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产生多倍体 植物的方法

阅读：703发布：2020-05-16

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权利要求

1.多倍体植物，其能通过将一种雌性亲本植物与至少两种雄性亲本植物杂交而获得。
2.权利要求1的多倍体植物，其是三亲本植物。
3.权利要求1或2的多倍体植物，其中所述至少两种雄性亲本植物在遗传上是不同的，优选地，其中它们属于不同的栽培种或品种。
4.权利要求1至3中任一项的多倍体植物，其中雄性亲本植物的至少一种与雌性亲本植物不相容。
5.权利要求1至4中任一项的多倍体植物，其是单子叶植物或双子叶植物。
6.如权利要求1至5中任一项限定的多倍体植物群。
7.权利要求1至5中任一项的植物的器官，部分，组织，细胞，种子或后代。
8.用于产生权利要求1至5中任一项的多倍体植物的方法，包括：
(a)提供至少三种亲本植物，其中至少一个第一和一个第二雄性亲本植物包含可选择标记物系统的组分；
(b)至少三种亲本植物的杂交；
(c)选择步骤(b)的存在标记物的后代；以及任选地，
(d)通过以下步骤产生无标记物的植物：
(i)步骤(c)的至少两个后代的杂交或自交；和
(ii)选择步骤(d)(i)的无标记物的后代。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述可选择标记物赋予除草剂，抗生素和/或抗代谢物抗性和/或可检测的，优选可见的输出，优选其中所述可选择标记物选自由bar基因和pat基因组成的除草剂抗性基因；和/或选自由nptII基因，hpt基因，acc3基因和aadA基因组成的抗生素抗性基因；和/或赋予抗代谢物抗性的基因，如dhfr基因；和/或选自GFP基因，YFP基因，CFP基因，BFP基因，Venus基因，dsRED基因，hcRED基因，mCherry基因，mPlum基因，mOrange基因，zoanFP基因，Cerulan基因，luc基因，cat基因，lacZ基因和uidA基因组成的生物报告基因，以及其修饰和/或增强的形式。
10.权利要求8或9的方法，其中所述至少一个第一和一个第二雄性亲本植物对于所述组分是纯合的。
11.能通过权利要求8-10中任一项的方法获得的多倍体植物，或所述植物的部分，组织，细胞，种子或后代。
12.权利要求8-10任一项的方法中的转基因植物及其后代的应用，其中所述转基因植物包含：
(i)稳定整合的表达盒，其中所述表达盒包含编码启动子的核苷酸序列，所述启动子优选为组成型启动子，所述启动子与编码能够调节靶核苷酸序列的反式激活因子的核苷酸序列可操作地连接，或者
(ii)稳定整合的第一表达盒，其包含编码启动子的核苷酸序列，所述启动子优选为组成型启动子，所述启动子与编码第一可选择标记物的核苷酸序列可操作地连接，所述可选择标记物表达时优选地提供抗生素，除草剂和/或抗代谢物抗性和/或报告基因表达。
13.转基因植物及其后代在权利要求8-10任一项方法中的应用，其中所述转基因植物包含：
(i)稳定整合的表达盒，其中所述表达盒包含能够被反式激活因子激活的靶核酸序列，所述靶核酸序列与编码可选择标记物的核苷酸序列可操作地连接，所述可选择标记物表达时优选地提供抗生素，除草剂和/或抗代谢物抗性和/或报告基因表达，或
(ii)稳定整合的第二表达盒，其包含编码启动子的核苷酸序列，所述启动子优选为组成型启动子，所述启动子与编码第二可选择标记物的核苷酸序列可操作地连接，所述第二可选择标记物表达时优选提供抗生素，除草剂和/或抗代谢物抗性和/或报告基因表达。
14.植物群，其包含权利要求8-10中任一项限定的至少三种亲本植物，优选权利要求12和13的转基因植物，以及第三种优选非转基因植物，所述非转基因植物优选在允许所述第三种植物作为雌性植物被权利要求12和13的转基因植物作为雄性植物的花粉授粉的条件下。
15.转基因三亲本植物及其后代，其包含
(i)稳定整合的第一表达盒，其包含编码启动子的核苷酸序列，所述启动子优选为组成型启动子，所述启动子与编码反式激活因子的核苷酸序列可操作地连接；和第二表达盒，其包含靶核苷酸序列，所述靶核苷酸序列被所述反式激活因子多肽激活，所述靶核苷酸序列可操作地连接至编码可选择标记物的核苷酸序列，或
(ii)稳定整合的第一表达盒，其包含编码启动子的核苷酸序列，所述启动子优选为组成型启动子，所述启动子与编码第一可选择标记物的核苷酸序列可操作地连接；和第二表达盒，其包含编码启动子的核苷酸序列，所述启动子优选为组成型启动子，所述启动子与编码第二可选择标记物的核苷酸序列可操作地连接，
优选地，其中可选择标记物在表达时提供抗生素，除草剂和/或抗代谢物抗性。

说明书全文

产生多倍体 植物的方法

发明领域

[0001] 本发明涉及杂交植物，尤其是多倍体植物，所述多倍体植物可通过杂交两种以上亲本植物的新方法获得，本发明还涉及此类植物的器官，组织，部分，细胞，种子或后代。此外，本发明涉及用于产生此类植物的标记物辅助的方法。

背景技术

[0002] 如今，农业部门面临着为不断增长的世界人口提供足够的食物，同时可耕地面积减少的巨大挑战。同时，由于农作物用于产生能量和作为化合物的替代物，因此对农作物的需求增加。因此，由于对农产品的需求增加，植物育种的关键任务是增加作物产量以及改善某些植物特性，例如耐热或抗虫害。如今，供应方便食品，如少籽茄子或甜瓜也变得越来越重要。植物的改良需要开发快速有效的育种程序以使其更经济。

[0003] 迄今为止，植物育种中的常用手段是两个亲本系的杂交，所述两个亲本系优选在遗传上是不同的，因为这可以通过杂交将赋予农业上有价值性状的不同种质组合在单个植物中。然而，两种不同亲本系的杂交并不总是产生阳性结果，而是可能导致杂交不相容性，引起后代的生长和生产力的受损，使后代不育甚至不能存活。在许多情况下，这种不相容性被引入在胚乳中，胚乳是种子中用于胚胎发育的培育组织，并且在中央细胞受精后形成。

[0004] 此外，植物耐受多余基因组拷贝的存在的能力被用于提高植物的作物产量，建立新的变种和形态或改善植物的遗传多样性以使它们有效地适应环境的变化。这些多余基因组拷贝可以通过数种机制在自然界中自发产生，包括减数分裂或有丝分裂失败，未减数(2n)配子的融合或体细胞染色体倍增，并且可以用于育种过程。例如，培育普通小麦以包含六组染色体，即是六倍体，与二倍体(2n)的野生小麦相比，其产生更高的作物产量。选择性繁殖和使用产生未减量小孢子和/或花粉粒的植物也是植物育种中众所周知的机制(参见例如国际申请公开WO2010/149322A1)。

[0005] 在许多植物中，二倍体精子中多余父本拷贝的基因渗入与后合子杂交的不相容反应有关。值得注意的是，这种所谓的三倍体限制被引入在胚乳中(Kohler等，Tends Genetic.26(2010)，142-148)并且可导致杂交体的死亡，活力降低或繁殖力降低。后一种现象用于例如繁殖少籽的三倍体植物，例如，通过四倍体与二倍体植物杂交产生茄子；参见例如国际申请公开WO2009/095266。然而，后代仍然来自两个亲本植物，即后代是双亲的，并且为了在后代中建立和组合不同植物来源的有利基因，仍然需要多个育种周期，并且最终不可能实现所需遗传信息的平均分配。另一方面，通过遗传工程定制植物的方法，即转基因植物可能并不总是能够实现的，因为作物中的许多性状是多基因的并且依赖于亲本植物的基因组背景。

[0006] 因此，对高性能植物，特别是杂种植物和多倍体植物存在需求，这些植物适用于以时间和成本有效的方式进行的育种计划以及获得这种植物的方法。通过权利要求中表征的实施方案解决了上述技术问题，这些实施方案在下面进一步描述并在实施例和附图中说明。

发明内容

[0007] 本发明总体上涉及可通过在一代内杂交超过两种亲本植物(多亲本杂交)获得的多倍体植物，以及进行这种多亲本杂交的新型标记物辅助的系统。更具体地，本发明涉及多亲本植物，优选三亲本植物及其在农业和农业经济学中的应用。本发明的多亲本植物由至少三种生殖细胞的融合产生，因此含有至少三种遗传上不同的亲本的全基因组，与简单来自遗传上三亲株的植物，即通过连续杂交获得的植物区别开来，连续杂交导致遗传材料与两个以上亲本的隔离。来自两个以上祖先植物的植物起源被称为多个亲本在进化时间尺度上的杂交。在这种情况下，遗传材料与两个以上亲本的隔离很容易通过以下连续的杂交来解释：A×B＝C；C×D＝E。这种连续的杂交模式既不涉及三种生殖细胞的融合，也没有任何后代具有三个亲生亲本。本发明的多倍体植物的多亲本-例如，三亲本来源与遗传三亲本的区别在于，根据本发明，三亲本植物来自三种生殖细胞的融合，因此含有三个遗传上不同的亲本的全基因组：A+B+C＝F。

[0008] 为了能够提供这种三亲本植物，根据本发明，建立了一种新的标记物辅助的系统，其被称为“高通量多亲本育种设计(HIPOD)方法”，这种方法可以通过在一代中杂交两种以上亲本植物产生多倍体植物，并且在下一代中产生不含标记物的多倍体植物。因此，本发明提供了多倍体植物，以及这种植物的器官，组织，部分，细胞，种子或后代，所述多倍体植物通过将一种雌性亲本植物与至少两种雄性亲本植物杂交而产生，其中雄性亲本植物可以是在遗传上相同的或不同的。

[0009] 虽然众所周知，数种植物耐受多余基因组拷贝的存在，但植物却进化出了阻碍超过两种配子融合的多精受精障碍，因为在大多数真核生物中，多精子是致命的，或者由于基因组不平衡导致生育能力降低甚至不孕，见上文。多精受精障碍在生殖过程中以不同的水平进行，动物和植物中发现的多精受精障碍的共同机制是卵细胞障碍，所述卵细胞障碍在配子融合后引入，并且施加了化学或物理障碍以降低其他精子进入的风险 (Iwao，Reproduction144(2012)，11-22；Scott等，Mol.Plant.1(2008)，611- 619；Jaffe，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88(1991)，9883-9887(1991))； Tsaadon等，Mol.Cell.Endocrinol.252(2006)，107-114；Spielman和Scott， Sexual Plant Reproduction21(2008)，53-65)。到目前为止，已经进行了水稻的体外研究，其中一种水稻植物的两个精子细胞与另一种水稻植物的卵细胞电融合，以研究可能有助于形成自体多倍体的途径(Toda等，Plant Physiol.171(2016)，206- 214)。然而，这种方法并未考虑用于繁殖具有不同雄性亲本的三倍体植物或在一般的植物育种中植入，特别是因为这种方法使用来自单一植物的精子细胞仍然产生双亲后代，而不是如本发明所述的多亲本植物。本发明的方法不整合天然存在的多精受精的植物内机制，而是基于纯合成的体外方法。因此，在一个实施方案中，在体外例如通过诸如Toda(2016)等人描述的水稻电融合产生的植物被具体排除在本发明之外。

[0010] 相比之下，如所附实施例中所阐明的，本发明的方法能够使包括至少两种不同雄性亲本系的三亲本系杂交，并产生可用于进一步育种程序的可存活后代。尤其是，本发明的方法包括用选择标记物的组分标记雄性亲本植物的每一种，将雄性亲本植物与雌性亲本植物杂交并选择存在可选择标记物的后代，所述可选择标记物当在单个植物中组合时优选赋予除草剂抗性和/或荧光。或者，本发明的方法包括用不同的可选择标记物标记雄性亲本植物的每一种，使雄性亲本植物与雌性亲本植物杂交，并选择存在两种不同的可选择标记物的后代，所述两种不同的可选择标记物当在单个植物中组合时优选分别赋予除草剂和抗生素抗性，并可能组合荧光。有利地，由于本发明方法的F1后代对于可选择标记物基因是杂合的，但就其多倍性而言是“纯合的”，即三亲本自交或F1代杂交尤其产生无标记物基因的F2代植物，所述F2代植物不带有任何对植物来说是外源的DNA。因此，本发明还提供了在下一代中不含标记物的多倍体植物。此外，本发明的方法可用于将不相容的至少一种雄性亲本植物与雌性亲本植物杂交。因此，本发明的方法通过提供来自相容和不相容杂交配偶体的精子适合于克服被子植物中的杂种不相容性甚至是物种障碍。

附图说明

[0011] 参考附图和序列描述了本发明的实施例。

[0012] 图1：用于产生多亲本，优选三亲本多倍体植物的高通量多亲本育种设计(HIPOD)方法的建立。(A)本发明的HIPOD方法包括提供至少三种亲本植物，其中至少一种第一和第二雄性亲本植物包含可选择标记物系统的组分，例如由NOS或RPS5a非特异性启动子驱动的合成转录因子mGAL4(第一组分，灰色)，该转录因子反式激活UAS启动子，所述UAS启动子驱动赋予除草剂YFP-标记的BAR-基因(第二组分，黑色)，当通过精子细胞和卵细胞融合而组合时产生BASTA抗性。当然，如本发明说明书中所述，也可以使用两种以上的组分和雄性亲本植物来补充可选择的表型，以及因此例如后代中的四亲本，四倍体或八倍体植物。或者，如说明书中所概述的，至少两种雄性亲本植物可各自包含不同的可选择标记物，例如分别赋予对除草剂和抗生素的抗性基因，当通过精细胞和卵细胞的融合组合时产生抗至少两种选择标记物的植物。(B)将来自花粉供体1(PD1)和花粉供体2(PD2)(分别为灰色和黑色)、带有双组分系统的各个组分的花粉施加到雌蕊的柱头。来自两个不同父本(分别为灰色和黑色)的两个精子细胞与卵细胞融合，但不是单精受精，能够反式激活，从而产生除草剂抗性的F1植物。 (C)用pRPS5a::mGAL4-VP16(左)，pUAS::BASTA_YFP(中)或用pRPS5a::mGAL4- VP16和pUAS::BASTA_YFP(右)共转化的原生质体的荧光显微镜检查。(D)由 pRPS5a::mGAL4-VP16/+(左)自交，pUAS::BASTA_YFP/+(中间)自交，以及 pRPS5a::mGAL4-VP16/-和pUAS：：BASTA_YFP/-(右)之间的杂交产生的除草剂处理的F1植物。(E)由pRPS5a::mGAL4-VP16/+(左)的自交，pUAS::BASTA_YFP/+(中) 的自交，以及pRPS5a::mGAL4-VP16/-和pUAS::BASTA_YFP/-(右)的杂交产生的F1植物萼片中的YFP荧光。比例尺15μm(C)，0.2cm(D)和50μm(E)。

[0013] 图2：具有三个亲本(HIPOD)的植物的产生。(A)除草剂处理的二倍体野生型植物 (左)的后代和经本发明的HIPOD方法产生的植物(右)。(B)二倍体野生型植物 (左)和经HIPOD方法产生的植物(右)的YFP荧光。(C)如下样品中靶向 pUAS::BASTA_YFP(黑色)和pRPS5a::mGAL4-VP16(灰色)的多重PCR：(1)经HIPOD 产生的除草剂抗性植物，(2)pUAS::BASTA_YFP/+，(3)pRPS5a::mGAL4-VP16/+， (4)pUAS::BASTA_YFP/-，pRPS5a::mGAL4-VP16/-，(5)水对照，(6)野生型对照。产生所分析的F1植物的杂交方案显示在图中。(D)二倍体野生型植物(上图)，三倍体野生型植物(中图)和经HIPOD产生的除草剂抗性植物(下图)的流式细胞术分析。(E)DAPI染色的二倍体野生型植物(左)和经HIPOD产生的植物(右)的染色体分散。比例尺0.4cm(A)，100μm(B)和5μm(C)。

[0014] 图3：多精受精产生可存活三亲本植物。(A)双亲本二倍体植物(2n BP)，从 2n×4n杂交(3n BP)回收的双亲本三倍体植物和除草剂抗性三倍体三亲本植物(3n TP)之间的生长高度比较。(B)，(C)2n BP，3n BP和3n TP植物的花序和花。(D) 2n BP(n＝19)，3n BP(n＝15)和3n TP植物(n＝7)的生长高度。(E)2n BP (n＝68)，3n BP(n＝101)和3n TP植物(n＝
104)的花瓣大小。(F)2n BP(n＝89)， 3n BP(n＝58和3n TP植物(n＝107))的萼片大小。(G)
2n BP(n＝24)，3n BP (n＝112)和3n TP(n＝93)植物中花瓣表皮细胞的大小。(H)，(I)2n BP(n＝19)， 3n BP(n＝19)和3n TP(n＝39)植物的Silique分析显示可育胚珠(黑色箭头)，不育胚珠(白色箭头)和败育胚珠(白色箭头)。(J)2n BP，3n BP和3n TP的花瓣表皮细胞。
(K)2n BP，3n BP和3n TP的种子形态。比例尺2cm(a)；1mm(b，c)； 0.5mm(h)；5μm(j)；0.5mm(k)。图(i)显示平均值±s.d.P值(***P<0.001) 通过t检验报告显著性。箱形图显示中位数，四分位数，最大值和最小值，异常值：Z ＞+/-3。

[0015] 图4：三种材料的多精子受精诱导的杂交。(A)使用HIPOD经三种材料(Col-0，C24 pRPS5a::mGAL4-VP16/+和Ler pUAS::BASTA_YFP/+)(3n TP)杂交产生的除草剂抗性植物。(B)二倍体双亲本植物(2n BP)和三倍体三亲本植物(3n TP)的YFP荧光分析。(C)2n双亲本(2n BP)，3n双亲本(3n BP)和3n TP的流式细胞术分析。(D) 在(1)3n TP，(2)Col-0(浅灰色)，(3)Ler(黑色)和(4)C24(灰色)中不同染色体(Chr.)上的材料特征性RFLP的分析。产生所分析的F1植物的杂交方案显示在图中。比例尺：1cm(A)；100μm(B)。

[0016] 图5：使用多精受精避免杂交不相容性。本发明的方法能够将至少两种雄性亲本植物与一种雌性亲本植物杂交，其中雄性亲本植物中的一种与雌性亲本植物不相容。尤其是，首先使用相容的杂交配偶体，并且相应的受精将为卵子和中央细胞二者提供相容的精子。此外，或稍后，将第二个不相容的配偶体的花粉施加于柱头上。不相容的杂交配偶体的遗传材料将被提供给卵细胞，但不提供给中央细胞，并且避免了胚乳触发的杂种不相容性。因此，卵细胞中的多精受精将允许不相容的精子的传播，同时避免了胚乳触发的杂交不相容性。左图表示相容杂交；中图显示不相容的杂交；右图显示两个父本杂交以避免胚乳中的杂交障碍。相容的精子细胞(灰色)和不相容的精子细胞 (黑色)。

[0017] 定义

[0018] 首先，整个说明书中使用的一些术语的定义如下。

[0019] 术语“杂交的”或“杂交”是指配子通过授粉融合产生后代并包括有性杂交(一种植物被另一种植物授粉)和自交(自花授粉，例如，当花粉和胚珠来自同一植物个体时)。术语“杂交”是指通过授粉将配子融合以产生后代的行为。因此，术语“一种雌性亲本植物与一种以上雄性亲本植物的杂交”与“用两个以上精子细胞受精一个卵细胞”可互换使用。当然，在被子植物中，“杂交”还包括用来自雄性亲本植物的精子细胞受精胚乳，优选在多亲本杂交的情况下，用来自第一种雄性亲本植物的精子细胞受精胚乳。

[0020] 本说明书中使用的术语“栽培种”是指由人工选择和育种的植物或植物组，其具有可通过繁殖维持的所需特征，例如大小，颜色，产量，抗病性，味道等。因此，栽培品种是独特的，均匀的和稳定的。栽培种是同一物种中的亚组。因此，对于未栽培的植物(野生植物)使用术语“品种”。

[0021] 本说明书中使用的“开花植物”和“被子植物”是产生种子的植物(种子植物)，并且通过数种特征区别于其他产生种子的植物(裸子植物)，所述数种特征包括存在开花器官，具有两对花粉囊的雄蕊，减少的雄性和雌性配子体，围绕胚珠的封闭心皮和胚乳形成，其中胚乳是开花植物种子内的高营养组织并为胚提供营养。

[0022] 在编码序列，启动子和其它遗传元件的上下文，术语“异源”表示该元件源自与其进行比较的实体的其余部分的基因型不同的实体。

[0023] 术语“杂合的”是指给定个体的遗传状况，其中不同的等位基因位于同源染色体上的相应基因座上。术语“纯合的”的遗传状况是指其中相同的等位基因位于同源染色体上的相应基因座上。

[0024] 在植物育种的背景下，术语“杂交”可以与“杂种杂交”交替使用，并且意指通过杂交不同品系或品种或物种的植物产生的两个遗传上不同的亲本植物之间的杂交，包括但不限于两个近交系(例如，遗传上杂合的或大部分杂合的个体)之间的杂交以产生杂种植物(后代)。

[0025] 术语“杂种不相容性”通常用作杂种无活力和不孕的总称。这种不相容性可以在生殖过程的不同水平上引入。可以区分由于杂交配偶体的倍性状态的差异而发生的杂种不相容性和“内在的”杂种不相容性，“内在的”杂种不相容性是指在没有倍性差异或分离谱系的表观生态因子的情况下发生。后者被认为是由于新衍生的等位基因之间的负异位显性，这些新衍生的等位基因是分离出现但对其他分支谱系的遗传背景功能失调。例如，杂种种子无活力(败育)是许多植物群体中常见的早期种间障碍，并且经常归因于胚乳中品种特异性的改变。

[0026] 在本申请的上下文中，术语“后代”植物是指作为来自一种或多种亲本植物的有性生殖的后代而产生的任何植物或其后代。例如，后代植物可以通过杂交两种或更多种亲本植物而获得，并且包括自交以及F1或F2代或更进一步的后代。

[0027] 如果遗传元件处于允许它们按照其预期功能的方式操作的结构关系中，则称其为“可操作地连接”。例如，如果启动子有助于启动编码序列的转录，则编码序列可以被称为与启动子可操作地连接(或在其控制下)。在启动子和编码区之间可能存在间隔序列，只要能保持这种功能关系。

[0028] 除非另有说明，否则本发明的“植物”是在任何发育阶段的植物，优选种子植物，包括双子叶植物和单子叶植物，优选开花植物。“植物器官”是指例如叶，茎，根，根尖，芽，分生组织，胚，花药，胚珠，种子，花或果实。

[0029] 术语“植物部分”是指植物的一部分，包括但不限于单细胞和细胞组织，例如植物中完整的植物细胞，细胞团块和组织培养物，植物可以从中再生。植物部分的实例包括但不限于来自花粉，胚珠，叶，胚，根，根尖，花药，花，果实，茎芽和种子的单细胞和组织；以及花粉，胚珠，叶，胚，根，根尖，花药，花，花序，果实，茎，枝条，接穗，砧木，种子，原生质体，愈伤组织等。术语“植物细胞”或“植物的细胞”用于描述例如含有细胞壁的分离的细胞或其聚集体或原生质体。

[0030] “多倍体”定义了一种状态，其中细胞中存在两组以上的染色体，而“三倍体”植物细胞具有三组染色体，“四倍体”植物细胞四组染色体，“五倍体”五组染色体，[0031] “六倍体”六组染色体，“七倍体”七组染色体，“八倍体”八组染色体，“九倍体”九组染色体，“十倍体”十组染色体，“十一倍体”十一组染色体，“十二倍体”十二组染色体。

[0032] 称为“启动子”的特定基因序列，如NOS启动子，RP5Sa启动子或UAS启动子，是衍生自基因的多核苷酸序列，所述基因启动可操作连接的基因表达产物的转录。已经认识到，上游和内含子非翻译基因序列的多个部分在某些情况下可以通过提供RNA聚合酶的结合结构域和通过启动DNA的转录来促进启动子活性。启动子含有作为基因表达调节剂的其他元件(例如顺式调节元件)。除非明确限制，启动子可以基于具有该基因的任何物种的基因序列，并且可以包含所需的任何添加，取代或缺失，只要保持了促进靶组织中的转录的能力即可。

[0033] 出于本说明书的目的，术语“多精受精”是指用超过一种精子细胞对一种卵细胞受精，所述超过一种精子细胞可以来自不同的花粉管，并且不与“双受精”混淆，所述“双受精”是被子植物中一种众所周知的机制，不仅包括卵细胞的受精，还包括与包含两个极核的与卵相邻的中央细胞的受精，以产生胚营养组织，即通常为三倍体的胚乳。这种双受精所需的两个精子细胞由单个花粉管递送。此外，在本发明的上下文，不要将多精受精与“生理多精受精”相混淆，在生理多精受精中允许数个精子细胞进入卵细胞，但只有一个精子核参与合子核的形成，而其他精子核经历变性。

[0034] “转基因植物”是指用至少一种多核苷酸，优选异源多核苷酸稳定转染的植物。优选地，多核苷酸是稳定整合的，这意味着整合的多核苷酸在植物中稳定维持，表达并稳定传递给后代。多核苷酸稳定整合到植物基因组中也包括整合到前一代亲本的基因组中，其中多核苷酸是稳定遗传的。

[0035] 本发明涉及在[1]至[19]项中表征并在实施例中说明的实施方案。

[0036] [1]可通过将一种雌性亲本植物与至少两种雄性亲本植物杂交而获得的多倍体植物。

[0037] 由于通常已知开花植物为有性繁殖并因此携带来自雄性和雌性亲本植物的遗传物质，并且因为已知植物表现出多精受精障碍以阻止由于可能发生的不相容性反应，卵细胞被一个以上的精子细胞受精，以前没有考虑过繁殖具有两个以上亲本的多倍体植物。如本发明所述，本发明人开发了一种高通量多亲本育种设计(HIPOD)方法，用于产生具有两个以上亲本的多倍体植物，即通过被称作多精受精的用两个以上精子细胞对一个卵细胞受精而产生多亲本植物。因此，本发明提供了多倍体植物，其特征在于是通过一种雌性亲本植物与一种以上的雄性亲本植物杂交获得的，本发明还提供了通过所述杂交获得的，以及从其中发育植物而获得的多倍体种子。雄性亲本植物可以是遗传上不同的或遗传上相同的。在下文中，当提及本发明的植物时，除非另有说明，否则还包括植物也从其发育的种子。

[0038] [2][1]的多倍体植物，其是三亲本植物。

[0039] 在一个实施方案中，本发明的多倍体植物是通过将一种雌性植物与两种，三种，四种，五种，六种，七种，八种，九种或十种雄性亲本植物杂交而获得的。优选地，所述多倍体植物通过三个亲本植物的杂交获得，即通过一种雌性亲本植物与两种雄性亲本植物杂交获得，也称为三亲本。

[0040] [3][1]或[2]的多倍体植物，其中亲本植物是二倍体或四倍体和/或多倍体植物是三倍体或六倍体。

[0041] 在一个实施方案中，本发明的多倍体植物包含三组，四组，五组，六组，七组，八组，九组，十组，十一组或十二组染色体，即是三倍体，四倍体，五倍体，六倍体，七倍体，八倍体，九倍体，十倍体，十一倍体或十二倍体，并且通过将一种雌性亲本植物与两种，三种，四种，五种，六种，七种，八种，九种或十种雄性亲本植物杂交获得，其中可以在具有不同倍性的亲本植物之间发生杂交，即亲本植物可以是单倍体，二倍体，三倍体，四倍体，五倍体，六倍体，七倍体，八倍体，九倍体，十倍体，十一倍体或十二倍体。优选地，本发明的多倍体植物是三倍体或六倍体，并且是通过三个二倍体或四倍体亲本植物的杂交，即由一个二倍体或四倍体雌性亲本植物与两个二倍体或四倍体雄性亲本植物的杂交而获得的。

[0042] 此外，本发明的多倍体植物是能存活的。在关于通过一种二倍体雌性亲本植物与两个二倍体雄性亲本植物杂交而产生的三倍体拟南芥植物的表型特征的实验中，已经显示三亲本植物的总植物大小增加了1.5倍，并且植物产生与二倍体双亲本植物相比更大的花序和花；参见图3(A)-(D)。此外，发现与二倍体植物相比，三亲本植物产生显著更大的器官。此外，花瓣和萼片的大小分别增加了20.7％和17.0％；参见图3(E) 和(F)。总之，与二倍体双亲本植物相比，本发明的多倍体植物表现出整株植物大小的增加，及其花序，花，器官，花瓣和萼片大小的增加。

[0043] 三倍体植物中减数分裂的固有后果是非整倍性，即染色体数目的不平衡。事实上，已经观察到三亲本三倍体植物的生育力，与双亲本三倍体类似，显著降低，并伴随着分离出皱缩和畸形的胚珠和种子；参见图3(H)，(I)和(K)。因此，本发明的三亲本植物也可用于少籽果实例如无籽瓜的育种。然而，在其他世代中，三倍体植物在二倍体，三倍体和四倍体植物中分离出来，其中二倍体植物和四倍体植物不患有非整倍性诱导的不育。

[0044] [4][1]-[3]中任一项的多倍体植物，其中至少两种雄性亲本植物在遗传上是不同的，优选其中它们属于不同的栽培种或品种。

[0045] 在另一个实施方案中，提供了本发明的多倍体植物，其通过将一种雌性亲本植物与至少两种雄性亲本植物杂交而获得，其中两种雄性亲本植物在遗传上是不同的，优选其中它们属于不同的栽培种或品种。因此，在野生植物群的情况下，虽然不同的品种属于同一个种并且因此可以相互育种，但一般来说这不会自然发生，因为它们通常来自不同的区域；即，它们在地理上是隔离的和/或它们是生殖隔离的。对于植物育种而言，这开辟了在一代内增加栽培植物的遗传多样性的新的可能性，并且由于所有三个配偶体的染色体在多亲本多倍体植物中同等体现的事实，这在传统的双亲本杂交中是不可能的，因为这需要两代，性状和蛋白质产品是平衡的，从而对该育种过程的结果具有更好的可预测性。

[0046] [5][1]-[4]中任一项的多倍体植物，其中至少一种雄性亲本植物与雌性亲本植物不相容。

[0047] 本发明的方法甚至允许杂交不相容的栽培种或品种或甚至不同的种。由于最近的学说教导了杂种不相容性通常引入在胚乳中，或者是由于存在两个亲本基因组拷贝，例如在用二倍体精子细胞受精时可能发生的，或由于杂交配偶体的特定基因之间的遗传不相容性，不希望受理论限制可以想象多精受精诱导的三倍体胚胎在种子中发育，其中胚乳未接受额外的亲本拷贝，可以绕过三倍体限制。这个原理在图5中示出并在下面进一步描述。

[0048] 因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的多倍体植物是通过将一种雌性亲本植物与至少两种雄性亲本植物杂交而获得的，其中至少一种雄性亲本植物与雌性亲本植物不相容。

[0049] [6][1]至[5]中任一项的多倍体植物，其是开花植物。

[0050] 已经用拟南芥(Arabidopsis thaliana)进行了实现三亲本杂交的实验。由于拟南芥在本领域中公知是高等植物特别是被子植物，即开花植物的模型植物，产生多亲本多倍体拟南芥植物的能力可以转移到其他被子植物中。因此，根据一个实施方案，本发明包括与拟南芥接近的多倍体被子植物。

[0051] [7][1]至[6]中任一项的多倍体植物，其是双子叶植物或单子叶植物。

[0052] 在一个优选的实施方案中，本发明涉及通过杂交超过两种亲本植物而获得的多倍体双子叶植物和单子叶植物。尤其是，本发明包括作物植物和栽培植物，其中第一种包括栽培植物以及非栽培植物(野生植物)并且包括人类直接或间接使用的所有植物，例如作为食品，药品，奢侈食品，作为牲畜的饲料或木材供应者，并且其中后者，即栽培植物是指由人工种植和繁殖并用作农作物或观赏植物的植物。这些栽培植物包括粮食作物，工业作物(例如纤维作物)，饲料作物和观赏植物。这些栽培植物的重要特征尤其是植物大小的增加，特别是所用植物器官的大小的增加，苦味化合物的缺失，害虫抗性和/或高营养含量。更优选地，在一个实施方案中，本发明涉及选自下述植物的植物。

[0053] [8][1]至[7]中任一项的多倍体植物，其选自玉米属(Zea)，茄属(Solanum)，小麦属(Triticum)，小黑麦属(Triticale)，向日葵属(Helianthus)，黑麦属(Secale)，大麦属(Hordeum)，芸苔属(Brassica)，短柄草属(Brachypodium)，大豆属 (Glycine)，棉花属(Gossypium)，高粱属(Sorghum)，甘蔗属(Saccharum)，狗尾草属(Setaria)，山羊草属(Aegilops)，稻属(Oryza)，胡萝卜属(Daucus)，桉树属(Eucalyptus)，赤藓属(Erythranthe)，螺旋狸藻属(Genlisea)，芭蕉属 (Musa)，燕麦属(Avena)，烟草属(Nicotiana)，咖啡属(Coffea)，葡萄属 (Vitis)，黄瓜属(Cucumis)，桑属(Morus)，Crucihimalaya，碎米荠属 (Cardamine)，独荇菜属(Lepidium)，荠菜属(Capsella)，奥利马鞭草属 (Olmarabidopsis)，南芥菜属(Arabis)，萝卜属(Raphanus)，芝麻菜属(Eruca)，柑橘属(Citrus)，麻风树属(Jatropha)，胡杨属(Populus)，Beta和木薯属(Manihot)，优选地，其中所述植物选自玉米(Zea mays)，马铃薯(Solanum tuberosum)，小麦(Triticum aestivum)，硬粒小麦(Triticum durum)，匍匐小麦(Triticum spelta)，向日葵
(Helianthus annuus)，黑麦(Secale cereale)，大麦(Hordeum vulgare)，球茎大麦(Hordeum bulbosum)，欧洲油菜(Brassica napus)，甘蓝(Brassica oleracea)，白菜(Brassica rapa)，芥菜(Brassica juncacea)，雪里蕻(Brassica nigra,)，大豆(Glycine max)，棉(Gossypium sp.)，高粱(Sorghum bicolor)，小黑麦(Triticale)，甘蔗(Saccharum officinarium)，意大利狗尾草(Setaria italica)，水稻(Oryza sativa)，小粒野生稻(Oryza minuta)，澳洲野生稻(Oryza australiensis)，高杆野生稻(Oryza alta)，二穗短柄草(Brachypodium distachyon)，海大麦(Hordeum marinum)，山羊草(Aegilops tauschii)，Daucus glochidiatus，Daucus pusillus，Daucus muricatus，胡萝卜 (Daucus carota)，巨桉(Eucalyptus grandis)，Erythranthe guttata，Genlisea aurea，芭蕉属(Musa sp.)，燕麦属(Avena sp.)，美花烟草(Nicotiana sylvestris)，烟草(Nicotiana tabacum)，绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)，番茄(Solanum lycopersicum)，中果咖啡(Coffea canephora)，葡萄(Vitis vinifera)，黄瓜(Cucumis sativus)，川桑(Morus notabilis)，须弥芥(Crucihimalaya himalaica)，卵叶须弥芥(Crucihimalaya wallichii)，弯曲碎米荠(Cardamine flexuosa)，北美独行菜(Lepidium virginicum)，荠菜 (Capsella bursa-pastoris)，小拟南芥(Olimarabidopsis pumila)，硬毛南芥 (Arabis Hirsuta)，萝卜(Raphanus sativus)，水泡芥(Eruca vesicaria sativa)，甜橙(Citrus sinensis)，麻疯树(Jatropha curcas)，毛白杨 (Populus trichocarpa)，甜菜(Beta vulgaris)和木薯(Manihot esculenta)。

[0054] [9]如[1]至[8]中任一项所定义的多倍体植物群。

[0055] 此外，本发明提供如上所述的多倍体植物群，其中所述植物群包含7，10，20，50， 100，500，1000，2000，5000，10000或甚至更多的所述多倍体植物，并且其中非多亲本植物的比例最多为75％，但优选小于50％，更优选小于25％，甚至更优选小于 10％，最优选小于
1％。

[0056] [10][1]至[8]中任一项的植物的器官，部分，组织，细胞，种子或后代。

[0057] 在另一个实施方案中，本发明还涉及本发明的多倍体植物的器官，部分，组织，细胞，种子或后代。

[0058] [11]产生[1]至[8]中任一项的多倍体植物的方法，包括：

[0059] (a)提供至少三种亲本植物，其中至少第一和第二雄性亲本植物包含选择性标记物系统的组分；

[0060] (b)杂交至少三种亲本植物；

[0061] (c)选择存在标记物的由步骤(b)获得的后代；并且任选地，

[0062] (d)通过以下步骤产生无标记物的植物：

[0063] (i)步骤(c)的后代中的至少两种的杂交或自交；以及

[0064] (ii)选择步骤(d)(i)没有标记物的后代。

[0065] 本发明的方法，即HIPOD方法在图1中说明，并且包括作为第一步的产生至少两种转基因雄性亲本植物或植物系，其中每一种包含的组分在精子-卵子融合期间一起产生在后代中表达的可选择标记物。优选根据本发明使用的可选择标记物系统的组分衍生自所谓的生物酵母双杂交系统，该系统最初开发用于研究蛋白-蛋白和蛋白-核酸相互作用，该系统同时也已被建立作为用于控制植物中基因表达的手段；参见例如欧洲专利申请 EP0589841A2中描述的表达盒。此外，双杂交系统已进一步开发为三/三杂交系统；参见例如，Putz等，Nucleic Acids Research 24(1996)，4838-4840和Cottier等，Front Plant Sci2(2011):101。三杂交系统可类似地根据本发明的方法的双杂交系统进行调整，从而提供三组分，所述三组分允许三种雄性亲本系与一种雌性植物杂交产生四亲本，例如四倍体或八倍体植物，所述每个三亲本系携带三组分中的一种。此外，根据本发明使用的可选择标记物系统的组分也可以来自用于植物中调节的基因表达的转录激活系统，其最初由Moore等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)，376-381)描述，并且多年来一直在适应和改进。基于此，已经建立了用于调节基因表达的pOp6/LhGR 和pOp/LhG4系统，并且是本领域已知的；参见例如Craft等(Plant J.41(2005)， 899-918)和Samalova等(Plant J.41(2005)，
919-935)。或者，可选择标记物系统的组分可以由两种不同的可选择标记物组成，所述可选择标记物例如为赋予除草剂和抗生素抗性基因，当通过精子细胞和卵细胞的融合组合时，产生对至少两种可选择标记物有抗性的植物。

[0066] 因此，本发明的方法可以包括以下步骤：

[0067] (a1)用第一组分转化第一亲本植物细胞，所述第一组分例如为表达盒，所述表达盒包含编码5'-调节区的核苷酸序列，例如，植物细胞中有活性的启动子，所述启动子与编码反式激活因子多肽的核苷酸序列可操作地连接；从所述第一转化的植物细胞再生转化的植物，亲本1；

[0068] (a2)用第二种组分转化第二亲本植物细胞，所述第二组分例如为表达盒，所述表达盒包含能够被所述反式激活因子多肽活化的靶核苷酸序列，所述靶核苷酸序列与编码可选择标记物的核苷酸序列可操作地连接，所述可选择标记物例如在表达时提供抗生素，除草剂和/或抗代谢物的抗性；从所述第二转化的植物细胞再生转化的植物，亲本2；和[0069] (b)将所述亲本1和亲本2作为雄性亲本植物与雌性植物杂交以获得多倍体，三亲本后代。

[0070] 如上所述，原则上欧洲专利申请EP0589841A2中描述的构件和方法，例如表达盒，可以用于本发明的方法，除了代替花药特异性5'-调节区，可以使用组成型启动子，例如实施例中使用的35S或NOS启动子，而不是编码反义RNA的核苷酸序列或在表达时破坏有活力的花粉形成的多肽，使用编码提供可选择的表型，例如BAR基因或荧光蛋白的产物的核苷酸序列。因此，为了实现根据本发明使用的标记物系统所必需和足够的组分是本领域公知的。此外，如上所述，可以使用两个以上的雄性亲本植物来产生多亲本植物，例如使用三杂交组分系统，其可以包括以下步骤：

[0071] (a1)用第一组分转化第一亲本植物细胞，所述第一组分例如为表达盒，所述表达盒包含编码5'-调节区的核苷酸序列，例如，植物细胞中有活性的启动子，所述启动子与核苷酸序列可操作地连接，所述核苷酸序列编码包含二聚体结构域的反式激活因子多肽的第一部分；以及从所述第一转化的植物细胞再生转化的植物亲本1；

[0072] (a2)用第二组分转化第二亲本植物细胞，所述第二组分例如为表达盒，所述表达盒包含编码5'-调节区的核苷酸序列，例如，植物细胞中有活性的启动子，所述启动子与编码反式激活因子多肽的第二部分的核苷酸序列可操作地连接，所述反式激活因子多肽包含与(a1)的反式激活因子多肽的第一部分的二聚体结构域二聚化的二聚化结构域；以及从所述第二转化的植物细胞再生转化的植物亲本2；

[0073] (a3)用第三组分转化第三亲本植物细胞，所述第三组分例如为表达盒，所述表达盒包含能够被(a1)和(a2)的反式激活因子多肽二聚体激活的靶核苷酸序列，所述二聚体与编码可选择标记物的核苷酸序列可操作地连接，所述可选择标记物表达时例如提供抗生素，除草剂和/或抗代谢物抗性；以及从所述第三转化的植物细胞再生转化的植物亲本3；以及

[0074] (b)将所述亲本1，亲本2和亲本3作为雄性亲本植物与雌性植物杂交以获得多倍体，四亲本后代。

[0075] 因此，原则上，步骤(a1)和(a2)可以通过设计标记物系统扩展到(a2+n)以获得多倍体(2+n)+1-亲本后代，使得(2+n)组分必须以协调的方式起作用，以便在组合在单个植物中时产生可选择标记物。

[0076] 在另一个实施方案中，本发明的方法包括作为第一步的产生至少两种转基因雄性亲本植物或植物系，所述亲本植物或植物系的每一种包含不同的可选择标记物，它们在精子-卵子融合期间一起产生对至少两种可选择标记物的抗性。

[0077] 因此，本发明的方法可以包括以下步骤：

[0078] (a1)用第一组分转化第一亲本植物细胞，所述第一组分例如为表达盒，所述表达盒包含编码5'-调节区的核苷酸序列，例如，植物细胞中有活性的启动子，所述启动子与编码第一可选择标记物的核苷酸序列可操作地连接；以及从所述第一转化的植物细胞再生转化的植物亲本1；

[0079] (a2)用第二组分转化第二亲本植物细胞，所述第二组分例如为表达盒，所述表达盒包含编码5'-调节区的核苷酸序列，例如，植物细胞中有活性的启动子，所述启动子与编码第二可选择标记物的核苷酸序列可操作地连接；以及从所述第一转化的植物细胞再生转化的植物亲本2；以及

[0080] (b)将所述亲本1和亲本2作为雄性亲本植物与雌性植物杂交以获得多倍体，三亲本后代。

[0081] 此外，如上所述，可以使用两种以上的雄性亲本植物来产生对多种可选择标记物具有抗性的多亲本植物。

[0082] 有利地，本发明方法的F1后代对于可选择标记物基因是杂合的，但就其多倍性而言是“纯合的”，例如，三亲本的。通常，具有3组染色体(ABD)的三倍体杂种和具有不均匀染色体组的植物通常具有降低的生育力并且可能是不育的。然而，如实施例4 中所述和图3H所示，根据本发明产生的三亲性植物显示可育的胚珠，因此可以通过自交进行产生。此外，由于未减数配子的产生或染色体组的体细胞倍增，可以获得可育的F1后代。例如，不育杂种幼苗可以用G2/M细胞周期抑制剂处理，所述G2/M细胞周期抑制剂例如为微管聚合抑制剂，如秋水仙碱，诺可达唑(nocodazole)，5二苯基胺，氟乐灵(trifluraline)和长春碱硫酸盐(vinblastine sulphate)，以产生染色体数量为两倍的植物，从而恢复生育力。使用秋水仙碱产生具有两倍染色体的植物，例如从具有3组染色体的不育三倍体黑麦/小麦杂种产生小黑麦的可育六倍体(6n)形式，是本领域熟知的并且同时也应用于其它植物；参见例如关于玉米的国际申请公布 WO2013/011507A1，关于茄子的WO2009/095266A1，关于大黄花(Miscanthus x giganteus)的WO2012/145248A1和Faleiro等的(Plant Cell,Tissue and Organ Culture (PCTOC)124(2016),57-67)。

[0083] 然后，六倍体形式的三亲本植物的自交将产生典型的F2的后代分离，包括三亲本但不含标记物基因系统的组分的植物，即不含(不同的)标记物或其部分，因而是非转基因的。因此，在另外的步骤中，本发明的方法包括F1代的自交，尤其导致无标记物基因的F2植物缺失对该植物来说外源的任何DNA。或者，同时存在产生无标记物的转化的/转基因植物的技术，例如CRISPR-Cas系统(参见，例如，Lowder等，Plant Physiology169(2015)，971-985)和cre/lox位点-特异性重组(参见，例如，Wang等， Transgenic Res.14(2005)，605-
614)，尽管不太优选，但可用于产生无标记物的植物。

[0084] 因此，本发明总体来说涉及产生多亲本多倍体植物的方法，包括(a)提供两种以上的亲本植物，其中(i)每种雄性亲本植物包含可选择标记物系统的一部分组分，或(ii) 每种雄性亲本植物包含不同的可选择标记物；(b)两种以上亲本植物的杂交；(c) 选择步骤(b)获得的存在标记物的后代；和任选的(d)通过(i)杂交或自交步骤(c) 的后代中的至少两个来产生无标记物的植物；(ii)选择步骤(d)(i)的不存在标记物的后代。

[0085] 用于产生转基因植物的构件和方法，包括双子叶植物和单子叶植物的转化是本领域已知的，参见例如Plant Cell and Tissue Culture-A Tool in Biotechnology:Basics and Application,Springer 2009 ISBN 978-3-540-93883-5。用于增强双子叶植物和单子叶植物中外源基因表达的有效启动子盒是本领域公知的；参见，例如，Mitsuhara等，Plant Cell Physiol.37(1996)，49-59和Potenza等，In Vitro Cellular&Developmental Biology-Plant 40(2004)，1-22，后者是综述。同样，自20世纪80年代以来，通过表达解毒酶在植物中对除草剂抗性进行工程化是众所周知的，参见，例如，De Block等， EMBO J.6(1987)，2513-2518和Miki等，J.Biotechnol，107(2004)，193-232，后者是综述。用于构建植物载体和产生本发明的转基因植物的具体实例描述于实施例1,2 和3中，并且可根据目标的可选择标记物进行调整。

[0086] 因此，在一个实施方案中，本发明的方法大体上涉及一种方法，所述方法包括将一种雌性亲本植物与一种以上的雄性亲本植物杂交，其中所述雄性亲本植物各自包含可选择标记物系统的一部分，所述可选择标记物系统的一部分当在一种单一的植物中存在时允许对所述植物进行选择。

[0087] 在将包含可选择标记物系统的单个部分的转基因雄性亲本植物与雌性亲本植物杂交后，进行幼苗的选择。由单精受精产生的幼苗，即来自雌性亲本植物与仅一种雄性亲本植物的杂交，被赋予对可选择标记物的敏感性。相比之下，只能由多精受精产生的两种构建体的组合将产生对可选择标记物的抗性或显示出可选择的表型。

[0088] 在另一个实施方案中，本发明的方法包括将一种雌性亲本植物与一种以上的雄性亲本植物杂交，其中所述雄性亲本植物各自包含不同的可选择标记物，当存在于一种单一植物中时允许选择存在这些标记物的所述植物。

[0089] 在将包含不同的可选择标记物的转基因雄性亲本植物与雌性亲本植物杂交后，进行幼苗的选择。由单精受精产生的幼苗，即来自雌性亲本植物与仅一种雄性亲本植物的杂交，仅对一种雄性亲本植物中包含的一种可选择标记物具有抗性。相反，只能由多精受精产生的两种构建体的组合将产生对不同可选择标记物具有抗性或显示出可选择表型的植物。优选地，使用赋予除草剂抗性的第一可选择标记物，优选对抑制谷氨酰胺合酶的除草剂的抗性，例如基于草铵膦的除草剂BASTA(Biolophos)，以及第二可选择标记物，其赋予抗生素抗性，优选对潮霉素的抗性。

[0090] 优选地，所述方法允许一种雌性亲本植物与两种，三种，四种，五种，六种，七种，八种，九种或十种雄性亲本植物杂交，其中杂交可以在具有不同倍性的亲本植物之间发生，即它们可以是单倍体，二倍体，三倍体，四倍体，五倍体，六倍体，七倍体，八倍体，九倍体，十倍体，十一倍体或十二倍体。因此，可选择标记物系统由两个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个或十个部分或两种，三种，四种，五种，六种，七种，八种，九种或十种不同的可选择标记物组成，其中当在一种单一植物中组合时允许对所述植物进行选择。

[0091] 在一个优选的实施方案中，本发明的方法包括将一种二倍体或四倍体雌性亲本植物与两个二倍体或四倍体雄性亲本植物杂交，其中两个雄性亲本植物各自包含可选择标记物系统的一部分；因此，所述制造系统由两部分组成，或者一个可选择标记物，或两个不同的可选择标记物。

[0092] 在一个实施方案中，本发明的可选择标记物系统包含第一部分和第二部分，所述第一部分包含在非特异性启动子控制下表达异源转录因子的驱动子，所述第二部分包含在相应响应性启动子控制下的可选择标记物基因。更具体地，当组合在一个植物中，优选紧密接近时，即在植物的相同部分中时，选择系统的各个部分类似于功能可选择的标记物和/或表达基因产物的功能表达元件，所述基因产物作为可选择标记物包含与调节序列可操作地连接的可选择标记物基因，优选包含启动子和/或异源转录因子。

[0093] 由于转基因植物是通过本发明的方法(步骤(a)至(c))获得的，其在公众中仍然存在争议并且特别是对于作为食物的接受性较差，因此，所述方法通过F1代的杂交或自交产生不含标记物的基因的植物提供了产生不含标记物的非转基因植物(步骤(d) 和(e))的可能性，所述不含标记物的基因的植物缺乏对所述植物来说外源的任何 DNA。

[0094] [12][11]的方法，其中所述可选择标记赋予除草剂、抗生素和/或抗代谢物抗性和/或可检测的，优选可见的输出。

[0095] 在一个实施方案中，本发明的可选择标记物赋予除草剂抗性。

[0096] 优选地，除草剂可选自但不限于抑制乙酰辅酶A羧化酶的除草剂，例如基于芳氧基苯氧基丙酸酯(FOP)-，环己二酮(DIM)-，和苯基吡唑啉(DEN)的除草剂；抑制乙酰乳酸合酶的除草剂，包括磺酰脲类(如啶嘧磺隆和甲磺隆)，咪唑啉酮类，三唑并嘧啶类，嘧啶基氧化苯甲酸酯类和磺酰氨基羰基三唑啉酮类；抑制5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶EPSPS的除草剂，如基于糖醛酸盐的除草剂(Roundup)；抑制谷氨酰胺合酶的除草剂，如基于草铵膦的除草剂BASTA(Biolophos)；合成的生长素除草剂，如2,4-D和麦草畏(Dicamba)；抑制光系统的除草剂，包括三嗪类除草剂，如阿托拉辛，尿素衍生物，如敌草隆；联吡啶类除草剂，如敌草快和百草枯；二苯醚类除草剂，如除草醚，硝氟草醚，氟锁草醚和氟硝草醚；以及腈-除草剂，例如基于溴苯腈的除草剂；以及抑制八氢番茄红素去饱和酶的除草剂，包括基于达草灭-，基于氟啶酮-和基于difunon-的除草剂。优选地，除草剂是基于草铵膦的除草剂，例如非选择性除草剂(“全面除草剂”)BASTA。可以选择抗生素，但不限于卡那霉素，新霉素，遗传霉素，巴龙霉素，潮霉素，庆大霉素，大观霉素，链霉素或妥布霉素。

[0097] 在另一个实施方案中，当可选择标记物系统的部分紧密接近时，即存在于一个植物中，优选在植物的一个部分中时，本发明的可选择标记物赋予可检测的，优选可见的输出，例如荧光。

[0098] 在另一个实施方案中，本发明的可选择标记物系统包含赋予除草剂，抗生素和/或抗代谢物抗性的可选择标记物以及赋予可见可检测输出的可选择标记物，其中第一个优选用于选择植物，第二个优选用作可视化的报道分子。在优选的实施方案中，可选择标记物赋予除草剂抗性，并且报告基因用于可视化。

[0099] 因此，在将包含可选择标记物系统的各个部分，即一个可选择标记物或两个不同的可选择标记物的一种以上转基因雄性亲本植物与一种雌性亲本植物中的杂交后，用除草剂进行幼苗的选择。由单精受精产生的幼苗，即来自所述雌性亲本植物与仅一种雄性亲本植物的杂交产生的幼苗赋予对除草剂的抗性，并在除草剂处理后死亡和/或保持无色。相反，两种构建体的组合，其只能由多精受精产生，将产生除草剂抗性和/或荧光后代。

[0100] 当然，除了赋予除草剂抗性的可选择标记物之外，也可以使用本领域公知的其他的植物用可选择标记物，例如，可以使用赋予抗生素或抗代谢物抗性的可选择标记物，以及可以使用赋予可见输出的其他标记，例如lacZ系统。

[0101] [13][11]或[12]的方法，其中所述至少第一和第二雄性亲本植物对于所述组分是纯合的。由于植物是真核生物，它们每个细胞具有两个或更多个遗传信息拷贝。通常，每个基因由两个等位基因呈现，这两个等位基因在纯合状态下是相同的并且在杂合状态下是不同的。在另一个实施方案中，雄性亲本植物对于可选择标记物系统的各个部分是纯合的。尤其是，第一雄性亲本植物(第一花粉供体)对于构建体是纯合的，所述构建体包含在非特异性启动子控制下表达异源转录因子的驱动子，并且其中第二花粉供体对于包含赋予除草剂抗性的基因的构建体是纯合的，所述赋予除草剂抗性的基因优选为在相应的响应启动子控制下的BAR基因或pat基因，任选地其中赋予除草剂抗性的基因与赋予荧光的基因，优选YFP基因连接。

[0102] 或者，雄性亲本植物对于不同的可选择标记物是纯合的。

[0103] [14][12]或[13]的方法，其中所述可选择标记物赋予除草剂，抗生素和/或抗代谢物抗性和/或可见的可检测输出，优选地，其中所述可选择标记物选自由bar基因和pat 基因组成的除草剂抗性基因；和/或选自由nptII基因，hpt基因，acc3基因，aadA 基因的抗生素抗性基因；和/或赋予抗代谢物抗性的基因，例如dhfr基因；和/或选自GFP基因，YFP基因，CFP基因，BFP基因，Venus基因，dsRED基因， hcRED基因，mCherry基因，mPlum基因，mOrange基因，zoanFP基因， Cerulan基因，luc基因，cat基因，lacZ基因和uidA基因的生物报告基因，及其修饰和/或增强的形式。

[0104] 本发明的可选择标记物系统适用于本领域公知的基于mGAL4-VP16/UAS的系统；参见例如欧洲专利申请EP0589841A2。因此，第一雄性亲本植物(第一花粉供体)构建体的异源转录因子是mGAL4-VP16，并且启动子是NOS启动子或RP5Sa启动子，并且其中第二雄性亲本植物(第二花粉供体)构建体的响应启动子是UAS启动子。因此，两种可选择标记物，即一种赋予除草剂抗性的标记物和另一种赋予荧光的标记物在相同的调节元件的控制下。当然，也可以使用等同的标记物系统，例如基于欧洲专利申请 EP0589841A2中描述的第一和第二表达盒的那些。如上所述，优选地，可选择标记物基因赋予除草剂抗性，最优选地，本发明的可选择标记物系统包含赋予对基于草铵膦的除草剂BASTA的抗性的BAR基因。

[0105] 赋予可选择标记物的荧光，也称为报道分子，可以是任何种类，只要它赋予可观察或可测量的表型即可。根据本发明，可以使用来自维多利亚水母(Aequorea victoria)的绿色荧光蛋白(GFP)(描述于国际申请公布WO95/07463，WO96/27675和WO95/121191)及其衍生物“Blue GFP”(Heim等人，“Curr.Biol”)，“Redshift GFP”(Muldoon等人，Biotechniques(1997)，162-167)以及增强的“EGFP”变体。进一步的实施方案是黄色，青色和蓝色荧光蛋白(分别为YFP，CFP和BFP)及其增强型变体EYFP，ECFP和EBFP，红色荧光蛋白(DsRed，HcRed，mCherry， dtTOMATO)和其他荧光蛋白，如Venus蛋白，mPlum，mOrange，zoanFP和Cerulan。另外的荧光蛋白质是本领域技术人员已知的，并且可以根据本发明使用。荧光蛋白质的检测通过本身已知的荧光检测方法进行。转基因植物中使用的荧光蛋白及其检测方法的综述例如提供在"Fluorescent Proteins in Transgenic Plants by Reginald J.Millwood, Hong S.Moon,and C.Neal Stewart Jr."中。在优选的实施方案中，YFP基因用作可选择标记物/报道分子。

[0106] [15]可通过[11]至[14]中任一项的方法获得的多倍体植物，或所述植物的部分，组织，细胞，种子或后代。

[0107] 当然，本发明还涉及分别通过本发明的方法或任何单独的步骤(a1+n)获得和可获得的植物以及这些植物的部分，组织，细胞，种子和后代，包括以下内容：

[0108] [16]在本发明方法中第一转基因植物的应用，其中所述转基因植物或者包含稳定整合的表达盒，其中所述表达盒包含编码启动子的核苷酸序列，所述启动子优选为与编码能够调节靶核苷酸序列的反式激活因子(或其部分)可操作连接的组成型启动子，所述反式激活因子(或其部分)能够调节靶核苷酸序列；或者包含稳定整合的第一表达盒，所述第一表达盒包含编码启动子的核苷酸序列，所述启动子优选为与编码第一可选择标记物的核苷酸序列可操作连接的组成型启动子，所述第一可选择标记物当表达时优选地提供抗生素，除草剂和/或抗代谢物抗性和/或报告基因表达。

[0109] [17]第二转基因植物在本发明方法中的应用，其中第二转基因植物或者包含稳定整合的表达盒，其中所述表达盒包含靶核酸序列，所述靶核酸序列能被反式激活因子激活，并且可操作地连接编码可选择标记物的核苷酸序列，所述可选择标记物在表达时优选提供抗生素，除草剂和/或抗代谢物抗性和/或报告基因表达；或者包含编码启动子的核苷酸序列的稳定整合的第二表达盒，所述启动子优选为组成型启动子，所述启动子与编码第二可选择标记物的核苷酸序列可操作地连接，所述第二可选择标记物在表达时优选提供抗生素，除草剂和/或抗代谢物抗性和/或报告基因表达。

[0110] [18]植物群，其包含[11]至[14]中任一项所限定的至少三种亲本植物，优选[16]和[17]的转基因植物，以及第三优选为非转基因植物，优选地在允许通过由作为雄性亲本植物的所述第一和第二转基因植物的花粉对作为雌性亲本植物的所述第三植物进行授粉的条件下进行。

[0111] [19]转基因三亲本-或多亲本植物及其后代，其或者包含稳定整合的第一表达盒，所述第一表达盒包含编码启动子的核苷酸序列，所述启动子优选为与编码反式激活因子的核苷酸序列可操作连接的组成型启动子，以及第二表达盒，所述第二表达盒包含被所述反式激活因子多肽激活的靶核苷酸序列，该靶核苷酸序列可操作地连接至编码可选择标记物的核苷酸序列；或者包含编码启动子的核苷酸序列的稳定整合的第一表达盒，所述启动子优选为组成型启动子，所述启动子可操作地连接至编码第一可选择标记物的核苷酸序列，以及第二表达盒，所述第二表达盒包含编码启动子的核苷酸序列，所述启动子优选为组成型启动子，所述启动子与编码第二可选择标记物的核苷酸序列可操作地连接，优选地，其中可选择标记物表达时提供抗生素，除草剂和/或抗代谢物抗性。

[0112] 这些和其他实施方案由本发明的说明书和实施例公开和涵盖。根据本发明使用的任何一种材料，方法，用途和化合物的进一步文献可以使用例如电子设备从公共图书馆和数据库中检索。例如，可以使用公共数据库“Medline”，其由美国国家生物技术信息中心(NCBI)和/或美国国立卫生研究院(NLM.NIH)的国家医学图书馆馆藏。进一步的数据库和网址，例如欧洲生物信息学研究所(EBI)的那些，其是欧洲分子生物学实验室(EMBL)的一部分，是本领域技术人员已知的，并且也可以使用因特网搜索引擎获得。Berks(TIBTECH12(1994)，352-364)中给出了生物技术中专利信息的概述和对回顾性搜索和查新有用的相关专利信息来源的调查。

[0113] 以上公开内容总体上描述了本发明。除非另有说明，否则本文使用的术语的定义参见牛津生物化学与分子生物学词典((Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology)，牛津大学出版社，1997(2000年修订版和2003年再版)，ISBN 0 19 850673 2)。本说明书全篇引用了几篇文献。所有引用的参考文献(包括本申请中引用的参考文献，授权专利，公开专利申请，包括背景部分和制造商的说明书，操作指南等)的内容在此明确引入作为参考；然而，并不承认所引用的任何文件是本发明的现有技术。通过参考以下具体实施例可以实现对本发明更完整的理解，这些实施例仅出于说明的目的并不意图限制本发明的范围。
实施例

[0114] 在下文中，列出了在本发明的上下文中使用的具体材料和方法。

[0115] 植物材料和生长条件使用的野生型拟南芥株是Ler，Col-0和C24。在长日照条件下(16小时光照/8小时黑暗)，在23℃下，将植物在Conviron MTPS生长室中土壤上发芽。在抽苔后，在另外的恒定生长条件下将植物转移至18℃。通过喷洒除草剂BASTA在土壤上进行植物选择，或者将种子用乙醇表面消毒并铺在含有潮霉素的MS培养基上。

[0116] 统计分析

[0117] 没有统计方法用于预先确定样本量。实验并不是随机的，并且研究人员在实验和分析过程中也不采用盲法。对于不等方差，使用双尾t检验进行统计：*p<0.05；**p<0.01； ***p<0.001。

[0118] 实施例1：克隆用于建立高通量多亲本育种设计(HIPOD)方法的载体构建体 HIPOD构建体已经通过调整基于mGAL4-VP16/UAS的系统产生，该系统包含在 Haselhoff(Methods Cell Biol.58(1999)，139-151)描述的非特异性RPS5a启动子控制下的表达异源转录因子mGAL4-VP16的驱动子，参见图1(A)。HIPOD构建体基于二元pGreenII0176(Genbank：EU048866 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU048866)组装，所述二元
pGreenII0176含有潮霉素和卡那霉素抗性，参见http://www.pgreen.ac.uk(Hellens等，Plant Molecular Biology 42(2000)，819-832；Hellens，pGreen II2007)。改变多克隆位点以包括克隆到MCS中在SpeI，NotI和SacI前面的额外的AscI和PacI限制性位点。通过PCR 扩增UAS/GAL4:VP16反式激活系统的各个序列(Haseloff，Methods Cell Biol.58 (1999)，
139-151；Sadowski等，Nature 335(1988)，563-564)。使用TN13s(5'-
ATGGCGCGCCGCATGCCTGCAGGTCGGA-3')(SEQ ID NO：1)和TN13as(5'-
ATTTAATTAACGGGGATCCGGTTCTCTC-3')(SEQ ID NO：2)扩增UAS序列。随后使用NotI/SacI限制性位点将YFP(Boisnard-Lorig等，The Plant Cell 13(2001)， 495-509)克隆到上述pGreenII0176载体中。BAR基因(Thompson等，The EMBO Journal6，(1987)，2519-2523)经PCR从pGreenII 0229(GenBank：EU048867.1/ http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU048867)载体使用引物TN14s(5'- ATTTAATTAAATGAGCCCAGAACGACGCCC-3')(SEQ ID NO：
3)和TN14as(5'- ATGCGGCCGCGATTTCGGTGACGGGCAGGAC-3')(SEQ ID NO：4)进行扩增，并使用PacI/NotI整合到载体中。在最后一步中，使用AscI/PacI在N末端融合UAS。使用TN12s(5'-ATTTAATTAAATGAAGCTCCTGTCCTCCATCGA-3')(SEQ ID NO：5) 和TN12as(5'-ATGCGGCCGCCTACCCACCGTACTCGTCAATTC-3')(SEQ ID NO： 6)，经PCR扩增GAL4:VP16。使用PacI/NotI限制性位点将GAL4:VP16插入改变的 pGreenII0176骨架中。使用TS15s(5'-
AGGCGCGCCGGGCCATAATCGTGAGTAGAT-3')(SEQ ID NO：7)和TS15as(5'-
ACGATCGCGGCTGTGGTGAGAGAAACA-3')(SEQ ID NO：8)从拟南芥基因组中扩增PRPS5a，并克隆到 pGemT-easy载体系统(Promega)中(Weijers等，Nature 414(2001)，709-710；Weijers等，Development 128，(2001)，4289-4299)。随后使用AscI/PvuI消化pRPS5a并N-末端融合至上述含有用AscI/PacI消化的 mGAL4:VP16的pGreenII骨架中。赋予对BASTA有抗性的基因的核苷酸序列显示在 SEQ ID NO：9中。启动子UAS和RPS5a的核苷酸序列分别显示在SEQ ID NO：10和 11中。YFP基因的核苷酸序列显示在SEQ ID NO：12中，GAL4:VP16构建体的序列显示在SEQ ID NO：13中。

[0119] 实施例2：建立HIPOD方法首先，使用拟南芥原生质体在瞬时表达分析中测试该系统。仅用构建体中的一种转化产生YFP阴性原生质体。相比之下，用两种HIPOD构建体共转染的原生质体表现出 YFP荧光；见图1(C)。在下一步骤中，经根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)辅助的花卉浸渍，用单独的二元载体构建体(pRPS5a::mGAL4-VP16和UAS::BAR_YFP) 转化不同的拟南芥(Ler)植物。pRPS5a::mGAL4-VP16构建体纯合的植物构成花粉供体1(PD1)，响应子构建体UAS::BAR_YFP纯合的植物构成花粉供体2(PD2)。虽然PD1或PD2的繁殖导致除草剂敏感的植物，但PD1和PD2之间的正反交产生除草剂抗性和YFP阳性后代；
参见图1(D)和(E)。

[0120] 实施例3：用于产生多倍体三亲本植物的HIPOD实施为了产生三亲本植物，将PD1(pRPS5a::mGAL4-VP16构建体纯合)和PD2(响应者构建体UAS::BAR_YFP纯合)作为不同的花粉供体提供到野生型花上。因此，使用 Jose Feijo实验室采用的基于真空吸尘器的收集装置(Johnson-Brousseau and McCormick， Plant.J.39(2004)，761-775)单独收集PD1和PD2的花粉粒，并且使用刷子在两到三天后将3-8个最老的闭合花蕾去雄并授粉。该过程重复4次，总共进行2575次双花授粉，产生120644粒种子。可以使用开源成像处理软件对种子进行计数，例如ImageJ (http://imagej.net/；例如Schneider等，Nature methods 9(2012)，671-675)。除草剂处理F1后，已经检测到7株除草剂(BASTA)抗性幼苗；参见图2(A)。此外，将从开放的花解剖的子叶或萼片转移到10％甘油中，并使用标准方案用Leica DMI6000b 荧光显微镜分析。检查后，检测到了YFP荧光(图2(B))，与HIPOD方法中使用的BAR基因特异性相关。

[0121] 为了确定这些植物是否确实是三亲本来源，使用靶向PD2构建体(UAS::BAR_YFP) 的引物5'-TATAGGGCGAATTGGGTACC-3'(SEQ ID NO：14)和5'- GGAACTGGCATGACGTGGGTTT-3'(SEQ ID NO：15)，以及靶向PD1构建体 (pRPS5a::mGAL4-VP16)的引物5'-TCGTTTTCTCTGCCGTCTCTCT-3'(SEQ ID NO：16)和5'-CCCTTGTTGCTGCTCTCCTC-3'(SEQ ID NO：17)经多重PCR对7 株幼苗进行基因分型。重要的是，所有植物都分离到两种HIPOD构建体(图2 (C))，表明两个不同父本的遗传物质已经传递到一个卵细胞中。

[0122] 两个父本拷贝的渐渗显示所得植物是三倍体。为了确定幼苗的倍性，已经进行了流式细胞术。为此，收获一片或两片叶子并用细胞核提取缓冲液在培养皿中用剃刀刀片切碎。然后，加入染色剂(Partec CyStain UV Precise-Kit)并在室温下温育
1分钟。使液体通过50μM尼龙筛并使用Partec 倍性分析仪进行分析。值得注意的是，所有七株植物都表现出三倍体植物的特征；见图2(D)。为了证实该结果，进行了补充方法，其中利用染色体涂片确定了除草剂抗性植物的染色体数目。根据公布的方案(Heslop-Harrison in Arabidopsis：A practical approach-The Practical Approach Series(ed.Zoe A.Wilson)，第5章，105-123，牛津大学出版社)，经分析取自每种基因型的代表性植物的花蕾进行染色体分离。拟南芥(Arabidopsis thaliana) 含有五种不同的染色体，并且在本研究中使用的二倍体Landsberg erecta登记号中，它们存在两个拷贝。值得注意的是，在从HIPOD回收的除草剂抗性后代的细胞核中，已检测到15个而不是10个染色体，证实了这些植物的三倍体特性；参见图2(E)。

[0123] 实施例4：三亲本植物的生长和活力的表征(植物表型分型)

[0124] 从数字图像测量生长高度，萼片长度，花瓣长度和细胞大小。将解剖的萼片和花瓣置入70％乙醇中以测量近端尺寸。对于细胞大小测量，在水合氯醛：甘油：ddH2O(8： 2：1)中清洗花瓣，并如Disch等人(Curr.Biol.16(2006),272-279)所述从单位面积数字显微照片的细胞数，近轴侧计算平均细胞大小。使用ImageJ软件计算所有尺寸测量值。如Volz等人(Dev.Cell 25(2013),310-316)所述进行受精率测定。通过在植物生命期间收集所有成熟角果来评估每种野生型植物产生的种子总数。使用上述软件工具处理各种子的数字图像。

[0125] 为了将由额外亲本拷贝的渐渗引起的属性和与这些植物的独特多精受精起源特异性相关的潜在负面影响相区分，已经包括双亲本三倍体植物，所述双亲本三倍体植物获自多倍体杂交(2n×4n)。与二倍体植物相比，三亲本植物的总植物大小增加了1.5倍，并且植物产生更大的花序和花。大小增加与双亲本三倍体植物相当；图3(A)-(D)。此外，发现与二倍体植物相比，三亲本植物产生大得多的器官，但与双亲本三倍体相比，表现出相似的器官大小。花瓣和萼片的大小分别增加20.7％和17.0％；图3(E) 和(F)。为了确定器官肥大是否由细胞增殖或扩张引起的，已经确定了花瓣表皮细胞的大小。三亲本和双亲本三倍体中的细胞大小显著增加；参见图3(G)和(J)。三倍体植物中减数分裂的固有后果是非整倍性的，即染色体数目的不平衡。事实上，已经观察到三亲本植物和双亲本三倍体的受精力显着降低，伴随着分离出萎缩和畸形的胚珠和种子；参见图3(H)，(I)和(K)。数据表明，本研究中描述的双亲本二倍体和多精受精诱导的三倍体植物之间的差异主要是由于遗传了额外的父本基因组拷贝，并且多精受精来源本身并未对发育和生长施加总体的负面影响。

[0126] 实施例5：HIPOD方法中多晶受精频率的计算作为近似，基于总种子计数(120644)和回收的三亲本幼苗(7)的数量计算多精受精率，如BASTA抗性和双亲本HIPOD构建体的阳性鉴定所证明。此外，考虑到通过使用HIPOD方法，只有所有多精受精事件的1/3的可被选择作为涉及单个父本逃逸检测的精子的超数精子贡献：频率＝(3x#三亲本植物/#种子)。因此，获得0.017％的多精受精率。当将该多精受精频率外推至拟南芥在本研究中使用的生长条件下平均产生的约45000个种子时，该数据显示每株植物可产生约7个多精受精诱导的多倍体植物。

[0127] 实施例6：三种不同种质的即时杂交三个遗传上不同的拟南芥材料已经组合在三个亲本杂交中。对于该三材料HIPOD杂交，在两个独立实验中进行了超过200次双授粉，产生9493个种子。为了便于检测三亲本后代，已将UAS HIPOD应答者构建体(参见实施例1)引入拟南芥Ler材料，并将 GAL4 HIPOD驱动子构建体(参见实施例1)引入C24材料中。在用来自不同父本的花粉对第三种材料Col-0授粉后，导致收获两种活的除草剂抗性植物TP3 1和TP3
2；参见图4(A)。植物通过了先前引入的三亲本植物测试：它们分离了活性YFP，并在流式细胞术测定中显示出三倍体谱；参见图4(B)和(C)。为了测试实际上是否已经传递了三种不同材料的染色体，已经靶向五种染色体中的每一种上的材料特异性限制性片段长度多态性(RFLP)。对于这种方法，设计了在所有五条染色体上位于Col-0， C24和Ler特征性RFLP侧翼的引物。基于网络工具POLYMORPH选择RFLP(Clark 等，Science317(2007)，338-342；Zeller等，Genome research 18(2008)，918-929) 并列于下表中。值得注意的是，已经检测到所有染色体上三种材料中每一种的多态性特征(图4(D))，表明已经遗传了所有三种基因组。

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