制备心脏肌球蛋白结合蛋白C抗体及检测方法
阅读：100发布：2020-05-12
专利汇可以提供制备心脏肌球蛋白结合蛋白C抗体及检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种制备心脏肌球蛋白结合蛋白C 抗体 ，属于 生物 技术领域。本 发明 的目的是制备MYBPC3-C0抗体，特异性结合MYBPC3，用于建立侧向 免疫层析 法（Lateral flow immunoassay,LFIA）检测MYBPC3 试剂 盒 。本发明构建标签-MYBPC3-C0重组蛋白载体，用细菌， 酵母 ，昆虫细胞，动物或人细胞表达标签-MYBPC3-C0蛋白，纯化标签-MYBPC3-C0蛋白为MYBPC3-C0 抗原 。本发明灵敏度高，特异性强，快速检测血液中MYBPC3浓度，用于早期诊断AMI发生。，下面是制备心脏肌球蛋白结合蛋白C抗体及检测方法专利的具体信息内容。
1.一种制备心脏肌球蛋白结合蛋白C抗体，其特征在于：构建标签-MYBPC3-C0重组蛋白载体，用细菌，酵母，昆虫细胞，动物或人细胞表达标签-MYBPC3-C0蛋白，纯化标签-MYBPC3-C0蛋白为MYBPC3-C0抗原；MYBPC3-C0蛋白氨基酸序列SEQ ID No.1：
MPEPGKKPVSAFSKKPRSVEVAAGSPAVFEAETERAGVKVRWQRGGSDISASNKYGLATEGTRHTLTVREVGPADQGSYAVIAGSSKVKFDLKVIEAEKAEPMLAPAPAPAEATGAPGEAPAPAAELGESAPSPKGSSSAALNGPTPGAPDDPI。
2.根据权利要求1所述的制备心脏肌球蛋白结合蛋白C抗体，其特征在于：MYBPC3-C0蛋白抗原，免疫动物是鼠，大鼠，兔，山羊，绵羊，羊驼，驴，马，产生MYBPC3-C0单克隆抗体或多克隆抗体。
3.根据权利要求1所述的制备心脏肌球蛋白结合蛋白C抗体，其特征在于：构建标签-MYBPC3-C0C1f重组蛋白载体，用细菌，酵母，昆虫细胞，动物或人细胞表达标签-C0C1f蛋白，纯化标签-C0C1f蛋白为MYBPC3校准品；C0C1f蛋白氨基酸序列SEQ ID No.2：
MPEPGKKPVSAFSKKPRSVEVAAGSPAVFEAETERAGVKVRWQRGGSDISASNKYGLATEGTRHTLTVREVGPADQGSYAVIAGSSKVKFDLKVIEAEKAEPMLAPAPAPAEATGAPGEAPAPAAELGESAPSPKGSSSAALNGPTPGAPDDPIGLFVMRPQDGEVTVGGSITFSARVAGASLLKPPVVKWFKGKWVDLSSKVGQHLQLHDSYDRASKVYLFELHITDAQPAFTGSYRCEVSTKDKFDCSNFNLTVHEAMGTGDLDLLS。
4.根据权利要求2或3所述的制备心脏肌球蛋白结合蛋白C抗体，其特征在于：MYBPC3单克隆抗体或多克隆抗体及MYBPC3校准品，建立检测MYBPC3方法，包括ELISA，化学发光免疫法，电化学发光免疫法，免疫荧光法，免疫比浊法，侧向免疫层析法，微流体免疫学方法，免疫芯片技术，生物传感技术。
5.根据权利要求2或3所述的制备心脏肌球蛋白结合蛋白C抗体，其特征在于：MYBPC3单克隆抗体或多克隆抗体及MYBPC3 校准品，建立一种侧向免疫层析法检测MYBPC3试剂盒，一种为快速定量检测MYBPC3免疫层析试纸条，其特征在于: 所述试纸条包括PVC底板上顺序连接固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成；所述的结合垫吸附MYBPC3抗体标记荧光微球；所述硝酸纤维素膜上固定MYBPC3抗体形成的检测线和抗IgG抗体构成的质控线。
6.根据权利要求2或3所述的制备心脏肌球蛋白结合蛋白C抗体，其特征在于：LFIA检测MYBPC3浓度试剂盒，检测血清，血浆,全血或其他体液中MYBPC3浓度。
制备心脏肌球蛋白结合蛋白C抗体及检测方法
技术领域
背景技术
[0002] 诊断急性心肌梗塞(Acute myocardial infarction,AMI)金标准血液指标为肌钙蛋白T（Cardiac troponin T，cTnT），但血液中cTnT水平在AMI初始阶段非常低,使得早期诊断AMI变得困难。
[0003] AMI理想标志物是在心肌梗塞后，从心肌细胞快速释放到血液中，而心脏肌球蛋白结合蛋白C (Myosin-Binding Protein C, Cardiac-Type，MYBPC3或cMyBP-C )更符合这一标准。
[0004] MYBPC3有1273个氨基酸，分子量为140KDa结构蛋白。MYBPC3属于Ⅲ型纤连蛋白超家族和免疫球蛋白超家族，含有３个Ⅲ型纤连蛋白结构域（Fibronectintype3，FN3）和８个免疫球蛋白样结构域（Immunoglobulin,Ig），Pro-Ala结构域（PAdomain），Myosin(S2)结合区（Mdomain）。FN3是两片反向平行的β⁃链形成的层状结构，含FN3的多为受体蛋白；Ig由约70-110氨基酸组成，是两层反向平行的β⁃折叠链形成的层状结构，看图1MYBPC3蛋白结构示意图。
[0005] MYBPC3参与肌节蛋白的结构和功能，MYBPC3的C10结构域与肌球蛋白纤维结合，而C8～C10结构区域结合肌联蛋白（Titin），有稳定肌小节结构作用。MYBPC3在C1和C2结构域之间有个特定区域，M domain与肌球蛋白（Myosin）颈部结合，也是MYBPC3磷酸化部位（Phosphorylation sites），作为cAMP依赖的蛋白激酶以及钙调蛋白依赖的蛋白激酶的作用位点，磷酸化心肌特定的模序调节心肌收缩力，MYBPC3不仅参与心肌结构的维持，还参与细胞内信息传递，影响肌丝的舒缩运动。
[0006] 机体内存在3种不同的MyBP-C异构体，通过不同基因编码，但3种MyBP-C异构体氨基酸序列有很高同源性。与骨骼肌型（MYBPC1）相比较，MYBPC3-N端（1-157氨基酸残基）是独特结构域（C0)并具有特异性抗原表位，可用免疫学方法特异性测定出心脏型 MYBPC3。
[0007] MYBPC3是高度磷酸化的蛋白,能增强对蛋白降解酶的抵抗力, 而273S和282S部位去磷酸化有助于 MYBPC3 降解，释放30-40KDa MYBPC3-N 端片段 (C0C1f)到循环中，提高血液中C0C1f水平。
[0008] MYBPC3是心肌细胞特有的粗肌丝结构蛋白之一，AMI发生时，血清MYBPC3浓度快升高，主要由于MYBPC3具有高度的可溶性及对蛋白水解酶非常敏感，在心肌缺血时，蛋白水解酶被启动并水解粗肌丝蛋白，MYBPC3去磷酸化，降解并释放入血流，导致血液中MYBPC3片段浓度在短时间内急剧升高。
[0009] AMI发生后3小时，血液中MYBPC3水平已升高，6小时达高峰，12小时后，MYBPC3恢复至基线水平；而血液中cTnT水平在6-12小时后增高。
[0010] 研究发现，需要3-9mg 心肌坏死时，能测出cTNT水平增高；而0.07mg心肌坏死时，就能测出MYBPC3水平增高。由于MYBPC3分子量大，在AMI超早期，完整的MYBPC3及其水解产物持续大量释放入血，能高于cTNT数倍，甚至数十倍，易于检测，测定血液中MYBPC3浓度，可成为超早期诊断AMI敏感和特异性指标。
发明内容
[0012] 本发明构建标签-MYBPC3-C0重组蛋白载体，用细菌，酵母，昆虫细胞，动物或人细胞表达标签-MYBPC3-C0蛋白，纯化标签-MYBPC3-C0蛋白为MYBPC3-C0抗原；MYBPC3-C0蛋白氨基酸序列SEQ ID No.1：MPEPGKKPVSAFSKKPRSVEVAAGSPAVFEAETERAGVKVRWQRGGSDISASNKYGLATEGTRHTLTVREVGPADQGSYAVIAGSSKVKFDLKVIEAEKAEPMLAPAPAPAEATGAPGEAPAPAAELGESAPSPKGSSSAALNGPTPGAPDDPI。
[0014] 本发明构建标签-MYBPC3-C0C1f重组蛋白载体，用细菌，酵母，昆虫细胞，动物或人细胞表达标签-C0C1f蛋白，纯化标签-C0C1f蛋白为MYBPC3校准品；C0C1f蛋白氨基酸序列SEQ ID No.2：MPEPGKKPVSAFSKKPRSVEVAAGSPAVFEAETERAGVKVRWQRGGSDISASNKYGLATEGTRHTLTVREVGPADQGSYAVIAGSSKVKFDLKVIEAEKAEPMLAPAPAPAEATGAPGEAPAPAAELGESAPSPKGSSSAALNGPTPGAPDDPIGLFVMRPQDGEVTVGGSITFSARVAGASLLKPPVVKWFKGKWVDLSSKVGQHLQLHDSYDRASKVYLFELHITDAQPAFTGSYRCEVSTKDKFDCSNFNLTVHEAMGTGDLDLLS。
[0015] 本发明MYBPC3单克隆抗体或多克隆抗体及MYBPC3校准品，建立检测MYBPC3方法，包括ELISA，化学发光免疫法，电化学发光免疫法，免疫荧光法，免疫比浊法，侧向免疫层析法，微流体免疫学方法，免疫芯片技术，生物传感技术。
[0016] 本发明MYBPC3单克隆抗体或多克隆抗体及MYBPC3 校准品，建立一种侧向免疫层析法检测MYBPC3试剂盒，一种为快速定量检测MYBPC3免疫层析试纸条，其特征在于: 所述试纸条包括PVC底板上顺序连接固定样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组成；所述的结合垫吸附MYBPC3抗体标记荧光微球；所述硝酸纤维素膜上固定MYBPC3抗体形成的检测线和抗IgG抗体构成的质控线。
[0019] 图1是MYBPC3蛋白结构示意图；图2是免疫层析试纸条侧视图；
图3是免疫层析试纸卡正面图；
图4是银染法测定MYBPC3-C0-His图；
图5是纯化MYBPC3-C0-His蛋白浓度标准曲线图；
图6是银染法测定MYBPC3-C0C1f-Flag图；
图7是纯化MYBPC3-C0C1f-Flag蛋白浓度标准曲线图；
图8是C0C1f校准品浓度与荧光强度单位相关曲线图。
图3是免疫层析试纸卡正面图；
图4是银染法测定MYBPC3-C0-His图；
图5是纯化MYBPC3-C0-His蛋白浓度标准曲线图；
图6是银染法测定MYBPC3-C0C1f-Flag图；
图7是纯化MYBPC3-C0C1f-Flag蛋白浓度标准曲线图；
图8是C0C1f校准品浓度与荧光强度单位相关曲线图。
具体实施方式
[0020] 本发明公开了制备MYBPC3特异性抗体及建立一种LFIA检测MYBPC3试剂盒的过程：为了建立检测MYBPC3方法，本发明制备MYBPC3-C0重组蛋白抗原，用于产生MYBPC3-C0单克隆抗体或多克隆抗体，用此抗体建立检测MYBPC3方法及LFIA检测MYBPC3体外诊断试剂盒。
[0021] 具体而言，本发明公开了一种MYBPC3-C0重组蛋白抗原制备过程，步骤如下：（1）合成MYBPC3-C0DNA；（2）构建pQE-60-MYBPC3-C0载体；（3）表达MYBPC3-C0-His蛋白；
(4)用Ni-NTAAgarose和离子层析柱分离和纯化MYBPC3-C0-His蛋白；（5）进行MYBPC3-C0-His蛋白复性和浓缩过程；（6）测定MYBPC3-C0-His蛋白浓度，-80℃冻存。
(4)用Ni-NTAAgarose和离子层析柱分离和纯化MYBPC3-C0-His蛋白；（5）进行MYBPC3-C0-His蛋白复性和浓缩过程；（6）测定MYBPC3-C0-His蛋白浓度，-80℃冻存。
[0022] MYBPC3-C0-His重组蛋白氨基酸序列：MPEPGKKPVSAFSKKPRSVEVAAGSPAVFEAETERAGVKVRWQRGGSDISASNKYGLATEGTRHTLTVREVGPADQGSYAVIAGSSKVKFDLKVIEAEKAEPMLAPAPAPAEATGAPGEAPAPAAELGESAPSPKGSSSAALNGPTPGAPDDPIRSHHHHHH本发明MYBPC3-C0-His经过蛋白复性过程，促进蛋白自然结构形成，His-MYBPC3-C0分子量为17KDa，适合作为蛋白抗原，用于免疫动物(鼠，大鼠，兔，山羊，绵羊，羊驼，驴,马等)，产生特异性MYBPC3-C0单克隆抗体或多克隆抗体。
[0023] 本发明表达MYBPC3-C0区域（1-155 氨基酸残基）是MYBPC3特有氨基酸序列，骨骼肌型（MYBPC1）缺乏此同源性序列，产生抗MYBPC3-C0抗体，建立免疫学方法特异性测定出心脏型 MYBPC3，而不结合MYBPC1，排出与MYBPC1交叉反应。
[0024] 本发明公开了一种MYBPC3-C0抗体制备过程，步骤如下：（1）制备MYBPC3-C0-His抗原；（2）免疫动物产生MYBPC3-C0抗血清；（3）测定MYBPC3-C0抗血清滴度和特异性；（4）MYBPC3-C0-His偶联树脂；（5）MYBPC3-C0-His-树脂层析柱分离和纯化出MYBPC3-C0抗体；（6）测定MYBPC3-C0抗体效价和特异性。
MYBPC3-C0-His抗原免疫动物产生抗血清中可能包括His抗体，用His peptide
（RSHHHHHH) 与MYBPC3-C0-His抗血清中His 抗体结合，形成His-peptide-His antibody复合物，排出His抗体结合 MYBPC3-C0-His蛋白。
MYBPC3-C0-His抗原免疫动物产生抗血清中可能包括His抗体，用His peptide
（RSHHHHHH) 与MYBPC3-C0-His抗血清中His 抗体结合，形成His-peptide-His antibody复合物，排出His抗体结合 MYBPC3-C0-His蛋白。
[0025] 本发明公开了一种MYBPC3-C0C1f重组蛋白制备过程，步骤如下：（1）合成MYBPC3-C0C1f-FlagDNA；（2）构建pQE-60-C0C1f-Flag载体；（3）表达C0C1f-Flag蛋白；(4)用FlagAgarose分离和纯化C0C1f-Flag蛋白；（5）进行C0C1f-Flag蛋白复性和浓缩过程；（6）测定C0C1f-Flag蛋白浓度，-80℃冻存。
[0026] C0C1f-Flag蛋白氨基酸序列：MPEPGKKPVSAFSKKPRSVEVAAGSPAVFEAETERAGVKVRWQRGGSDISASNKYGLATEGTRHTLTVREVGPADQGSYAVIAGSSKVKFDLKVIEAEKAEPMLAPAPAPAEATGAPGEAPAPAAELGESAPSPKGSSSAALNGPTPGAPDDPIGLFVMRPQDGEVTVGGSITFSARVAGASLLKPPVVKWFKGKWVDLSSKVGQHLQLHDSYDRASKVYLFELHITDAQPAFTGSYRCEVSTKDKFDCSNFNLTVHEAMGTGDLDLLSDYKDDDDKDA
MYBPC3是高度磷酸化的蛋白, 能增强对蛋白降解酶的抵抗力,当AIM发生时，MYBPC3在C1和C2结构域之间的磷酸化部位，特别是273S和282S 部位去磷酸化，有助于MYBPC3-N端降解，释放30-40KDa MYBPC3-N 端片段 (C0C1f) 到血循环中，用免疫学方法能检测出血液中高水平C0C1f。
MYBPC3是高度磷酸化的蛋白, 能增强对蛋白降解酶的抵抗力,当AIM发生时，MYBPC3在C1和C2结构域之间的磷酸化部位，特别是273S和282S 部位去磷酸化，有助于MYBPC3-N端降解，释放30-40KDa MYBPC3-N 端片段 (C0C1f) 到血循环中，用免疫学方法能检测出血液中高水平C0C1f。
[0027] 本发明C0C1f-Flag蛋白经过蛋白复性过程，促进C0C1f-Flag蛋白自然结构形成，作为MYBPC3校准品。
[0028] 本发明用 MYBPC3单克隆抗体或多克隆抗体进一步建立检测 MYBPC3方法，包括酶联免疫吸附法（ELISA），化学发光法（Chemiluminescence immunoassay, CLIA），电化学发光法(Electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA)，免疫荧光法（Fluorescence immunoassay, FIA），免疫比浊法（Turbidimetric immunoassay），侧向免疫层析法（Lateralflow immunoassay，LFIA）,微流体免疫学方法（Microfluidic immunoassay），免疫芯片技术（Immune chip technology），生物传感技术（Biological sensing technology）等。
[0029] 本发明公开了一种建立检测MYBPC3体外诊断试剂盒的过程，具体为快速定量检测MYBPC3免疫层析试纸条，步骤如下：MYBPC3抗体-荧光微球制备过程：
（1）碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)活化羧基修饰荧光微球；（2）加入MYBPC3抗体进行偶联反应；（3）终止偶联反应；（4）用Tris缓冲液悬浮MYBPC3抗体-荧光微球，4℃，保存备用。
（1）碳二亚胺(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)活化羧基修饰荧光微球；（2）加入MYBPC3抗体进行偶联反应；（3）终止偶联反应；（4）用Tris缓冲液悬浮MYBPC3抗体-荧光微球，4℃，保存备用。
[0030] 本发明公开了一种结合垫吸附有MYBPC3抗体-荧光微球的制备过程：用Tris缓冲液稀释MYBPC3抗体-荧光微球浓度到需要浓度，用2-6ul/cm速度，将上述荧光微球喷涂到结合垫上，30-37°C，干燥4-8小时，干燥密封，备用。
[0031] 本发明公开了一种硝酸纤维素膜上T线和C线的制备过程：用NaPO4缓冲液稀释MYBPC3抗体（T线液）和抗IgG抗体（C线液）到需要浓度，用0.6-
1.0ul/cm速度，将T线液和C线液分别喷涂到硝酸纤维素膜上，形成T线和C线，间隔为4-6mm，
30-37℃，干燥4-8小时，干燥密封，备用。
1.0ul/cm速度，将T线液和C线液分别喷涂到硝酸纤维素膜上，形成T线和C线，间隔为4-6mm，
30-37℃，干燥4-8小时，干燥密封，备用。
[0032] 本发明公开了一种试纸条组装过程：在PVC底板中间粘贴硝酸纤维素膜，一端粘贴吸水纸，位于硝酸纤维素膜上方；另一端粘贴结合垫，位于硝酸纤维素膜上方；在结合垫另一端粘贴样品垫，位于结合垫上方，形成试纸板，切割成宽3-5mm试纸条。
[0033] 本发明公开了一种试纸卡组装过程：本发明含有外壳，由壳面和壳底座两部分构成。将上述试纸条置于壳底座上，合上壳面，形成试纸卡。所述壳面上对应于硝酸纤维膜位置设有检测窗口，壳面上对应于样品垫位置设加样孔。
[0034] 本发明用双抗体夹心免疫层析原理：样品中MYBPC3通过层析作用向前移动，与结合垫吸附MYBPC3抗体-荧光微球结合，形成MYBPC3-MYBPC3抗体-荧光微球复合物，在毛细动力作用下，进入硝酸纤维素膜，MYBPC3-MYBPC3抗体-荧光微球与硝酸纤维素膜T线固定MYBPC3抗体结合，而形成荧光微球-MYBPC3抗体-MYBPC3-MYBPC3抗体复合物，聚集在T线，游离MYBPC3抗体-荧光微球在T线处不结合，继续向前移动，并与C线固定抗IgG抗体结合，未结合成分继续移动到吸水纸位置。T线捕获的荧光微球量与样品中MYBPC3浓度呈正相关，而C线捕获的荧光微球,表明完成免疫层析过程。通过免疫荧光分析仪对T线、C线信号进行扫描，根据T线信号强度与样品中MYBPC3浓度呈正相关，获得样品中MYBPC3浓度。
[0035] 本发明提供一种MYBPC3免疫层析试纸卡操作过程：将MYBPC3校准品加到MYBPC3免疫层析试纸卡加样孔中，反应10-15分钟，用免疫荧光分析仪，测定试纸卡上T线和C线荧光强度，制备MYBPC3浓度与荧光强度单位相关曲线，进一步设置免疫荧光分析仪MYBPC3浓度与荧光强度单位相关参数后，设立免疫荧光分析仪自动检测MYBPC3浓度系统，再进一步检测样品中MYBPC3浓度。
[0036] 结合具体实验，对本发明原理和结果作进一步说明，以下列出本发明多步骤试验过程：一、制备MYBPC3-C0重组蛋白
（一）合成MYBPC3-C0DNA(核酸序列)
合成MYBPC3-C0DNA表达 MYBPC3-C0蛋白氨基酸序列：
MPEPGKKPVSAFSKKPRSVEVAAGSPAVFEAETERAGVKVRWQRGGSDISASNKYGLATEGTRHTLTVREVGPADQGSYAVIAGSSKVKFDLKVIEAEKAEPMLAPAPAPAEATGAPGEAPAPAAELGESAPSPKGSSSAALNGPTPGAPDDPI。
（一）合成MYBPC3-C0DNA(核酸序列)
合成MYBPC3-C0DNA表达 MYBPC3-C0蛋白氨基酸序列：
MPEPGKKPVSAFSKKPRSVEVAAGSPAVFEAETERAGVKVRWQRGGSDISASNKYGLATEGTRHTLTVREVGPADQGSYAVIAGSSKVKFDLKVIEAEKAEPMLAPAPAPAEATGAPGEAPAPAAELGESAPSPKGSSSAALNGPTPGAPDDPI。
[0037] （二）构建pQE-60-MYBPC3-C0载体1.pQE-60载体DNA 3ul（3ug）
Cutsmart buffer 6ul
NcoI 3ul
BglII 3ul
H20 45ul
混均，37℃，反应2小时
2.放在1% Agarose/TBE 胶电泳孔中，进行电泳，EB进行DNA染色，紫外线下观察3.5kb载体DNA条带，切割下DNA条带,放到微量离心管中
3.用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)提取Agarose 条带中DNA
4.用Nanodrop Spectrophotometer 测定DNA 浓度
5.用T4DNAligase，连接合成MYBPC3-C0 DNA到pQE-60载体中
微量离心管中加入以下物质：
MYBPC3-C0DNA 50ng
载体 DNA（NcoI/BglII） 50ng
10X T4 DNA LigaseBuffer 1.0 ul
T4 DNA Ligase 0.5ul
H2O 到10ul
混均，25℃ 反应4小时，
6.连接DNA转入感受态细菌中
7.用PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits (Life Technologies Inc.)提取质粒DNA
8.鉴定出pQE-60-MYBPC3-C0载体，用于表达MYBPC3-C0-His重组蛋白。
Cutsmart buffer 6ul
NcoI 3ul
BglII 3ul
H20 45ul
混均，37℃，反应2小时
2.放在1% Agarose/TBE 胶电泳孔中，进行电泳，EB进行DNA染色，紫外线下观察3.5kb载体DNA条带，切割下DNA条带,放到微量离心管中
3.用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)提取Agarose 条带中DNA
4.用Nanodrop Spectrophotometer 测定DNA 浓度
5.用T4DNAligase，连接合成MYBPC3-C0 DNA到pQE-60载体中
微量离心管中加入以下物质：
MYBPC3-C0DNA 50ng
载体 DNA（NcoI/BglII） 50ng
10X T4 DNA LigaseBuffer 1.0 ul
T4 DNA Ligase 0.5ul
H2O 到10ul
混均，25℃ 反应4小时，
6.连接DNA转入感受态细菌中
7.用PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits (Life Technologies Inc.)提取质粒DNA
8.鉴定出pQE-60-MYBPC3-C0载体，用于表达MYBPC3-C0-His重组蛋白。
[0038] 三) 表达MYBPC3-C0-His重组蛋白1.pQE-60-MYBPC3-C0载体转入感受态细菌（M15细菌株）中
2.涂种50ul上述细菌液在25ug/ml Kanamycin, 100ug/ml Ampicillin LB-琼脂板上，
37℃，培养过夜
3.挑选单个菌落，接种到5ml 25ug/ml Kanamycin, 100ug/ml Ampicillin LB培养液中，37℃, 摇动，过夜
4.稀释细菌液到100ml，37℃，摇动0.5-3小时，OD600值0.2-0.5时，
5.加40ulIPTG（0.5M）到细菌液中,25℃,摇动4-6小时
6.离心，收集细菌，用PBS洗涤一次
7.加PBS，pH7.5,含0.1%NP-40,1.0mM DTT, 1.0mM PMSF,10ug/mlLeupeptin, 10ug/ml Aprotinin到离心管中，悬浮细菌
8.用超声法破碎细菌后，4℃，离心，13000rpm, 20分钟，转移上清液到新离心管中。
2.涂种50ul上述细菌液在25ug/ml Kanamycin, 100ug/ml Ampicillin LB-琼脂板上，
37℃，培养过夜
3.挑选单个菌落，接种到5ml 25ug/ml Kanamycin, 100ug/ml Ampicillin LB培养液中，37℃, 摇动，过夜
4.稀释细菌液到100ml，37℃，摇动0.5-3小时，OD600值0.2-0.5时，
5.加40ulIPTG（0.5M）到细菌液中,25℃,摇动4-6小时
6.离心，收集细菌，用PBS洗涤一次
7.加PBS，pH7.5,含0.1%NP-40,1.0mM DTT, 1.0mM PMSF,10ug/mlLeupeptin, 10ug/ml Aprotinin到离心管中，悬浮细菌
8.用超声法破碎细菌后，4℃，离心，13000rpm, 20分钟，转移上清液到新离心管中。
[0039] （四）纯化MYBPC3-C0-His重组蛋白1.制备SP-Sepharose 层析柱，用Buffer A(20mM NaPO4,pH8.0，100mM NaCl,0.1% CTAB)平衡SP-Sepharose 层析柱
2.上述细菌上清液（含MYBPC3-C0-His，pI=6.8），加到SP-Sepharose 层析柱中，通过SP-Sepharose 层析柱，收集滤过液，再加到SP-Sepharose 层析柱中，反复5次后，收集滤过液（含MYBPC3-C0-His）
3.Tris缓冲液洗涤Ni-NTAAgarose（QIAGEN）
4.加Ni-NTA Agarose到上述滤过液中，在4℃，反应1小时
5.在4℃条件下，离心，3000rpm, 2分钟，去除上清液
6.加50mM Tris,pH8.0,300mM NaCl,10mMImidazole,0.05%NP-40到Ni-NTA Agarose离心管中，洗涤4次
7.加洗脱液（50mM Tris, pH8.0，200mM NaCl, 500mMImidazole）到Ni-NTA Agarose离心管中,洗脱结合蛋白，再重复洗脱步骤二次
8.混合洗脱液，转入到透析袋 (Spectra/Pro) 中，放在透析液(50mM Tris, pH7.5,
150mM NaCl, 5% Glycerol, 1.0mM DTT, 1.0mM EDTA，1.0mMPMSF) 中，在4℃条件下，缓慢搅动，过夜
9.收集透析袋中蛋白液体移到离心管中
10.制备Q-Sepharose 层析柱，用Buffer B(50mM K2PO4, pH8.0,100mM NaCl, 0.2% CTAB)平衡Q-Sepharose 层析柱
11.加上述透析液到Q-Sepharose 层析柱中，通过Q-Sepharose 层析柱，收集滤过液，再加到Q-Sepharose 层析柱中，反复5次（MYBPC3-C0-His蛋白结合到Q-Sepharose层析柱）
12.加Buffer B到Q-Sepharose层析柱中，缓慢通过Q-Sepharose层析柱
13.洗脱液（0.5M K2PO4, pH5.0, 300mM NaCl, 0.1%CTAB）到Q-Sepharose层析柱中,洗脱液缓慢通过Q-Sepharose层析柱，收集洗脱液（含MYBPC3-C0-His蛋白）
14.洗脱液转入到透析袋中 (Spectra/Pro) ，再放入透析液 (20mM NaPO4, pH7.5,
100mM NaCl, 5% Glycerol, 1.0mM DTT,1.0mM EDTA，1.0mM PMSF) 中，在4 ℃条件下，缓慢搅动，过液
15.将透析袋中透析蛋白液移到微量离心管中，在4 ℃条件下，离心，13000rpm, 10分钟
16.加上述透析蛋白液到蛋白浓缩和净化离心柱中（Microcon-10KDa Centrifugal Filter），浓缩和净化离心柱中透析蛋白液
17.测定蛋白液浓度，-80℃，冻存。
2.上述细菌上清液（含MYBPC3-C0-His，pI=6.8），加到SP-Sepharose 层析柱中，通过SP-Sepharose 层析柱，收集滤过液，再加到SP-Sepharose 层析柱中，反复5次后，收集滤过液（含MYBPC3-C0-His）
3.Tris缓冲液洗涤Ni-NTAAgarose（QIAGEN）
4.加Ni-NTA Agarose到上述滤过液中，在4℃，反应1小时
5.在4℃条件下，离心，3000rpm, 2分钟，去除上清液
6.加50mM Tris,pH8.0,300mM NaCl,10mMImidazole,0.05%NP-40到Ni-NTA Agarose离心管中，洗涤4次
7.加洗脱液（50mM Tris, pH8.0，200mM NaCl, 500mMImidazole）到Ni-NTA Agarose离心管中,洗脱结合蛋白，再重复洗脱步骤二次
8.混合洗脱液，转入到透析袋 (Spectra/Pro) 中，放在透析液(50mM Tris, pH7.5,
150mM NaCl, 5% Glycerol, 1.0mM DTT, 1.0mM EDTA，1.0mMPMSF) 中，在4℃条件下，缓慢搅动，过夜
9.收集透析袋中蛋白液体移到离心管中
10.制备Q-Sepharose 层析柱，用Buffer B(50mM K2PO4, pH8.0,100mM NaCl, 0.2% CTAB)平衡Q-Sepharose 层析柱
11.加上述透析液到Q-Sepharose 层析柱中，通过Q-Sepharose 层析柱，收集滤过液，再加到Q-Sepharose 层析柱中，反复5次（MYBPC3-C0-His蛋白结合到Q-Sepharose层析柱）
12.加Buffer B到Q-Sepharose层析柱中，缓慢通过Q-Sepharose层析柱
13.洗脱液（0.5M K2PO4, pH5.0, 300mM NaCl, 0.1%CTAB）到Q-Sepharose层析柱中,洗脱液缓慢通过Q-Sepharose层析柱，收集洗脱液（含MYBPC3-C0-His蛋白）
14.洗脱液转入到透析袋中 (Spectra/Pro) ，再放入透析液 (20mM NaPO4, pH7.5,
100mM NaCl, 5% Glycerol, 1.0mM DTT,1.0mM EDTA，1.0mM PMSF) 中，在4 ℃条件下，缓慢搅动，过液
15.将透析袋中透析蛋白液移到微量离心管中，在4 ℃条件下，离心，13000rpm, 10分钟
16.加上述透析蛋白液到蛋白浓缩和净化离心柱中（Microcon-10KDa Centrifugal Filter），浓缩和净化离心柱中透析蛋白液
17.测定蛋白液浓度，-80℃，冻存。
[0040] （五）银染法测定MYBPC3-C0-His蛋白纯度（图4）1.冻存蛋白液离心管放到37 ℃水浴中，快速溶化，放到冰块中
2.1.0ul蛋白液,加5ul PBS, 4ul 4X蛋白加样液（50 mMTris，pH 6.8，2% SDS,10% Glycerol,1% β-mercaptoethanol, 12.5mM EDTA, 0.02% Bromophenol blue）, 100 ℃，3分钟
3.加10ul蛋白样本液到10% SDS-PAGE 凝胶孔中，进行电泳
4.完成电泳后，获取SDS-PAGE 凝胶，进行银染色，步骤如下：
ⅰ.加100ml 50% Methanol 到SDS-PAGE凝胶的容器中，室温下，缓慢摇动，15分钟，去除Methanol液体
ⅱ.加100ml 5% Methanol 到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下，缓慢摇动，10分钟，去除Methanol液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶1次
ⅲ.加10ul DTT 到SDS-PAGE胶容器中,有200ml水，室温下，缓慢摇动，10分钟，去除DTT液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶1次
ⅳ.加100ml 0.1% AgNO3到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下，缓慢摇动，15分钟，去除AgNO3液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶2次
ⅴ.加100ml 3% Na2CO3& 0.05% Formaldehyde 到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下反应，看到清晰蛋白条带为止
ⅵ.加Critic Acid到SDS-PAGE凝胶容器中,终止反应
ⅶ.用水清洗SDS-PAGE胶后，干燥SDS-PAGE凝胶,判断MYBPC3-C0-His纯度达99%以上。
2.1.0ul蛋白液,加5ul PBS, 4ul 4X蛋白加样液（50 mMTris，pH 6.8，2% SDS,10% Glycerol,1% β-mercaptoethanol, 12.5mM EDTA, 0.02% Bromophenol blue）, 100 ℃，3分钟
3.加10ul蛋白样本液到10% SDS-PAGE 凝胶孔中，进行电泳
4.完成电泳后，获取SDS-PAGE 凝胶，进行银染色，步骤如下：
ⅰ.加100ml 50% Methanol 到SDS-PAGE凝胶的容器中，室温下，缓慢摇动，15分钟，去除Methanol液体
ⅱ.加100ml 5% Methanol 到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下，缓慢摇动，10分钟，去除Methanol液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶1次
ⅲ.加10ul DTT 到SDS-PAGE胶容器中,有200ml水，室温下，缓慢摇动，10分钟，去除DTT液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶1次
ⅳ.加100ml 0.1% AgNO3到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下，缓慢摇动，15分钟，去除AgNO3液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶2次
ⅴ.加100ml 3% Na2CO3& 0.05% Formaldehyde 到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下反应，看到清晰蛋白条带为止
ⅵ.加Critic Acid到SDS-PAGE凝胶容器中,终止反应
ⅶ.用水清洗SDS-PAGE胶后，干燥SDS-PAGE凝胶,判断MYBPC3-C0-His纯度达99%以上。
[0041] 六)Bradford法测定纯化MYBPC3-C0-His浓度1.取1ml浓缩染料试剂（Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate）与4ml H2O
混合均匀，获得稀释染料试剂
2.制备BSA标准液, 浓度分别为0， 0.25, 0.5, 1.0, 2.0，4.0mg/ml
3.加79ul PBS 到微量滴定板孔中，加1.0ul不同浓度BSA标准液，
1.0ul纯化MYBPC3-C0-His蛋白液，每个样本加3个孔
4.加80ul稀释染料试剂到微量滴定板孔中，室温，放置5分钟
5.放微量滴定板到生化分析仪中，选用波长495nm,测定OD值
6.制备BSA浓度标准曲线，计算出纯化MYBPC3-C0-His蛋白浓度
纯化MYBPC3-C0-His平均OD值为3.093
MYBPC3-C0-His蛋白浓度=1.2657x–0.5965 = 3.32mg/ml
。
混合均匀，获得稀释染料试剂
2.制备BSA标准液, 浓度分别为0， 0.25, 0.5, 1.0, 2.0，4.0mg/ml
3.加79ul PBS 到微量滴定板孔中，加1.0ul不同浓度BSA标准液，
1.0ul纯化MYBPC3-C0-His蛋白液，每个样本加3个孔
4.加80ul稀释染料试剂到微量滴定板孔中，室温，放置5分钟
5.放微量滴定板到生化分析仪中，选用波长495nm,测定OD值
6.制备BSA浓度标准曲线，计算出纯化MYBPC3-C0-His蛋白浓度
纯化MYBPC3-C0-His平均OD值为3.093
MYBPC3-C0-His蛋白浓度=1.2657x–0.5965 = 3.32mg/ml
。
[0042] 二．制备MYBPC3-C0抗体（一）产生羊MYBPC3-C0抗血清
1. (Day 0) 采集5ml山羊血液
2. (Day 1)0.5mlMYBPC3-C0(1.0mg/ml)与0.5ml福氏完全佐剂(CFA)混合,20点注射到山羊皮下（50ul/每点）
3. (Day 14)0.25mlMYBPC3-C0 (1.0mg/ml)与0.25ml福氏不完全佐剂(IFA)混合,10点注射到山羊皮下（50ul/每点）
4.(Day 28)0.25ml MYBPC3-C0(1.0mg/ml)与0.25mlIFA混合,10点注射到山羊皮下（50ul/每点）
5. (Day 42) 采集山羊血5ml，测定MYBPC3-C0抗血清滴度和特异性
6. (Day 45) 0.25ml MYBPC3-C0 (1.0mg/ml)与0.25mlIFA混合, 10点注射到山羊皮下（50ul/每点）
7. (Day 59) 采集200ml山羊血液
8. (Day 60) 0.25ml MYBPC3-C0(1.0mg/ml)与0.25mlIFA混合, 10点注射到山羊皮下（50ul/每点）
9.(Day 74) 采集山羊血液，终止试验。
1. (Day 0) 采集5ml山羊血液
2. (Day 1)0.5mlMYBPC3-C0(1.0mg/ml)与0.5ml福氏完全佐剂(CFA)混合,20点注射到山羊皮下（50ul/每点）
3. (Day 14)0.25mlMYBPC3-C0 (1.0mg/ml)与0.25ml福氏不完全佐剂(IFA)混合,10点注射到山羊皮下（50ul/每点）
4.(Day 28)0.25ml MYBPC3-C0(1.0mg/ml)与0.25mlIFA混合,10点注射到山羊皮下（50ul/每点）
5. (Day 42) 采集山羊血5ml，测定MYBPC3-C0抗血清滴度和特异性
6. (Day 45) 0.25ml MYBPC3-C0 (1.0mg/ml)与0.25mlIFA混合, 10点注射到山羊皮下（50ul/每点）
7. (Day 59) 采集200ml山羊血液
8. (Day 60) 0.25ml MYBPC3-C0(1.0mg/ml)与0.25mlIFA混合, 10点注射到山羊皮下（50ul/每点）
9.(Day 74) 采集山羊血液，终止试验。
[0043] （二）产生兔MYBPC3-C0抗血清1. (Day 0) 采集2mlNew Zealand兔血液
2. (Day 1)0.2mlMYBPC3-C0(1.0mg/ml)与0.2ml福氏完全佐剂(CFA)混合,10点皮下注射到New Zealand兔（40ul/每点）
3. (Day 14) 0.1ml MYBPC3-C0(1.0mg/ml)与0.1ml福氏不完全佐剂(IFA)混合, 5点皮下注射到New Zealand兔（40ul/每点）
4. (Day 28) 0.2ml MYBPC3-C0 (1.0mg/ml)与0.2mlIFA混合, 5点皮下注射到New Zealand兔（40ul/每点）
5. (Day 35) 采集25ml New Zealand兔血液
6. (Day 42) 0.1ml MYBPC3-C0(1.0mg/ml)与0.1mlIFA混合, 5点皮下注射到New Zealand兔（40ul/每点）
7. (Day 56) 采集New Zealand兔血液, 终止实验。
2. (Day 1)0.2mlMYBPC3-C0(1.0mg/ml)与0.2ml福氏完全佐剂(CFA)混合,10点皮下注射到New Zealand兔（40ul/每点）
3. (Day 14) 0.1ml MYBPC3-C0(1.0mg/ml)与0.1ml福氏不完全佐剂(IFA)混合, 5点皮下注射到New Zealand兔（40ul/每点）
4. (Day 28) 0.2ml MYBPC3-C0 (1.0mg/ml)与0.2mlIFA混合, 5点皮下注射到New Zealand兔（40ul/每点）
5. (Day 35) 采集25ml New Zealand兔血液
6. (Day 42) 0.1ml MYBPC3-C0(1.0mg/ml)与0.1mlIFA混合, 5点皮下注射到New Zealand兔（40ul/每点）
7. (Day 56) 采集New Zealand兔血液, 终止实验。
[0044] （三）测定MYBPC3-C0抗血清滴度和特异性1.用50mM 碳酸盐缓冲液(pH9.6)制备MYBPC3-C0-His(10μg/ml), BSA(10μg/ml)包被液, 加1OOul包被液到酶反应板孔中，4℃，过夜，PBS洗涤1次
2.每孔加200ul封闭液PBS(1.0% BSA), 室温, 2小时，PBS洗涤2次
3.MYBPC3-C0抗血清(加1.0mg/ml His-peptide)稀释到不同浓度（1:10, 1:50, 1:
200，1:1000），加100ul到孔中 , 在室温下，缓慢摇动60分钟, 吸除反应液
4.用PBST（0.02% Tween20）洗涤酶反应板4次，每次5分钟
5.加稀释100ul抗羊或兔IgG抗体-HRP（Promega）到孔中, 在室温下, 缓慢摇动60分钟,
吸除抗体液
6.用PBST洗涤酶反应板4次，每次5分钟
7. 加100ul HRP底物(TMB Substrate buffer, Santa Cruz Biotech Inc.), 反应10分钟
8. 加50ul 2N H2SO4, 终止反应
9.放酶反应板板到MULTISKAN FC 分析仪中，选用波长450nm，测定OD 值
2.每孔加200ul封闭液PBS(1.0% BSA), 室温, 2小时，PBS洗涤2次
3.MYBPC3-C0抗血清(加1.0mg/ml His-peptide)稀释到不同浓度（1:10, 1:50, 1:
200，1:1000），加100ul到孔中 , 在室温下，缓慢摇动60分钟, 吸除反应液
4.用PBST（0.02% Tween20）洗涤酶反应板4次，每次5分钟
5.加稀释100ul抗羊或兔IgG抗体-HRP（Promega）到孔中, 在室温下, 缓慢摇动60分钟,
吸除抗体液
6.用PBST洗涤酶反应板4次，每次5分钟
7. 加100ul HRP底物(TMB Substrate buffer, Santa Cruz Biotech Inc.), 反应10分钟
8. 加50ul 2N H2SO4, 终止反应
9.放酶反应板板到MULTISKAN FC 分析仪中，选用波长450nm，测定OD 值
[0045] （四）MYBPC3-C0-His偶联琼脂糖1.20mgMYBPC3-C0-His，200mg NHS活化琼脂糖（NHS-Activated Agarose）购于ThermoFisherScientific，溶解2ml在PBSpH7.5中,摇动2小时
2．上述反应液转入离心管中，3000g, 离心2分钟，去除液体
3.加5mlPBSpH7.5到离心管中，3000g, 离心2分钟，去除液体，重复此步骤一次
4.加5ml终止液（1M Ethanolamine）到离心管中，摇动30分钟
5.3000g, 离心2分钟，去除液体
6.加5ml PBS pH7.5 到离心管中，3000g, 离心2分钟，去除液体，重复此步骤三次
7.加5ml保存液（ PBS，pH7.5，0.05% NaN3）到离心管中，3000g, 离心2分钟，去除液体
8.加2ml保存液（ PBS，pH7.5，0.05% NaN3）到离心管中，4℃放置，备用。
2．上述反应液转入离心管中，3000g, 离心2分钟，去除液体
3.加5mlPBSpH7.5到离心管中，3000g, 离心2分钟，去除液体，重复此步骤一次
4.加5ml终止液（1M Ethanolamine）到离心管中，摇动30分钟
5.3000g, 离心2分钟，去除液体
6.加5ml PBS pH7.5 到离心管中，3000g, 离心2分钟，去除液体，重复此步骤三次
7.加5ml保存液（ PBS，pH7.5，0.05% NaN3）到离心管中，3000g, 离心2分钟，去除液体
8.加2ml保存液（ PBS，pH7.5，0.05% NaN3）到离心管中，4℃放置，备用。
[0046] （五）MYBPC3-C0-琼脂糖层析柱分离MYBPC3-C0抗体1.5ml MYBPC3-C0抗血清(含1.0mg/mlHis-peptide)与5mlPBS pH7.5混合，并通过
0.22um 滤膜
2. 加10ml上述MYBPC3-C0抗血清稀释液到MYBPC3-C0-琼脂糖离心管中，摇动1小时
3. 3000g, 离心2分钟，去除液体
4. 加10ml 洗涤液(20mM Tris，pH7.5，0.5M NaCl，0.02%NP-40)到MYBPC3-C0-琼脂糖离心管中，摇动15分钟
5.3000g, 离心2分钟，去除液体，重复4-5步骤三次
6. 加1ml 洗脱液(100mM Glycine, pH2.8)到离心管中，4000g, 离心1分钟，收集上清液，
加到50ul 2.0M Tris（pH9.0）微量离心管中，混均，重复此步骤5次。
0.22um 滤膜
2. 加10ml上述MYBPC3-C0抗血清稀释液到MYBPC3-C0-琼脂糖离心管中，摇动1小时
3. 3000g, 离心2分钟，去除液体
4. 加10ml 洗涤液(20mM Tris，pH7.5，0.5M NaCl，0.02%NP-40)到MYBPC3-C0-琼脂糖离心管中，摇动15分钟
5.3000g, 离心2分钟，去除液体，重复4-5步骤三次
6. 加1ml 洗脱液(100mM Glycine, pH2.8)到离心管中，4000g, 离心1分钟，收集上清液，
加到50ul 2.0M Tris（pH9.0）微量离心管中，混均，重复此步骤5次。
[0047] 7. 混合洗脱液转入透析袋中，用透析液（20mM NaPO4(pH7.5),150mM NaCl, 1.0mM EDTA,
1.0mM DTT, 1.0mM PMSF, 10% Glycerol）, 4℃，过夜。
1.0mM DTT, 1.0mM PMSF, 10% Glycerol）, 4℃，过夜。
[0048] 8. 加上述MYBPC3-C0抗体液到蛋白浓缩和净化离心柱（Microcon-10kDa Centrifugal Filter）中，浓缩MYBPC3-C0抗体9. 测定MYBPC3-C0抗体浓度,放 -20℃，保存，备用。
[0049] （六）测定MYBPC3-C0抗体效价和特异性1.用50mM 碳酸盐缓冲液(pH9.6)制备MYBPC3-C0(10μg/ml), BSA(10μg/ml)包被液, 加1OOul包被液到酶反应板孔中，4℃，过夜，PBS洗涤1次
2.每孔加200ul封闭液PBS(0.5% BSA), 室温, 2小时，PBS洗涤2次
3.加入100ul不同浓度MYBPC3-C0抗体（0, 1, 5, 20, 100ng/ml）到孔中, 在室温下，缓慢摇动60分钟, 吸除反应液
4. 用PBST（0.02% Tween20）洗涤酶反应板4次，每次5分钟
5. 加稀释100ul抗羊或兔IgG抗体-HRP（Promega）到孔中, 在室温下, 缓慢摇动60分钟,
吸除抗体液
6. 用PBST洗涤酶反应板4次，每次5分钟
7. 加100ul HRP底物(TMB Substrate buffer, Santa Cruz Biotech Inc.), 反应10分钟
8. 加50ul 2N H2SO4, 终止反应
9.放酶反应板板到MULTISKAN FC 分析仪中，选用波长450nm，测定OD 值
2.每孔加200ul封闭液PBS(0.5% BSA), 室温, 2小时，PBS洗涤2次
3.加入100ul不同浓度MYBPC3-C0抗体（0, 1, 5, 20, 100ng/ml）到孔中, 在室温下，缓慢摇动60分钟, 吸除反应液
4. 用PBST（0.02% Tween20）洗涤酶反应板4次，每次5分钟
5. 加稀释100ul抗羊或兔IgG抗体-HRP（Promega）到孔中, 在室温下, 缓慢摇动60分钟,
吸除抗体液
6. 用PBST洗涤酶反应板4次，每次5分钟
7. 加100ul HRP底物(TMB Substrate buffer, Santa Cruz Biotech Inc.), 反应10分钟
8. 加50ul 2N H2SO4, 终止反应
9.放酶反应板板到MULTISKAN FC 分析仪中，选用波长450nm，测定OD 值
[0050] 三．制备MYBPC3-C0C1f重组蛋白（一）合成MYBPC3-C0C1f-FlagDNA(核酸序列)
合成MYBPC3-C0C1f-FlagDNA表达 C0C1f-Flag蛋白氨基酸序列：
MPEPGKKPVSAFSKKPRSVEVAAGSPAVFEAETERAGVKVRWQRGGSDISASNKYGLATEGTRHTLTVREVGPADQGSYAVIAGSSKVKFDLKVIEAEKAEPMLAPAPAPAEATGAPGEAPAPAAELGESAPSPKGSSSAALNGPTPGAPDDPIGLFVMRPQDGEVTVGGSITFSARVAGASLLKPPVVKWFKGKWVDLSSKVGQHLQLHDSYDRASKVYLFELHITDAQPAFTGSYRCEVSTKDKFDCSNFNLTVHEAMGTGDLDLLSDYKDDDDKDA。
合成MYBPC3-C0C1f-FlagDNA表达 C0C1f-Flag蛋白氨基酸序列：
MPEPGKKPVSAFSKKPRSVEVAAGSPAVFEAETERAGVKVRWQRGGSDISASNKYGLATEGTRHTLTVREVGPADQGSYAVIAGSSKVKFDLKVIEAEKAEPMLAPAPAPAEATGAPGEAPAPAAELGESAPSPKGSSSAALNGPTPGAPDDPIGLFVMRPQDGEVTVGGSITFSARVAGASLLKPPVVKWFKGKWVDLSSKVGQHLQLHDSYDRASKVYLFELHITDAQPAFTGSYRCEVSTKDKFDCSNFNLTVHEAMGTGDLDLLSDYKDDDDKDA。
[0051] （二）构建pQE-60-MYBPC3-C0C1f-Flag载体1.pQE-60载体DNA 3ul（3ug）
Cutsmart buffer 6ul
NcoI 3ul
HindIII 3ul
H20 45ul
混均，37℃，反应2小时
2.放在1% Agarose/TBE 胶电泳孔中，进行电泳，EB进行DNA染色，紫外线下观察3.5kb载体DNA条带，切割下DNA条带,放到离心管中
3.用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)提取Agarose 条带中DNA
4.用Nanodrop Spectrophotometer 测定DNA 浓度
5.用T4 DNA ligase，连接合成MYBPC3-C0C1f-Flag DNA 到pQE-60载体中
在微量离心管中加入以下物质
C0C1f-FlagDNA 50ng
载体 DNA（NcoI/HindIII） 50ng
10X T4 DNA LigaseBuffer 1.0 ul
T4 DNA Ligase 0.5ul
H2O 到10ul
混均，25℃ 反应4小时，
6.连接DNA转入感受态细菌中
7.用PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits (Life Technologies Inc.)提取质粒DNA
8.鉴定出pQE-6-C0C1f-Flag载体，用于表达C0C1f-Flag重组蛋白。
Cutsmart buffer 6ul
NcoI 3ul
HindIII 3ul
H20 45ul
混均，37℃，反应2小时
2.放在1% Agarose/TBE 胶电泳孔中，进行电泳，EB进行DNA染色，紫外线下观察3.5kb载体DNA条带，切割下DNA条带,放到离心管中
3.用QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN)提取Agarose 条带中DNA
4.用Nanodrop Spectrophotometer 测定DNA 浓度
5.用T4 DNA ligase，连接合成MYBPC3-C0C1f-Flag DNA 到pQE-60载体中
在微量离心管中加入以下物质
C0C1f-FlagDNA 50ng
载体 DNA（NcoI/HindIII） 50ng
10X T4 DNA LigaseBuffer 1.0 ul
T4 DNA Ligase 0.5ul
H2O 到10ul
混均，25℃ 反应4小时，
6.连接DNA转入感受态细菌中
7.用PureLink Quick Plasmid Miniprep Kits (Life Technologies Inc.)提取质粒DNA
8.鉴定出pQE-6-C0C1f-Flag载体，用于表达C0C1f-Flag重组蛋白。
[0052] 三) 表达C0C1f-Flag重组蛋白1.pQE-60-C0C1f-Flag载体转入感受态细菌（M15细菌株）中
2.涂种50ul上述细菌液在25ug/ml Kanamycin, 100ug/ml Ampicillin LB-琼脂板上，
37℃，培养过夜
3.挑选单个菌落，接种到5ml 25ug/ml Kanamycin, 100ug/ml Ampicillin LB培养液中，37℃, 摇动，过夜
4.稀释细菌液到100ml，37℃，摇动0.5-3小时，OD600值0.2-0.6时，
5.加40ulIPTG（0.5M）到细菌液中,25℃,摇动4-6小时
6.离心，收集细菌，用PBS洗涤一次
7.加PBS，pH7.5, 含0.1%NP-40,1.0mM DTT,1.0mMEDTA，1.0mM PMSF,10ug/
mlLeupeptin, 10ug/ml Aprotinin到离心管中，悬浮细菌
8.用超声法破碎细菌后，4℃，离心，13000rpm, 20分钟，转移上清液到新离心管中。
2.涂种50ul上述细菌液在25ug/ml Kanamycin, 100ug/ml Ampicillin LB-琼脂板上，
37℃，培养过夜
3.挑选单个菌落，接种到5ml 25ug/ml Kanamycin, 100ug/ml Ampicillin LB培养液中，37℃, 摇动，过夜
4.稀释细菌液到100ml，37℃，摇动0.5-3小时，OD600值0.2-0.6时，
5.加40ulIPTG（0.5M）到细菌液中,25℃,摇动4-6小时
6.离心，收集细菌，用PBS洗涤一次
7.加PBS，pH7.5, 含0.1%NP-40,1.0mM DTT,1.0mMEDTA，1.0mM PMSF,10ug/
mlLeupeptin, 10ug/ml Aprotinin到离心管中，悬浮细菌
8.用超声法破碎细菌后，4℃，离心，13000rpm, 20分钟，转移上清液到新离心管中。
[0053] 四) 纯化C0C1f-Flag重组蛋白1.制备SP-Sepharose 层析柱，用Buffer A(20mM NaPO4,pH7.5，100mM NaCl,0.1% CTAB)平衡SP-Sepharose 层析柱
2.上述细菌上清液（含C0C1f-Flag，pI=5.4），加到SP-Sepharose 层析柱中，通过SP-Sepharose 层析柱，收集滤过液，再加到SP-Sepharose 层析柱中，反复5次后，收集滤过液（含C0C1f-Flag）
3.Tris缓冲液洗涤Flag-Agarose
4.加Flag-Agarose到上述滤过液中，在4℃，反应1小时
5.在4℃条件下，离心，3000rpm, 2分钟，去除上清液
6.加50mM Tris,pH7.5，400mM NaCl,0.05%NP-40到Flag-Agarose离心管中，洗涤4次
7.加洗脱液（50mM Glycine，pH2.8）到Flag-Agarose离心管中,洗脱结合蛋白，反复6次
8.混合洗脱液转入到透析袋 (Spectra/Pro) 中，放在透析液(50mM Tris, pH7.5,
150mM NaCl, 5% Glycerol, 1.0mM DTT,1.0mM EDTA，1.0mMPMSF) 中，在4℃条件下，缓慢搅动，过夜
9.收集透析袋中蛋白液体移到离心管中
10.将透析袋中透析蛋白液移到微量离心管中，在4 ℃条件下，离心，13000rpm, 10分钟
11.加上述透析蛋白液到蛋白浓缩和净化离心柱中（Microcon-10KDa Centrifugal Filter），浓缩和净化离心柱中透析蛋白液
12.测定蛋白液浓度，-80℃，冻存。
2.上述细菌上清液（含C0C1f-Flag，pI=5.4），加到SP-Sepharose 层析柱中，通过SP-Sepharose 层析柱，收集滤过液，再加到SP-Sepharose 层析柱中，反复5次后，收集滤过液（含C0C1f-Flag）
3.Tris缓冲液洗涤Flag-Agarose
4.加Flag-Agarose到上述滤过液中，在4℃，反应1小时
5.在4℃条件下，离心，3000rpm, 2分钟，去除上清液
6.加50mM Tris,pH7.5，400mM NaCl,0.05%NP-40到Flag-Agarose离心管中，洗涤4次
7.加洗脱液（50mM Glycine，pH2.8）到Flag-Agarose离心管中,洗脱结合蛋白，反复6次
8.混合洗脱液转入到透析袋 (Spectra/Pro) 中，放在透析液(50mM Tris, pH7.5,
150mM NaCl, 5% Glycerol, 1.0mM DTT,1.0mM EDTA，1.0mMPMSF) 中，在4℃条件下，缓慢搅动，过夜
9.收集透析袋中蛋白液体移到离心管中
10.将透析袋中透析蛋白液移到微量离心管中，在4 ℃条件下，离心，13000rpm, 10分钟
11.加上述透析蛋白液到蛋白浓缩和净化离心柱中（Microcon-10KDa Centrifugal Filter），浓缩和净化离心柱中透析蛋白液
12.测定蛋白液浓度，-80℃，冻存。
[0054] （五）银染法测定C0C1f-Flag蛋白纯度1.冻存蛋白液离心管放到37 ℃水浴中，快速溶化，放到冰块中
2.1.0ul蛋白液,加5ul PBS, 4ul 4X蛋白加样液（50 mMTris，pH 6.8，2% SDS,10% Glycerol,1% β-mercaptoethanol, 12.5mM EDTA, 0.02% Bromophenol blue）, 100 ℃，3分钟
3.加10ul蛋白样本液到10% SDS-PAGE 凝胶孔中，进行电泳
4.完成电泳后，获取SDS-PAGE 凝胶，进行银染色，步骤如下：
i.加100ml 50% Methanol 到SDS-PAGE凝胶的容器中，室温下，缓慢摇动，15分钟，去除Methanol液体
ii.加100ml 5% Methanol 到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下，缓慢摇动，10分钟，去除Methanol液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶1次
iii. 加10ul DTT 到SDS-PAGE胶容器中,有200ml水，室温下，缓慢摇动，10分钟，去除DTT液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶1次
iv.加100ml 0.1% AgNO3到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下，缓慢摇动，15分钟，去除v.加100ml 3% Na2CO3& 0.05% Formaldehyde 到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下反应，看到清晰蛋白条带为止
vi. 加Critic Acid到SDS-PAGE凝胶容器中,终止反应
ⅶ.用水清洗SDS-PAGE胶后，干燥SDS-PAGE凝胶,判断C0C1f-Flag纯度，达98%以上。
2.1.0ul蛋白液,加5ul PBS, 4ul 4X蛋白加样液（50 mMTris，pH 6.8，2% SDS,10% Glycerol,1% β-mercaptoethanol, 12.5mM EDTA, 0.02% Bromophenol blue）, 100 ℃，3分钟
3.加10ul蛋白样本液到10% SDS-PAGE 凝胶孔中，进行电泳
4.完成电泳后，获取SDS-PAGE 凝胶，进行银染色，步骤如下：
i.加100ml 50% Methanol 到SDS-PAGE凝胶的容器中，室温下，缓慢摇动，15分钟，去除Methanol液体
ii.加100ml 5% Methanol 到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下，缓慢摇动，10分钟，去除Methanol液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶1次
iii. 加10ul DTT 到SDS-PAGE胶容器中,有200ml水，室温下，缓慢摇动，10分钟，去除DTT液体,用水洗涤SDS-PAGE凝胶1次
iv.加100ml 0.1% AgNO3到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下，缓慢摇动，15分钟，去除v.加100ml 3% Na2CO3& 0.05% Formaldehyde 到SDS-PAGE凝胶容器中，室温下反应，看到清晰蛋白条带为止
vi. 加Critic Acid到SDS-PAGE凝胶容器中,终止反应
ⅶ.用水清洗SDS-PAGE胶后，干燥SDS-PAGE凝胶,判断C0C1f-Flag纯度，达98%以上。
[0055] 六)Bradford法测定纯化C0C1f-Flag浓度1.取1ml浓缩染料试剂（Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate）与4ml H2O
混合均匀，获得稀释染料试剂
2.制备BSA标准液, 浓度分别为0，0.25, 0.5, 1.0, 2.0，4.0mg/ml
3.加79ul PBS 到微量滴定板孔中，加1.0ul不同浓度BSA标准液，
1.0ul纯化C0C1f-Flag蛋白液，每个样本加3个孔
4.加80ul稀释染料试剂到微量滴定板孔中，室温，放置5分钟
5.放微量滴定板到生化分析仪中，选用波长495nm,测定OD值
6.制备BSA浓度标准曲线，计算出纯化C0C1f-Flag蛋白浓度
纯化C0C1f-Flag平均OD值为 1.935
C0C1f-Flag蛋白浓度=1.2202x–0.5562=1.8mg/ml
。
混合均匀，获得稀释染料试剂
2.制备BSA标准液, 浓度分别为0，0.25, 0.5, 1.0, 2.0，4.0mg/ml
3.加79ul PBS 到微量滴定板孔中，加1.0ul不同浓度BSA标准液，
1.0ul纯化C0C1f-Flag蛋白液，每个样本加3个孔
4.加80ul稀释染料试剂到微量滴定板孔中，室温，放置5分钟
5.放微量滴定板到生化分析仪中，选用波长495nm,测定OD值
6.制备BSA浓度标准曲线，计算出纯化C0C1f-Flag蛋白浓度
纯化C0C1f-Flag平均OD值为 1.935
C0C1f-Flag蛋白浓度=1.2202x–0.5562=1.8mg/ml
。
[0056] 四.制备免疫层析检测MYBPC3试纸条（一）MYBPC3抗体偶联铕螯合物荧光微球
本发明实施例中，选用铕螯合物(Europium Chelate)荧光标记羧基修饰微粒
（Europium Chelate PS-COOH），购于Bangs Laboratories Inc.可选用铕螯合物荧光标记羧基修饰微粒直径为100-300nm。
本发明实施例中，用EDC和Sulfo-NHS把兔MYBPC3抗体偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球（直径200nm）上, 步骤如下：
1. 取0.1ml Europium Chelate PS-COOH (10mg/ml), 直径200nm，加入1.5ml离心管中
2. 再加入1.2ml 50mM MES缓冲液(pH6.0)到离心管中，混合微球
3. 离心，16000rpm，20分钟，去除上清液
4. 再加0.2ml 50mM MES缓冲液(pH6.0)含5mM EDC和20mM Sulfo-NHS到离心管中,混均，
25℃，反应30分钟
5. 离心，16000rpm，20分钟，去除反应液
6. 加入0.2ml 10mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)，含兔MYBPC3抗体（75ug）到离心管中,
25°C，反应2小时
7. 加入40ul of 0.2M Tris(pH7.5) 到离心管中，25°C，反应60分钟
8. 离心，16000rpm，20分钟，去除上清液，
9. 加入1.4ml 1.0% BSA，0.1% Tween-20，20mMTris缓冲液(pH7.5)到离心管中
10. 离心，16000rpm，20分钟，去除上清液
11. 用缓冲液（20mM Tris，pH7.5，1.0% BSA，20% Sucrose, 1.0% PVP，0.5% Tween20）悬浮兔MYBPC3抗体-荧光微球到需要浓度，4°C储存，备用。
本发明实施例中，选用铕螯合物(Europium Chelate)荧光标记羧基修饰微粒
（Europium Chelate PS-COOH），购于Bangs Laboratories Inc.可选用铕螯合物荧光标记羧基修饰微粒直径为100-300nm。
本发明实施例中，用EDC和Sulfo-NHS把兔MYBPC3抗体偶联到铕螯合物荧光标记羧基修饰微球（直径200nm）上, 步骤如下：
1. 取0.1ml Europium Chelate PS-COOH (10mg/ml), 直径200nm，加入1.5ml离心管中
2. 再加入1.2ml 50mM MES缓冲液(pH6.0)到离心管中，混合微球
3. 离心，16000rpm，20分钟，去除上清液
4. 再加0.2ml 50mM MES缓冲液(pH6.0)含5mM EDC和20mM Sulfo-NHS到离心管中,混均，
25℃，反应30分钟
5. 离心，16000rpm，20分钟，去除反应液
6. 加入0.2ml 10mM磷酸盐缓冲液(pH6.0)，含兔MYBPC3抗体（75ug）到离心管中,
25°C，反应2小时
7. 加入40ul of 0.2M Tris(pH7.5) 到离心管中，25°C，反应60分钟
8. 离心，16000rpm，20分钟，去除上清液，
9. 加入1.4ml 1.0% BSA，0.1% Tween-20，20mMTris缓冲液(pH7.5)到离心管中
10. 离心，16000rpm，20分钟，去除上清液
11. 用缓冲液（20mM Tris，pH7.5，1.0% BSA，20% Sucrose, 1.0% PVP，0.5% Tween20）悬浮兔MYBPC3抗体-荧光微球到需要浓度，4°C储存，备用。
[0057] （二）处理样品垫和结合垫本发明选用玻璃纤维MF1样品垫（GE Healthcare），浸泡在样品垫处理液（20 mM Tris, pH7.5, 2% Sucrose,0.5%BSA，0.5%PVP，0.2% Tween-20)，室温下，1 小时，再30℃，干燥8小时，密封，备用。
本发明选用玻璃纤维GFDX结合垫（EMD Millipore），浸泡在结合垫处理液（20 mM Tris, pH7.5，5% Sucrose，0.5% PVP,0.5%BSA，0.2% Tween-20)，室温下，1 小时，再30°C，烘干8小时，密封，备用。
（三）喷涂结合垫和硝酸纤维素膜
1. 用缓冲液1（20mM Tris，pH7.5，20%Sucrose,1.0%PVP，1.0% BSA, 0.5% Tween-20）将兔MYBPC3抗体-铕螯合物荧光微球液稀释到0.15mg/ml，用Bio-DotXYZ3060仪，用非接触式微定量喷头方式，4ul/cm 速度，将兔MYBPC3抗体-荧光微球喷到结合垫（GFDX）上，30°C，烘干8小时，加入干燥剂封存，备用。
2. 用缓冲液2（10mM NaPO4，pH8.0，0.5%Trehalose, 0.1%PVP）稀释羊MYBPC3抗体到
1.5mg/ml，稀释抗兔IgG 抗体浓度到1.0mg/ml，将硝酸纤维素膜放在Bio-DotXYZ3060仪，用非接触式微定量喷头方式，0.8ul/cm 速度，将上述羊MYBPC3抗体液和抗兔IgG抗体液喷到硝酸纤维素膜上，两线间距6mm, 30℃，烘干6小时，加入干燥剂封存备用。
（四）组装免疫层析试纸卡
试纸条组装在湿度小于30%，30-37℃房间进行。免疫层析试纸条, 看图1，包括PVC底板及粘附于PVC底板上的样品垫（25mm）、结合垫（8mm）、硝酸纤维素膜（25mm）、吸水纸（30mm）; 其中，硝酸纤维素膜粘覆于底板中间部位，其上有相间隔羊MYBPC3抗体线形成T线和由抗兔IgG抗体线形成C线; 结合垫喷涂有兔MYBPC3抗体-铕螯合物荧光微球。
本发明实施例中，T线与C线平行设置，T线与C线之间的距离为6mm。
吸水纸位于硝酸纤维素膜靠近C线一端，与硝酸纤维素膜部分重叠，重叠长度为2mm；吸水纸重叠在硝酸纤维素膜上方。结合垫位于硝酸纤维素膜靠近T线一端；与硝酸纤维素膜部分重叠，重叠长度为2mm；结合垫重叠在硝酸纤维素膜上方。样品垫位于结合垫的外侧，并与结合垫部分重叠，重叠长度为3mm; 样品垫重叠在结合垫上方。将上述每组部分组装成试纸板，切割成宽度为4mm 试纸条。
将上述试纸条装入壳底座中，合上壳面，构成试纸卡（图2），壳面上设置有加样孔（8）检测窗口（9），露出试纸条局部区域；加样孔开口于样品垫（2）上部，露出部分样品垫区域；观察窗口开位于硝酸纤维素膜（4）上部，以露出全部T线（5）和C线（6）。
本发明选用玻璃纤维GFDX结合垫（EMD Millipore），浸泡在结合垫处理液（20 mM Tris, pH7.5，5% Sucrose，0.5% PVP,0.5%BSA，0.2% Tween-20)，室温下，1 小时，再30°C，烘干8小时，密封，备用。
（三）喷涂结合垫和硝酸纤维素膜
1. 用缓冲液1（20mM Tris，pH7.5，20%Sucrose,1.0%PVP，1.0% BSA, 0.5% Tween-20）将兔MYBPC3抗体-铕螯合物荧光微球液稀释到0.15mg/ml，用Bio-DotXYZ3060仪，用非接触式微定量喷头方式，4ul/cm 速度，将兔MYBPC3抗体-荧光微球喷到结合垫（GFDX）上，30°C，烘干8小时，加入干燥剂封存，备用。
2. 用缓冲液2（10mM NaPO4，pH8.0，0.5%Trehalose, 0.1%PVP）稀释羊MYBPC3抗体到
1.5mg/ml，稀释抗兔IgG 抗体浓度到1.0mg/ml，将硝酸纤维素膜放在Bio-DotXYZ3060仪，用非接触式微定量喷头方式，0.8ul/cm 速度，将上述羊MYBPC3抗体液和抗兔IgG抗体液喷到硝酸纤维素膜上，两线间距6mm, 30℃，烘干6小时，加入干燥剂封存备用。
（四）组装免疫层析试纸卡
试纸条组装在湿度小于30%，30-37℃房间进行。免疫层析试纸条, 看图1，包括PVC底板及粘附于PVC底板上的样品垫（25mm）、结合垫（8mm）、硝酸纤维素膜（25mm）、吸水纸（30mm）; 其中，硝酸纤维素膜粘覆于底板中间部位，其上有相间隔羊MYBPC3抗体线形成T线和由抗兔IgG抗体线形成C线; 结合垫喷涂有兔MYBPC3抗体-铕螯合物荧光微球。
本发明实施例中，T线与C线平行设置，T线与C线之间的距离为6mm。
吸水纸位于硝酸纤维素膜靠近C线一端，与硝酸纤维素膜部分重叠，重叠长度为2mm；吸水纸重叠在硝酸纤维素膜上方。结合垫位于硝酸纤维素膜靠近T线一端；与硝酸纤维素膜部分重叠，重叠长度为2mm；结合垫重叠在硝酸纤维素膜上方。样品垫位于结合垫的外侧，并与结合垫部分重叠，重叠长度为3mm; 样品垫重叠在结合垫上方。将上述每组部分组装成试纸板，切割成宽度为4mm 试纸条。
将上述试纸条装入壳底座中，合上壳面，构成试纸卡（图2），壳面上设置有加样孔（8）检测窗口（9），露出试纸条局部区域；加样孔开口于样品垫（2）上部，露出部分样品垫区域；观察窗口开位于硝酸纤维素膜（4）上部，以露出全部T线（5）和C线（6）。
[0058] 五．免疫荧光分析仪检测MYBPC3浓度过程（一）免疫层析试纸卡操作过程
用MYBPC3免疫层析试纸卡进行定量检测样品中MYBPC3时，在样品孔上加入MYBPC3校准液(25ul),血清/浆（25ul）和全血（50ul）, 再加75ul层析液(PBS，pH7.5,1.0% BSA，0.5% Tween-20)到样品孔中，反应10-15分钟，T线和C线都应产生相应的荧光信号，用免疫荧光分析仪进行检测。
（二）建立免疫荧光分析仪检测MYBPC3浓度程序
1.建立MYBPC3浓度与RLU相关曲线
用C0C1f-Flag重组蛋白作为MYBPC3校准品，PBS（pH7.5）含0.5%BSA制备C0C1f-Flag校准品，浓度为 0, 1,2.5，5，10, 20, 40ng/ml。加25ulC0C1f-Flag校准品到MYBPC3免疫层析试纸卡样品孔中，再加75ul层析液到样品孔中, 进行膜层析反应，10-15分钟后，用免疫荧光分析仪, 选定激发波长365nm,检测波长610nm，测定试纸条卡T线及C线荧光强度。以C0C1f-Flag校准品浓度为纵坐标，校准品荧光强度单位(RLU)为横坐标，制备C0C1f-Flag校准品浓度与荧光强度单位相关曲线，得到方程式，y=4.7099x–1.8752，R2=0.9964，通过此相关曲线得到C0C1f-Flag浓度标准卡，作为对样品中所含MYBPC3浓度进行定量分析依据输入上述标准卡到免疫荧光分析仪，建立自动运行系统，免疫荧光分析仪通过相应的分析软件自动计算出待测样品中MYBPC3浓度。
2.用MYBPC3免疫层析试纸卡检测样品中MYBPC3浓度
加25ul血清到MYBPC3层析试纸卡加样孔部位，再加75ul层析液到样品孔中，进行膜层析反应，10-15分钟后，用免疫荧光分析仪自动检测系统，测定MYBPC3浓度，结果如下：
用MYBPC3免疫层析试纸卡进行定量检测样品中MYBPC3时，在样品孔上加入MYBPC3校准液(25ul),血清/浆（25ul）和全血（50ul）, 再加75ul层析液(PBS，pH7.5,1.0% BSA，0.5% Tween-20)到样品孔中，反应10-15分钟，T线和C线都应产生相应的荧光信号，用免疫荧光分析仪进行检测。
（二）建立免疫荧光分析仪检测MYBPC3浓度程序
1.建立MYBPC3浓度与RLU相关曲线
用C0C1f-Flag重组蛋白作为MYBPC3校准品，PBS（pH7.5）含0.5%BSA制备C0C1f-Flag校准品，浓度为 0, 1,2.5，5，10, 20, 40ng/ml。加25ulC0C1f-Flag校准品到MYBPC3免疫层析试纸卡样品孔中，再加75ul层析液到样品孔中, 进行膜层析反应，10-15分钟后，用免疫荧光分析仪, 选定激发波长365nm,检测波长610nm，测定试纸条卡T线及C线荧光强度。以C0C1f-Flag校准品浓度为纵坐标，校准品荧光强度单位(RLU)为横坐标，制备C0C1f-Flag校准品浓度与荧光强度单位相关曲线，得到方程式，y=4.7099x–1.8752，R2=0.9964，通过此相关曲线得到C0C1f-Flag浓度标准卡，作为对样品中所含MYBPC3浓度进行定量分析依据输入上述标准卡到免疫荧光分析仪，建立自动运行系统，免疫荧光分析仪通过相应的分析软件自动计算出待测样品中MYBPC3浓度。
2.用MYBPC3免疫层析试纸卡检测样品中MYBPC3浓度
加25ul血清到MYBPC3层析试纸卡加样孔部位，再加75ul层析液到样品孔中，进行膜层析反应，10-15分钟后，用免疫荧光分析仪自动检测系统，测定MYBPC3浓度，结果如下：
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