一种E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法
阅读：0发布：2022-01-08
专利汇可以提供一种E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种E型产气荚膜梭菌类毒素 疫苗 的制备方法，包括如下步骤：(1)将E型产气荚膜梭菌菌种接种于无菌血平皿培养基上，厌 氧 培养，进行菌株的复苏；(2)将复苏后的E型产气荚膜梭菌菌种接种于液体硫 乙醇 酸盐 流体 培养基中，厌氧条件下进行増菌，制得 种子 液；(3)将种子液接种于产毒培养基中，厌氧培养，制备得到外毒素液；(4)将制备的外毒素液经灭活、乳化处理，再加入硫柳汞，即制备得到E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗。本发明开发制备了免疫 力 强，无毒 副作用 的E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗。该疫苗可以有效 预防 由此菌导致的犊 牛 ，羔羊痢疾等 疾病 。，下面是一种E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法专利的具体信息内容。
1.一种E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将E型产气荚膜梭菌菌种接种于无菌血平皿培养基上，厌氧培养，进行菌株的复苏；
(2)将复苏后的E型产气荚膜梭菌菌种接种于液体硫乙醇酸盐流体培养基中，厌氧条件下进行増菌，制得种子液；
(3)将种子液接种于产毒培养基中，厌氧培养，过滤除菌，制备得到外毒素液；
(4)将制备的外毒素液经灭活、乳化处理，再加入硫柳汞，即制备得到E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗；
步骤(1)中，所述无菌血平皿培养基由如下方法制备而成：
将3.8g血琼脂基础，1g葡萄糖，溶于100mL的去离子水中，121℃，15min高压灭菌，冷却至50℃，加入5mL脱纤维绵羊血，摇晃均匀，倾入灭菌的平皿，即得；
步骤(3)中，所述产毒培养基由如下方法制备而成：
2g蛋白胨，1g糊精，2g酵母提取物，1.2g L-精氨酸溶于100mL PBS缓冲液，用浓盐酸调pH为7.5，高压灭菌，即得；
厌氧培养时，厌氧条件的气体构成按体积分数为：88％N2、5％CO2、7％H2；
步骤(4)中，灭活采用的方法为：向外毒素液中加入甲醛，使其终浓度为0.3％，置于37℃，充分振荡，转速为140rmp，灭活24h。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，厌氧培养的温度为37℃，厌氧培养的时间为36h。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，41℃厌氧培养18h进行増菌。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，厌氧培养的条件为：43℃厌氧振荡培养6h。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，向灭活后的外毒素液中加入白油佐剂进行乳化，外毒素液与白油佐剂加入的体积比为1:2。
一种E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法
技术领域
背景技术
[0002] 产气荚膜梭菌，旧称魏氏梭菌，根据其产生的4种主要外毒素(α，β，ε，ι)，将产气荚膜梭菌分为A，B，C，D，E五个毒素型型。Bohenel指出：“魏氏梭菌致病是由于它们形成分泌的毒素和代谢产物，无毒素产生就不会出现临床症状”。作为该菌成员之一的E型产气荚膜梭菌主要分泌α和ι外毒素。尽管在动物生产中很少有典型症状有关E型产气荚膜梭菌病，仍然有报告指出E型产气荚膜梭菌占到所有产气荚膜梭菌分离株的5％，同时5％的E型产气荚膜梭菌能与50％的牛致死性溶血性肠炎有关。并且E型产气荚膜梭菌主要侵袭羔羊，犊牛等反刍动物。20世纪初，在英国，报道了犊牛和羔羊的ι毒素肠毒血症的发生，在那时已经有报道一定数量的牛溶血性，坏死性肠炎即痢疾的发生，并且从发病的绵羊和牛也检测到了E型菌株和ι毒素。在巴西，E型产气荚膜梭菌在分离的菌株中占比比较大，在健康和腹泻的牛中接近30％的样品携带有ι毒素，其中有9％的牛会发生猝死。同时E型菌也可以感染多个物种，从具有肠毒血症临床症状的山羊，鹿，野猪中，也分离到了E型产气荚膜梭菌菌株。因此，为了预防E型产气荚膜梭菌对犊牛、羔羊的潜在危害，有必要对E型产气荚膜梭菌的疫苗进行研究。
[0003] 产气荚膜梭菌形成的主要外毒素的化学成分为蛋白质，具有较好的免疫原性。因此，根据产气荚膜梭菌的发病机理，制备不同类别的产气荚膜梭菌毒素，将其灭活后做成类毒素疫苗，用于畜禽预防和治疗，能够达到确实可靠的免疫和治疗效果。目前已有关于A型-D型产气荚膜梭菌类毒素疫苗制备的报道，但关于E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备，迄今仍未见报道。
发明内容
[0004] 针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 一种E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备方法，包括如下步骤：
[0009] (3)将种子液接种于产毒培养基中，厌氧培养，过滤除菌，制备得到外毒素液；
[0010] (4)将制备的外毒素液经灭活、乳化处理，再加入硫柳汞，即制备得到E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗。
[0011] 优选的，步骤(1)中，所述E型产气荚膜梭菌菌种采用的标准菌种E型NCTC8084(National Collection of Type Cultures，英国微生物菌种保藏中心)。该菌株可通过现有技术中的常规渠道直接获得。该菌株经多次试验，与其他E型产气荚膜梭菌菌株相比，产毒效果最佳。
[0012] 优选的，步骤(1)中，所述无菌血平皿培养基由如下方法制备而成：
[0014] 优选的，步骤(1)中，厌氧培养的温度为37℃，厌氧培养的时间为36h。
[0015] 优选的，步骤(2)中，41℃厌氧培养18h进行増菌。不同类型的产气荚膜梭菌其増菌培养的条件是存在明显差异的，针对E型产气荚膜梭菌，本发明对其増菌培养的温度和时间条件进行了优化考察，结果发现，温度过高或温度过低都不利于E型产气荚膜梭菌的生长，培养时间过短，会使増菌效果不显著；培养时间过长则会影响菌株后期的产外毒素。当培养温度为41℃，培养时间为18h时，其増菌效果最优。
[0016] 优选的，步骤(3)中，所述产毒培养基由如下方法制备而成：
[0018] 优选的，步骤(3)中，厌氧培养的条件为：43℃厌氧振荡培养6h。
[0019] 进一步优选的，厌氧培养时，厌氧条件的气体构成按体积分数为：88％N2、5％CO2、7％H2。
[0020] 在产毒培养基中进行厌氧培养以制备外毒素液，是制备E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的关键步骤，因为在相同佐剂条件下，疫苗免疫效果往往与毒素含量呈正比，毒素含量越高，疫苗效果越好。
[0021] 由于不同类型的产气荚膜梭菌分泌毒素的条件是不同的，彼此间难以进行借鉴或参考，针对E型产气荚膜梭菌外毒素液的制备，本发明从产毒培养基的营养成分、pH条件、厌氧培养的温度、时间以及厌氧条件的气体组成等进行了探索，结果发现，本发明的产毒培养基特别符合E型产气荚膜梭菌分泌毒素对营养成分的需求，本发明以商品化的蛋白胨、酵母提取物等成品作为原材料替代原有的质量不可控的牛肉、牛肝等原材料，通过筛选培养基配方并优化产毒素的培养条件，使培养基的产毒能力得到极大的提高，而且产毒性能稳定、质量可控、配制使用方便、价格低廉。pH条件也是影响毒素产量的关键因素，pH为7.5时的毒素产量最高，pH低于或高于7.5都会降低毒素的产量。更为关键的是，厌氧培养的温度和时间条件，虽然在细菌生长适宜温度范围内，提高培养温度有利于菌体的生长，但菌体生长和细菌产毒分属不同的阶段，最有利于菌体生长的培养温度不一定能够获得最高的毒素产量，经多次试验摸索发现，43℃厌氧振荡培养6h能够获得最高的毒素产量。另外，厌氧环境的气体组成对于E型产气荚膜梭菌生长和分泌毒素都会产生影响，如果该气体成分发生改变如混合气体成分比例发生改变，就会导致E型产气荚膜梭菌不生长，同时也不会分泌毒素。
[0022] 优选的，步骤(4)中，灭活采用的方法为：向外毒素液中加入甲醛，使其终浓度为0.3％，置于37℃，充分振荡，转速为140rmp，灭活24h。
[0023] 由于不同类型的产气荚膜梭菌所分泌的外毒素存在不同，导致对外毒素液进行灭活的处理条件存在差异，对外毒素液进行灭活处理的效果主要与甲醛的浓度、温度、灭活的时间等有关，采用高浓度的甲醛和高温灭活，虽然能使灭活时间减少，但对抗原的损失也较大；灭活时间过短，会使灭活不充分，灭活时间过长，一方面增加了成本，另一方面对抗原也有损失。综合考虑灭活的效率和对抗原性的影响，本发明对灭活条件进行了优选，结果发现，采用0.3％的甲醛、37℃、灭活24h能够取得最优的灭活效果。
[0024] 优选的，步骤(4)中，向灭活后的外毒素液中加入白油佐剂进行乳化，外毒素液与白油佐剂加入的体积比为1:2。
[0025] 优选的，白油佐剂的构成为：12份白油和1份Span-80混合后，再加入占白油和Span-80混合液总质量1.5％的硬脂酸铝；白油中正碳数为C16-C20的烷烃所占的质量百分数为10-20％。经多次试验发现，采用上述构成的白油佐剂制备的疫苗，其抗体效价最高且副作用最小。
[0026] 本发明的有益效果：
[0027] 本发明首次开发制备了免疫力强，无毒副作用的E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗。该疫苗可以有效预防由此菌导致的犊牛，羔羊痢疾等疾病。
具体实施方式
[0028] 应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0029] 为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
[0030] 本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。其中，血琼脂基础、硫乙醇酸盐流体培养基(FT)、酵母提取物等均为常规的市售产品。
[0031] 实施例1：犊牛、羔羊痢疾的E型产气荚膜梭菌类毒素疫苗的制备
[0032] 具体步骤如下：
[0033] (1)外毒素制取：移液器取E型产气荚膜梭菌菌种NCTC8084(National Collection of Type Cultures8084)保存液涂布于无菌血平板培养基(无菌血平皿培养基：3.8g血琼脂基础，1g葡萄糖，溶于100mL的去离子水中，121℃，15min高压灭菌，冷却至50℃左右，加入5mL脱纤维绵羊血，摇晃均匀，倾入灭菌的平皿即可)，37℃厌氧培养36h。用无菌的接种环取
5-10个菌落接种于无菌的硫乙醇酸盐流体培养基(FT)，41℃厌氧培养18h增菌。取培养之后的E8084种子液按照7：100的体积比例接种于自制的无菌产毒培养基(产毒培养基：2g蛋白胨，1g糊精，2g酵母提取物，1.2g L-精氨酸溶于100mL PBS缓冲液，用浓盐酸调pH为7.5，高压灭菌)，43℃厌氧(气体构成：88％N2，5％CO2，7％H2)振荡培养6h。培养液4℃10000rpm，离心30min，取上清，滤菌器过滤除菌，得到外毒素。
5-10个菌落接种于无菌的硫乙醇酸盐流体培养基(FT)，41℃厌氧培养18h增菌。取培养之后的E8084种子液按照7：100的体积比例接种于自制的无菌产毒培养基(产毒培养基：2g蛋白胨，1g糊精，2g酵母提取物，1.2g L-精氨酸溶于100mL PBS缓冲液，用浓盐酸调pH为7.5，高压灭菌)，43℃厌氧(气体构成：88％N2，5％CO2，7％H2)振荡培养6h。培养液4℃10000rpm，离心30min，取上清，滤菌器过滤除菌，得到外毒素。
[0034] (2)外毒素灭活：将制取的外毒素加入甲醛，并使终浓度为0.3％，并调pH为7.5，置于37℃，充分振荡，转速为140rpm，灭活24h，即可灭活完全。
[0035] (3)类毒素疫苗制备：将灭活好后的类毒素与白油佐剂以1:2的体积比进行乳化，并加入硫柳汞，使其终浓度为0.01％，充分乳化后，制成类毒素疫苗。
[0036] 实施例2：
[0037] (1)安全性检测
[0038] 取3只1.5kg左右家兔，皮下注射5mL的类毒素疫苗(实施例1制备)，连续观察10d,结果显示注射部位无肿胀，肉芽肿等情况。
[0039] (2)疫苗效力检验
[0040] 用体重22g左右的昆明鼠6只，分为两组，分别注射皮下注射0.2mL类毒素疫苗(实施例1制备)和0.2mL的生理盐水，28日后，各注射最小致死剂量E型产气荚膜梭菌毒素0.3mL，观察5日，对照组小白鼠全部死亡；免疫组小白鼠3只均未死，继续观察5天，无痢疾等发病症状，均健康存活。证明本发明的疫苗对实验动物的保护率达100％。
[0041] 对比例1：
[0042] 移液器取E型产气荚膜梭菌菌种NCTC8084(National Collection of Type Cultures8084)保存液涂布于无菌血平板培养基(无菌血平皿培养基：3.8g血琼脂基础，1g葡萄糖，溶于100mL的去离子水中，121℃，15min高压灭菌，冷却至50℃左右，加入5mL脱纤维绵羊血，摇晃均匀，倾入灭菌的平皿即可)，37℃厌氧培养36h。用无菌的接种环取5-10个菌落接种于无菌的硫乙醇酸盐流体培养基(FT)，37℃厌氧培养12h增菌。取培养之后的E8084种子液按照7：100的体积比例接种于自制的无菌产毒培养基(产毒培养基：2g蛋白胨，1g糊精，2g酵母提取物，1.2g L-精氨酸溶于100mL PBS缓冲液，用浓盐酸调pH为7.4，高压灭菌)，40℃厌氧(气体构成：88％N2，5％CO2，7％H2)振荡培养5h。培养液4℃10000rpm，离心30min，取上清，滤菌器过滤除菌，得到外毒素。
[0043] 对比例2：
[0044] 移液器取E型产气荚膜梭菌菌种NCTC8084(National Collection of Type Cultures8084)保存液涂布于无菌血平板培养基(无菌血平皿培养基：3.8g血琼脂基础，1g葡萄糖，溶于100mL的去离子水中，121℃，15min高压灭菌，冷却至50℃左右，加入5mL脱纤维绵羊血，摇晃均匀，倾入灭菌的平皿即可)，37℃厌氧培养46h。用无菌的接种环取5-10个菌落接种于无菌的硫乙醇酸盐流体培养基(FT)，38℃厌氧培养14h增菌。取培养之后的E8084种子液按照7：100的体积比例接种于自制的无菌产毒培养基(产毒培养基：2g蛋白胨，1g糊精，2g酵母提取物，1.2g L-精氨酸溶于100mL PBS缓冲液，用浓盐酸调pH为7.4，高压灭菌)，38℃厌氧(气体构成：85％N2，9％CO2，6％H2)振荡培养5h。培养液4℃10000rpm，离心30min，取上清，滤菌器过滤除菌，得到外毒素。
[0045] 对比例3：
[0046] 移液器取E型产气荚膜梭菌菌种NCTC8084(National Collection of Type Cultures8084)保存液涂布于无菌血平板培养基(无菌血平皿培养基：3.8g血琼脂基础，1g葡萄糖，溶于100mL的去离子水中，121℃，15min高压灭菌，冷却至50℃左右，加入5mL脱纤维绵羊血，摇晃均匀，倾入灭菌的平皿即可)，37℃厌氧培养36h。用无菌的接种环取5-10个菌落接种于无菌的硫乙醇酸盐流体培养基(FT)，39℃厌氧培养12h增菌。取培养之后的E8084种子液按照7：100的体积比例接种于自制的无菌产毒培养基(产毒培养基：2g蛋白胨，1g糊精，2g酵母提取物，1.2g L-精氨酸溶于100mL PBS缓冲液，用浓盐酸调pH为7.4，高压灭菌)，45℃厌氧(气体构成：88％N2，5％CO2，7％H2)振荡培养4h。培养液4℃10000rpm，离心30min，取上清，滤菌器过滤除菌，得到外毒素。
[0047] 分别取实施例1、对比例1-3制备的外毒素，稀释后尾静脉注射体重为16-18g的小白鼠，每滴度注射2只，每只注射0.2ml，观察小鼠在注射后72h内的死亡情况。记录能使小鼠发生2/2死亡的最小毒素量。结果发现，对比例1-3制备的外毒素的最小毒素量分别为实施例1的2.4倍、5.6倍和3.8倍。说明在不同培养条件下，E型产气荚膜梭菌的产毒量差异显著，采用本发明的方法进行培养，E型产气荚膜梭菌的产毒量最高。
[0048] 以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
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