(w/v)和pH值为6.5的琼脂糖1％(w/v)。
[0079] 本实施例丝状真菌的筛选培养基的制备方法同实施例1。
[0080] 实施例6
[0081] 本发明丝状真菌的筛选培养基的一种实施例，本实施例所述丝状真菌的筛选培养基与实施例1所述丝状真菌的筛选培养基的不同之处仅在于：本实施例中，所述营养培养基含有下述含量的组分：2-脱氧葡萄糖50mmol/L、植酸钙0.6％(w/v)、乳酸20mmol/L、木糖1％(w/v)、硝酸钾1.5％(w/v)、硫酸铵0.5％(w/v)、氯化钠0.5％(w/v)、氯化镁0.05％(w/v)和pH值为6.5的琼脂糖1％(w/v)。
[0082] 本实施例丝状真菌的筛选培养基的制备方法同实施例1。
[0083] 对比例1
[0084] 本对比例的一种培养基，其包括下述含量的组分：硝酸钾1.5％(w/v)、硫酸铵0.5％(w/v)、氯化钠0.05％(w/v)、氯化镁0.05％(w/v)、pH值为6.5的琼脂糖1％(w/v)，2-脱氧葡萄糖5mmol/L，木糖0.6％(w/v)。
[0085] 本对比例培养基的制备方法为：将硝酸钾、硫酸铵、氯化钠、氯化镁、pH值为6.5的琼脂糖溶液混合后，于121℃灭菌15min，待冷却至65℃左右，依次加入使用0.22um无菌滤膜除菌的50×2-脱氧葡萄糖母液和50×木糖母液，得到本对比例的培养基。
[0086] 对比例2
[0087] 本对比例的一种培养基，其包括下述含量的组分：硝酸钾1.5％(w/v)、植酸钙0.4％(w/v)、硫酸铵0.5％(w/v)、氯化钠0.05％(w/v)、氯化镁0.05％(w/v)、pH值为6.5的琼脂糖1％(w/v)、葡萄糖0.6％(w/v)。
[0088] 本对比例培养基的制备方法为：将硝酸钾、植酸钙、硫酸铵、氯化钠、氯化镁、pH值为6.5的琼脂糖溶液混合后，于121℃灭菌15min，待冷却至65℃左右，加入使用0.22um无菌滤膜除菌的50×葡萄糖母液，得到本对比例的培养基。
[0089] 对比例3
[0090] 本对比例的一种培养基，其包括下述含量的组分：硝酸钾1.5％(w/v)、乳酸20mmol/L、木糖0.6％(w/v)、2-脱氧葡萄糖5mmol/L、植酸钙0.4％(w/v)、硫酸铵0.5％(w/v)、氯化钠0.05％(w/v)、氯化镁0.05％(w/v)、琼脂糖1％(w/v)。
[0091] 本对比例培养基的制备方法为：
[0092] (1)溶解植酸钙：将植酸钙溶于去离子水中，并放入3-5粒转子，后通过磁力搅拌器磁力搅拌5h以上，溶解过程中缓慢加入乳酸。
[0093] (2)配制无菌2-脱氧葡萄糖溶液：将2-脱氧葡萄糖溶于去离子水中，然后通过0.22um的滤膜除菌，4℃冷藏备用。
[0094] (3)配制无菌无机盐混合液：按比例称取氯化钠、氯化镁，溶于去离子水中，过滤除菌，室温存放。
[0095] (4)向溶解好的植酸钙溶液中依次加入木糖、硝酸钾、硫酸铵，定量后搅拌均匀，调节pH至6.5。
[0096] (5)高压灭菌：按比例称取琼脂糖，加入上述混合培养基中，121℃，15min灭菌。
[0097] (6)冷却至65℃左右，按比例依次添加配制好的无菌2-脱氧葡萄糖溶液和无菌无机盐混合液，摇匀后倒板，得到本对比例的培养基。
[0098] 效果例1诱变方法及过程
[0099] 突变菌落的获取-ARTP诱变米曲霉菌株
[0100] 1、出发菌株的致死率分析：
[0101] 选取一支生长正常、产孢丰富的米曲霉菌株的成熟斜面，勾取3环左右的孢子移入100ml三角瓶中，瓶中预先加入灭菌的0.85％生理盐水约20mL，并加入适量的 的玻璃株；漩涡震荡一段时间，目的是将孢子分散制成孢子悬液。用显微镜进行镜检，将孢子悬液浓度调整为5×107个/mL左右。
[0102] 打开ARTP诱变设备电源和气瓶阀门，取10uL的孢子悬液均匀涂布在灭菌载片表面。从旋转台1号凹槽开始，用弯头镊子顺时针依次将待处理样品载片放置到自动旋转台上方载片固定圆形凹槽内。设定各个载片的处理功率为120W，气流量为10SLM，处理距离为2mm，处理时间依次为0s、2s、10s、20s、30s、60s、80s，设置完毕后开始处理样品。全部样品处理完毕后，用无菌镊子将载片分别放至装有1mL无菌水的EP管中。将EP管置于振荡器上振荡
1min，把附着在载片上的孢子洗脱至无菌水中，形成新的菌悬液；将诱变后的孢子悬液逐级稀释到104。并将获得孢子分别涂布到对比例1、对比例3、实施例1培养基上获得不同培养基的致死率曲线。
1min，把附着在载片上的孢子洗脱至无菌水中，形成新的菌悬液；将诱变后的孢子悬液逐级稀释到104。并将获得孢子分别涂布到对比例1、对比例3、实施例1培养基上获得不同培养基的致死率曲线。
[0103] 2、突变菌株的筛选
[0104] 选取孢子致死率在90％以上的条件进行，诱变育种。并将诱变后的孢子分别涂布稀释到对比例1、对比例3、实施例1培养基上，进行培养筛选。
[0105] 将在对比例1培养基上的生长菌落大小较野生型提高50％以上的菌株，转接到对比例2培养基上进行进一步的植酸钙分解效果筛选。并连续在对比例1和对比例2培养基上对照传代3代。
[0106] 将在对比例3培养基上的生长菌落大小较野生型提高50％以上的菌株同时分解圈明显的菌株进行筛选，并连续在对比例3培养基上传代3代。
[0107] 将实施例1培养基上的生长菌落大小较野生型提高50％以上的菌株同时显色圈明显的菌株进行筛选，并连续在实施例1培养基上传代3代。
[0108] 考察不同培养基下，阳性菌个数、阳性率及耗时情况，结果如下述表1所示。
[0109] 表1
[0110]
[0111] 注：阳性菌是指在特定筛选培养基上生长菌落大小较野生型提高50％以上的菌株(同时分解圈明显和显色圈的圈径比是野生型的1.2倍以上)。
[0112] 效果例2菌株的筛选及酶活力测定
[0113] 分别挑选自效果例1中三种不同类型筛选方法获得效果较好的各15株突变菌进行40小时制曲发酵分析，每株突变菌进行3次重复试验，对获得曲料进行谷氨酰胺酶、氨肽酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、果胶酶以及植酸酶活力测定，检测方法及酶活定义都参考国家标准，测定结果如表2所示。
[0114] 表2
[0115]
[0116]
[0117]
[0118]
[0119] 实验结果表明，从对比例1和对比例2培养基筛选出的15株菌种中有3株比出发菌种的综合酶系有一定优势且性状较稳定；从对比例3培养基筛选出的15株菌种中有5株比出发菌种的综合酶系有一定优势且性状较稳定；从实施例1培养基筛选出的15株菌种中有12株比出发菌种的综合酶系有一定优势且性状较稳定。对比说明，利用本发明筛选培养基筛选的突变菌种酶活稳定性好，基本不波动。
[0120] 效果例3筛选菌株的酱油发酵参数
[0121] 从实施例1培养基筛选出的酶活高且稳定性能优良的新菌株中挑选其中两株编号为417、438进行酱油试酿(每个菌株做三次平行试验)。依次转接斜面活化后，进行三角瓶扩大培养，然后继续进行模拟生产制曲小试及发酵。(斜面采用豆汁培养基；三角瓶培养基采用麸皮、面粉；制曲培养基采用大豆、小麦等原料制备。)发酵结束后，检测原油的氨基氮、全氮、还原糖、谷氨酸、沉淀物、浊度等指标，结果如表3；并加热原油进行感官鉴评，感官鉴评的雷达图如图1所示。
[0122] 其中，豆汁培养基包括下述含量的组分：豆汁(4-5°Be’)，可溶性淀粉2％(w/v)，磷酸二氢钾0.1％(w/v)，硫酸镁0.025％(w/v)，硫酸铵0.05％(w/v),琼脂粉1.5％(w/v)，pH值为6.5。
[0123] 表3
[0124]
[0125]
[0126] 由表3可见，新菌株417、438发酵原油的氨基氮比出发菌株高出5％以上，全氮比出发菌株高出2％以上，谷氨酸高出10％以上；加热后浊度及加热沉淀物明显比出发菌株低很多。由图1可见，417菌株原油的鲜甜味道有明显的提升；438菌株原油的色泽红壮、体态澄清且原油口感清爽，鲜甜味美。
[0127] 发明人还参照效果例1～3的方法，分别考察了实施例2～5培养基的效果，发现实施例2～5培养基均具有与实施例培养基相同的筛选效果，在此不一一赘述。
[0128] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
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