技术领域
[0001] 本
发明涉及分子
生物学，具体地说，涉及绵羊B4GALNT2基因全长序列的扩增及其表达量的检测。
背景技术
[0002] B4GALNT2基因是β-1,4-N-乙酰基-半乳糖胺基转移酶2基因的简称，该基因所表达的蛋白在体内主要行使蛋白修饰的功能作用，属于蛋白糖基化通路重要组成部分；可将体内β-1,4连接的N-乙酰半乳糖胺转移至α-2,3-唾液
酸化链的半乳糖残基上，完成相应
抗原蛋白修饰等。
[0003] 目前针对B4GALNT2基因的研究集中在绵羊繁殖性能的调控机理和多羔表型性状主效基因的挖掘。法国的肉用绵羊品系-Lacaune绵羊可通过DLX3:c.*803A>G连
锁突变来判断其产羔和排卵数潜能，Lacaune绵羊也被认为存在一个控制排卵数的主效基因-FecL。随后，法国农业科学院的最新研究表明：位于B4GALNT2基因第7内含子中的SNP g.36938224T>A突变和与EZR基因间区的SNP g.37034573A>G突变与产羔和排卵数性状紧密相关，从而推测B4GALNT2基因是控制Lacaune绵羊高繁殖
力性状的主效基因。小鼠的B4GALNT2蛋白也被证明在卵丘细胞群的扩增中发挥着重要作用。因而，在未来的绵羊繁殖调控作用的研究中，B4GALNT2基因可能是重要的研究
节点。
[0004] 然而，现有的NCBI中的绵羊B4GALNT2基因仅公布了一个起始转录位点(登录号：NM_001318076.1)，其公布的B4GALNT2基因的3’端序列不够完整，且未通过NCBI的最终审查。该序列扩增来自于法国绵羊品种Lacaune，而本发明的序列扩增来源于中国著名的多羔绵羊品种-小尾寒羊。世界绵羊具有多个起源，绵羊群体间LD值很小，说明群体间存在较大的变异，为更加精确地研究国内绵羊品种中的B4GALNT2基因，需要建立单独的mRNA序列。未见B4GALNT2基因在各物种中的全长序列扩增，其原因可能在于该基因的3’端序列较长，且
3’端RACE引物设计较为困难。
[0005] 针对绵羊物种，B4GALNT2基因作为高繁殖力基因FecL的候选基因，故该基因的扩增方法以及对其表达检测的方法将为后续的研究奠定良好的
基础。因此，亟需提供绵羊B4GALNT2基因全长序列的扩增方法及其表达量的检测方法。
发明内容
[0006] 为了解决
现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供绵羊B4GALNT2基因全长序列的扩增及其表达量的检测。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：
[0008] 第一方面，本发明提供了绵羊B4GALNT2基因的全长序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009] 本发明针对NM_001318076.1序列，先对3’端的参考序列进行普通PCR扩增，进一步延伸后，再设计相应的3’端RACE引物，最终获得了更为完整的B4GALNT2基因3’端序列。
[0010] 本发明相对于现有技术，提供了B4GALNT2基因的全长序列，尤其是B4GALNT2基因的3’端序列。miRNA在基因表达调控中扮演着重要
角色，它可以通过与mRNA的3’端非翻译区作用从而在转录后
水平上介导mRNA的翻译，B4GALNT2基因3’端序列的获得将有利于miRNA对其调控作用的研究。
[0011] 本发明还提供了一种扩增绵羊B4GALNT2基因的全长序列的方法，利用6对扩增引物，2个5’端cDNA末端快速扩增引物，2个3’端cDNA末端快速扩增引物，通过普通PCR、降落PCR和巢式PCR来完成序列的扩增。
[0012] 所述6对扩增引物通过普通PCR可扩增绵羊B4GALNT2基因的各保守区域序列：
[0013] 上游引物F1：ACCACTCCTTCAGCCTAGTG；
[0014] 下游引物R1：TCATCGTCCACCCAGAGAAC；
[0015] 上游引物F2：CAGACTGAACTCCCTGCGGTGA；
[0016] 下游引物R2：CACATCCAGTTCGGTCTTCTC；
[0017] 上游引物F3：AAGATTGAGGTGCTGGTGGA；
[0018] 下游引物R3：TGCCCTGATCAGTGATTGGT；
[0019] 上游引物F4：CAGCCCTGGAGAAGACCTAC；
[0020] 下游引物R4：CCCACGCTCTGATCCTCTAA；
[0021] 上游引物F5：CTTGAGGAAGTGGCAGTCTG；
[0022] 下游引物R5：GCCACTGCGCTTACAAAGTA；
[0023] 上游引物F6：ATGGGATGCAAGAAGGTGGA；
[0024] 下游引物R6：TTTTGACCTACCGTGGCTGT。
[0025] 所述2个5’端cDNA末端快速扩增引物为5’GSP1和5’GSP2，所述2个3’端cDNA末端快速扩增引物为3’GIP和3’GOP，引物序列如下：
[0026] 5’GSP1：AGAGGCTCTTGATGTGTTTCTCAGGGAG；
[0027] 5’GSP2：CCCAGGGCCAAGAATAAGACGGACATC；
[0028] 3’GIP：TGGGATGCAAGAAGGTGGAGGGCAGAG；
[0029] 3’GOP：GATTCTCCCACTGCTGCGCTGCCTTTT。
[0030] 利用以上引物序列可完成绵羊B4GALNT2基因的全长序列的扩增，具体步骤为：
[0031] (1)经体外培养3天的绵羊颗粒细胞通过RNA提取
试剂盒提取其总RNA，并分别按照Takara公司的Prime Script RT reagent Perfect Real Time试剂盒和SMARTer RACE 5’/3’Kit User Manual试剂盒
说明书合成普通cDNA模板、5’cDNA第一链模板和3’cDNA第一链模板。
[0032] (2)利用步骤(1)所获得的普通cDNA为模板，以前述的6对扩增引物，通过普通PCR方法扩增B4GALNT2基因的各保守区序列。
[0033] 其中，普通PCR扩增程序为：95℃、5min，33×[95℃、30s，
退火温度、30s，72℃、45s]，72℃、8min，4℃保存。
[0034] (3)利用步骤(1)所获得的5’cDNA第一链为模板，以5’GSP1和5’GSP2为扩增引物，通过降落PCR方法扩增B4GALNT2基因的5’端序列。
[0035] 其中，降落PCR扩增程序为：95℃、5min，10×[95℃、30s，72-0.4℃、30s，72℃、3min]，25×[95℃、30s，68℃、30s，72℃、3min]，72℃、8min，4℃保存。
[0036] (4)利用步骤(1)所获得的3’cDNA第一链为模板，以3’GOP为扩增引物，通过降落PCR方法扩增B4GALNT2基因的3’端序列，再以所获得的降落PCR产物为模板，以3’GIP为巢式引物，进行巢式PCR扩增。
[0037] 其中，降落PCR扩增程序为：95℃、5min，10×[95℃、30s，72-0.4℃、30s，72℃、3min]，25×[95℃、30s，68℃、30s，72℃、3min]，72℃、8min，4℃保存；巢式PCR扩增程序为：
95℃、5min，25×[95℃、30s，68℃、30s，72℃、3min]，72℃、8min，4℃保存。
[0038] (5)上述步骤(2)、(3)和(4)中最终所获得的PCR扩增产物通过琼脂糖凝胶
电泳检测，均经切胶纯化后连接到pMD18-T载体，转化到DH5α感受态细胞中，挑选阳性质粒，再通过琼脂糖凝胶电泳鉴定获得所需目的条带，通过Sanger测序得到绵羊B4GALNT2各保守区序列、5’端序列和3’端序列
片段信息。
[0039] (6)将步骤(5)中扩增得到B4GALNT2的各保守区序列、5’端序列和3’端序列片段通过DNAMAN
软件进行序列拼接，得到绵羊B4GALNT2基因mRNA全长序列即B4GALNT2a和B4GALNT2b。
[0040] 本发明所有获得的扩增片段经Sanger测序及NCBI序列比对后，证明所得序列均属于绵羊B4GALNT2基因的mRNA序列。
[0041] 第二方面，本发明提供了在绵羊组织中检测B4GALNT2基因表达量的方法，取待测样品的RNA，并反转录为cDNA，以所述cDNA为模板，利用1对表达量检测引物，通过
荧光定量PCR来完成B4GALNT2基因的表达量检测。
[0042] 所述表达量检测引物的引物序列如下：
[0043] 荧光定量引物F：CCTGAAAGCTTCTCTGGGGA；
[0044] 荧光定量引物R：CCGGCTACTGGTCAAAATGG。
[0045] 更进一步地，为了更好的保证检测的准确性，在进行荧光定量PCR时，同时加入内参β-actin基因的荧光定量引物，序列如下：
[0046] 内参β-actin引物F：CCAACCGTGAGAAGATGACC；
[0047] 内参β-actin引物R：CCCGAGGCGTACAGGGACAG。
[0048] 其中，荧光定量PCR扩增程序为：95℃、5min，40×[95℃、10s，60℃、10s，72℃、10s]，95℃、5s，65℃、1min，40℃、30s。
[0049] 本发明的有益效果在于：
[0050] 本发明首次从体外培养的绵羊颗粒细胞的RNA中克隆到了B4GALNT2基因全长cDNA序列，并为该基因表达量检测提供方法，为绵羊B4GALNT2基因功能尤其在卵巢组织中调控排卵机制的研究奠定序列信息基础，并对了解雌性绵羊排卵数差异具有重要意义。
[0051] 生物体内的miRNA是通过在转录后水平抑制mRNA翻译或者调控mRNA降解的方式来调控基因表达的。具体表现在miRNA是通过与mRNA的3’端UTR区的相应序列作用，从而在转录后水平上介导mRNA的表达。已经证明敲除小鼠75％的Dicer1基因后，其在繁殖上表现为不孕，究其原因是因为miR-17-5p和let-7b调控了该突变小鼠的金属蛋白酶1的表达。因而，更加完整的B4GALNT2基因3’端序列，将有利于相应miRNA结合位点的研究，为揭示B4GALNT2基因的表达后调控提供序列信息。
[0052] 本发明中，所提供的两个5’端RACE引物(5’GSP1和5’GSP2)，可获得两个5’端起始转录位点。不同的5’端起始位点的发现可证明该基因存在多个转录本，从而侧面反应出该基因在各个组织中的表达形式可能存在差异。
附图说明
[0053] 图1为本发明
实施例1中绵羊B4GALNT2基因扩增后的凝胶电泳图。
[0054] 图2为本发明实施例1中绵羊B4GALNT2a和B4GALNT2b两个转录本的序列结构示意图。
[0055] 图3为本发明实施例1中绵羊B4GALNT2a和B4GALNT2b两个转录本的详细序列信息图。
[0056] 图4为本发明实施例2中B4GALNT2基因在小尾寒羊和滩羊中各组织的表达量分布图。
具体实施方式
[0057] 下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种
修改和替换。
[0058] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0059] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0060] 实施例1绵羊B4GALNT2基因的全长序列扩增
[0061] 1.合成以下所述的6对引物：
[0062] 上游引物F1：ACCACTCCTTCAGCCTAGTG；
[0063] 下游引物R1：TCATCGTCCACCCAGAGAAC；
[0064] 上游引物F2：CAGACTGAACTCCCTGCGGTGA；
[0065] 下游引物R2：CACATCCAGTTCGGTCTTCTC；
[0066] 上游引物F3：AAGATTGAGGTGCTGGTGGA；
[0067] 下游引物R3：TGCCCTGATCAGTGATTGGT；
[0068] 上游引物F4：CAGCCCTGGAGAAGACCTAC；
[0069] 下游引物R4：CCCACGCTCTGATCCTCTAA；
[0070] 上游引物F5：CTTGAGGAAGTGGCAGTCTG；
[0071] 下游引物R5：GCCACTGCGCTTACAAAGTA；
[0072] 上游引物F6：ATGGGATGCAAGAAGGTGGA；
[0073] 下游引物R6：TTTTGACCTACCGTGGCTGT。
[0074] 2.合成以下4个引物：
[0075] 5’GSP1：AGAGGCTCTTGATGTGTTTCTCAGGGAG；
[0076] 5’GSP2：CCCAGGGCCAAGAATAAGACGGACATC；
[0077] 3’GIP：TGGGATGCAAGAAGGTGGAGGGCAGAG；
[0078] 3’GOP：GATTCTCCCACTGCTGCGCTGCCTTTT。
[0079] 3.利用步骤2和3中所列的引物序列可完成绵羊B4GALNT2基因的全长序列扩增，具体步骤为：
[0080] (1)经体外培养3天的绵羊颗粒细胞通过RNA提取试剂盒提取其总RNA，并分别按照Takara公司的Prime Script RT reagent Perfect Real Time试剂盒和SMARTer RACE 5’/3’Kit User Manual试剂盒说明书合成普通cDNA模板、5’cDNA第一链模板和3’cDNA第一链模板。
[0081] (2)利用步骤(1)所获得的普通cDNA为模板，以步骤1中所列的各引物，通过普通PCR方法扩增得到B4GALNT2基因的各保守区序列，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1中a-f所示。
[0082] 其中所用的普通PCR扩增程序为：95℃、5min，33×[95℃、30s，退火温度、30s，72℃、45s]，72℃、8min，4℃保存。
[0083] (3)利用步骤(1)所获得的5’cDNA第一链为模板，以步骤2中所列的5’GSP1和5’GSP2为扩增引物，通过降落PCR方法扩增B4GALNT2基因的5’端序列，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1中的g、h所示。
[0084] 其中所用的降落PCR扩增程序为：95℃、5min，10×[95℃、30s，72-0.4℃、30s，72℃、3min]，25×[95℃、30s，68℃、30s，72℃、3min]，72℃、8min，4℃保存。
[0085] (4)利用步骤(1)所获得的3’cDNA第一链为模板，以步骤2中所列的3’GOP为扩增引物，通过降落PCR方法扩增B4GALNT2基因的3’端序列，再以3’GIP为巢式引物，以本步骤所获的降落PCR产物为模板进行巢式PCR扩增，扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1中的i所示。。
[0086] 其中所用的降落PCR扩增程序为：95℃、5min，10×[95℃、30s，72-0.4℃、30s，72℃、3min]，25×[95℃、30s，68℃、30s，72℃、3min]，72℃、8min，4℃保存；所用的巢式PCR扩增程序为：95℃、5min，25×[95℃、30s，68℃、30s，72℃、3min]，72℃、8min，4℃保存。
[0087] (5)上述步骤(2)、(3)和(4)中最终所获得的PCR扩增产物均经切胶纯化后连接到pMD18-T载体，转化到DH5α感受态细胞中，挑选阳性质粒，再通过琼脂糖凝胶电泳鉴定获得所需目的条带，通过Sanger测序得到绵羊B4GALNT2各保守区序列、5’端序列和3’端序列片段信息。
[0088] (6)将步骤(5)中扩增得到B4GALNT2的各保守区序列、5’端序列和3’端序列片段通过DNAMAN软件进行序列拼接，得到绵羊B4GALNT2基因mRNA全长序列的两个转录本即B4GALNT2a和B4GALNT2b，两个转录本的结构示意图如图2，B4GALNT2a和B4GALNT2b的序列详细信息如图3。
[0089] 实施例2B4GALNT2基因在小尾寒羊和滩羊各组织中的表达量检测
[0090] 1.合成B4GALNT2基因表达量检测的荧光定量引物，序列如下：
[0091] 荧光定量引物F：CCTGAAAGCTTCTCTGGGGA；
[0092] 荧光定量引物R：CCGGCTACTGGTCAAAATGG；
[0093] 合成内参β-actin基因的荧光定量引物，序列如下：
[0094] 内参β-actin引物F：CCAACCGTGAGAAGATGACC；
[0095] 内参β-actin引物R：CCCGAGGCGTACAGGGACAG。
[0096] 2.分别提取小尾寒羊和滩羊的心、肝、脾、
肺、肾、输卵巢、子宫体、子宫角、肌肉、下丘脑、垂体、卵巢及小脑组织的RNA，并反转录为cDNA。
[0097] 3.以步骤2中的各cDNA为模板，利用步骤1中的B4GALNT2基因和内参β-actin基因引物序列，通过荧光定量PCR仪检测B4GALNT2基因在各组织间的表达量差异；荧光定量PCR的扩增程序为：95℃、5min，40×[95℃、10s，60℃、10s，72℃、10s]，95℃、5s，65℃、1min，40℃、30s。
[0098] 检测结果如图4；其中B4GALNT2基因在绵羊卵巢中表达量最高，且仅在小尾寒羊和滩羊的肾脏和输卵管中表达差异显著。
[0099] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
