【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は染色体が二倍体性を有するトルラスポラ属（Torulaspora)に属する大型冷凍耐性パン酵母の製法に関する。

【０００２】

【従来の技術】トルラスポラ属に属する酵母、例えばトルラスポラ・デルブルッキ（Torulaspora delbrueckii
: 旧名サッカロミセス・ロゼイ Saccharomyces rosei
は分類学的に消滅し、新名となった。 「JA Barnett等著、Yeasts : Characteristicsand Identification ,５
０８頁，Cambridge University Press, Cambridge,１９
８３年」及び「NJW Kreger-van Rij 編著，The Yeas
ts, 第３改訂版，４３５頁，Elsevier Science Publish
ers, Amsterdam, １９８４年」参照）は糖濃度の高い菓子パン製造に優れ（特公昭５４−１３４９１号）、又、
冷凍耐性のある酵母（特開昭５６−１４４０３６号）として市販されている。 冷凍耐性とは発酵用酵母菌体を含むパン生地をあらかじめ混捏し若干時間発酵させるか又はそのまま−２０℃以下に冷凍保存しておき、必要に応じ解凍し再発酵させパンを焼成しうる性質である。 冷凍保存できるという性質は早朝からパン製造にとりかからねばならぬという過程を省略せしめ、又、需要を察知してパンを焼成できるという利点をもたらす。 しかし、トルラスポラ・デルブルッキは一般に菌体細胞が小さいため培養後の集菌、洗浄、脱水等の作業に時間がかかるという欠点がある。 従来、トルラスポラ・デルブルッキの二倍体酵母としては、染色体上に栄養要求性等の人為的突然変異遺伝形質を有する酵母がプロトプラスト融合法によって得られている（特開昭５８−１５５０８３
号）。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、プロトプラスト融合法による二倍体酵母は、パン酵母としての性質が劣ると言う欠点を有する。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らはトルラスポラ属に属する酵母のプロトプラストを調製し、これを再生させる際、ジメチルスルホキシドを再生培地に添加したり、再生の際に０．５ mM 以下のマグネシウムを含む培地を用いたところ、染色体の二倍体化しているが、染色体上に栄養要求性の人為的突然変異遺伝形質を有しない大型細胞株を得ることができた。 トルラスポラ・デルブルッキは通常一倍体で増殖する酵母である（前記のN.
JW Kreger-van Rij, The Yeasts,４３４頁参照）。

【０００５】

【作用】本発明により得られた二倍体大型細胞株はパン酵母としての性質は変わらずに、その倍数性を安定に維持し、冷凍耐性はそのままであった。 又、倍数性の増加に伴ないパン生地膨張力価も若干向上した。 しかも上記作業時間を大幅に短縮する事ができた。 本法にて得られる二倍体株は直接染色体倍数化（direct diploidizatio
n)であり、いわゆるブロトプラスト融合とは異なる。

【０００６】なお、本発明に用いる親酵母株は野生型であり、あらかじめ栄養要求性または薬剤耐性マーカー付与等の変異処理を必要としない。 従って、得られた二倍体酵母株は栄養要求性等の人為的突然変異遺伝形質を染色体上に持たない。 そのため、胞子を形成させる等の分離（セグリゲーション）を人為的または自然におこして一倍体にもどっても、栄養要求性等の変異遺伝形質を有する子孫株を生じない。 また、いわゆる変異処理の操作が必要でないため、対象とする酵母の良い遺伝形質に損傷を与えるおそれがなく、得られる二倍体酵母はパン生地試験でも良好な結果を与える。

【０００７】

【実施例】以下に、トルラスポラ・デルブルッキを用いた場合の二倍体株造成の実施例と得られた菌株の性質について述べる。 本発明に用いた親株トルラスポラ・デルブルッキＹ−１３４−５の細胞体積は約１８μm ³であるが、下記のようにして造成した菌株は５０〜６０μm ³であり約３倍大きい。

【０００８】実施例 (1) ジメチルスルホキシド処理による大型細胞株の造成 トルラスポラ・デルブルッキＹ−１３４−５（微工研菌寄第９０５号）をＹＰＤ（１％酵母エキス、１％ポリペプトン、２％グルコース）培地に３０℃で好気的に培養した。 対数生育期菌体を遠心にて集め、高張液Ａ（０.
６ M KCl ,２０ mM Tris , HClにて pH ７. ５）にて洗浄後、５ ml の高張液Ａに懸濁した。 この際、菌数は約 ４×10 ⁸ cells ／mlとなるように調節した。 ２−メルカプトエタノールを菌懸濁液１ ml あたり１５μl 加え、３０℃にて３０分間インキュベートした。 処理菌体を遠心にて集め、高張液Ａにて２回洗浄し、２−メルカプトエタノールを完全に除去した。 菌体を５ ml の高張液に懸濁し、Zymolyase60000 （麒麟麦酒（株）社製）
を３ mg 加え、１時間インキュベートすると９９％以上プロトプラスト化した。 プロトプラスト形成率は懸濁液を１滴ずつスライドグラス上に２個所のせ、片方に１０
％Ｎ−ラウロイルザルコシン・ナトリウム溶液を１μl
添加し、双方を検鏡比較することにより目算した。 生成したプロトプラストは５００×Ｇ、１０分間の遠心により集めた。 高張液Ａにて２回同様な遠心条件にて洗浄後、プロトプラストを高張液Ａ５mlに懸濁し、同Ａ液にて１０倍ずつ何段階かに希釈した。 その ０．２ ml を採取し、４５℃の溶融寒天（Yeast Nitrogen Base With
out Amino Acids (Difco社製品）に１％グルコース，
０．６Ｍ塩化カリウム，２％寒天を添加したもの）８ml
に混入し、あらかじめ固めてある同様の組成の寒天平板培地（１５ml）上に重層した。 この重層寒天平板上にジメチルスルホキシドをしみこませた抗生物質用ペーパーディスクを置き、３０℃で３日間培養した。 培養後、ペーパーディスクの周辺に再生出現したコロニーを採取・
検鏡し、大型細胞化したものを、常法により２回単一コロニー分離をくり返し、精製した。 ペーパーディスクを置く代わりにジメチルスルホキシドを寒天再生培地にあらかじめ２．５％均一に含有させても同じ結果が得られた。

【０００９】(2) ０．５ mM 以下のマグネシウムを含む培地を用いる大型細胞（倍数体）株の造成 実施例(1) と操作は全く同じで有るが、プロトプラストを再生させる寒天培地のマグネシウム濃度を低くした。
即ち、実施例(1) で培地構成分として用いたYeast Nitr
ogen Base Without Amino Acids のマグネシウム濃度は該製品製造元の記述（Difco Manual, 第１０改訂版，１
１３６頁，Difco Laboratories Inc., Michigan, USA)
に従って溶解すると２．０３mMとなる。 硫酸マグネシウム(MgSO ₄・７H ₂ O)を1/10量とした以外はDifco 社製品と全く同じ組成の培地を自分で作り、これをプロトプラスト再生寒天培地の構成分として用いた。 換言すればマグネシウム濃度のみ０．２mMとなっている。 このような寒天培地でプロトプラストから再生させたコロニーには大型細胞化したものがあった。 これを前述と同様にして釣菌・検鏡し、精製した。 なお、低マグネシウム培地にてジメチルスルホキシドを添加しておくと、大型細胞株の出現頻度は上昇した。

【００１０】(3) 得られた大型細胞株の諸性質 (1) の方法によりプロトプラストを再生させて得られた大型細胞株のうち、パン生地膨張試験、冷凍耐性に優れていた株の１株をトルラスポラ・デルブルッキＳＡＮＫ
５１８８４（微工研菌寄第７８９６号）と命名した。 同様に０．５mM以下のマグネシウムを含む培地にてプロトプラストを再生させることにより得られた大型細胞株のうち、優れた性質の株をトルラスポラ・デルブルッキＳ
ＡＮＫ５１９８４（微工研菌寄第７８９７号）と命名した。 これら菌株の細胞体積は表１および表２から明かの如く、親株Ｙ−１３４−５に較べ約３倍大きく、細胞内ＤＮＡ含量も約２倍となっている。

【００１１】

【表１】

【００１２】細胞の長軸および短軸は長軸を２ａ，短軸を２ｂとし、５０ケの細胞について写真より計測し平均値及び標準偏差を算出した。 体積は細胞が完全な楕円球と仮定し、公式Ｖ＝4/3 πab ²より計算した。

【００１３】

【表２】

【００１４】仔牛胸腺ＤＮＡを標準とし、ジフェニルアミンを用いる比色定量にて測定した。 Ｙ−１３４−５
のＤＮＡ含量は約２３fg/cell （fg＝１０ ^-15 g)。

【００１５】大型化した株は胞子形成が良好であり、胞子形成用寒天平板培地（１％酢酸カリウム，０．１％酵母エキス，０．０５％グルコース，２％寒天）上、２日間、３０℃にて培養すると多数の細胞が１ないし２ケ、
稀に３ケないし４ケの胞子を保有するようになった。 これら子嚢を含む菌体を集め、前記とほぼ同様な操作によりプロトプラスト化し、これを低張液に入れ破裂させることにより胞子を得ることができる。 この胞子を培養するともはや細胞は親株Ｙ−１３４−５とほぼ同じ大きさになっており、一倍体に戻ることが確認された。 しかし通常の培養を続ける限り、大型細胞株ＳＡＮＫ５１８８
４及びＳＡＮＫ５１９８４は細胞の大きさを維持する安定な菌株であり、大規模培養が可能である。 表３から明かの如く、ＳＡＮＫ５１８８４及びＳＡＮＫ５１９８４
の生育速度（doubling time)はＹＰＤ培地、３０℃好気的条件下で８４分であり、親株Ｙ−１３４−５に較べ遜色なく、最終菌体収量も劣らない。

【００１６】

【表３】

【００１７】更に、表４から明らかのごとく、炭素化合物資化性はＳＡＮＫ５１８８４及びＳＡＮＫ５１９８４
とＹ−１３４−５は全く同じであった。 表４ 炭素化合物資化性 試験菌株：Ｙ−１３４−５，ＳＡＮＫ５１８８４およびＳＡＮＫ５１９８４ 資化性有：グルコース，イヌリン，乳酸，Ｄ−マンニット，ラフィノース，Ｄ−ソルビット，Ｌ−ソルボース，
シュクロース，トレハロース 資化性無：Ｄ−アラビノース，Ｌ−アラビノース，セロビオース，クエン酸，エリスリット，ガラクチット，ガラクトース，ラクトース，マルトース，メレジトース，
メリビオース，α−メチル−Ｄ−グルコシド，ラムノース，アドニット，Ｄ−リボース，サリシン，デンプン，
コハク酸，Ｄ−キシロース 。

【００１８】細胞の大きさ、細胞内ＤＮＡ含量から、得られた大型細胞株ＳＡＮＫ５１８８４及びＳＡＮＫ５１
９８４は二倍体と結論した。 その他の菌学的性質は一倍体酵母のそれと一致するが（前記の NJW Kreger-van
Rij, The Yeasts, ４３５頁参照）、胞子形成に際し偽接合管を形成しないこと、および細胞がそのまま胞子嚢に変換する点において異なる。

【００１９】なお、一般に親株は培養の際、条件が悪いと凝集し、集菌・脱水が不可能となることがある。 一方、大型化した細胞株ＳＡＮＫ５１８８４及びＳＡＮＫ
５１９８４には凝集性はほとんどなかった。

【００２０】(4) 直接二倍体化の証明 ジメチルスルホキシドの存在下又は０．５ mM 以下のマグネシウムを含む培地でのプロトプラスト再生により生ずる大型細胞株が、いわゆるプロトプラスト融合でなく、細胞分裂の攪乱により生じた直接二倍体化であることは以下のようにして証明した。 まずトルラスポラ・デルブルッキＹ−１３４−５をエチルメタンスルホネート処理の常法（石川辰夫編，微生物遺伝学実験法，195
頁，共立出版，東京，１９８２年）により、栄養要求変異株を造成した。 即ちトルラスポラ・デルブルッキＳＡ
ＮＫ５２１８４（Ade ^- Ura ^- ) とＳＡＮＫ５２２８４ (Ar
g ^- Met ^- ) の二重要求株である。 これら菌株から栄養要求解除（野生型表現形質）株は検出されず、復帰変異率は１０ ^-10以下と推定される。 この２株を培養集菌後、１
対１に混合し、(1) と同様にしてプロトプラストとし、
(2) の如き０．５mM以下のマグネシウムを含む寒天培地及びこれに(1) の如く２．５％ジメチルスルホキシドを均一に添加した培地にて再生させた。 この際、培地中には各種栄養要求物をあらかじめ添加した。 各要求物を加えた寒天培地での再生コロニー数を表５Ａに示した。

【００２１】即ち、ＳＡＮＫ５２１８４及びＳＡＮＫ５
２２８４共、再生する。 大型細胞形成培地に再生したコロニーを拾い検鏡すると、かなりの割合で大型細胞株の出現が認められる。 この大型細胞株の要求性を調べると表５Ｂにみる如くAde ^- Ura ^-又はArg ^- Met ^-のどちらかであり、プロトプラストが融合した場合期待される栄養要求解除株は全く出現しなかった。

【００２２】

【表５】

【００２３】(A) プロトプラスト再生至適培地に要求物を加え、プロトプラストよりの再生コロニー数を計数。 ＳＡＮＫ５２１８４（Ade ^- Ura ^- ) 及びＳＡＮＫ５２
２８４（Arg ^- Met ^- ) 共、再生している。 (B) 低マグネシウム濃度（０．２mM) 再生培地に要求物等を加え、プロトプラストを再生させた。 そのコロニーを釣菌・検鏡し、大型細胞化した株の栄養要求性を調べた。 注１ Ade ：アデニン，Ura ; ウラシル，Arg ：アルギニン，Met ：メチオニンの略。 注２ Ade ^- Ura ^- :アデニン及びウラシル要求性，Arg ^- Me
t ^- ：アルギニン及びメチオニン要求性，none：要求性無し。

【００２４】

【発明の効果】参考例 (1) 大型細胞株ＳＡＮＫ５１８８４よりケーキ酵母の調製 パン用酵母はケーキ状にして市販されている。 ケーキ調製に要する時間を大型細胞株ＳＡＮＫ５１８８４及び親株Ｙ−１３４−５について比較試験した。 ＳＡＮＫ５１
８８４とＹ−１３４−５を同じ条件下で培養した。 即ち、種・生酵母３５kgを１０トン培養槽に入れ、廃糖蜜、尿素、第二リン酸ナトリウムを添加供給しながら温度３０℃、 pH ５．０〜５．５、通気１v.vmにて１６
時間通気攪拌培養した。 酵母菌体を遠心集菌し、４回洗浄、濃縮して、酵母クリーム１０００リットル（生酵母５２０kg含有）を得た。 食塩溶液にて処理し回転真空脱水機（デハイドレーター，Alfa-Laval社製）にてケーキ酵母にした。 表６に示すように回転真空脱水機の処理面積８m ²あたり、１時間に処理しうるクリーム酵母量はＹ
−１３４−５が１０００リットルであるに対し、ＳＡＮ
Ｋ５１８８４は２６００リットルであり単位面積・時間あたり得られるケーキ酵母量は２．６倍となっている。
即ち、脱水に要する作業時間は1/2.6 と大幅に短縮された。

【００２５】

【表６】

【００２６】(2) 大型細胞株ＳＡＮＫ５１８８４の冷凍耐性 上記の如く得られたケーキ酵母を用い、表７に示す配合と工程でパン生地を作成し、−２０℃にて冷凍後８日目および１９日目にとり出して解凍し、パン焼成を行なった。 表７． 冷凍貯蔵−解凍後パン焼成体積及びその工程 ［配合］ 小 麦 粉 １００ 砂 糖 ４ 食 塩 ２ 生地改良剤 １．２ ショートニング ４ 酵 母 ６ 水 ６３ ［工程］ 混 捏 時 間：低速３分，中速３分，ショートニング 低速２分，中速５分，高速３分 捏 上 温 度：２８℃ 前 発 酵 ：３０℃，３０分→ガス抜き，成型 冷 凍：−３０℃，６０分急速冷凍，→−２０℃貯蔵 解 凍：２６℃，９０分 ホ イ ロ ：３８℃，湿度９０％，９０分 焼 成：２２０℃，２５分 結果を表８に示す。

【００２７】

【表８】

【００２８】＊１ ホイロは定容積の金属箱に入れて行なう。 箱上面より突出するパン生地の高さを測り、発酵能の指標とする。 ＊２ 比容積は焼成パン体積を重量にて除した数値。 表８から明かの如く、ＳＡＮＫ５１８８４を用いた場合、
焼成パン体積は冷凍１９日後でも２１８７mlあり、親株Ｙ−１３４−５による２０６５mlに勝った。

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