一种检测PS外泌体的生物传感器及其制备方法
专利汇可以提供一种检测PS外泌体的生物传感器及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种磷酯酰丝 氨 酸(PS)外泌体的 生物 传感器 及其制备方法。本发明以PS特异性识别肽作为识别元件，识别肽组装的生物传感 电极 作为捕获基底，由g-C3N4纳米片、鲁米诺-AuNPs和识别肽组成的电致 化学发光 探针作为 信号 探针。用捕获基底和信号探针特异性识别样品中的PS外泌体，形成三明治结构，通过信号探针产生检测信号。PS识别肽可特异性与 肿瘤 源外泌体上的PS结合，所述PS识别肽结构简单，亲和 力 和选择性高，不易受pH、 温度 等环境因素影响， 稳定性 好。本发明可实现高灵敏度和高选择性的PS外泌体检测。，下面是一种检测PS外泌体的生物传感器及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种检测磷酯酰丝氨酸(PS)阳性外泌体的生物传感器，其特征在：以PS特异性识别肽作为识别元件，识别肽组装的生物传感电极作为捕获基底，由g-C3N4纳米片、鲁米诺-AuNPs和识别肽组成的电致化学发光探针作为信号探针。
2.根据权利要求1所述的PS特异性识别肽，其特征在于：氨基酸序列为
FNFRLKAGAKIRFGRGC，序列中下划线部分为PS特异性识别序列，RGC为键连序列，末端半胱氨酸C中的巯基可以与金结合。
3.根据权利要求1所述的捕获基底，其制备方法特征在于：以氯金酸溶液为电沉积底液，玻碳电极为工作电极，采用恒电位沉积方法，制备出AuNPs修饰的玻碳电极，进一步用去离子水冲洗、室温晾干后，将修饰电极浸入识别肽溶液中进行孵育并冲洗；随后再将修饰电极浸入牛血清蛋白中进行封闭，得到识别肽组装的生物传感电极。
4.根据权利要求3所述的捕获基底制备方法中，所述氯金酸溶液的质量分数为1%，恒电位沉积的电压为- 0.2 V，沉积时间为10～30 s；所述识别肽水溶液的浓度为0.2～1 μM，在
4 ℃孵育0.5～12 h；牛血清蛋白水溶液的质量分数为0.2%～1%，在4 ℃下孵育0.5～1 h。
5.根据权利要求1所述的信号探针，其制备方法特征在于：将g-C3N4纳米片和鲁米诺-AuNPs混合均匀后，搅拌，然后以6000 rpm离心30分钟除去上清得到鲁米诺-AuNPs@g-C3N4沉淀物，将得到的鲁米诺-AuNPs@g-C3N4沉淀物与识别肽通过巯基与金配位作用形成Au-S键进行结合即可得到鲁米诺-AuNPs@g-C3N4/识别肽信号探针。
6.根据权利要求5所述的信号探针制备方法中，所述g-C3N4纳米片和鲁米诺-AuNPs溶液的投料比例为(0.5～1) mg：(0.5～10) mL；室温下搅拌18～36 h；所述鲁米诺-AuNPs@g-C3N4沉淀物与识别肽结合温度为4～40 ℃，时间为6～10 h。
7.一种检测PS外泌体生物传感器的测试方法，其特征是，将待测外泌体溶液在权利要求1或3所述的生物传感电极上孵育，使PS阳性外泌体捕获在生物传感器电极上，随后将权利要求1或5所述的鲁米诺-AuNPs@g-C3N4/识别肽信号探针溶液在捕获有PS阳性外泌体的生物传感器电极上孵育，使探针结合在生物传感器电极的PS阳性外泌体上，从而组成信号探针和生物传感器电极夹载PS外泌体的识别肽基三明治型生物传感器，对该电致化学发光生物传感器在含过氧化氢(H2O2)的磷酸盐缓冲溶液(PBS)中进行检测，通过信号探针产生电致化学发光信号，从而指示PS外泌体的含量。
一种检测PS外泌体的生物传感器及其制备方法
技术领域
背景技术
发明内容
在该策略利用特异性识别肽代替抗体，可有效区分肿瘤源外泌体和正常外泌体，提高了检测系统的选择性和稳定性。另外，该传感器可用于检测血清中的肿瘤源外泌体，适用于临床检测。
附图说明
通过直接热解三聚氰胺制备g-C3N4。三聚氰胺在550℃加热4小时，在此温度下再保持4小时并冷却至室温。然后得到的黄色产物是块状g-C3N4粉末。如下合成g-C3N4纳米片：向1 g该本体g-C3N4粉末中加入100 mL 5mol/L HNO3，在125℃回流24小时，并在室温下冷却。将白色产物以12000 rpm离心，用超纯水洗涤至接近中性的pH，并且再分散于水中。为了获得均匀尺寸的纳米片，将所得悬浮液超声处理4小时，然后以8000 rpm离心30分钟以除去残留的未剥落的g-C3N4纳米颗粒和大面积纳米片。然后，将获得的上清液以5000 rpm离心以除去悬浮液。最后，将产物在35℃的真空烘箱中干燥12小时以获得g-C3N4纳米片备用。将鲁米诺溶解在NaOH溶液中配成15 mM的溶液，然后取2.4 mL该溶液与20 mL的0.25 mM的氯金酸混合，在室温下搅拌30 min。在剧烈的搅拌下向混合溶液中逐滴加入，用冷水新配置的0.1 M NaBH4，溶液由淡黄色变为蓝紫色，继续搅拌20 min即可获得鲁米诺-AuNPs溶液。
将100 mg g-C3N4纳米片和50 mL鲁米诺-AuNPs溶液混合均匀后，室温下搅拌18 h，然后以6000 rpm离心30分钟除去上清得到鲁米诺-AuNPs@g-C3N4沉淀物，图2为鲁米诺-AuNPs@g-C3N4纳米材料的透射电子显微镜图。将得到的鲁米诺-AuNPs@g-C3N4沉淀物与识别肽通过巯基与金配位作用30℃下进行结合6 h即可得到鲁米诺-AuNPs@g-C3N4/PS识别肽信号探针。
将50 mg g-C3N4纳米片和100 mL鲁米诺-AuNPs溶液混合均匀后，室温下搅拌36 h，然后以6000 rpm离心30分钟除去上清得到鲁米诺-AuNPs@g-C3N4沉淀物，图2为鲁米诺-AuNPs@g-C3N4纳米材料的透射电子显微镜图。将得到的鲁米诺-AuNPs@g-C3N4沉淀物与识别肽通过巯基与金配位作用40℃下进行结合8 h即可得到鲁米诺-AuNPs@g-C3N4/PS识别肽信号探针。
由于磷酯酰丝氨酸在正常外泌体与肿瘤源外泌体上含量存在明显差异，因此可利用该传感器平台识别肿瘤细胞分泌的PS阳性外泌体。本申请采用该方法区分了正常细胞HMrSV5和卵巢癌细胞SKOV3ip分泌的外泌体，并对实际血清中的PS阳性外泌体进行了检测。图4为对SKOV3ip和HMrSV5细胞分泌外泌体的ECL响应(A)及检测不同介质中的SKOV3ip外泌体(B)。此电致化学发光生物传感器对相同浓度的卵巢肿瘤细胞SKOV3ip和正常细胞HMrSV5分泌的外泌体进行检测，结果具有明显的差别，说明该肽基传感器对肿瘤源外泌体具有良好的选择性。为了评估该传感器检测肿瘤源外泌体的临床应用性，分别检测不同介质，即磷酸盐缓冲溶液(PBS)和5%去外泌体的牛血清(FBS)中相同浓度的PS阳性外泌体，结果基本一致，表明该方法可以很好地用于复杂的生物样品。
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