技术领域
[0001] 本
发明涉及干细胞技术领域，具体为一种干细胞的冷冻液及其冷冻方法。
背景技术
[0002] 脂肪干细胞是一种能够高度自我分
化成各种细胞并且大量存在于脂肪组织中的细胞群体。它能够在特定的条件下分化成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等不同种类的细胞。由于脂肪干细胞分化条件和方向的不确定性，目前临床上采用颗粒脂肪移植；应用细胞进行研究的前提是低温保存，以备随时取用。目前提取脂肪干细胞的冻存过程的干细胞存活率不高，或者恢复成正常细胞所需要的时将较长；为此我们提供一种干细胞的冷冻液及其冷冻方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
发明内容
[0003] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：一种干细胞的冷冻液及其冷冻方法，包括培养液与冷冻液，其特征在于，所述培养液为DMEM/F12培养液，所述冷冻液包括二甲基亚砜、总黄
酮、土豆粉提取物、人血清
白蛋白、樱桃提取物、
棕榈油提取物、小
牛血清、海藻糖、
链霉素和胰蛋白酶；
[0004] 所述DMEM/F12培养液的百分比组成为40-60％；所述各冷冻液的百分比组成为：二甲基亚砜30-50％，总黄酮10-20％，土豆粉提取物5-10％，人血清白蛋白4-9％，樱桃提取物12-18％，棕榈油提取物3-7％，
小牛血清1-7％，海藻糖5-15％、链霉素2-4％和胰蛋白酶3-
8％。
[0005] 优选的，所述土豆粉提取物所需要的主要成分为
葡萄糖。
[0006] 优选的，所述樱桃提取物所需要的主要成分为
铁离子。
[0007] 优选的，所述棕榈油提取物所需要的主要成分为为甘油。
[0008] 优选的，所述DMEM/F12培养液的百分比组成为40％；所述各冷冻液的百分比组成为：二甲基亚砜30％，总黄酮10％，土豆粉提取物5％，人血清白蛋白4％，樱桃提取物12-％，棕榈油提取物3％，小牛血清1％，海藻糖5％、链霉素2％和胰蛋白酶3％。
[0009] 优选的，所述DMEM/F12培养液的百分比组成为45％；所述各冷冻液的百分比组成为：二甲基亚砜35％，总黄酮13％，土豆粉提取物7％，人血清白蛋白6％，樱桃提取物14％，棕榈油提取物4％，小牛血清2.5％，海藻糖7％、链霉素2.5％和胰蛋白酶4％。
[0010] 优选的，所述DMEM/F12培养液的百分比组成为50％；所述各冷冻液的百分比组成为：二甲基亚砜40％，总黄酮14％，土豆粉提取物8％，人血清白蛋白7％，樱桃提取物15％，棕榈油提取物5％，小牛血清4％，海藻糖10％、链霉素3％和胰蛋白酶5％。
[0011] 优选的，所述DMEM/F12培养液的百分比组成为55％；所述各冷冻液的百分比组成为：二甲基亚砜45％，总黄酮17％，土豆粉提取物8％，人血清白蛋白8％，樱桃提取物18％，棕榈油提取物6％，小牛血清5.5％，海藻糖12％，链霉素3.5％和胰蛋白酶7％。
[0012] 优选的，所述DMEM/F12培养液的百分比组成为60％；所述各冷冻液的百分比组成为：二甲基亚砜50％，总黄酮20％，土豆粉提取物10％，人血清白蛋白9％，樱桃提取物18％，棕榈油提取物7％，小牛血清7％，海藻糖15％、链霉素4％和胰蛋白酶8％。
[0013] 一种干细胞的冷冻方法,包括以下步骤：
[0014] 步骤一，将脂肪组织
块进行消毒处理，切块清洗赶紧，之后使用离心机进行离心处理，离心专转速为1000-1500r/min，时间为5-10分钟；
[0015] 步骤二，将组织块放入至消化酶中进行处理，处理时间为10-30分钟，之后将组织块过滤后，加入DMEM/F12培养液中，然后对得到的细胞进行清洗，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，最终获得细胞上悬液；
[0016] 步骤三，将细胞悬液放入至培养皿中，在将培养皿放入至
培养箱中培养，保温箱的
温度保持在37℃，保温时间为24小时，每隔24小时，再接种于培养容器进行培养，此后每2-3天换液一次，直至融合率达到80-90％为止；
[0017] 步骤四：将步骤三所得干细胞中分别装入冻存管中，且每只中计入细胞冷冻液并置于液氮中冷冻，备用，冻存的降温速率为-5～-10℃/min。
[0018] 本发明的有益效果：
[0019] 1、本发明的冻存液结合传统冻存液配制方法，在原有的
基础上进行了改进，降低了二甲基亚砜的用量，新添加了总黄酮，活化细胞的功能，具有抗
氧化衰老的作用；
[0020] 2、本发明的所使用的冻存液与
现有技术相比，提高了脂肪干细胞的复苏比例，以及脂肪干细胞的生长成本；
[0021] 3、在冻存液中加入甘油，甘油对细胞起到保湿，同时可提供细胞生存所需要的部分
能量。
具体实施方式
[0022] 下面将对本发明
实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
[0023] 本发明提供一种技术方案：一种干细胞的冷冻液及其冷冻方法，包括培养液与冷冻液，其培养液为DMEM/F12培养液，冷冻液包括二甲基亚砜、总黄酮、土豆粉提取物、人血清白蛋白、樱桃提取物、棕榈油提取物、小牛血清、海藻糖、链霉素和胰蛋白酶；
[0024] DMEM/F12培养液的百分比组成为40-60％；各冷冻液的百分比组成为：二甲基亚砜30-50％，总黄酮10-20％，土豆粉提取物5-10％，人血清白蛋白4-9％，樱桃提取物12-18％，棕榈油提取物3-7％，小牛血清1-7％，海藻糖5-15％、链霉素2-4％和胰蛋白酶3-8％。
[0025] 土豆粉提取物所需要的主要成分为葡萄糖。
[0026] 樱桃提取物所需要的主要成分为铁离子。
[0027] 棕榈油提取物所需要的主要成分为为甘油。
[0028] DMEM/F12培养液的百分比组成为40％；各冷冻液的百分比组成为：二甲基亚砜30％，总黄酮10％，土豆粉提取物5％，人血清白蛋白4％，樱桃提取物12-％，棕榈油提取物
3％，小牛血清1％，海藻糖5％、链霉素2％和胰蛋白酶3％。
[0029] DMEM/F12培养液的百分比组成为45％；各冷冻液的百分比组成为：二甲基亚砜35％，总黄酮13％，土豆粉提取物7％，人血清白蛋白6％，樱桃提取物14％，棕榈油提取物
4％，小牛血清2.5％，海藻糖7％、链霉素2.5％和胰蛋白酶4％。
[0030] DMEM/F12培养液的百分比组成为50％；各冷冻液的百分比组成为：二甲基亚砜40％，总黄酮14％，土豆粉提取物8％，人血清白蛋白7％，樱桃提取物15％，棕榈油提取物
5％，小牛血清4％，海藻糖10％、链霉素3％和胰蛋白酶5％。
[0031] DMEM/F12培养液的百分比组成为55％；各冷冻液的百分比组成为：二甲基亚砜45％，总黄酮17％，土豆粉提取物8％，人血清白蛋白8％，樱桃提取物18％，棕榈油提取物
6％，小牛血清5.5％，海藻糖12％，链霉素3.5％和胰蛋白酶7％。
[0032] DMEM/F12培养液的百分比组成为60％；各冷冻液的百分比组成为：二甲基亚砜50％，总黄酮20％，土豆粉提取物10％，人血清白蛋白9％，樱桃提取物18％，棕榈油提取物
7％，小牛血清7％，海藻糖15％、链霉素4％和胰蛋白酶8％。
[0033] 一种干细胞的冷冻方法,包括以下步骤：
[0034] 步骤一，将脂肪组织块进行消毒处理，切块清洗赶紧，之后使用离心机进行离心处理，离心专转速为1000-1500r/min，时间为5-10分钟；
[0035] 步骤二，将组织块放入至消化酶中进行处理，处理时间为10-30分钟，之后将组织块过滤后，加入DMEM/F12培养液中，然后对得到的细胞进行清洗，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，最终获得细胞上悬液；
[0036] 步骤三，将细胞悬液放入至培养皿中，在将培养皿放入至培养箱中培养，保温箱的温度保持在37℃，保温时间为24小时，每隔24小时，再接种于培养容器进行培养，此后每2-3天换液一次，直至融合率达到80-90％为止；
[0037] 步骤四：将步骤三所得干细胞中分别装入冻存管中，且每只中计入细胞冷冻液并置于液氮中冷冻，备用，冻存的降温速率为-5～-10℃/min。
[0038] 对比例1：
[0039] DMEM/F12培养液的百分比组成为55％；各冷冻液的百分比组成为：二甲基亚砜45％，总黄酮17％，土豆粉提取物8％，人血清白蛋白8％，樱桃提取物18％，棕榈油提取物
6％，小牛血清5.5％，海藻糖12％，链霉素3.5％和胰蛋白酶7％；
[0040] 一种干细胞的冷冻方法,包括以下步骤：
[0041] 步骤一，将脂肪组织块进行消毒处理，切块清洗赶紧，之后使用离心机进行离心处理，离心专转速为1000-1500r/min，时间为5-10分钟；
[0042] 步骤二，将组织块放入至消化酶中进行处理，处理时间为10-30分钟，之后将组织块过滤后，加入DMEM/F12培养液中，然后对得到的细胞进行清洗，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，最终获得细胞上悬液；
[0043] 步骤三，将细胞悬液放入至培养皿中，在将培养皿放入至培养箱中培养，保温箱的温度保持在37℃，保温时间为24小时，每隔24小时，再接种于培养容器进行培养，此后每2-3天换液一次，直至融合率达到80-90％为止；
[0044] 步骤四：将步骤三所得干细胞中分别装入冻存管中，且每只中计入细胞冷冻液并置于液氮中冷冻，备用，冻存的降温速率为-5～-10℃/min；
[0045] 实施例1：
[0046] DMEM/F12培养液的百分比组成为55％；各冷冻液的百分比组成为：二甲基亚砜45％，总黄酮17％，土豆粉提取物8％，人血清白蛋白8％，樱桃提取物18％，棕榈油提取物
6％，小牛血清5.5％，海藻糖15％，链霉素3.5％和胰蛋白酶7％；
[0047] 一种干细胞的冷冻方法,包括以下步骤：
[0048] 步骤一，将脂肪组织块进行消毒处理，切块清洗赶紧，之后使用离心机进行离心处理，离心专转速为1000-1500r/min，时间为5-10分钟；
[0049] 步骤二，将组织块放入至消化酶中进行处理，处理时间为10-30分钟，之后将组织块过滤后，加入DMEM/F12培养液中，然后对得到的细胞进行清洗，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，最终获得细胞上悬液；
[0050] 步骤三，将细胞悬液放入至培养皿中，在将培养皿放入至培养箱中培养，保温箱的温度保持在37℃，保温时间为24小时，每隔24小时，再接种于培养容器进行培养，此后每2-3天换液一次，直至融合率达到80-90％为止；
[0051] 步骤四：将步骤三所得干细胞中分别装入冻存管中，且每只中计入细胞冷冻液并置于液氮中冷冻，备用，冻存的降温速率为-5～-10℃/min；
[0052] 实施例2：
[0053] DMEM/F12培养液的百分比组成为60％；各冷冻液的百分比组成为：二甲基亚砜45％，总黄酮17％，土豆粉提取物8％，人血清白蛋白8％，樱桃提取物18％，棕榈油提取物
6％，小牛血清5.5％，海藻糖12％，链霉素3.5％和胰蛋白酶7％；
[0054] 一种干细胞的冷冻方法,包括以下步骤：
[0055] 步骤一，将脂肪组织块进行消毒处理，切块清洗赶紧，之后使用离心机进行离心处理，离心专转速为1000-1500r/min，时间为5-10分钟；
[0056] 步骤二，将组织块放入至消化酶中进行处理，处理时间为10-30分钟，之后将组织块过滤后，加入DMEM/F12培养液中，然后对得到的细胞进行清洗，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，最终获得细胞上悬液；
[0057] 步骤三，将细胞悬液放入至培养皿中，在将培养皿放入至培养箱中培养，保温箱的温度保持在37℃，保温时间为24小时，每隔24小时，再接种于培养容器进行培养，此后每2-3天换液一次，直至融合率达到80-90％为止；
[0058] 步骤四：将步骤三所得干细胞中分别装入冻存管中，且每只中计入细胞冷冻液并置于液氮中冷冻，备用，冻存的降温速率为-5～-10℃/min；
[0059] 实施例3：
[0060] DMEM/F12培养液的百分比组成为55％；各冷冻液的百分比组成为：二甲基亚砜40％，总黄酮17％，土豆粉提取物8％，人血清白蛋白8％，樱桃提取物18％，棕榈油提取物
6％，小牛血清5.5％，海藻糖12％，链霉素3.5％和胰蛋白酶7％；
[0061] 一种干细胞的冷冻方法,包括以下步骤：
[0062] 步骤一，将脂肪组织块进行消毒处理，切块清洗赶紧，之后使用离心机进行离心处理，离心专转速为1000-1500r/min，时间为5-10分钟；
[0063] 步骤二，将组织块放入至消化酶中进行处理，处理时间为10-30分钟，之后将组织块过滤后，加入DMEM/F12培养液中，然后对得到的细胞进行清洗，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，最终获得细胞上悬液；
[0064] 步骤三，将细胞悬液放入至培养皿中，在将培养皿放入至培养箱中培养，保温箱的温度保持在37℃，保温时间为24小时，每隔24小时，再接种于培养容器进行培养，此后每2-3天换液一次，直至融合率达到80-90％为止；
[0065] 步骤四：将步骤三所得干细胞中分别装入冻存管中，且每只中计入细胞冷冻液并置于液氮中冷冻，备用，冻存的降温速率为-5～-10℃/min；
[0066] 实施例4：
[0067] DMEM/F12培养液的百分比组成为55％；各冷冻液的百分比组成为：二甲基亚砜45％，总黄酮17％，土豆粉提取物8％，人血清白蛋白8％，棕榈油提取物6％，小牛血清
5.5％，海藻糖12％，链霉素3.5％和胰蛋白酶7％；
[0068] 一种干细胞的冷冻方法,包括以下步骤：
[0069] 步骤一，将脂肪组织块进行消毒处理，切块清洗赶紧，之后使用离心机进行离心处理，离心专转速为1000-1500r/min，时间为5-10分钟；
[0070] 步骤二，将组织块放入至消化酶中进行处理，处理时间为10-30分钟，之后将组织块过滤后，加入DMEM/F12培养液中，然后对得到的细胞进行清洗，用吸管轻轻吹打使细胞均匀，最终获得细胞上悬液；
[0071] 步骤三，将细胞悬液放入至培养皿中，在将培养皿放入至培养箱中培养，保温箱的温度保持在37℃，保温时间为24小时，每隔24小时，再接种于培养容器进行培养，此后每2-3天换液一次，直至融合率达到80-90％为止；
[0072] 步骤四：将步骤三所得干细胞中分别装入冻存管中，且每只中计入细胞冷冻液并置于液氮中冷冻，备用，冻存的降温速率为-5～-10℃/min。
[0073] 将对比例及实施例1-4制备得到的脂肪干细胞复苏，重悬计数，并计算活率。结果见表1：
[0074] 表1
[0075] 项目 脂肪干细胞数(个数) 脂肪干细胞活率(％)对比例1 7.7×107 95.0
实施例1 7.8×107 95.4
实施例2 8.1×107 97.2
实施例3 7.5×107 96.3
实施例4 7.1×107 94.3
[0076] 由上可知，组织最终获得脂肪干细胞7.1×107-8.1×107个，存活率为95、0～97.2％。
[0077] 在本
说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“示例”、“具体示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
