技术领域
[0001] 本
发明属于分子遗传育种领域，具体涉及一种检测绵羊LRRFIP1基因拷贝数变异的方法，该方法利用实时定量PCR技术，以基因组DNA为模板，以ANKRD1基因为参照，根据2*2-ΔCt值从而确定个体的拷贝数变异类型。
背景技术
[0002] DNA分子标记(DNAmolecular marker)是反映个体和种群间基因组特异性的DNA
片段。分子标记包括限制性片段长度多态性标记(Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP)、随机扩增基因组DNA多态性标记(Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD、扩增片段长度多态性标记(Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP)、微卫星DNA(Microsatellite，MS)、单核苷酸多态性标记(Single Nucleotide Polymorphisms，SNP)、插入/缺失多态性(Indels)等。而拷贝数变异(CNVs)是指长度为1kb至数Mb的有关DNA片段拷贝数突变，包括DNA单一片段的扩增、缺失、插入、倒置等，也包括复杂的
染色体扩增、缺失和插入的各种组合，由于CNVs比SNPs和Indels
覆盖范围更广，因此，遗传效应更大，可用作分子育种标记。
[0003]
富亮氨酸重复序列(Fli-1)相互作用蛋白-1(leucine-rich repeat(in flightless I)interacting protein-1,LRRFIP1)蛋白是一种转录抑制因子，能够作为Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)
信号通路的一个调节器发挥重要的作用，参与调节
炎症反应。LRRFIP1基因还参与调节肥胖患者
血浆CRP、IL-6表达
水平，但相关变异在
家畜中的影响还未见报道。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种快速检测绵羊LRRFIP1基因CNV标记的方法及其应用。
[0005] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0006] 一种检测绵羊LRRFIP1基因拷贝数变异的方法，包括以下步骤：以待测绵羊(例如，茶卡羊等地方绵羊品种)个体血样全基因组DNA为模板，以引物对P1及引物对P2为引物，分别通过实时
荧光定量PCR扩增LRRFIP1基因的拷贝数变异区域及作为内参的ANKRD1基因的部分片段，然后根据定量结果鉴定待测绵羊个体LRRFIP1基因的拷贝数变异类型。
[0007] 优选的，所述的LRRFIP1基因的拷贝数变异区域位于绵羊LRRFIP1基因参考基因组序列NC_019458.2的3239601位至3242400位，共2800bp。
[0008] 优选的，所述的拷贝数变异类型是根据2*2-ΔCt将定量结果分为的三类：多拷贝型，2*2-ΔCt>2；缺失型，2*2-ΔCt<2；正常型，2*2-ΔCt＝2。
[0009] 优选的，所述的引物对P1为：
[0010] 上游引物F1：5’-CGCTGAGCTGTCCCAATACA-3’
[0011] 下游引物R1：5’-GGGAAAGACTCCCTGTAAACACT-3’；
[0012] 所述的引物对P2为：
[0013] 上游引物F2：5’-TGGGCACCACGAAATTCTCA-3’
[0014] 下游引物R2：5’-TGGCAGAAATGTGCGAACG-3’。
[0015] 优选的，所述的实时荧光定量PCR的扩增体系包括：10ng/μL模板DNA 1μL及10pmol/L的引物对P1或引物对P2所对应的上、下游引物各0.5μL。
[0016] 优选的，所述的实时荧光定量PCR的反应程序为：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃
退火1min，共40个循环。
[0017] 优选的，基于引物对P1扩增的PCR产物片段大小为127bp，基于引物对P2扩增的PCR产物片段大小为143bp。
[0018] 上述检测绵羊LRRFIP1基因拷贝数变异的方法在绵羊分子标记辅助选择育种中的应用。
[0019] 优选的，所述的待测绵羊(例如，茶卡羊)群体中，具有多拷贝型拷贝数变异类型的个体在生长性状(例如，胸围、体重)上优于具有正常型、缺失型拷贝数变异类型的个体。
[0020] 本发明的有益效果体现在：
[0021] 本发明以待测绵羊的基因组DNA为模板，利用实时荧光定量PCR准确、可靠的检测个体的基因组中LRRFIP1基因的拷贝数变异类型，根据检测结果，以及绵羊群体中的拷贝数变异情况与其体重、胸围、体高、体长等重要经济性状关联分析的结果，本发明提出的检测LRRFIP1基因CNV标记的方法可以用于快速建立生长性状(例如，体重、胸围)优势绵羊种群(例如，茶卡羊种群)，从而加快绵羊优良性能的选育
进程。该方法简单、快速、便于推广应用。
附图说明
[0022] 图1为本发明中进行qPCR(LRRFIP1基因)绘制的扩增曲线。
[0023] 图2是本发明中进行qPCR(LRRFIP1基因)绘制的溶解曲线。
具体实施方式
[0024] 下面结合附图和
实施例对本发明做进一步详细说明，所述实施例是对本发明的解释，而不是对本发明保护范围的限制。
[0025] 本发明利用实时荧光定量PCR对LRRFIP1基因的拷贝数变异进行检测并用于分子育种，包括以下步骤：
[0026] (1)利用NCBI
数据库查找LRRFIP1基因序列，再用Primer 5.0
软件进行引物设计。
[0027] (2)采用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测候选位点在群体中的拷贝数变异情况；
[0028] (3)利用SPSS 23.0软件将拷贝数变异类型与绵羊生长性状进行关联分析，筛选到与绵羊生长性状相关的CNV标记；
[0029] (4)根据拷贝数变异类型获得生长性状优异的绵羊种群，进行选育。
[0030] 1、茶卡羊样本采集
[0031] 本发明具体以221头茶卡羊作为检测对象，茶卡羊血样采集自青海省乌兰县茶卡镇，
采样时间是2018年5月。
[0032] 2、血样基因组DNA的提取
[0033] 1)
冰冻的血样在室温水浴中融化，将1mL
全血转入一个无菌的2mL离心管中。
[0034] 2)加入等体积的PBS缓冲液，温和摇动10min，室温3500g离心10min。
[0035] 3)用移液器吸弃上清，重复步骤2至上清液透明，沉淀无色。
[0036] 4)离心管中加DNA提取液1mL，温和摇动使细胞沉淀悬浮，加入蛋白酶K 3μL(终浓度为60μg/mL)，混匀。
[0037] 5)在恒温水浴箱中55℃温育过夜(16h左右)，至细胞沉淀物被完全消化，溶液澄清。
[0038] 6)反应液冷却至室温，加入1倍体积(1mL)的Tris饱和酚，放置冰上温和摇动20min，4℃、12000g离心10min。
[0039] 7)将上层水相用移液器移到另一灭菌离心管中。
[0040] 8)加入0.5倍体积(0.5mL)的酚和0.5倍体积(0.5mL)的氯仿，放置冰上温和摇动20min，4℃、12000g离心10min。
[0041] 9)将上层水相用移液器移到另一灭菌离心管中。
[0042] 10)加入1倍体积(1mL)的氯仿，放置冰上温和摇动20min，4℃、12000g离心10min。
[0043] 11)将上层水相用移液器移到另一灭菌离心管中。
[0044] 12)加入2倍体积的预冷无水
乙醇(-20℃)，轻轻口底摇晃多次至DNA析出，然后-20℃放置30min。
[0045] 13)用玻璃钩将DNA团钩出转入一新的灭菌离心管中，或4℃、12000g离心10min，弃去乙醇。
[0046] 14)加入70％乙醇1mL，温和摇动10min，4℃、12000g离心10min，弃乙醇；重复漂洗一次。
[0047] 15)
真空干燥或室温下使乙醇挥发干净，根据DNA的量，加入超纯水100～300μL，4℃保存至DNA完全溶解，分光光度计测定浓度后，-80℃保存。
[0048] 3、目标序列及内参序列的扩增
[0049] 以NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公布的绵羊LRRFIP1基因序列(GenBank Accession No.NC_019458.2)为参考序列，利用Primer 5.0设计CNV区域(NC_019458.2的3239601位至3242400位)中一段127bp的序列(目标序列)的引物(引物对P1)，内参序列为已知的不存在拷贝数变异的序列，即ANKRD1基因中的一段143bp的序列，采用相同方法设计扩增内参序列的引物(引物对P2)。引物对序列信息如表1所示(引物合成时间2018年10月)。
[0050] 表1.实时荧光定量PCR的引物信息
[0051]
[0052] 实时荧光定量PCR所用的扩增体系以10μL计为：10ng/μL模板DNA(血样基因组DNA)1μL，10pmol/L的上、下游引物各0.5μL，2×SYBR Green qPCR Mix 5μL，及ddH2O 3μL。
[0053] PCR扩增的反应程序为：(1)95℃预变性10min；(2)95℃变性15s，60℃退火1min，共40个循环。绘制溶解曲线(Bio Rad CFX96 3.1)。
[0054] 通过绘制扩增曲线(图1)和溶解峰确定引物适用于qPCR分析。根据绘制的溶解曲线，各样品曲线吻合在一起，且曲线走势平滑，峰高且尖，无引物二聚体或非特异扩增引起的杂峰(图2)。
[0055] 4、拷贝数变异的推断
[0056] 每个样品分别用目标序列和内参序列的引物进行扩增，并且每对引物3个重复。根-ΔCt -ΔCt据2*2 方法进行拷贝数的分析。其中ΔCt＝Ct目的基因–Ct内参基因。2*2 表示的是拷贝数。Ct即Cycle threshold，为PCR扩增过程中，扩增产物的荧
光信号达到设定的
阈值时所经过的扩增循环次数。根据2*2-ΔCt将定量结果分为三类：多拷贝型(Gain)，2*2-ΔCt>2；缺失型(Loss)，2*2-ΔCt<2；正常型(Median)，2*2-ΔCt＝2。
[0057] 5、LRRFIP1基因CNV位点与生长性状的关联分析
[0058] 生产数据：体高、体长、胸围、体重。
[0059] 关联分析模型：先对数据进行描述分析，确定是否存在离群值，再利用最小二乘分析对数据校正；根据数据特征，应用SPSS 23.0软件分析各基因型间的生长性状效应。在对基因型效应进行分析时采用了固定模型：Yijk＝μ+Ai+CNVj+eijk。其中：Yijk为性状观察值，μ为总体均值，Ai为第i头个体的年龄，CNVj为第j个拷贝数变异类型的固定效应，eijk为随机误差。各组数据间的差异性采用LSD多重比较进行检验，试验结果以Mean±SE形式表示。
数据处理结果见表2。
[0060] 表2.茶卡羊LRRFIP1基因拷贝数变异与生长性状的
关联性分析[0061]
[0062] 注：平均值肩标上具有相同字母表示差异不显著(P>0.05)，平均值肩标上字母不同表示差异显著(P<0.05)。括号里面的数值表示拷贝数变异类型的
频率。
[0063] 关联分析结果表明(见表2)：在茶卡羊中，具有多拷贝型的个体在胸围和体重上优于正常型和缺失型的个体。说明LRRFIP1基因CNV位点的多拷贝型可以作为一个提高绵羊生长性状(例如，胸围、体重性状)的候选分子遗传标记(CNV标记)。
[0064] 6、上述CNV标记在绵羊选育中的应用
[0065] 获得的候选分子遗传标记，可以用于寻找与其相关或紧密连
锁的影响绵羊生长性状的数量性状基因座。还可以用于绵羊的分子标记辅助选择，即通过对绵羊LRRFIP1基因CNV位点拷贝数变异类型的检测，选择多拷贝型的个体留种并扩繁，从而能够加快绵羊品种(例如，茶卡羊)改良的选育进程。
