一种抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体
阅读：443发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种抗人心肌肌 钙 蛋白I的重组 抗体 ，具体涉及一种新颖的包含cTnI 抗原 结合结构域的分离的结合蛋白，并对该结合蛋白的制备、应用等方面进行研究。所述结合蛋白活性强，与人cTnI蛋白具有很高的亲和 力 ，可广泛应用于cTnI蛋白的检测领域。，下面是一种抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体专利的具体信息内容。
1.一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，其中所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区：或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与心肌肌钙蛋白I具有KD≤2.22×10-8mol/L的亲和力；
互补决定区CDR-VH1为G-X1-T-F-T-X2-Y-N-X3-H，其中，
X1是F或Y，X2是E或D，X3是V、L或I；
互补决定区CDR-VH2为Y-X1-Y-P-X2-N-G-I-X3-G-Y-N-Q，其中，
X1是I或L，X2是N或Y，X3是S或T；
互补决定区CDR-VH3为R-X1-A-Y-X2-Y-D-W-X3-A-Y，其中，
X1是D或E，X2是E或D，X3是L或I；
互补决定区CDR-VL1为S-Q-S-X1-G-X2-N-X3-Y，其中，
X1是I、V或L，X2是T或S，X3是L或I；
互补决定区CDR-VL2为Y-A-X1-X2-S-I-S，其中，
X1是S或T，X2是D、Q或E；
互补决定区CDR-VL3为Q-S-X1-X2-W-P-Y-T，其中，
X1是Q或N，X2是D、Q或N；
优选的：
所述互补决定区CDR-VH1中，X1是Y；
所述互补决定区CDR-VH2中，X3是T；
所述互补决定区CDR-VH3中，X3是L；
所述互补决定区CDR-VL1中，X2是T；
所述互补决定区CDR-VL2中，X1是S；
所述互补决定区CDR-VL3中，X1是N；
优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是E；
优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是D；
优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是V；
优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是L；
优选的，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是I；
优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是I；
优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是L；
优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是N；
优选的，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是Y；
优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X1是D；
优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X1是E；
优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是E；
优选的，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是D；
优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是I；
优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是V；
优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是L；
优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是L；
优选的，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是I；
优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是D；
优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是Q；
优选的，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是E；
优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是D；
优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是Q；
优选的，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是N；
优选的，各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：
。
2.如权利要求1所述包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白中包括至少3个CDRs；或者，所述结合蛋白包括至少6个CDRs；
优选的，所述结合蛋白为纳米抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种；
优选的，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。
3.如权利要求1或2所述包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其特征在于，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列；
优选的，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列；
优选的，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、骆驼、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人；
优选的，所述恒定区来源于小鼠；
轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示；
重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。
4.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码权利要求1～3任一项所述的结合蛋白。
5.一种载体，其包含权利要求4所述的核酸分子。
6.一种宿主细胞，其被权利要求5所述的载体转化。
7.一种生产权利要求1～3任一项所述的结合蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
在培养基中和合适的培养条件下培养权利要求6所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的结合蛋白。
8.权利要求1～3任一项所述的结合蛋白在制备用于诊断急性心肌梗死、急性冠状动脉综合征、肺梗、不稳定性心绞痛、心肌损伤的诊断剂或试剂盒中的应用。
9.一种检测测试样品中的肌钙蛋白I抗原的方法，其包括：
a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的肌钙蛋白I抗原与权利要求3所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；和
b)检测所述免疫复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中所述肌钙蛋白I抗原的存在；
优选的，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合；
优选的，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述肌钙蛋白I抗原结合。
10.一种试剂盒，其包括权利要求1～3任一项所述的结合蛋白。
一种抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体
技术领域
[0001] 本发明涉及免疫技术领域，具体而言，涉及一种抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体。
背景技术
[0002] 20世纪80年代前，世界卫生组织(WHO)一直将心肌酶谱活性作为急性心肌梗死(AMI)的诊断标准之一。20世纪80年代末，科研人员发现，肌钙蛋白(troponin，Tn)的敏感性和特异性高于磷酸肌酸激酶(CK)、磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶和天冬氨酸氨基转移酶等生物标志物。心肌肌钙蛋白I(cTnI)仅存于心肌，是心肌细胞的标志物，其异常改变可影响心脏的舒缩功能，并可用于诊断心肌坏死，判断心肌损伤等，成为心肌细胞损伤敏感性和特异性最强的标志物之一，是公认的快速诊断AMI和急性冠脉综合征(acute coronary syndromes，ACS)以及协助ACS危险分层和反映其预后的主要生化标志。
[0003] 正常人血液中cTnI含量一般低于0.3μg/L。当心肌细胞胞膜完整性因缺血或缺氧等受到破坏时，游离的cTnI可迅速透过细胞膜进入血流。因此，在发病初期快速、灵敏且准确的测定人血中的cTnI及其变化趋势对急性心肌梗死的诊断、急性冠状动脉综合征的危险分层、监测各种因素导致的心肌损伤等有着重要的临床意义。临床上用于检测cTnI水平的方法有酶联免疫吸附法(ELISA)，化学发光，胶体金等，不同方法都有各自的优缺点，但是都需要针对于cTnI的特异性单克隆抗体。
[0004] 现有的cTnI抗体由于活性低、亲和力差，无法很好地应用于cTnI蛋白的检测中，因此本领域对于有效且特异性结合检测cTnI并对其进行检测的抗体存在着强烈需求。
发明内容
[0005] 本发明涉及一种新颖的包含cTnI抗原结合结构域的分离的结合蛋白，并对该结合蛋白的制备、应用等方面进行研究。
[0006] 所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区；或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与心肌肌钙蛋白I具有KD≤2.22×10-8mol/L的亲和力；
[0007] 互补决定区CDR-VH1为G-X1-T-F-T-X2-Y-N-X3-H，其中，
[0008] X1是F或Y，X2是E或D，X3是V、L或I；
[0009] 互补决定区CDR-VH2为Y-X1-Y-P-X2-N-G-I-X3-G-Y-N-Q，其中，
[0010] X1是I或L，X2是N或Y，X3是S或T；
[0011] 互补决定区CDR-VH3为R-X1-A-Y-X2-Y-D-W-X3-A-Y，其中，
[0012] X1是D或E，X2是E或D，X3是L或I；
[0013] 互补决定区CDR-VL1为S-Q-S-X1-G-X2-N-X3-Y，其中，
[0014] X1是I、V或L，X2是T或S，X3是L或I；
[0015] 互补决定区CDR-VL2为Y-A-X1-X2-S-I-S，其中，
[0016] X1是S或T，X2是D、Q或E；
[0017] 互补决定区CDR-VL3为Q-S-X1-X2-W-P-Y-T，其中，
[0018] X1是Q或N，X2是D、Q或N；
[0019] 一个重要优点在于，所述结合蛋白活性强，与人cTnI蛋白具有很高的亲和力。
具体实施方式
[0020] 本发明可通过后续对于本发明一些实施方案描述以及其中所包括的实施例的详细内容而更容易被了解。
[0021] 在进一步叙述本发明之前，应明了本发明不会被局限于所述特定实施方案中，因为这些实施方案必然是多样的。亦应明了本说明书中所使用的用语仅是为了阐述特定实施方案，而非作为限制，因为本发明的范围将会被仅仅界定在所附的权利要求中。
[0022] 名词定义
[0023] “包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白”泛指包含CDR区的一切蛋白/蛋白片段。“抗体”此用语包括多克隆抗体及单克隆抗体以及这些抗体的抗原化合物结合片段，包括Fab、F(ab’)2、Fd、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位，以及这些抗体和片段的单链衍生物。抗体的类型可以选择IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD。此外，“抗体”此用语包括天然发生的抗体以及非天然发生的抗体，包括例如嵌合型(chimeric)、双功能型(bifunctional)和人源化(humanized)抗体，以及相关的合成异构形式(isoforms)。“抗体”此用语可和“免疫球蛋白”互换使用。
[0024] 抗体的“可变区”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端结构域。重链的可变结构域可以被称为“VH”。轻链的可变结构域可以被称为“VL”。这些结构域通常是抗体的最可变的部分，并含有抗原结合位点。轻链或重链可变区(VL或VH)由被三个称为“互补决定区”或“CDR”的高变区打断的构架区构成。构架区和CDR的范围已被精确定义，例如在Kabat(参见《免疫重要的蛋白质的序列》(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，E.Kabat等，美国卫生与人类服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，(1983))和Chothia中。抗体的构架区，即构成要件轻链和重链的组合的构架区，起到定位和对齐CDR的作用，所述CDR主要负责与抗原的结合。
[0025] 当在本文中使用时，“构架”或“FR”区意味着抗体可变结构域的排除被定义为CDR的那些区域之外的区域。每个抗体可变结构域构架可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
[0026] 通常情况下，重链和轻链的可变区VL/VH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
[0027] 当在本文中使用时，与多肽或核酸相关联的术语“纯化的”或“分离的”是指多肽或核酸不是处于其天然介质中或天然形式下。因此，术语“分离的”包括从其原始环境，例如如果它是天然存在的，从天然环境取出的多肽或核酸。例如，分离的多肽通常不含通常与其结合或通常与其混合或在溶液中的至少某些蛋白质或其他细胞组分。分离的多肽包括细胞裂解物中包含的天然生产的所述多肽，纯化或部分纯化形式的所述多肽，重组多肽，被细胞表达或分泌的所述多肽，以及在异源宿主细胞或培养物中的所述多肽。与核酸相关联，术语分离的或纯化的指示例如所述核酸不在其天然的基因组背景中(例如在载体中，作为表达盒，连接到启动子，或人工引入到异源宿主细胞中)。
[0028] 本发明的示例性实施方案
[0029] 本发明涉及一种包含抗原结合结构域的分离的结合蛋白，其中所述抗原结合结构域包括选自下述氨基酸序列的至少一个互补决定区；或；与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少80％的序列同一性且与心肌肌钙蛋白I具有KD≤7.12×10-10mol/L的亲和力；
[0030] 互补决定区CDR-VH1为G-X1-T-F-T-X2-Y-N-X3-H，其中，
[0031] X1是F或Y，X2是E或D，X3是V、L或I；
[0032] 互补决定区CDR-VH2为Y-X1-Y-P-X2-N-G-I-X3-G-Y-N-Q，其中，
[0033] X1是I或L，X2是N或Y，X3是S或T；
[0034] 互补决定区CDR-VH3为R-X1-A-Y-X2-Y-D-W-X3-A-Y，其中，
[0035] X1是D或E，X2是E或D，X3是L或I；
[0036] 互补决定区CDR-VL1为S-Q-S-X1-G-X2-N-X3-Y，其中，
[0037] X1是I、V或L，X2是T或S，X3是L或I；
[0038] 互补决定区CDR-VL2为Y-A-X1-X2-S-I-S，其中，
[0039] X1是S或T，X2是D、Q或E；
[0040] 互补决定区CDR-VL3为Q-S-X1-X2-W-P-Y-T，其中，
[0041] X1是Q或N，X2是D、Q或N。
[0042] 在一些实施方式中，所述抗原结合结构域与下述氨基酸序列的互补决定区具有至少85％，或90％，或91％，或92％，或93％，或94％，或95％，或96％，或97％，或98％，或99％的序列同一性且与胃蛋白酶原II具KD≤2.22×10-8mol/L，KD值也可以选择1×10-9mol/L、2×10-9mol/L、3×10-9mol/L、4×10-9mol/L、4.5×10-9mol/L、5×10-9mol/L、6×10-9mol/L、7×10-9mol/L、8×10-9mol/L、9×10-9mol/L、1×10-10mol/L、3×10-10mol/L、5×10-10mol/L、7×10-10mol/L、9×10-10mol/L或1×10-8mol/L；
[0043] 或者7.12×10-10mol/L≤KD≤2.22×10-8mol/L；
[0044] 其中，亲和力按照本发明说明书中的方法测定。
[0045] 在一些实施方式中：
[0046] 所述互补决定区CDR-VH1中，X1是Y；
[0047] 所述互补决定区CDR-VH2中，X3是T；
[0048] 所述互补决定区CDR-VH3中，X3是L；
[0049] 所述互补决定区CDR-VL1中，X2是T；
[0050] 所述互补决定区CDR-VL2中，X1是S；
[0051] 所述互补决定区CDR-VL3中，X1是N。
[0052] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是E。
[0053] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X2是D。
[0054] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是V。
[0055] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是L。
[0056] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH1中，X3是I。
[0057] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是I。
[0058] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X1是L。
[0059] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是N。
[0060] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH2中，X2是Y。
[0061] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X1是D。
[0062] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X1是E。
[0063] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是E。
[0064] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VH3中，X2是D。
[0065] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是I。
[0066] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是V。
[0067] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X1是L。
[0068] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是L。
[0069] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL1中，X3是I。
[0070] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是D。
[0071] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是Q。
[0072] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL2中，X2是E。
[0073] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是D。
[0074] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是Q。
[0075] 在一些实施方式中，所述互补决定区CDR-VL3中，X2是N。
[0076] 在一些实施方式中，各互补决定区的突变位点选自下述突变组合中的任一种：
[0077]
[0078] 。
[0079] 在一些实施方式中，所述结合蛋白中包括至少3个CDRs(例如重链的3个CDRs，或者轻链的3个CDRs)；或者，所述结合蛋白包括至少6个CDRs。
[0080] 在一些实施方式中，所述结合蛋白为包含可变区和恒定区的完整抗体。
[0081] 在一些实施方式中，所述结合蛋白为抗体的“功能片段”，例如纳米抗体、F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv、scFv、双特异抗体和抗体最小识别单位中的一种。
[0082] scFv(sc＝单链)，双特异抗体(diabodies)。
[0083] 本发明所述的“功能片段”特别地指对于cTnI具有与母体抗体相同特异性的抗体片段。除上述功能片段外，还包括半衰期已增加的任何片段。
[0084] 这些功能片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明说明中记载的内容推断，本发明的抗体片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原分裂二硫键的方法获得上述的功能片段。
[0085] 抗体片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪，通过肽合成获得。
[0086] 在一些实施方式中，所述结合蛋白包括序列依次如SEQ ID NO:1-4所示的轻链骨架区FR-L1、FR-L2、FR-L3及FR-L4，和/或，序列依次如SEQ ID NO:5-8所示的重链骨架区FR-H1、FR-H2、FR-H3及FR-H4。
[0087] 需要说明的是，除本申请上述公开的氨基酸序列外，骨架区的种属来源可以为人，以构成人源化抗体。
[0088] 在一些实施方式中，所述结合蛋白还包含抗体恒定区序列。
[0089] 在一些实施方式中，所述恒定区序列选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE、IgD任何其中之一恒定区的序列。
[0091] 在一些实施方式中，所述恒定区来源于鼠；
[0092] 轻链恒定区序列如SEQ ID NO:9所示；
[0093] 重链恒定区序列如SEQ ID NO:10所示。
[0094] 根据本发明的一方面，本发明还涉及一种分离的核酸分子，所述核酸分子为DNA或RNA，其编码如上所述的结合蛋白。
[0095] 根据本发明的一方面，本发明还涉及一种载体，其包含如上所述的核酸分子。
[0096] 本发明进一步包含至少一种编码如上所述的核酸分子的核构建体，例如质粒，进一步为表达质粒，在本申请的一个实施例中会介绍该载体的构建方法。
[0097] 根据本发明的一方面，本发明还涉及一种宿主细胞，其被如上所述的载体转化。
[0099] 在一些实施方式中，所述宿主细胞为CHO细胞。
[0100] 根据本发明的一方面，本发明还涉及一种生产如上所述的结合蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：
[0101] 在培养基中和合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞，从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的结合蛋白。
[0103] 根据本发明的一方面，本发明还涉及一种检测测试样品中的肌钙蛋白I抗原的方法，其包括：
[0104] a)在足以发生抗体/抗原结合反应的条件下，使所述测试样品中的肌钙蛋白I抗原与权利要求如上所述的结合蛋白接触以形成免疫复合物；和
[0105] b)检测所述免疫复合物的存在，所述复合物的存在指示所述测试样品中所述肌钙蛋白I抗原的存在；
[0107] 在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述结合蛋白结合；
[0108] 在此实施方式中，所述结合蛋白以第一抗体的形式与所述第二抗体形成配对抗体，用于结合cTnI的不同抗原表位；
[0109] 所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。
[0110] 在一些实施方式中，在步骤a)中，所述免疫复合物中还包括第二抗体，所述第二抗体与所述肌钙蛋白I抗原结合；
[0111] 在此实施方式中，所述结合蛋白作为所述第二抗体的抗原，所述的第二抗体可以标记由显示信号强度的指示剂，以使得所述复合物容易被检测。
[0112] 在一些实施方式中，所述显示信号强度的指示剂包括荧光物质、量子点、地高辛标记探针、生物素、放射性同位素、放射性造影剂、顺磁离子荧光微球、电子致密物质、化学发光标记物、超声造影剂、光敏剂、胶体金或酶中的任一种。
[0113] 在一些实施方式中，所述荧光物质包括Alexa 350、Alexa 405、Alexa 430、Alexa 488、Alexa 555、Alexa 647、AMCA、氨基吖啶、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665、BODIPY-FL、BODIPY-R6G、BODIPY-TMR、BODIPY-TRX、5-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基荧光素、5-羧基-2′，4′，5′，7′-四氯荧光素、5-羧基荧光素、5-羧基罗丹明、6-羧基罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、Cascade Blue、Cy2、Cy3、Cy5、Cy7、6-FAM、丹磺酰氯、荧光素、HEX、6-JOE、NBD(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑)、Oregon Green 488、Oregon Green 500、Oregon Green514、Pacific Blue、邻苯二甲酸、对苯二甲酸、间苯二甲酸、甲酚固紫、甲酚蓝紫、亮甲酚蓝、对氨基苯甲酸、赤藓红、酞菁、偶氮甲碱、花青、黄嘌呤、琥珀酰荧光素、稀土金属穴状化合物、三双吡啶基二胺铕、铕穴状化合物或螯合物、二胺、双花青苷、La Jolla蓝染料、别藻蓝蛋白、allococyanin B、藻蓝蛋白C、藻蓝蛋白R、硫胺、藻红青蛋白、藻红蛋白R、REG、罗丹明绿、罗丹明异硫氰酸酯、罗丹明红、ROX、TAMRA、TET、TRIT(四甲基罗丹明异硫醇)、四甲基罗丹明和德克萨斯红中的任一种。
[0114] 在一些实施方式中，所述放射性同位素包括110In、111In、177Lu、18F、52Fe、62Cu、64Cu67 67 68 86 90 89 94 94 99 120 123 124 125 131 154-158 32 11
、Cu、Ga、Ga、Y、Y、Zr、mTc、Tc、mTc、 I、 I、 I、 I、 I、 Gd、P、C、
13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr中的任一种。
、Cu、Ga、Ga、Y、Y、Zr、mTc、Tc、mTc、 I、 I、 I、 I、 I、 Gd、P、C、
13N、15O、186Re、188Re、51Mn、52mMn、55Co、72As、75Br、76Br、82mRb和83Sr中的任一种。
[0116] 在一些实施方式中，所述荧光微球为：聚苯乙烯荧光微球，内部包裹有稀土荧光离子铕。
[0117] 根据本发明的一方面，本发明还涉及一种试剂盒，其包括如上所述的结合蛋白。
[0118] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0119] 实施例1
[0120] 本实施例提供了一种抗人心肌肌钙蛋白I的重组抗体的示例性制备方法。
[0121] S10，构建表达质粒：
[0122] 本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司；
[0123] MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司；
[0124] BD SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒购自Takara公司；
[0125] pMD-18T载体购自Takara公司；
[0126] 质粒提取试剂盒购自天根公司；
[0127] 引物合成和基因测序由Invitrogen公司完成；
[0128] 分泌Anti-cTnI 12D2单克隆抗体为已有的杂交瘤细胞株，复苏备用。
[0129] S11，引物的设计与合成：
[0130] 扩增重链和轻链的5’RACE上游引物：
[0131] SMARTER II A Oligonucleotide：
[0132] 5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACXXXXX<3’；
[0133] 5'-RACE CDS Primer(5'-CDS)：5’>(T)25VN<3’(N＝A,C,G,orT；V＝A,G,orC)；
[0134] Universal Primer A Mix(UPM):
[0135] 5’>CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’；
[0136] Nested Universal Primer A(NUP):
[0137] 5’>AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT<3’；
[0138] mIgG CKR：5’>CGCCTAACACTCATTCCTGTTGAAGC<3’；
[0139] mIgG CHR：5’>CCGCTCATTTACCCGGAGACCG<3’。
[0140] S12，抗体可变区基因克隆及测序：
[0141] 从分泌Anti-cTnI 12D2单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取中RNA，用SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒及试剂盒中的SMARTER II A Oligonucleotide和5'-CDS引物进行第一链cDNA合成，获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。Light Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIgG CKR引物进行扩增，Heavy Chain基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和mIgG CHR引物进行扩增。其中Light Chain的引物对扩增出0.7KB左右的目的条带，Heavy Chain的引物对扩增出1.4KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后插入到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆各4个克隆送Invitrogen公司进行测序。
[0142] S13，Anti-cTnI 12D2抗体可变区基因的序列分析：
[0143] 将上述测序得到的基因序列放在IMGT抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为357bp，属于VkII基因家族，其前方有57bp的前导肽序列；Heavy Chain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为366bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。
[0144] S14，重组抗体表达质粒的构建：
[0145] pcDNATM 3.4 vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计Anti-cTnI12D2抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，引物如下：
[0146] cTnI-12D2-HF：5’>CCCAAGCTTGCCGCCACCATGAGTGTGCTCACTCAGGTCCTGGGGT<3’；
[0147] cTnI-12D2-HR:5’>GGGGAATTCTCATTTACCCGGAGACCGGGAGATGGTCTTC<3’；
[0148] cTnI-12D2-LF:5’>CCCAAGCTTGCCGCCACCATGAAGTCACAGACCCAGGTCTTCGTA<3’；
[0149] cTnI-12D2-LR:5’>CCCGAATTCTCAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCTTGACGATG<3’；
[0150] 通过PCR扩增方法扩出0.73KB的Light Chain基因片段和1.45kb的Heavy Chain基因片段。Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。
[0151] 实施例2
[0152] 重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞及表达上清抗体活性鉴定
[0153] 质粒用超纯水稀释至400ng/ml，调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100ul质粒与700ul细胞混合，转入电转杯，电转，转入10ml含CD CHO AGT培养基中，37度摇床中培养(8％CO2、震幅150)；每天取样检测细胞活率，当细胞活率低于50％，离心细胞培养上清，得到的抗体(具有序列如SEQ ID NO:11以及12所示的轻链和重链)。取取4μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE。
[0154] 经分析，重链的互补决定区(WT)：
[0155] CDR-VH1为G-F(X1)-T-F-T-E(X2)-Y-N-V(X3)-H；
[0156] CDR-VH2为Y-I(X1)-Y-P-N(X2)-N-G-I-S(X3)-G-Y-N-Q；
[0157] CDR-VH3为R-D(X1)-A-Y-E(X2)-Y-D-W-I(X3)-A-Y；
[0158] 轻链的互补决定区：
[0159] CDR-VL1为S-Q-S-I(X1)-G-S(X2)-N-L(X3)-Y；
[0160] CDR-VL2为Y-A-T(X1)-D(X2)-S-I-S；
[0161] CDR-VL3为Q-S-Q(X1)-D(X2)-W-P-Y-T；
[0162] 其中，X1、X2、X3均为待突变位点。
[0163] 表1与抗体活性有关的突变位点
[0164]
[0165]
[0166] 发明人将WT中的CDR位点进行上述突变，以获得活性更好的抗体。
[0167] 包被液稀释cTnI质控品重组抗原到1ug/ml进行微孔板包被，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的cTnI单克隆抗体，100uL/孔，37℃,30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入羊抗鼠IgG-HRP，每孔100uL，37℃,30min；洗涤液清洗5次，拍干；加入显色液A液(50uL/孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm)处读OD值。
[0168] 表2抗体活性分析数据
[0169]样品浓度ng/ml WT 突变1 突变2 突变3 突变4 突变5
1000 1.919 2.407 2.397 2.314 2.146 2.115
200 1.673 2.194 2.124 2.098 1.977 1.940
40 0.535 1.265 1.253 1.1 1.005 1.092
8 0.431 0.371 0.361 0.339 0.238 0.286
1.6 0.104 0.142 0.139 0.124 0.135 0.120
0.32 0.092 0.112 0.101 0.086 0.079 0.073
0 0.080 0.073 0.058 0.073 0.064 0.084
1000 1.919 2.407 2.397 2.314 2.146 2.115
200 1.673 2.194 2.124 2.098 1.977 1.940
40 0.535 1.265 1.253 1.1 1.005 1.092
8 0.431 0.371 0.361 0.339 0.238 0.286
1.6 0.104 0.142 0.139 0.124 0.135 0.120
0.32 0.092 0.112 0.101 0.086 0.079 0.073
0 0.080 0.073 0.058 0.073 0.064 0.084
[0170] 从上表可知，突变1的活性效果最佳，因而以突变1作为骨架序列筛选效价较好的突变位点(保证筛选得到的抗体活性与突变1相近，抗体活性±10％)，部分结果如下。
[0171] 表3与抗体亲和力有关的突变位点
[0172]
[0173]
[0174]
[0175]
[0176] 亲和力分析
[0178] 1000nmol、500nmol、250nmol、125nmol、62.5nmol、31.25nmol、15.625nmol、0nmol；
[0179] 运行流程：缓冲液1(PBST)中平衡60s，抗体溶液中固化抗体300s，缓冲液2(PBST)中孵育180s，抗原溶液中结合420s，缓冲液2中解离800s，用10mM pH 1.69GLY溶液及缓冲液3进行传感器再生，输出数据。
[0180] 表4亲和力分析数据
[0181]
[0182]
[0183]
[0184] 从表4可以看出，表3中列出的突变位点对抗体的亲和力影响不大。
[0185] 为验证上述结果，以WT作为骨架序列重复上述实验，进行突变位点的亲和力验证，部分结果如下。
[0186] 表5以WT为骨架进行的突变
[0187]
[0188] 表6亲和力分析数据
[0189] KD(M) KD(M)
WT 6.83E-09 WT 1-20 8.63E-09
WT 1-5 7.67E-09 WT 1-30 9.53E-09
WT 1-10 6.57E-09 WT 1-40 1.39E-08
WT 6.83E-09 WT 1-20 8.63E-09
WT 1-5 7.67E-09 WT 1-30 9.53E-09
WT 1-10 6.57E-09 WT 1-40 1.39E-08
[0190] 从表5和表6分析，在保证具有抗体活性的前提下，上述突变位点与其他位点的关联也不大。
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