一种绵羊肺炎支原体体外培养基及制备方法
阅读：845发布：2020-05-14
专利汇可以提供一种绵羊肺炎支原体体外培养基及制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开一种支原体体外培养基，及这种培养基的制备方法。本发明的支原体体外培养基制备方法是将：PPLO Both、 葡萄糖 、丙 酮 酸 钠、25％ 酵母 浸出 液和酚红一定比例混合后高压灭菌，待其 温度 稳定在37℃以下后，再加入灭活健康 马 血清和经过高压灭菌 水 溶解的50mg/mL 氨 苄青霉素，再用1mol/L的NaOH调pH值到7.6-7.8，得到培养基。本发明既能减少培养所需的时间，还明显提高了 绵羊 肺 炎支原体的活菌滴度，为绵羊肺炎支原体优质 疫苗 的研制奠定了 基础 。，下面是一种绵羊肺炎支原体体外培养基及制备方法专利的具体信息内容。
一种绵羊肺炎支原体体外培养基及制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种细菌培养基及其制备方法，确切的讲涉及一种绵羊肺炎支原体体外培养基，以及这种培养基的制备方法。
背景技术
[0002] 绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae.MO)最早由Mackay等人(1963)从患有肺腺癌的绵羊肺中分离得到一种介于细菌与病毒之间的无细胞壁的原核病原微生物，是引起绵羊传染性胸膜肺炎的病原体，绵羊经呼吸道感染后可表现发热、咳嗽、腹式呼吸、渐进性消瘦及增生性、化脓性肺炎，发病率为20％～30％，病死率一般为30％～50％，有的高达80％，导致绵羊尤其是羔羊的大批死亡，给养羊业造成严重危害。在我国最早由胡景韶等(1982)从发病绵羊上分离到了绵羊肺炎支原体，随后新疆、四川、云南、辽宁、江苏和甘肃等地都有从患肺炎的绵羊肺中分离到Mo的病例，是目前国内规模化舍饲绵羊的高发高害传染病。所以对羊支原体病的研究益受到人们的重视。
[0003] 近年来，随着我国养羊业的迅速发展，尤其是以规模化全舍饲养殖模式为主的肉羊生产中，由绵羊肺炎支原体引发的绵羊传染性胸膜肺炎在地域分布及流行强度上日趋增大、危害性日趋严重。羊养殖业是我国畜牧养殖中重要的组成部分，对拉动我国畜牧业的整体经济发展有很大的帮助。但是在实际羊养殖的过程中还是会出现一些问题，流行疾病的感染会给羊的身体健康带来很大的危害，从而给羊养殖户造成了很大的经济损失，羊支原体肺炎就是重点疾病之一，接种疫苗是防治该病最为有效的方式，而制约疫苗行业发展的瓶颈是Mo大量体外培养难的问题，因此，如何提高Mo的生长滴度是亟待解决的问题。
发明内容
[0004] 本发明提供一种快速、高效的可以用于绵羊肺炎支原体培养的体外培养基及其制备方法。解决现有培养基培养菌量低，效率差的问题。同时提供这种培养基的制备方法。
[0005] 制备方法如下：
[0006] PPLO Both 21-25g/L，葡萄糖10-12g/L，丙酮酸钠10-12g/L，25％酵母浸出液80-100mL/L，1％酚红2-3mL/L，用1M NaOH调pH值到7.6-7.8，混合均匀后高压灭菌。待混合液温度稳定在37℃一下后，再加入灭活健康马血清200-220mL/L和经过高压灭菌水溶解的50mg/ml氨苄青霉素1mL得到培养基。
[0007] 经过反复试验表明，本发明的培养基生长滴度和生长速度都要比KM2培养基效果好，与现有技术相比，所带来的技术创新点是：
[0008] 1.较现有培养基KM2培养绵羊肺炎支原体菌量107CCU/ml。本发明培养基培养绵羊肺炎支原体最高可达1010CCU/ml；
[0009] 2.较现有培养基KM2，本发明培养基制作方法更为简便，不用配置MEM；
[0010] 3.本发明培养基培养绵羊肺炎支原体仅12小时即可生长，72小时达到峰值。
[0011] 4.本发明培养基不需要添加醋酸铊，更为环保，对人体无害。
具体实施方式
[0012] 实例1：
[0013] 1.本发明培养基的制备：
[0014] 以下实例所用化学试剂都是常规试剂，均可商购获得。
[0015] 配置1000mL绵羊肺炎支原体培养基：
[0016] (1)PPLO Both 21g
[0017] (2)葡萄糖 10g
[0018] (3)丙酮酸钠 10g
[0019] (4)25％酵母浸出液 100mL
[0020] (5)1％酚红 3mL
[0021] (6)无菌马血清 200mL
[0022] (7)50mg/mL氨苄青霉素 1mL
[0023] 将(1)～(5)试剂逐一融入700mL单蒸水中充分混匀，调pH7.8，115℃高压灭菌20分钟，取出凉至37℃以下。加入(6)，(7)。
[0024] 2.质量浓度为1％的酚红溶液的配置：
[0025] 称取酚红1.0g，置研钵中，分6次加入6mL(每次1mL)1M NaOH(4.0g溶于100mL单蒸水)，研磨至充分溶解。将溶解的酚红吸入100mL容量瓶中，用单蒸水洗下研钵中残留的酚红液体，后用单蒸水补足100mL。
[0026] 3.质量浓度为25％的酵母浸出液的配置：
[0027] 鲜酵母500g搅拌溶解于2000mL双蒸水中，80℃水浴30分钟。冷却至室温后，3000转/分离心20分钟取上清。将上清用2M的NaOH调PH至7.8-8.0后煮沸。置室温放凉后，使用双层滤纸过滤后，-20℃保存备用。
[0028] 实例2：
[0029] 1.对比试验
[0030] KM2培养基的配制：
[0031] MEM 5g，葡萄糖0.4g，丙酮酸钠0.2g，水解乳蛋白5.1g，1％酚红2.5mL，25％新鲜酵母浸出液20mL，青霉素(20万IU/ml)1mL，10％醋酸铊1mL，无菌马血清200mL，混合。用去离子水定容至1000ml，用灭菌的1M NaOH调pH值到7.4，经0.22微米滤膜滤过除菌备用。
[0032] 2.检测
[0033] 活菌滴度(CCU)测定。方法如下：取12支试管，每管加对应培养基4.5mL，在第1管中加入0.5ml生长良好的绵羊肺炎支原体培养物，用振荡器充分混匀，换新的移液管，从第1管吸取0.5mL加入到第2管中，依次进行10倍稀释至第11管，第11管中弃去0.5ml培养液；得到-1 -11培养液的稀释度分别为10 -10 ，第12管为对应培养基对照。试验管设3个重复。将试管置
37℃恒温培养箱中静置培养，每天观察颜色变化，连续观察10天，发生颜色变化的最高稀释度即为该培养物的活菌滴度，用颜色变化单位(CCU)表示。试验重复3次
37℃恒温培养箱中静置培养，每天观察颜色变化，连续观察10天，发生颜色变化的最高稀释度即为该培养物的活菌滴度，用颜色变化单位(CCU)表示。试验重复3次
[0034] 3.结果
[0035] 经三次试验结果显示，在相同条件下，KM2培养基培养绵羊肺炎支原体3次CCU测定结果均为107CCU/ml，使用本发明培养基培养绵羊肺炎支原体，3次CCU测定结果均为1010CCU/ml，远高于KM2培养基培养绵羊肺炎支原体的活菌滴度。
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