Cell fusion culture by using transformat protoplast in eucalyptus plant
专利汇可以提供Cell fusion culture by using transformat protoplast in eucalyptus plant专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且PURPOSE:To efficiently obtain polyploidy cells useful, e.g. for producing a new- breed plant by carrying out cell fusion between a protoplast of an Eucalyptus plant and a transformat protoplast, subsequently culturing it in the presence of a herbaceous plant protoplast and then culturing it in an antibiotic-containing medium. CONSTITUTION:To a callus obtained from a shoot anlage of an Eucalyptus plant (e.g. Eucalyptus saligna) and a callus obtained from a shoot anlage of a transformat Eucalyptus plant, an enzyme solution containing cellulase, pectolyase, etc., is added and the resultant mixture is treated at 27 deg.C for 16hr to isolate the respective protoplasts of two kinds of Eucalyptus plants for cell fusion. The resultant isolated protoplasts are then subjected to cell fusion by using a 40wt.% polyethylene glycol solution, etc., and the fused cell is subsequently cultured in the presence of a protoplast of a herbaceous plant (e.g. Hibiscu cannabinus) excellent in fissiparity to obtain a colony. The obtained colony is cultured in an antibiotic-containing culture medium, thus efficiently selecting the objective polyploid-candidate colony.，下面是Cell fusion culture by using transformat protoplast in eucalyptus plant专利的具体信息内容。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ユーカリ属植物における形質転換体プロトプラストを使用した細胞融合方法に関し、更に詳しくは融合する２種類のユーカリ属植物のプロトプラストのうち、その一方に形質転換体プロトプラストを使用し、細胞融合によって得られたコロニーから倍数体候補コロニーを効率よく選抜する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞融合により得られた倍数性細胞の選抜にはさまざまな手法が使用されているが、一般的な方法としては不活性化剤の利用があげられる。
【０００３】ヨードアセトアミドなどの不活性化剤で処理されたプロトプラストは、分裂能を失い融合したハイブリッド細胞のみが分裂することになる。
【０００４】この方法はイネ、ブラシカ、ニンジンなど草本類で使われているが、ユーカリなどの木本性植物の細胞融合については、その基礎となるプロトプラストの培養が困難である場合が多く、カンキツ類（小林、大河原１９９０、植物細胞工学、２巻 第４５〜４９頁）以外その体細胞雑種の報告例はほとんどなく、この場合は不活性化剤は使用されてない。
【０００５】本発明者らはすでにユーカリ属植物をはじめとする木本性植物のプロトプラストの培養方法について提案した（特開昭６４−４３１３８号公報、特開平２
−１２９６３１号公報）。
【０００６】これらの方法によれば、再生を目的とするユーカリ属植物などの木本性植物のプロトプラストを分裂、増殖の旺盛な草本性植物のプロトプラスト特にケナフのプロトプラストと共存させて培養し、コロニーあるいはカルスを得た後、回転培養器に移して苗条原基を作出し、さらに、植物体を再生させることが可能となった。
【０００７】細胞融合によって得られる倍数性細胞の培養については、特願平３−６３６９２号明細書で提案した方法、すなわち、細胞融合したプロトプラストの分裂、コロニー形成が困難な木本性植物について細胞融合したのち、分裂、増殖の旺盛な草本性植物のプロトプラストと共存下で培養することにより、目的とする分裂、
増殖能を有する倍数性細胞の培養が可能となった。 しかし、細胞融合で得られる倍数性細胞の効率的な選抜方法については全く知見が得られていなかった。 そこで体細胞雑種作出の基礎となる倍数性細胞の選抜の簡素化について鋭意検討を行った結果、本発明を完成するに至った。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】ユーカリ属植物の形質転換体プロトプラストを使用した細胞融合によって得られたコロニーの中から、倍数性コロニーを効率的に選抜する培養方法を提供するものである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、融合すべき二種類のユーカリ属植物のうち、少なくとも一方に形質転換体プロトプラストを使用し、細胞融合し、次いで分裂増殖の旺盛な草本性植物のプロトプラストと共存培養することによって得られたコロニーを抗生物質を含む培地で培養することにより、倍数体候補コロニーを選抜するユーカリ属植物の細胞融合培養方法である。
【００１０】なお、本発明に用いるプロトプラストを単離するために使用する苗条原基、及び苗条、カルスの作出方法、プロトプラストの単離・調整方法は本発明者等が提案した特開昭６３−３０１７８４号公報、特開平２
−１２８６３１号公報に記載されている方法に従って行えばよい。
【００１１】本発明に用いる形質転換体苗条原基の作出方法等については本発明者等が提案した特開平２−１３
８９６６号公報の方法に従って行えばよい。
【００１２】以下、ユーカリ属植物の形質転換されたプロトプラストとの細胞融合方法、融合処理後に得られる倍数性細胞のプロトプラストの培養方法および選抜方法等について詳しく説明する。
【００１３】（形質転換されたユーカリプロトプラストとの細胞融合方法）２種類のユーカリプロトプラストを単離・調整したのち、一般的に用いられている細胞融合方法、例えばＰＥＧ法、電気刺激法などにより融合処理を行う。 これによって倍数性プロトプラストが得られる。
【００１４】（倍数性プロトプラストの培養方法および選抜方法）融合・調整して得られた目的とするユーカリ属植物のプロトプラスト（倍数性細胞）とこれと共存して培養する草本性植物のプロトプラストを各々１０ 4ないし１０ 5コ／ｍｌの濃度に調整する。 次に、両プロトプラストを１：３〜３：１の割合で混合して、例えばガンボーグのＢ５培地、ムラシゲ・スクーグのＭＳ培地等をプロトプラストの性質に応じて選択して植物ホルモン類、例えばナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）、インドール酢酸（Ｉ
ＡＡ）等のオーキシン類およびベンジルアデニン（Ｂ
Ａ）、１−（２−クロロ−４−ピリジル）−３−フェニルウレア（４ＰＵ）、カイネチン、ゼアチン、チジアズロン等のサイトカイニン類を添加した液体培地あるいは培地固化剤であるGellam Gumを添加した培地で培養する。
【００１５】プレートしたプロトプラストの培養初期は、暗条件で培養するのが好適であり、培養期間中の温度としては、２０℃ないし３０℃が好ましいが、特に２
５℃ないし２８℃の間が好ましい。
【００１６】培養後３０〜５０日後に例えば、Genetici
n （Ｇ４１８）５〜３０μｇ／ｍｌ、カナマイシン１０
０〜１０００μｇ／ｍｌ、ハイグロマイシン１００〜５
００μｇ／ｍｌ等の抗生物質を添加し、選抜期間１０〜
３０日間で目的とする抗生物質耐性の倍数性のコロニーのみが得られる。
【００１７】以下、実施例によって本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
【００１８】
実施例１ 供試植物細胞融合に供するプロトプラストを単離する材料として、倍数性細胞を選抜するマーカーを有する特開平２−
１３８９６６号公報記載の方法で形質転換したユーカリ属植物（ Eucalyptus saligna 以下 E.salignaと記す）
から作出した苗条原基及びマーカーを有しない E.salig
na非形質転換苗条原基を用いた。 さらに、これと共存させて培養する草本性植物のプロトプラストとしてケナフ（ Hibisc-us cannabinus ) のカルス由来のものを使用した。
【００１９】（プロトプラストの単離・調整方法）形質転換された E.salignaの苗条原基より作出されたカルス、形質転換されていない E.salignaの苗条原基より作出されたカルスおよびケナフから作出されたカルス各々１ｇに対して、２０ｍｌの酵素液（１％セルラーゼオノズカＲＳ、０．０５％ペクトリアーゼＹ−２３．１％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、１３％マニトール、ｐ
Ｈ５．６）を加えて２７℃の温度、振盪回数３０ｒｐｍ
で１６時間の酵素処理を行ない３種のプロトプラストを別々に単離した。
【００２０】得られたプロトプラストの懸濁液をナイロンメッシュでろ過して未消化の細胞塊等を除き、さらに７５０ｒｐｍで３分間の遠心分離処理をして酵素液とプロトプラストを分離し、１３％マニトールで２回洗浄した後、２種類のE.salignaのプロトプラストをそれぞれ１０ 6コ／ｍｌの濃度に調整し、融合に供試した。 なお、ケナフのプロトプラストは５×１０ 4コ／ｍｌの濃度に調整し、共存培養に供試した。
【００２１】（プロトプラストの融合と培養方法および選抜方法）上記の方法により調整した２種類の E.salig
naのプロトプラストを分子量１，５４０〜６，０００の４０％ポリエチレングリコール液（ＰＥＧ）で融合処理を行った。 その後、０．５Ｍマニトール、５０ｍＭ Ｃ
ａＣｌ 2 ２Ｈ 2 Ｏ液（洗い液）でプロトプラストを洗浄することにより細胞融合したプロトプラストが得られた。 なお、この融合処理は、電気パルスによっても行うことができる。
【００２２】次に、融合した E.salignaのプロトプラストを５×１０ 4コ／ｍｌの濃度に調整し、これにケナフのプロトプラストを３：１（ユーカリ３：ケナフ１）の割合で混合する。
【００２３】これを表−１に示したガンボーグのＢ５培地にＮＡＡ ５ｍｇ／ｍｌ、ＢＡ０．５ｍｇ／ｍｌ、ショ糖１％、マニトール９％を加えた液体培地、あるいは
Gelrite ０．０５％を含む培地２ｍｌに懸濁して直径６
ｃｍのシャーレにプレートした。
【００２４】培養後約３０日目にマニトールの濃度を６
％に下げた上記と同様のホルモン濃度の液体培地を添加した。
【００２５】さらに、２７℃の温度の暗条件で４２日間培養した後、表−１に示すガンボーグのＢ５培地に０．
０２ｍｇ／ｍｌのＮＡＡ、０．５ｍｇ／ｍｌの４ＰＵ、
１％のショ糖、３％のマニトール、１０μｇ／ｍｌのＧ
４１８を加えた液体選抜培地に移し、暗条件で２０日間培養することによりＧ４１８耐性の倍数性コロニーが選抜される。 なお、選抜効率の結果を表２に示した。 表に示した結果からわかるように倍数性コロニーの候補の割合は、細胞融合処理後に得られた全コロニーに対して約１２％となり、倍数性細胞選抜の過程を簡素化できることが明らかとなった。
【００２６】
【表１】
【００２７】実施例２ 供試植物細胞融合に供試するプロトプラストを単離する材料として、倍数性細胞を選抜するマーカーを有する Eucalyptu
s saligna の形質転換苗条原基及びマーカーを有しない非形質転換苗条原基（ Eucalyptus camaldulensis ) を用いた。 さらに、これと共存させて培養する草本性植物のプロトプラストとしてケナフ（ Hibi-scus cannabinu
s ) のカルス由来のものを使用した。
【００２８】実施例−１と同様の方法によりプロトプラスト単離、融合処理を行いＧ４１８を含む液体培地で選抜することによりＧ４１８耐性のコロニーを選抜した。
なお、選抜効率の結果を表２に示した。 表２に示した結果からわかるように倍数性コロニーの割合は、細胞融合処理後に得られた全コロニーに対して５％となり、倍数性細胞選抜の過程を簡素化できることか明らかになった。
【００２９】
【表２】
【００３０】
【発明の効果】以上説明したようにこれまでのユーカリの細胞融合は、選抜マーカーを持たないプロトプラスト同士の細胞融合であったために細胞融合処理後に得られるコロニー数が多く、目的である細胞の選抜が困難であった。 しかし、細胞融合すべき一方に形質転換されたユーカリのプロトプラストを用いることより効率的に目的である細胞を選抜することが可能となり、植物の新品種創成に極めて有力な方法を提供する。
フロントページの続き (51)Int.Cl. 5識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ａ０１Ｈ 4/00 8502−2Ｂ
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