山羊IGFBP3基因cDNA编码序列克隆的方法
专利汇可以提供山羊IGFBP3基因cDNA编码序列克隆的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种山羊IGFBP3基因cDNA编码序列克隆的方法，其核苷酸序列如 序列表 SEQ ID NO：1所示，包括以下步骤：A1、提取山羊背最长肌组织中的总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；A2、引物的设计和PCR扩增：以 绵羊 该基因的序列为模板在起始密码子上游区域和终止密码子的下游区域设计引物，设计的引物为：正向引物：5'AGCTCGCTGCCGCCCAGT3'，反向引物：5'GCTGATCATGTCCTTGGCAG3'；A3、PCR产物的纯化回收；A4、克隆。本发明提供了一种简捷的获取山羊IGFBP3基因cDNA编码序列的方法，为进一步研究该基因在山羊生长发育过程的作用奠定了 基础 。，下面是山羊IGFBP3基因cDNA编码序列克隆的方法专利的具体信息内容。
1.山羊IGFBP3基因cDNA编码序列克隆的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：从山羊肌肉组织样品中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；
步骤二：扩增引物的设计及PCR反应：以绵羊该基因的序列为模板在起始密码子上游区域和终止密码子的下游区域设计引物；设计的引物为：
正向引物：5' AGCTCGCTGCCGCCCAGT 3'
反向引物：5' GCTGATCATGTCCTTGGCAG 3'
用cDNA为模板先进行梯度PCR反应，退火温度范围选择50℃到60℃共8个温度点，优化普通PCR的条件。
2.PCR反应体系为25µL体系：0.25 µL的TaKaRa Taq酶，12.5 µL的 2×GC BufferⅡ，
4 µL的dNTP Mixture，正反向引物各0.5 µL，6.25 µL的灭菌ddH2O，模板cDNA 1 µL。
3.反应条件为95℃预变性4 min，35个循环（94℃，45 s；53.4℃，30 s；72℃，90 s），最后72℃ 7 min；
步骤三：扩增产物的回收和纯化；
步骤四：纯化的产物进行克隆与测序，得到882bp的核苷酸序列，如序列表SEQ ID NO：
1所示，即为山羊IGFBP3基因的编码区全序列。
山羊IGFBP3基因cDNA编码序列克隆的方法
技术领域
背景技术
发明内容
A1、从山羊背最长肌组织中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA；
A2：以绵羊该基因的序列为模板在起始密码子上游区域和终止密码子的下游区域设计引物；
A3：以cDNA为模板进行PCR扩增；
A4：扩增产物的胶回收和纯化；
A5：纯化的产物进行克隆与测序，即能得到山羊IGFBP3基因cDNA编码序列。
12000rpm离心10min；弃去上层清液后，加入4℃预冷的75%乙醇（用DEPC处理水配制）1mL，静置5min，4℃下7500g离心5min；弃上清，用枪吸取多余的液体，空气干燥约3min；加入
30µL DEPC处理水，吹打混匀，充分溶解RNA，然后立即反转录成cDNA。
具体实施方式
选取出生后120d的南江黄羊进行宰杀，取其背最长肌组织样品后迅速置于液氮中保存待用。
（2） 加氯仿0.2mL(必须按总体积的1/5)，旋涡仪振荡混匀15秒，室温静置5min；（3）
4℃下12000rpm离心15min；
（4）转移上层水相450µL于另一个新的1.5mLEP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室温静置10min；
（5）4℃下12000rpm离心10min；
（6）弃去上层清液后，加入4℃预冷的75%乙醇（用DEPC处理水配制）1mL，静置5min，（7）4℃下7500g离心5min；
（8）弃上清，用枪吸取多余的液体，空气干燥约3min；加入30µL DEPC处理水，吹打混匀，充分溶解RNA。
正向引物：5' AGCTCGCTGCCGCCCAGT 3'
反向引物：5' GCTGATCATGTCCTTGGCAG 3'
（2） PCR的反应体系和条件：反应体系（25µL）：0.25 µL的TaKaRa Taq酶，12.5 µL的
2×GC Buffer I，4 µL的dNTP Mixture，正反向引物各0.5 µL，6.25 µL的灭菌ddH2O，模板cDNA 1 µL。反应条件为95℃预变性4 min，35个循环（94℃，45 s；53.4℃，30 s；72℃，90 s），最后72℃ 7 min；PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。
（1）通过1.5%的琼脂糖凝胶电泳将目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，然后用干净的手术刀将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5 mL离心管中。
将胶回收产物与pMD19-T载体连接。将载体在冰上融化，短暂离心装有载体的离心管，以免液体挂在管壁上。在超净操作台上按照如下体系配置连接液：
将反应混合液置于16℃水浴锅中连接3h。
800µL，送往上海生工生物工程有限公司进行测序。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 噻菌灵半抗原、偶联抗原、抗体及胶体金快速检测装置及其用途 | 2020-05-13 | 870 |
| 一种抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体 | 2020-05-11 | 156 |
| 一种抗人心肌肌钙蛋白I的抗体及其应用 | 2020-05-11 | 936 |
| 一种全天然润唇膏及其制备方法 | 2020-05-14 | 155 |
| 制备心脏肌球蛋白结合蛋白C抗体及检测方法 | 2020-05-12 | 100 |
| 一种快速检测绵羊LRRFIP1基因CNV标记的方法及其应用 | 2020-05-13 | 198 |
| 一种抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体 | 2020-05-11 | 443 |
| 一种绵羊皮革鞣制剂的制备方法 | 2020-05-13 | 335 |
| 一种检测羊包虫病ELISA抗体检测试剂盒及其应用 | 2020-05-14 | 285 |
| 一种绵羊肺炎支原体体外培养基及制备方法 | 2020-05-14 | 845 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
