有用于癌症免疫疗法的牛痘病毒突变体
阅读：1041发布：2020-05-11
专利汇可以提供有用于癌症免疫疗法的牛痘病毒突变体专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文公开了与 治疗 、 预防 和/或改善有需要的受试者的癌症相关的方法和组合物。在具体方面，本 发明 技术涉及痘病毒单独地或与免疫检查点阻断剂组合地作为溶瘤和免疫治疗组合物的用途，所述痘病毒包括具有 牛 痘宿主范围因子C7缺失的重组改良安卡拉牛痘(MVA)病毒或牛痘病毒(分别为MVAΔC7L和VACVΔC7L)。在一些实施方案中，本公开文本的技术涉及进一步修饰以表达人Fms样酪 氨 酸激酶3配体(Flt3L)的MVAΔC7L或VACVΔC7L病毒。，下面是有用于癌症免疫疗法的牛痘病毒突变体专利的具体信息内容。
1.一种工程化的改良安卡拉牛痘(MVA)病毒株，其包含C7L基因的破坏。
2.根据权利要求1所述的工程化的MVA病毒株，其中所述经破坏的C7L基因不编码全长野生型基因产物。
3.根据权利要求1所述的工程化的MVA病毒株，其中所述经破坏的C7L基因包含异源核酸序列到C7L基因的编码序列的插入。
4.根据权利要求1所述的工程化的MVA病毒株，其中所述经破坏的C7L基因包含一个或多个基因盒的插入。
5.根据权利要求1所述的工程化的MVA毒株，其中所述经破坏的C7L基因包含一个或多个基因盒对至少一部分基因的替换。
6.根据权利要求1所述的工程化的MVA病毒，其中所述经破坏的C7L基因包含一个或多个基因盒对整个C7L基因的替换。
7.根据权利要求4所述的工程化的MVA毒株，其中所述一个或多个基因盒包含编码人Fms样酪氨酸激酶3配体(hFlt3L)的核苷酸序列。
8.根据权利要求4所述的工程化的MVA毒株，其中所述一个或多个基因盒包含编码可选择标记的核苷酸序列。
9.根据权利要求1所述的工程化的MVA毒株，其中所述MVA毒株展现出以下特征中的一种或多种：
与感染相应的野生型毒株的树突细胞和THP-1细胞相比，诱导树突细胞和THP-1细胞中干扰素β(IFNB)表达水平升高；
与感染相应的野生型毒株的树突细胞相比，诱导树突细胞中TBK1和IRF3磷酸化水平升高；
与感染相应的野生型毒株的树突细胞相比，诱导树突细胞中ISG表达水平升高；
与感染相应的野生型毒株的癌细胞相比，诱导癌细胞中IFNB、CCL4、CCL5、CXCL10中的至少一种水平升高；以及
与感染相应的野生型毒株的肿瘤相比，减小与所述工程化的MVA毒株接触的肿瘤的肿瘤体积。
10.根据权利要求9所述的工程化的MVA毒株，其中所述癌细胞包含黑素瘤细胞。
11.根据权利要求9所述的工程化的MVA毒株，其中所述肿瘤包含恶性黑素瘤。
12.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求1所述的工程化的改良安卡拉牛痘
(MVA)病毒株。
13.根据权利要求12所述的免疫原性组合物，其还包含药学上可接受的载体。
14.根据权利要求12所述的免疫原性组合物，其还包含药学上可接受的佐剂。
15.一种工程化的减毒牛痘病毒(VACV)株，其包含C7L基因的破坏。
16.根据权利要求15所述的工程化的减毒VACV毒株，其中所述经破坏的C7L基因不编码全长野生型基因产物。
17.根据权利要求15所述的工程化的减毒VACV毒株，其中所述经破坏的C7L基因包含异源核酸序列到C7L基因的编码序列的插入。
18.根据权利要求15所述的工程化的减毒VACV毒株，其中所述经破坏的C7L基因包含一个或多个基因盒的插入。
19.根据权利要求15所述的工程化的减毒VACV毒株，其中所述经破坏的C7L基因包含一个或多个基因盒对至少一部分基因的替换。
20.根据权利要求19所述的工程化的减毒VACV毒株，其中所述一个或多个基因盒包含编码人Fms样酪氨酸激酶3配体(hFlt3L)的核苷酸序列。
21.根据权利要求19所述的工程化的减毒VACV毒株，其中所述一个或多个基因盒包含编码可选择标记的核苷酸序列。
22.根据权利要求15所述的工程化的减毒VACV毒株，其中与感染相应的野生型毒株的小鼠相比，感染所述工程化的VACV毒株的小鼠具有增加的感染后寿命。
23.一种免疫原性组合物，其包含根据权利要求15所述的工程化的牛痘病毒(VACV)株。
24.根据权利要求23所述的免疫原性组合物，其还包含药学上可接受的载体。
25.根据权利要求23所述的免疫原性组合物，其还包含药学上可接受的佐剂。
26.一种重组牛痘病毒(VACV)核酸序列，其中在SEQ ID NO:1的位置15,716和16,168之间的核酸序列被包含编码可选择标记的开放阅读框的异源核酸序列替换。
27.根据权利要求26所述的重组VACV核酸序列，其中所述异源核酸序列的开放阅读框与能够指导所述可选择标记表达的启动子可操作地连接。
28.根据权利要求26所述的重组VACV核酸序列，其中所述可选择标记是生物发光蛋白、荧光蛋白、化学发光蛋白、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)或其任何组合。
29.根据权利要求26所述的重组VACV核酸序列，其中所述可选择标记是绿色荧光蛋白(GFP)。
30.根据权利要求26所述的重组VACV核酸序列，其中所述异源核酸序列还包含编码人Fms样酪氨酸激酶3配体(hFlt3L)的开放阅读框。
31.一种重组改良安卡拉牛痘(MVA)病毒核酸序列，其中在SEQ ID NO:2的位置18,407和18,859之间的核酸序列被包含编码可选择标记的开放阅读框的异源核酸序列替换。
32.根据权利要求31所述的重组MVA核酸序列，其中所述异源核酸序列的开放阅读框与能够指导所述可选择标记表达的启动子可操作地连接。
33.根据权利要求31所述的重组牛痘病毒核酸序列，其中所述可选择标记是生物发光蛋白、荧光蛋白、化学发光蛋白、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)或其任何组合。
34.根据权利要求31所述的重组牛痘病毒核酸序列，其中所述可选择标记是绿色荧光蛋白(GFP)。
35.根据权利要求31所述的重组牛痘病毒核酸序列，其中所述异源核酸序列还包含编码人Fms样酪氨酸激酶3配体(hFlt3L)的开放阅读框。
36.一种用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括将包含有效量的包含C7L基因的破坏的工程化的改良安卡拉牛痘(MVA)病毒株(MVAΔC7L)和/或基因工程化以表达hFlt3L的MVAΔC7L病毒(MVAΔC7L-hFlt3L)的组合物递送至肿瘤。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述破坏包含C7L基因的缺失。
38.根据权利要求36所述的方法，其中治疗包含以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫应答或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫应答、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。
39.根据权利要求36所述的方法，其中所述免疫应答的诱导、增强或促进包含以下中的一种或多种：
与感染相应的野生型毒株的树突细胞和THP-1细胞相比，树突细胞和THP-1细胞中干扰素β(IFNB)表达的水平升高；
与感染相应的野生型毒株的树突细胞相比，树突细胞中TBK1和IRF3磷酸化的水平升高；
与感染相应的野生型毒株的树突细胞相比，树突细胞中ISG表达的水平升高；以及与感染相应的野生型毒株的肿瘤细胞相比，肿瘤细胞中IFNB、CCL4、CCL5和CXCL10中的至少一种的水平升高。
40.根据权利要求36所述的方法，其中所述组合物通过瘤内或静脉内注射或者瘤内和静脉内注射的同时或顺序组合来给予。
41.根据权利要求36所述的方法，其中所述肿瘤是黑素瘤、结肠癌、乳腺癌或前列腺癌。
42.根据权利要求36所述的方法，其中所述组合物还包含一种或多种免疫检查点阻断剂。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述免疫检查点阻断剂选自：CTLA-4、CD80、CD86、PD-1、PDL1、PDL2、LAG3、B7-H3、B7-H4、TIM3、ICOS、IIDLBCL抑制剂、BTLA、伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、皮地利珠单抗、AMP-224、MPDL3280A、BMS-936559、MED14736、MSB
00107180及其任何组合。
44.一种用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括将包含有效量的包含C7L基因的破坏的工程化的减毒牛痘病毒(VACV)株(VACVΔC7L)、基因工程化以表达hFlt3L的VACVΔC7L病毒(VACVΔC7L-hFlt3L)或其组合的组合物递送至肿瘤。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述破坏包含C7L基因的缺失。
46.根据权利要求44所述的方法，其中治疗包含以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫应答或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫应答、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。
47.根据权利要求44所述的方法，其中所述免疫应答的诱导、增强或促进包含以下中的一种或多种：
与感染相应的野生型毒株的树突细胞和THP-1细胞相比，树突细胞和THP-1细胞中干扰素β(IFNB)表达的水平升高；
与感染相应的野生型毒株的树突细胞相比，树突细胞中TBK1和IRF3磷酸化的水平升高；
与感染相应的野生型毒株的树突细胞相比，树突细胞中ISG表达的水平升高；以及与感染相应的野生型毒株的肿瘤细胞相比，肿瘤细胞中IFNB、CCL4、CCL5和CXCL10中的至少一种的水平升高。
48.根据权利要求44所述的方法，其中所述组合物通过瘤内或静脉内注射或者瘤内和静脉内注射的同时或顺序组合来给予。
49.根据权利要求44所述的方法，其中所述肿瘤是黑素瘤、结肠癌、乳腺癌或前列腺癌。
50.根据权利要求44所述的方法，其中所述组合物还包含一种或多种免疫检查点阻断剂。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述免疫检查点阻断剂选自：CTLA-4、CD80、CD86、PD-1、PDL1、PDL2、LAG3、B7-H3、B7-H4、TIM3、ICOS、IIDLBCL抑制剂、BTLA、伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、皮地利珠单抗、AMP-224、MPDL3280A、BMS-936559、MED14736、MSB
00107180及其任何组合。
52.一种刺激免疫应答的方法，其包括：
向受试者给予根据权利要求12所述的免疫原性组合物。
53.一种刺激免疫应答的方法，其包括：
向受试者给予根据权利要求23所述的免疫原性组合物。
有用于癌症免疫疗法的牛痘病毒突变体
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2017年5月12日提交的美国临时申请号62/505,713的优先权，将其通过引用以其整体特此并入。
[0004] 本发明是在由美国国立卫生研究院授予的AI073736、AI095692、AR068118和CA008748下在美国政府支持下完成的。政府拥有本发明的某些权利。
[0006] 本申请含有以ASCII格式电子提交并且通过引用以其整体特此并入的序列表。在2018年5月8日创建的所述ASCII副本命名为115872-0781_SL.txt并且大小为492,760字节。
技术领域
[0007] 本公开文本的技术总体上涉及肿瘤学、病毒学和免疫疗法领域。具体而言，本发明技术涉及痘病毒单独地或与免疫检查点阻断剂组合地作为溶瘤和免疫治疗组合物的用途，所述痘病毒包括具有牛痘宿主范围因子C7缺失的重组改良安卡拉牛痘(MVA)病毒或牛痘病毒(分别为MVAΔC7L和VACVΔC7L)。在一些实施方案中，本公开文本的技术涉及进一步修饰以表达人Fms样酪氨酸激酶3配体(hFlt3L)的MVAΔC7L或VACVΔC7L病毒。
背景技术
[0008] 提供以下描述以帮助读者理解。所提供的信息或所引用的参考文献均不被承认是现有技术。
[0009] 恶性肿瘤(如黑素瘤)固有地对常规疗法具有抗性，并且提出了重大的治疗挑战。免疫疗法是一个不断发展的研究领域，并且是治疗某些类型的癌症的另外的选择。免疫疗法方法所基于的基本原理是可以刺激免疫系统以识别肿瘤细胞，并且靶向它们进行破坏。
尽管通过癌细胞呈递抗原，并且存在可能对肿瘤细胞潜在发生反应的免疫细胞，但是在许多情况下，免疫系统未被激活或肯定地被抑制。此现象的关键是肿瘤通过迫使免疫系统的细胞抑制免疫系统的其他细胞来保护自身免受免疫应答影响的能力。肿瘤发展出许多免疫调节机制来逃避抗肿瘤免疫应答。因此，需要改善的免疫治疗方法来增强宿主抗肿瘤免疫和靶向肿瘤细胞进行破坏。
尽管通过癌细胞呈递抗原，并且存在可能对肿瘤细胞潜在发生反应的免疫细胞，但是在许多情况下，免疫系统未被激活或肯定地被抑制。此现象的关键是肿瘤通过迫使免疫系统的细胞抑制免疫系统的其他细胞来保护自身免受免疫应答影响的能力。肿瘤发展出许多免疫调节机制来逃避抗肿瘤免疫应答。因此，需要改善的免疫治疗方法来增强宿主抗肿瘤免疫和靶向肿瘤细胞进行破坏。
发明内容
[0010] 在一方面，本公开文本提供了一种工程化的改良安卡拉牛痘(MVA)病毒株，其包含C7L基因的破坏。在一些实施方案中，所述经破坏的C7L基因不编码全长野生型基因产物。在一些实施方案中，所述经破坏的C7L基因包含异源核酸序列到C7L基因的编码序列的插入。在一些实施方案中，所述经破坏的C7L基因包含一个或多个基因盒的插入。在一些实施方案中，所述经破坏的C7L基因包含一个或多个基因盒对至少一部分基因的替换。在一些实施方案中，所述经破坏的C7L基因包含一个或多个基因盒对整个C7L基因的替换。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码可选择标记的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码人Fms样酪氨酸激酶3配体(hFlt3L)的核苷酸序列。
[0011] 在一方面，本公开文本提供了一种工程化的改良安卡拉牛痘(MVA)病毒株，其包含C7L基因的破坏，其中所述MVA毒株展现出以下特征中的一种或多种：(i)与感染相应的野生型毒株的树突细胞和THP-1细胞相比，诱导树突细胞和THP-1细胞中干扰素β(IFNB)表达水平升高；(ii)与感染相应的野生型毒株的树突细胞相比，诱导树突细胞中TBK1和IRF3磷酸化水平升高；(iii)与感染相应的野生型毒株的树突细胞相比，诱导树突细胞中ISG表达水平升高；(iv)与感染相应的野生型毒株的癌细胞相比，诱导癌细胞中IFNB、CCL4、CCL5和CXCL10中的至少一种水平升高；以及(v)与感染相应的野生型毒株的肿瘤相比，减小与所述工程化的MVA毒株接触的肿瘤的肿瘤体积。在一些实施方案中，所述癌细胞包含黑素瘤细胞。在一些实施方案中，所述肿瘤包含恶性黑素瘤。
[0012] 在一方面，本公开文本提供了一种包含工程化的改良安卡拉牛痘(MVA)病毒株的免疫原性组合物，所述工程化的改良安卡拉牛痘(MVA)病毒株包含C7L基因的破坏。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的佐剂。
[0013] 在一方面，本公开文本提供了一种工程化的减毒牛痘病毒(VACV)株，其包含C7L基因的破坏。在一些实施方案中，所述经破坏的C7L基因不编码全长野生型基因产物。在一些实施方案中，所述经破坏的C7L基因包含异源核酸序列到C7L基因的编码序列的插入。在一些实施方案中，所述经破坏的C7L基因包含一个或多个基因盒的插入。在一些实施方案中，所述经破坏的C7L基因包含一个或多个基因盒对至少一部分基因的替换。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码可选择标记的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述一个或多个基因盒包含编码人Fms样酪氨酸激酶3配体(hFlt3L)的核苷酸序列。在一些实施方案中，与感染相应的野生型毒株的小鼠相比，感染所述工程化的减毒VACV毒株的小鼠具有增加的感染后寿命。
[0014] 在一方面，本公开文本提供了一种包含工程化的减毒牛痘病毒(VACV)株的免疫原性组合物，所述工程化的减毒牛痘病毒(VACV)株包含C7L基因的破坏。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，所述免疫原性组合物还包含药学上可接受的佐剂。
[0015] 在一方面，本公开文本提供了一种重组牛痘病毒(VACV)核酸序列，其中在SEQ ID NO:1的位置15,716和16,168之间的核酸序列被包含编码可选择标记的开放阅读框的异源核酸序列替换。在一些实施方案中，所述异源核酸序列的开放阅读框与能够指导所述可选择标记表达的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述可选择标记是生物发光蛋白、荧光蛋白、化学发光蛋白、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)或其任何组合。在一些实施方案中，所述可选择标记是绿色荧光蛋白(GFP)。在一些实施方案中，所述异源核酸序列还包含编码人Fms样酪氨酸激酶3配体(hFlt3L)的开放阅读框。
[0016] 在一方面，本公开文本提供了一种重组改良安卡拉牛痘(MVA)病毒核酸序列，其中在SEQ ID NO:2的位置18,407和18,859之间的核酸序列被包含编码可选择标记的开放阅读框的异源核酸序列替换。在一些实施方案中，所述异源核酸序列的开放阅读框与能够指导所述可选择标记表达的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述可选择标记是生物发光蛋白、荧光蛋白、化学发光蛋白、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)或其任何组合。在一些实施方案中，所述可选择标记是绿色荧光蛋白(GFP)。在一些实施方案中，所述异源核酸序列还包含编码人Fms样酪氨酸激酶3配体(hFlt3L)的开放阅读框。
[0017] 在一方面，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括将包含有效量的包含C7L基因的破坏的工程化的改良安卡拉牛痘(MVA)病毒株(MVAΔC7L)和/或基因工程化以表达hFlt3L的MVAΔC7L病毒(MVAΔC7L-hFlt3L)的组合物递送至肿瘤。在一些实施方案中，所述破坏包含C7L基因的缺失。在一些实施方案中，治疗包含以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫应答或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫应答、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。在一些实施方案中，所述免疫应答的诱导、增强或促进包含以下中的一种或多种：(i)与感染相应的野生型毒株的树突细胞和THP-1细胞相比，树突细胞和THP-1细胞中干扰素β(IFNB)表达的水平升高；(ii)与感染相应的野生型毒株的树突细胞相比，树突细胞中TBK1和IRF3磷酸化的水平升高；(iii)与感染相应的野生型毒株的树突细胞相比，树突细胞中ISG表达的水平升高；以及(iv)与感染相应的野生型毒株的肿瘤细胞相比，肿瘤细胞中IFNB、CCL4、CCL5和CXCL10中的至少一种的水平升高。在一些实施方案中，所述组合物通过瘤内或静脉内注射或者瘤内和静脉内注射的同时或顺序组合来给予。在一些实施方案中，所述肿瘤是黑素瘤、结肠癌、乳腺癌或前列腺癌。在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种免疫检查点阻断剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点阻断剂选自：CTLA-4、CD80、CD86、PD-1、PDL1、PDL2、LAG3、B7-H3、B7-H4、TIM3、ICOS、II DLBCL抑制剂、BTLA、伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、皮地利珠单抗(pidilizumab)、AMP-224、MPDL3280A、BMS-936559、MED14736、MSB 00107180及其任何组合。
[0018] 在一方面，本公开文本提供了一种用于治疗有需要的受试者的实体瘤的方法，所述方法包括将包含有效量的包含C7L基因的破坏的工程化的牛痘病毒(VACV)株(VACVΔC7L)和/或基因工程化以表达hFlt3L的VACVΔC7L病毒(VACVΔC7L-hFlt3L)的组合物递送至肿瘤。在一些实施方案中，所述破坏包含C7L基因的缺失。在一些实施方案中，治疗包含以下中的一种或多种：在所述受试者体内诱导针对所述肿瘤的免疫应答或者在所述受试者体内增强或促进针对所述肿瘤的正在进行的免疫应答、减小所述肿瘤的大小、根除所述肿瘤、抑制所述肿瘤的生长、抑制所述肿瘤的转移性生长、诱导肿瘤细胞的凋亡或延长所述受试者的存活期。在一些实施方案中，所述免疫应答的诱导、增强或促进包含以下中的一种或多种：(i)与感染相应的野生型毒株的树突细胞和THP-1细胞相比，树突细胞和THP-1细胞中干扰素β(IFNB)表达的水平升高；(ii)与感染相应的野生型毒株的树突细胞相比，树突细胞中TBK1和IRF3磷酸化的水平升高；(iii)与感染相应的野生型毒株的树突细胞相比，树突细胞中ISG表达的水平升高；以及(iv)与感染相应的野生型毒株的肿瘤细胞相比，肿瘤细胞中IFNB、CCL4、CCL5和CXCL10中的至少一种的水平升高。在一些实施方案中，所述组合物通过瘤内或静脉内注射或者瘤内和静脉内注射的同时或顺序组合来给予。在一些实施方案中，所述肿瘤是黑素瘤、结肠癌、乳腺癌或前列腺癌。在一些实施方案中，所述组合物还包含一种或多种免疫检查点阻断剂。在一些实施方案中，所述免疫检查点阻断剂选自：CTLA-4、CD80、CD86、PD-1、PDL1、PDL2、LAG3、B7-H3、B7-H4、TIM3、ICOS、II DLBCL抑制剂、BTLA、伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、皮地利珠单抗、AMP-224、MPDL3280A、BMS-936559、MED14736、MSB 00107180及其任何组合。
[0019] 在一方面，本公开文本提供了一种刺激免疫应答的方法，其包括向受试者给予包含工程化的改良安卡拉牛痘(MVA)病毒株的免疫原性组合物，所述工程化的改良安卡拉牛痘(MVA)病毒株包含C7L基因的破坏。
[0020] 在一方面，本公开文本提供了一种刺激免疫应答的方法，其包括向受试者给予包含工程化的减毒牛痘病毒(VACV)株的免疫原性组合物，所述工程化的减毒牛痘病毒(VACV)株包含C7L基因的破坏。附图说明
[0021] 图1A-1D是数据的一系列图形表示，其显示牛痘C7抑制STING、TBK1或IRF3介导的5
IFNB基因表达。图1A：将24孔板中的HEK293T细胞(2x 10)用表达IFNB-luc报告物、STING、如所指示的C7L的质粒转染。转染后24h进行双萤光素酶测定。通过将在IFNB启动子下的萤火虫萤光素酶活性相对于来自对照质粒pRL-TK的海肾萤光素酶活性归一化，以任意单位表示相对萤光素酶活性。通过将相对萤光素酶活性除以背景水平来计算诱导倍数。数据是均
5
值±SEM(n＝3)。图1B-1D：将HEK293T细胞(2x 10)用表达TBK1、IRF3或IRF3-5D的质粒(表达或不表达渐增量的C7(10、50或250ng))转染。IRF3-5D是磷酸化活性突变型IRF3。数据是均值±SEM(n＝3)。(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，t检验)。
IFNB基因表达。图1A：将24孔板中的HEK293T细胞(2x 10)用表达IFNB-luc报告物、STING、如所指示的C7L的质粒转染。转染后24h进行双萤光素酶测定。通过将在IFNB启动子下的萤火虫萤光素酶活性相对于来自对照质粒pRL-TK的海肾萤光素酶活性归一化，以任意单位表示相对萤光素酶活性。通过将相对萤光素酶活性除以背景水平来计算诱导倍数。数据是均
5
值±SEM(n＝3)。图1B-1D：将HEK293T细胞(2x 10)用表达TBK1、IRF3或IRF3-5D的质粒(表达或不表达渐增量的C7(10、50或250ng))转染。IRF3-5D是磷酸化活性突变型IRF3。数据是均值±SEM(n＝3)。(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，t检验)。
[0022] 图1E和1F是显示牛痘C7与转录因子IRF3相互作用的印迹。将HEK293T细胞单独地或组合地用Flag标记的人IRF3或C7L共转染。图1E：将全细胞裂解物(WCL)用抗Flag和抗C7抗体印迹。图1F：将全细胞裂解物用抗C7抗体免疫沉淀(IP：抗C7)，并且用抗Flag抗体免疫印迹。
[0023] 图2A-2C是数据的一系列图形表示，其显示牛痘C7抑制聚IC/TLR3和TRIF介导的INFB启动子激活。图2A：将HEK293T细胞(2x 105)用表达TLR3、IFN-β-luc报告物的质粒和渐增量的C7表达质粒(10、50或250ng)转染。24h后，将细胞用聚IC(5μg/ml)处理。聚IC处理后24h测定萤光素酶活性。数据是均值±SEM(n＝3)。图2B：将HEK293T细胞(2x 105)用表达TRIF、IFNB-luc报告物和渐增量的C7(10、50或250ng)的质粒转染。转染后24h进行双萤光素酶测定。数据是均值±SEM(n＝3)。图2C：将HEK293T细胞(2x 105)用表达MAVS、IFNB-luc报告物和渐增量的C7(10、50或250ng)的质粒转染。转染后24h进行双萤光素酶测定。数据是均值±SEM(n＝3)。(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，t检验)。
[0024] 图3A-3D是数据的一系列图形表示，其显示巨噬细胞中牛痘C7的过表达抑制通过多种刺激物诱导的IFNB基因表达。将表达C7或具有空载体(EV)的RAW264.7稳定细胞系(2x 6
10)分别用仙台病毒(SeV)(10HA单位/ml)感染，或用聚IC(5μg/ml)转染(图3A)，或用热灭活的MVA(H-MVA)(相当于10的MOI)处理，或用ISD(10μg/ml)转染(图3B)。24h后，通过定量实时PCR测量IFNB基因表达水平。图3C-3D：将表达C7或具有空载体的THP-1稳定细胞系(2x
106)用(PMA；20ng/ml)分化3天，然后按(图3A-3B)处理。数据是均值±SEM(n＝3)。(**P<
0.01；***P<0.001，t检验)。
10)分别用仙台病毒(SeV)(10HA单位/ml)感染，或用聚IC(5μg/ml)转染(图3A)，或用热灭活的MVA(H-MVA)(相当于10的MOI)处理，或用ISD(10μg/ml)转染(图3B)。24h后，通过定量实时PCR测量IFNB基因表达水平。图3C-3D：将表达C7或具有空载体的THP-1稳定细胞系(2x
106)用(PMA；20ng/ml)分化3天，然后按(图3A-3B)处理。数据是均值±SEM(n＝3)。(**P<
0.01；***P<0.001，t检验)。
[0025] 图4A是在质粒DNA pC7L-GFP载体和MVA病毒基因组DNA之间在C7基因基因座处的同源重组的示意图。使用pC7L-GFP质粒将在牛痘合成早期和晚期启动子(PsE/L)控制下的特定目的基因(SG)(如人Flt3L(hFlt3L))插入C7L基因座中。在这种情况下，将在牛痘p7.5启动子控制下的GFP用作选择标记。将表达盒两侧侧接C7L基因侧翼区域(C7-L和C7-R)的部分序列。图4B示出了表达GFP的MVAΔC7L病毒的噬斑纯化。将BHK21细胞(1x 106)用MVA以0.2的MOI感染。感染1-2h后，将细胞用pC7L-GFP与lipofectamine2000转染。在质粒DNA和MVA基因组DNA的C7L基因座处发生的同源重组导致将GFP表达盒插入MVA基因组DNAC7基因座中，以从MVA基因组中缺失整个C7L基因，并且导致重组病毒MVAΔC7L的产生。将重组病毒基于GFP表达富集，并且将GFP+噬斑纯化4-5轮，直到获得所需的重组病毒而不污染MVA。图
4C提供了重组病毒MVAΔC7L的PCR验证。重组病毒的PCR分析证明成功产生了MVAΔC7L。将病毒基因组DNA通过PCR分析以验证C7L的缺失。
4C提供了重组病毒MVAΔC7L的PCR验证。重组病毒的PCR分析证明成功产生了MVAΔC7L。将病毒基因组DNA通过PCR分析以验证C7L的缺失。
[0026] 图5A-5D是数据的一系列图形表示，其显示与MVA相比，MVAΔC7L在骨髓衍生的树突细胞(BMDC)和THP-1细胞中诱导更强的先天免疫应答。将1x 106个BMDC(图5A)或THP-1(图5C)用MVA或MVAΔC7L以10的MOI感染。在指定的时间点，进行IFNB mRNA的定量实时PCR分析。数据是均值±SEM(n＝3)。图5B：与(图5A)相同，将BMDC用WT VACV、MVA或MVAΔC7L以10的MOI感染。在感染后22h收集上清液。通过ELISA确定IFN-β的浓度。数据是均值±SEM(n＝3)。图5D：将BMDC(1x 106)用MVA或MVAΔC7L以10的MOI感染。在感染后2、4和8h收集细胞。
使用抗磷酸-TBK1、抗TBK1、IRF3的抗磷酸丝氨酸-396和抗IRF3进行Western印迹分析。将β-肌动蛋白用作上样对照。
使用抗磷酸-TBK1、抗TBK1、IRF3的抗磷酸丝氨酸-396和抗IRF3进行Western印迹分析。将β-肌动蛋白用作上样对照。
[0027] 图6A-6B是数据的一系列图形表示，其显示牛痘C7减弱I型IFN诱导的JAK-STAT信号传导途径。图6A：牛痘ORF(C1L-C10L)抑制I型IFN诱导的干扰素刺激应答元件(ISRE)活性的能力的筛选。将HEK293T细胞(2x 105)用表达ISRE-luc报告物的质粒和对照质粒pRL-TK以及如所指示的牛痘ORF(C1L-C10L)转染，所述ISRE-luc报告物在ISRE一旦被激活时即表达萤火虫萤光素酶，并且所述对照质粒pRL-TK在ISRE一旦被激活时即表达海肾萤光素酶。转染后24h，将细胞用人IFN-β以1000U/ml的终浓度处理。IFN-β处理后24h进行双萤光素酶测定。通过将萤火虫萤光素酶活性相对于海肾萤光素酶活性归一化，以任意单位表示相对萤光素酶活性。数据是均值±SEM(n＝3)。(**P<0.01，t检验)。图6B：按图6A进行条件和分析，不同的是将HEK293T细胞用渐增量的含有C7L基因的质粒(10、50或250ng)转染。数据是均值±SEM(n＝3)。(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001，t检验)。
[0028] 图7A和7B是数据的一系列图形表示，其显示HEK293T和鼠巨噬细胞中牛痘C7的过表达抑制I型IFN诱导的ISG15基因表达。将表达C7或具有空载体的HEK293T(图7A)或RAW264.7(图7B)稳定细胞系(1x 106)用人(图7A)或鼠(图7B)IFN-β以1000U/ml的终浓度处理16h。通过定量实时PCR测量ISG15 mRNA水平。数据是均值±SEM(n＝3)。(***P<0.001，t检验)。
[0029] 图8A和8B是数据的一系列图形表示，其显示与MVA相比，MVAΔC7L在BMDC中诱导更高水平的干扰素刺激基因(ISG)表达。将BMDC(1x 106)用MVA或MVAΔC7L以10的MOI感染。感染后12和24h，收获细胞并且进行ISG15(图8A)或Mx1(图8B)mRNA的定量实时PCR分析。数据是均值±SEM(n＝3)。(***P<0.001，t检验)。
[0030] 图9A和9B是数据的一系列图形表示，其显示MVAΔC7L无法表达C7蛋白并且不能抑制IFN-β诱导的STAT2磷酸化。(A)将HeLa细胞(2x 105)用MVA或MVAΔC7L以10的MOI感染。在感染后4和12h收集细胞。使用抗C7抗体进行Western印迹分析。将GAPDH用作上样对照。(B)在用鼠IFN-β以1000U/ml的终浓度处理指定的时间之前，将TBK1-/-MEF用MVA或MVAΔC7L以10的MOI感染6h。使用抗pSTAT2或抗C7抗体进行Western印迹分析。将GAPDH用作上样对照。
[0031] 图10A和10B是数据的一系列图形表示，其显示牛痘C7蛋白与STAT2相互作用。将HEK293T细胞(1.5x 107)用2.5μg的Flag标记的人STAT1或STAT2与HA标记的C7共转染，然后用人IFN-β以1000U/ml的终浓度处理或假处理45min。图10A示出了使用抗FLAG和抗HA抗体的全细胞裂解物(WCL)的western印迹，证明了在转染细胞中STAT1或STAT2和C7-HA的表达。将β-肌动蛋白用作上样对照。用抗HA抗体免疫沉淀全细胞裂解物后，然后用抗Flag抗体探测与C7-HA蛋白相互作用的蛋白质。图10B示出了使用抗Flag抗体的抗HA免疫沉淀物的western印迹，证明通过抗C7-HA从全细胞裂解物中仅下拉了Flag标记的STAT2。
[0032] 图11A和11B示出了重组病毒VACVΔC7L的PCR分析，证明从牛痘基因组成功缺失了C7基因。使用pC7L-GFP质粒将特定目的基因插入C7基因座中。在这种情况下，将在牛痘p7.56
启动子控制下的GFP用作选择标记(图4A)。将BSC40细胞(1x 10)用MVA以0.2的MOI感染。感染1-2h后，将细胞用pC7-GFP与lipofectamine 2000转染。在质粒DNA和VACV基因组DNA的C7L基因座处发生的同源重组导致将GFP表达盒插入VACV基因组DNAC7基因座中，以从VACV基因组中缺失整个C7L基因，并且导致重组病毒VACVΔC7L的产生。通过PCR分析病毒基因组DNA。图11A显示在VACVΔC7L病毒中，从VACV基因组中缺失了C7基因。在感染WT VACV或VACVΔC7L的HeLa细胞中进行Western印迹分析。图11B显示牛痘C7蛋白未由VACVΔC7L感染的细胞表达。
启动子控制下的GFP用作选择标记(图4A)。将BSC40细胞(1x 10)用MVA以0.2的MOI感染。感染1-2h后，将细胞用pC7-GFP与lipofectamine 2000转染。在质粒DNA和VACV基因组DNA的C7L基因座处发生的同源重组导致将GFP表达盒插入VACV基因组DNAC7基因座中，以从VACV基因组中缺失整个C7L基因，并且导致重组病毒VACVΔC7L的产生。通过PCR分析病毒基因组DNA。图11A显示在VACVΔC7L病毒中，从VACV基因组中缺失了C7基因。在感染WT VACV或VACVΔC7L的HeLa细胞中进行Western印迹分析。图11B显示牛痘C7蛋白未由VACVΔC7L感染的细胞表达。
[0033] 图12A和12B是图像和图形表示，其显示VACVΔC7L具有比WT VACV小的噬斑大小，并且对IFN抑制更敏感。图12A示出了WT VACV和VACVΔC7L在感染前用人IFN-β以1000U/ml的终浓度预处理或假处理12h的BSC40细胞(非洲绿猴肾细胞系)上的噬斑测定。左上角显示了基于病毒滴度的每个孔中预期的噬斑形成单位(pfu)。初次接种后，在将细胞用结晶紫染料染色之前，如所指示，将细胞用或不用人IFN-b以1000U/ml的终浓度继续接种48h。图12B是在存在或不存在人IFN-β的情况下WT VACV和VACVΔC7L的多步生长曲线。将BSC40细胞用人IFN-β以1000U/ml的终浓度预处理或假处理12h。然后，如所指示，在存在或不存在IFN-β的情况下，将细胞用WT VACV或VACVΔC7L以0.05的MOI感染。在指定的时间收集感染的细胞，并且通过在BSC40细胞上的噬斑测定来确定病毒滴度。
[0034] 图13A-13D是数据的一系列图形表示，其显示在鼠鼻内感染模型中VACVΔC7L被高度减毒。图13A是在WT C57BL/6J小鼠中用WT VACV以渐增的剂量(包括2x 103、2x 104、2x 105或2x 106个噬斑形成单位(PFU))鼻内感染后随天数变化的初始重量％的图。图13B是感染渐增剂量的WT VACV的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。每组中n＝10。图13C是在WT C57BL/6J小鼠中用VACVΔC7L以渐增的剂量(包括2x 105、2x 106或2x 107PFU)鼻内感染后随天数变化的初始重量％的图。图13D是感染渐增剂量的VACVΔC7L的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。每组中n＝10。
[0035] 图14A-14D是数据的图形表示，其显示WT VACV在Sting缺陷型(STINGGt/Gt)小鼠中获得了毒力，然而在鼠鼻内感染模型中VACVΔC7L在STINGGt/Gt小鼠中仍然没有致病性。图Gt/Gt 514A是在STING 小鼠和WT年龄匹配的C57BL/6J对照中用WT VACV以2x 10PFU鼻内感染后随天数变化的初始重量％的图。图14B是感染WT VACV的STINGGt/Gt和WT小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。每组中n＝6。图14C是在STINGGt/Gt小鼠和WT年龄匹配的C57BL/6J对照中用VACVΔC7L以2x 105PFU鼻内感染后随天数变化的初始重量％的图。图14D是感染VACVΔC7L的STINGGt/Gt和WT小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。每组中n＝10。
[0036] 图15A-15B是数据的图形表示，其显示WT和STINGGt/Gt小鼠在VACVΔC7L感染中均存活，发展了针对致死性WT VACV感染的抗病毒免疫。图15A是在用WT VACV以2x 106PFU攻击的用VACVΔC7L感染中存活的STINGGt/Gt和WT小鼠鼻内感染后随天数变化的初始重量％的图。将从未感染VACVΔC7L的初试小鼠也用WT VACV以相同剂量攻击。图15B是STINGGt/Gt和WT小鼠的Kaplan-Meier存活曲线，所述小鼠最初感染VACVΔC7L并且在VACVΔC7L感染中存6
活，然后用WT VACV以2x 10PFU攻击。
活，然后用WT VACV以2x 10PFU攻击。
[0037] 图16A-16G是数据的图形表示，其显示在鼠鼻内感染模型中在STAT2-/-或IFNAR1-/-小鼠中，VACVΔC7L病毒获得了毒力。图16A是在STAT2-/-、IFNAR1-/-、MDA5-/-小鼠和WT年龄匹配的C57BL/6J对照中用VACVΔC7L以2x 107pfu鼻内感染后随天数变化的初始重量％的图。-/- -/- -/-
图16B是感染VACVΔC7L病毒的STAT2 、IFNAR1 、MDA5 小鼠和WT对照小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。每组中n＝5。图16C是感染后4h收获的每克组织的病毒滴度(Log pfu)的图。每组中n＝3。图16D是在STAT2-/-小鼠中用VACVΔC7L以2x 102、2x103、2x 104或2x
105pfu鼻内感染后随天数变化的初始重量％的图。图16E是用VACVΔC7L以2x 102、2x 103、
4 5 -/-
2x 10或2x 10pfu病毒感染的STAT2 的Kaplan-Meier存活曲线。每组中n＝5。图16F是在IFNAR1-/-小鼠中用VACVΔC7L以2x 102、2x 103或2x 105pfu鼻内感染后随天数变化的初始重量％的图。图16G是用VACVΔC7L以2x 102、2x 103或2x 105pfu病毒感染的STAT2-/-的Kaplan-Meier存活曲线。每组中n＝5。
图16B是感染VACVΔC7L病毒的STAT2 、IFNAR1 、MDA5 小鼠和WT对照小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。每组中n＝5。图16C是感染后4h收获的每克组织的病毒滴度(Log pfu)的图。每组中n＝3。图16D是在STAT2-/-小鼠中用VACVΔC7L以2x 102、2x103、2x 104或2x
105pfu鼻内感染后随天数变化的初始重量％的图。图16E是用VACVΔC7L以2x 102、2x 103、
4 5 -/-
2x 10或2x 10pfu病毒感染的STAT2 的Kaplan-Meier存活曲线。每组中n＝5。图16F是在IFNAR1-/-小鼠中用VACVΔC7L以2x 102、2x 103或2x 105pfu鼻内感染后随天数变化的初始重量％的图。图16G是用VACVΔC7L以2x 102、2x 103或2x 105pfu病毒感染的STAT2-/-的Kaplan-Meier存活曲线。每组中n＝5。
[0038] 图17A-17B是数据的图形表示，其显示在鼠鼻内感染模型中在MDA5-/-STINGGt/Gt小鼠中，VACVΔC7L病毒获得了毒力。图17A：在STINGGt/Gt、MDA5-/-STINGGt/Gt小鼠和WT年龄匹配的C57BL/6J对照中用VACVΔC7L以2x 107pfu鼻内感染后随天数变化的初始重量％。图17B：感染VACVΔC7L病毒的STINGGt/Gt、MDA5-/-STINGGt/Gt小鼠和WT对照的Kaplan-Meier存活曲线。每组中n＝5。
[0039] 图18A-18M是数据的图形表示，其显示VACVΔC7L感染导致树突细胞(DC)、嗜中性粒细胞、CD8+和CD4+T细胞流入被感染的肺的支气管肺泡腔中。将C57BL/6J小鼠用WT VACV以2x 105pfu或用VACVΔC7L以2x 107pfu鼻内感染。在感染后3和6天收集BALF。通过FACS分析细胞。图18A：在支气管肺泡灌洗液(BAL)中Siglec F+CD11c+肺泡巨噬细胞的点状图；图18B：
在BAL中肺泡巨噬细胞占CD45+细胞的百分比；图18C：在BAL中肺泡巨噬细胞的绝对数量。图
18D：感染后第3天和第6天在BAL中CD11c+MHC-IIhi常规树突细胞(cDC)的点状图；图18E：在BAL中cDC占CD45+细胞的百分比；图18F：在BAL中cDC的绝对数量。图18G：感染后第3天和第6天在BAL中Ly6G+Ly6C+嗜中性粒细胞的点状图；图18H：在BAL中Ly6G+Ly6C+嗜中性粒细胞占+ + +
CD45细胞的百分比；图18I：在BAL中Ly6GLy6C嗜中性粒细胞的绝对数量。图18J：感染后第
6天在BAL中CD8+T细胞的点状图；图18K：在BAL中CD8+T细胞占CD45+细胞的百分比和CD8+T细胞的绝对数量。图18L：感染后第6天在BAL中CD4+T细胞的点状图；图18M：在BAL中CD4+T细胞占CD45+细胞的百分比和CD4+T细胞的绝对数量。
在BAL中肺泡巨噬细胞占CD45+细胞的百分比；图18C：在BAL中肺泡巨噬细胞的绝对数量。图
18D：感染后第3天和第6天在BAL中CD11c+MHC-IIhi常规树突细胞(cDC)的点状图；图18E：在BAL中cDC占CD45+细胞的百分比；图18F：在BAL中cDC的绝对数量。图18G：感染后第3天和第6天在BAL中Ly6G+Ly6C+嗜中性粒细胞的点状图；图18H：在BAL中Ly6G+Ly6C+嗜中性粒细胞占+ + +
CD45细胞的百分比；图18I：在BAL中Ly6GLy6C嗜中性粒细胞的绝对数量。图18J：感染后第
6天在BAL中CD8+T细胞的点状图；图18K：在BAL中CD8+T细胞占CD45+细胞的百分比和CD8+T细胞的绝对数量。图18L：感染后第6天在BAL中CD4+T细胞的点状图；图18M：在BAL中CD4+T细胞占CD45+细胞的百分比和CD4+T细胞的绝对数量。
[0040] 图19A-19B是数据的图形表示，其显示在STAT2-/-或IFNAR1-/-小鼠中，VACVΔC7L诱导的CD8+T细胞募集减少。图19A：在WT、STAT2-/-或IFNAR-/-小鼠中，用PBS假感染或用VACVΔC7L(2x 105pfu)感染后第6天，在BAL中CD8+T细胞的点状图。图19B：在感染后第6天，在BAL中CD8+T细胞占CD45+细胞的百分比。
[0041] 图20A-20B是数据的图形表示，其显示鼻内感染VACVΔC7L导致CD8+和CD4+T细胞募集进入肺实质中。将WT C57BL6/J小鼠用WT VACV或用VACVΔC7L以2x 105pfu感染。在感染后第6天收集肺并且用胶原酶D消化。将单细胞悬浮液用抗CD45、抗CD3、抗CD4和抗CD8抗体染色，并且通过FACS分析。图20A：感染后第6天在肺中CD8+T细胞的点状图；在肺中CD8+T细胞占CD45+细胞的百分比。图20B：感染后第6天在肺中CD4+T细胞的点状图；在肺中CD4+T细胞占CD45+细胞的百分比。
[0042] 图21A-21B是数据的图形表示，其显示鼻内感染VACVΔC7L导致牛痘病毒B8R特异性CD8+T细胞的产生并且募集进入肺和支气管肺泡腔中。将WTC57BL6/J小鼠用WT VACV或用VACVΔC7L以2x 105pfu鼻内感染。感染后5天收集BAL和肺。收集肺并且用胶原酶D消化。将单细胞悬浮液在布雷菲德菌素A(5μg/ml)的存在下与SIINFEKL(SEQ ID NO:7)或TS YKFESV(SEQID NO:8)肽脉冲的BMDC一起孵育6h，然后用抗CD45、抗CD3、抗CD8和抗IFN-γ抗体染色，并且通过FACS分析。
[0043] 图22A-22B是数据的图形表示，其显示宿主防御急性VACVΔC7L鼻内感染不需要CD8+T细胞。将WT C57BL6/J小鼠用VACVΔC7L以2x 107pfu鼻内感染。在病毒感染前1天和感+染后1、3和5天，腹膜内注射200μg的抗CD8耗竭抗体(克隆2.43.BioXCell)。图22A是鼻内感染VACVΔC7L后随天数变化的初始重量％的图。图22B是感染VACVΔC7L的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。每组中n＝5。
[0044] 图23A-23B是数据的图形表示，其显示鼻内感染VACVΔC7L导致IFN-β、促炎细胞因子和趋化因子释放到支气管肺泡腔中。将C57BL/6J小鼠用WTVACV以2x 105pfu或用VACVΔC7L以2x 107pfu鼻内感染。在感染后1和3天收集BAL。图23A是通过ELISA确定的BAL中IFN-β的浓度。图23B是通过Luminex分析(Cytokine 20-Plex Mouse Panel，ThermoFisher)确定的BAL中的细胞因子和趋化因子概况。
[0045] 图24提供了数据的图形表示，其显示在IFNβ/YFP报告小鼠中，VACVΔC7L感染诱导从II型肺泡上皮细胞(AECII)产生IFN-β。将IFNβ/YFP报告小鼠或WT C57BL/6J WT对照用VACVΔC7L鼻内感染(每只小鼠2x 107pfu)。48h后，收集肺，并且在将肺切成小块之前，在室温下为其输注在低熔点琼脂糖(1％)中的分散酶(1U/ml)持续30min。产生单细胞悬浮液并且通过FACS分析。右上方显示的是来自WT和IFNβ/YFP报告小鼠的肺中的CD45+细胞。右中间显示的是来自WT和IFNβ/YFP报告小鼠的肺中的CD45-细胞。右下方显示的是来自WT和IFNβ/YFP报告小鼠的肺中的CD45-CD31-Tla-细胞(不包括CD31+内皮细胞和Tla+I型AEC)。
[0046] 图25A-25D是数据的图形表示，其显示VACVΔC7L感染诱导从肺II型肺泡上皮细胞(ACEII)产生IFN-β、CCL4和CCL5。图25A：将谱系阴性的上皮干/祖细胞(LNEP)定义为CD45-- - - hi +CD16CD32CD31EpCAM CD104细胞，将其经FACS分选用于体外培养。图25B：将LNEP在角质形成细胞生长因子的存在下在基质胶包被平板上生长培养4天后，在分化的原代肺II型肺泡上皮细胞(AEC)中对SPC(表面活性剂C)进行免疫荧光染色。图25C：在WT VACV或VACVΔC7L感染(以10的MOI)12h后，在原代肺II型AEC中的IFNB、CCL4和CCL5的RT-PCR分析。图25D：
在WT VACV或VACVΔC7L感染24h后，来自原代肺II型AEC上清液的IFN-β、CCL4和CCL5的ELISA分析。
在WT VACV或VACVΔC7L感染24h后，来自原代肺II型AEC上清液的IFN-β、CCL4和CCL5的ELISA分析。
[0047] 图26A-26B是数据的图形表示，其显示IFN-β的鼻内施用使小鼠免于致死性VACV感染。将WT C57BL6/J小鼠用WT VACV以2x 106pfu鼻内感染。12h后，为小鼠鼻内注射1μg重组小鼠IFN-β。图26A是鼻内感染WT VACV后随天数变化的初始重量％的图。图26B是感染WT VACV的小鼠的Kaplan-Meier存活曲线。每组中n＝5。
[0048] 图27A-D是数据的图形表示，其显示在B16-F10黑素瘤细胞中，MVAΔC7L是比MVA更强的先天免疫应答诱导剂。将B16-F10细胞用MVA或MVAΔC7L以10的MOI感染，并且在感染后8和48h收集细胞。示出了Ifnb(图27A)、Ccl4(图27B)、Ccl5(图27C)、Cxcl10(图27D)基因表达的定量实时PCR分析。
[0049] 图28A-D是数据的图形表示，其显示在双侧B16-F10肿瘤植入模型中瘤内注射MVAΔC7L比MVA更有效。图28A是B16-F10双侧肿瘤植入模型的肿瘤植入和处理方案。简言之，将B16-F10黑素瘤细胞皮内植入C57B/6J小鼠的左右侧腹(右侧腹5x 105，左侧腹1x 105)。肿瘤植入后8天，我们将2x 107pfu的MVA或MVAΔC7L瘤内注射进右侧腹较大的肿瘤内。每周两次测量肿瘤大小并且注射肿瘤。监测小鼠的存活。图28B是用PBS、MVA或MVAΔC7L处理的荷瘤小鼠的Kaplan-Meier存活曲线图(n＝10，*P<0.05；***P<0.001；Mantel-Cox检验)。图28C和28D是数据的图形表示，其示出了在注射PBS、MVA或MVAΔC7L之后随天数变化的注射的(图
28C)和未注射的(图28D)肿瘤的体积。
28C)和未注射的(图28D)肿瘤的体积。
[0050] 图29A-D是数据的图形表示，其显示与MVA相比，瘤内注射MVAΔC7L诱导更强的CD8+和CD4+免疫应答。图29A是在用MVA、MVAΔC7L或PBS处理的小鼠的注射的肿瘤中，肿瘤浸润的淋巴细胞的FACS分析图。示出了在用PBS(n＝4)或MVA(n＝4)或MVAΔC7L(n＝5)处理的小鼠的注射的肿瘤内颗粒酶B+CD8+T细胞、颗粒酶B+CD4+T细胞的百分比、CD8+/Treg的比率(*P<0.05；****P<0.0001，t检验)。图29B是FACS分析数据的图，其示出了在用PBS(n＝4)或MVA(n＝4)或MVAΔC7L(n＝5)处理的小鼠的未注射的肿瘤内颗粒酶B+CD8+T细胞、颗粒酶B+CD4+T细胞的百分比、CD8+/Treg的比率(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001，t检验)。
图29C是FACS数据的图，其示出了在用PBS(n＝4)或MVA(n＝4)或MVAΔC7L(n＝5)处理的小鼠的TDLN中的酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)四聚体阳性CD8+T细胞。图29D是FACS数据的图，其示出了在用PBS(n＝4)或MVA(n＝4)或MVAΔC7L(n＝5)处理的小鼠的非引流LN中的TRP-2四聚体阳性CD8+T细胞(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。
图29C是FACS数据的图，其示出了在用PBS(n＝4)或MVA(n＝4)或MVAΔC7L(n＝5)处理的小鼠的TDLN中的酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2)四聚体阳性CD8+T细胞。图29D是FACS数据的图，其示出了在用PBS(n＝4)或MVA(n＝4)或MVAΔC7L(n＝5)处理的小鼠的非引流LN中的TRP-2四聚体阳性CD8+T细胞(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001)。
[0051] 图30A-C是显示重组MVAΔC7L-hFlt3L产生的数据的图形表示。图30A：显示通过在C7侧翼序列(C6L和C8L)进行同源重组产生MVAΔC7L-hFlt3L重组病毒的示意图。简言之，插入侧接C6和C8序列的具有在牛痘p7.5启动子控制下的GFP和在牛痘合成早期和晚期启动子(PsE/L)控制下的hFlt3L基因的单个盒，以替换MVA基因组中的C7基因。图30B：用于扩增插入物的引物和重组病毒的PCR验证。图30C：在CEF和BHK21细胞中MVAΔC7L-hFlt3L的复制曲线。将细胞用MVAΔC7L-hFlt3L以0.05的MOI感染，并且在感染后1、24、36、48和72h收集细胞。在BHK21细胞上通过滴定来确定病毒滴度。通过比较感染后72h的病毒滴度与感染后1h的病毒滴度来计算变化倍数。
[0052] 图31.通过MVAΔC7L-hFlt3L-GFP感染的细胞表达hFlt3L。将细胞用MVAΔC7L-GFP或MVAΔC7L-hFlt3L-GFP以10的MOI感染细胞，并且在感染后24h收集细胞。使用抗hFlt3L抗体通过FACS分析评估hFlt3L表达。
具体实施方式
[0053] 应当理解，为了提供对本发明技术的实质性理解，在各个细节层次上描述了本发明技术的某些方面、模式、实施方案、变型和特征。
[0054] I.定义
[0056] 如在本说明书和所附权利要求书中所用，单数形式“一种/一个”(“a”)、“一种/一个”(“an”)和“所述”(“the”)包括复数指示物，除非上下文另外明确说明。例如，提及“一个细胞”包括两个或更多个细胞的组合等。
[0057] 如本文所用，术语“约”涵盖可能在测量中发生的并且对于熟练技术人员而言清楚的实验误差范围。
[0058] 如本文所用，如与病毒结合使用的“减毒的”是指病毒与非减毒的对应物相比具有降低的毒力或致病性，但是仍是有活力的或存活的。通常，与非减毒的病毒相比，减毒使致病因子(如病毒)对受感染的对象具有较小的危害或毒力。这与被杀死的病毒或完全灭活的病毒形成对照。
[0059] 如本文所用，“联合给予”是指与MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L组合地给予第二治疗方法。例如，与MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L在时间上非常接近地给予免疫检查点阻断剂。例如，可以与MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L同时(如上所述，当瘤内地或全身地给予MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L时，通过静脉内或瘤内注射)或者在MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L给予之前或之后，给予PD-1/PDL-1抑制剂和/或CTLA4抑制剂(在更具体的实施方案中，抗体)。在一些实施方案中，如果MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L给予和免疫检查点阻断剂给予的间隔为1-7天或甚至间隔长达三周，这将仍在如本文所述的“在时间上非常接近地”，因此这样的给予将被视为“联合的”。
[0060] 在本文使用术语“相应的野生型毒株”以指代衍生出工程化的MVA或VACV毒株的野生型MVA或牛痘病毒(VACV)株。如本文所用，野生型MVA或VACV毒株是尚未被工程化以破坏或缺失(敲除)C7基因的毒株。工程化的MVA或VACV毒株可能已经过修饰以破坏或缺失(敲除)C7基因。
[0061] 如本文所用，术语“递送”意指使本公开文本的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L沉积在肿瘤微环境中，无论这是通过向肿瘤局部给予(瘤内)还是通过例如静脉内途径完成的。所述术语侧重于到达肿瘤本身的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L。在一些实施方案中，“递送”与给予是同义的，但是记住它与特定的给予地点一起使用(例如，瘤内)。
[0062] 术语“破坏”和“突变”在本文中可互换使用，以指代在遗传物质中可检测到且可遗传的变化。突变可以包括插入、缺失、取代(例如，转换、颠换)、转座、倒位、敲除及其组合。突变可能仅涉及单个核苷酸(例如，点突变或单核苷酸多态性)或多个核苷酸。在一些实施方案中，突变是沉默的，即未检测到突变的表型效应。在其他实施方案中，突变导致表型变化，例如，改变编码产物的表达水平，或者改变编码产物本身。在一些实施方案中，与野生型毒株相比，破坏或突变可能会产生基因产物(例如，蛋白质或RNA)表达水平降低的破坏的基因。在其他实施方案中，与野生型毒株表达的蛋白质的活性相比，破坏或突变可能导致表达的蛋白质具有较低的活性。
[0063] 如本文所用，“有效量”或“治疗有效量”是指足够量的药剂，当以一个或多个剂量并且持续一段时间给予时，其足以在缓解、治愈或减轻疾病方面提供所需的生物学结果。在本公开文本中，MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的有效量是(当持续合适的时间段并且以合适的频率给予时)减少癌细胞数量；或减小肿瘤大小或根除肿瘤；或抑制(即，减慢或停止)癌细胞向外周器官的浸润；抑制(即，减慢或停止)转移性生长；抑制(稳定或阻止)肿瘤生长；允许治疗肿瘤；和/或诱导和促进针对肿瘤的免疫应答的量。根据本公开文本，本领域普通技术人员可以使用常规实验来确定在任何个别情况下的适当的治疗量。这种确定将开始于在体外发现有效的量和在动物中发现有效的量。治疗有效量将首先基于发现对培养细胞赋予益处的一种或多种浓度来确定。有效量可以从细胞培养物内的数据推断出来，并且可以基于诸如本文详述的因素上调或下调。尽管可以给予更低或更高的剂量，病毒构建体的有效量通常在约105至约1010个噬斑形成单位(pfu)的范围6 9
内。在一些实施方案中，剂量是约10-10pfu。在一些实施方案中，单位剂量以在从1到10ml范围内的体积来给予。根据所使用的特定pfu滴定方法，pfu与病毒颗粒的等效性可能有所不同。通常，pfu等于约5至100个病毒颗粒。能以一个或多个分剂量持续规定的时间段并且以规定的给予频率来给予治疗有效量的带有hFlt3L转基因的病毒。例如，根据本公开文本的带有hFlt3L的病毒的治疗有效量可以根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别、体重和一般状况以及病毒构建体在特定受试者体内针对特定癌症引起所需免疫应答的效力等因素而变化。
内。在一些实施方案中，剂量是约10-10pfu。在一些实施方案中，单位剂量以在从1到10ml范围内的体积来给予。根据所使用的特定pfu滴定方法，pfu与病毒颗粒的等效性可能有所不同。通常，pfu等于约5至100个病毒颗粒。能以一个或多个分剂量持续规定的时间段并且以规定的给予频率来给予治疗有效量的带有hFlt3L转基因的病毒。例如，根据本公开文本的带有hFlt3L的病毒的治疗有效量可以根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别、体重和一般状况以及病毒构建体在特定受试者体内针对特定癌症引起所需免疫应答的效力等因素而变化。
[0064] 特别提及本文公开的基于病毒的免疫刺激剂，“有效量”或“治疗有效量”是指包含MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的组合物的如下量，其足以减少、抑制或消除肿瘤细胞的生长，从而减少或根除肿瘤，或者其足以抑制、减少或消除体外、离体或受试者体内的转移扩散，或者其足以引起和促进针对肿瘤的免疫应答，所述免疫应答视情况而定最终将导致转移扩散的减少、抑制和/或消除中的一种或多种。肿瘤细胞生长的减少、抑制或根除可能是坏死、细胞凋亡或免疫应答或前述两种或更多种的组合的结果(然而，例如细胞凋亡的沉淀可能不是由于与溶瘤病毒观察到的相同因素)。在治疗上有效的量可以取决于诸如组合物中使用的特定病毒、被治疗受试者的年龄和状况、肿瘤形成的程度、存在或不存在其他治疗方法等因素而变化。类似地，待给予的组合物的剂量及其给予的频率将取决于多种因素，如活性成分的效力、给予后其活性持续时间、给予途径、受试者的体型、年龄、性别和身体状况、不良反应的风险以及医师的判断。以多种剂型(如可注射溶液)给予组合物。
[0065] 特别提及与免疫检查点抑制剂的组合疗法，免疫检查点阻断剂的“有效量”或“治疗有效量”意指免疫检查点阻断剂的足以逆转或减少肿瘤微环境中的免疫抑制作用以及足以激活或增强被治疗的受试者的宿主免疫的量。免疫检查点阻断剂包括但不限于针对CD28抑制剂的抑制性抗体如CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞抗原4)(例如，伊匹单抗)、抗PD-1(程序性死亡1)抑制性抗体(例如，纳武单抗、派姆单抗、皮地利珠单抗、拉姆布罗力珠单抗(lambrolizumab))和抗PD-L1(程序性死亡配体1)抑制性抗体(MPDL3280A、BMS-936559、MEDI4736、MSB 00107180)以及针对LAG-3(淋巴细胞激活基因3)、TIM3(T细胞免疫球蛋白和粘蛋白3)、B7-H3和TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)的抑制性抗体。由于已经完成了一些给药临床试验，因此前述的剂量范围是已知的或容易地在本领域技术范围内的，从而外推到其他可能的药剂。
[0066] 在一些实施方案中，肿瘤表达特定的检查点，但是在本发明的上下文中，这并不是严格必要的，因为免疫检查点阻断剂更通常地阻断由肿瘤细胞、基质细胞和肿瘤浸润的免疫细胞引起的肿瘤内的免疫抑制机制。
[0067] 例如，当在黑素瘤中作为手术后的辅助疗法给予时，CTLA4抑制剂伊匹单抗在90分钟内以1-2mg/mL给予，每三周的总输注量为3mg/kg，共4剂。这种疗法通常伴随着严重的甚至危及生命的免疫介导的不良反应，这限制了耐受剂量以及可以给予的累积量。预期当将伊匹单抗与MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L联合给予时，可以降低伊匹单抗的剂量和/或累积量。具体而言，根据下文所述的实验结果，预期如果向肿瘤直接联合给予CTLA4抑制剂与一种或两种前述MVA病毒，则可以进一步降低CTLA4抑制剂的剂量。因此，上文为伊匹单抗提供的量可以是用于确定联合给予时待给予患者的特定剂量和累积量的起点。
[0068] 作为另一个例子，开具派姆单抗的处方为作为黑素瘤的辅助疗法稀释至25mg/mL给予。每三周在30分钟内以2mg/kg的剂量给药。这可以是用于确定在MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的联合给予中剂量和给予的起点。
[0069] 纳武单抗也可以作为确定与MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L组合给予的检查点抑制剂的剂量和给予方案的起点。开具纳武单抗的处方为每2周在60分钟内以3mg/kg作为静脉输注给予。
[0070] 免疫刺激剂(如激动剂抗体)也已被探究作为癌症的免疫疗法。例如，抗ICOS抗体与ICOS的胞外域结合，从而导致ICOS信号传导激活和T细胞激活。抗OX40抗体可以与OX40结合并且增强T细胞受体信号传导，从而导致T细胞激活、增殖和存活。其他例子包括针对4-1BB(CD137)、GITR的激动剂抗体。
[0071] 免疫刺激性激动剂抗体可以与MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的瘤内注射组合地全身地使用。可替代地，免疫刺激性激动剂抗体可以经由瘤内递送同时地或顺序地与MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L联合使用。
[0072] 在本文使用术语“工程化的”以指代生物体已经被操纵以在基因上改变、修饰或变化，例如通过破坏基因组。例如，“工程化的牛痘病毒株”或“工程化的改良安卡拉牛痘病毒”是指已经被操纵以在基因上改变、修饰或变化的牛痘或改良安卡拉牛痘毒株。
[0073] 在本文使用术语“基因盒”以指代编码并且能够表达一个或多个目的基因(例如，hFlt3L、可选择标记或其组合)的DNA序列，其可以在DNA序列的一个或多个选定的限制位点之间插入。在一些实施方案中，插入基因盒会产生破坏的基因。在一些实施方案中，基因的破坏涉及用基因盒替换至少一部分基因，所述基因盒包括编码目的基因(例如，hFlt3L、可选择标记或其组合)的核苷酸序列。
[0074] 如本文所用，“免疫检查点抑制剂”或“免疫检查点阻断剂”或“免疫检查点阻断抑制剂”是指完全或部分降低、抑制、干扰或调节一种或多种检查点蛋白活性的分子。检查点蛋白调节T细胞激活或功能。检查点蛋白包括但不限于CD28受体家族成员CTLA-4及其配体CD80和CD86；PD-1及其配体PD-L1和PD-L2；LAG3、B7-H3、B7-H4、TIM3、ICOS、II DLBCL、BTLA或前述两种或更多种的任何组合。预期本文所用的非限制性例子包括伊匹单抗、纳武单抗、派姆单抗、皮地利珠单抗、AMP-224、MPDL3280A、BMS-936559、MEDI4736、MSB 00107180或其任何组合。
[0075] 如本文所用，“免疫应答”是指淋巴细胞、抗原呈递细胞、吞噬细胞、粒细胞和由以上细胞或肝产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)中的一种或多种的如下作用，其导致选择性损毁、破坏或消除人体的癌性细胞、转移性肿瘤细胞等。免疫应答可以包括细胞应答(如T细胞应答)，其是细胞即T细胞功能的改变(调节，例如显著增强、刺激、激活、损害或抑制)。T细胞应答可以包括特定类型的T细胞或T细胞亚群(例如，效应CD4+、CD4++ +辅助、效应CD8、CD8细胞毒性或自然杀伤(NK)细胞)的产生、增殖或扩增或刺激。可以通过检测一种或多种细胞受体或细胞表面分子(例如，CD或分化分子簇)来鉴定此类T细胞亚群。
T细胞应答还可以包括影响其他细胞的分化或增殖的细胞因子(如可溶性介体(例如，细胞因子、淋巴因子、细胞因子结合蛋白或白细胞介素))的表达改变(统计上显著的增加或减少)。例如，I型干扰素(IFN-α/β)是先天免疫的关键调节剂(Huber等人Immunology132(4):
466-474(2011))。动物和人类研究已经显示了IFN-α/β在抗原识别和抗肿瘤免疫应答的初始阶段期间直接影响CD4+和CD8+T细胞的命运的作用。响应于树突细胞的激活而诱导I型IFN，这进而是先天免疫系统的前哨。免疫应答还可以包括体液(抗体)应答。
T细胞应答还可以包括影响其他细胞的分化或增殖的细胞因子(如可溶性介体(例如，细胞因子、淋巴因子、细胞因子结合蛋白或白细胞介素))的表达改变(统计上显著的增加或减少)。例如，I型干扰素(IFN-α/β)是先天免疫的关键调节剂(Huber等人Immunology132(4):
466-474(2011))。动物和人类研究已经显示了IFN-α/β在抗原识别和抗肿瘤免疫应答的初始阶段期间直接影响CD4+和CD8+T细胞的命运的作用。响应于树突细胞的激活而诱导I型IFN，这进而是先天免疫系统的前哨。免疫应答还可以包括体液(抗体)应答。
[0076] 在本文使用术语“免疫原性组合物”以指代将在已经暴露于组合物的哺乳动物中引起免疫应答的组合物。在一些实施方案中，免疫原性组合物包含单独的或与免疫检查点阻断抑制剂组合的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和/或VACVΔC7L-hFlt3L。
[0077] “敲除的基因”或“基因缺失”是指包括无效突变的基因(例如，通过基因编码的野生型产物不表达，表达水平低至无作用，或是无功能的)。在一些实施方案中，敲除的基因包括基因本身的异源序列或基因工程化的无功能序列，这使得基因无功能。在其他实施方案中，敲除的基因缺少一部分野生型基因。例如，在一些实施方案中，缺失了至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％或至少约60％的野生型基因序列。在其他实施方案中，敲除的基因缺少至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约100％的野生型基因序列。在其他实施方案中，敲除的基因可能包括多达100％的野生型基因序列(例如，可能缺失野生型基因序列的一些部分)，但是也包括插入其中的一个或多个异源和/或无功能核酸序列。
[0078] 在本文使用术语“MVAΔC7L”以指代如下改良安卡拉牛痘(MVA)突变型病毒或包含所述病毒的疫苗，在其中C7基因不表达，表达水平低至无作用，或表达的蛋白质无功能(例如，是无效突变)。如本文所用，“MVAΔC7L”涵盖不表达功能性C7蛋白的重组MVA病毒。在一些实施方案中，ΔC7L突变体包括代替全部或大部分C7L基因序列的异源核酸序列。例如，如本文所用，“MVAΔC7L”涵盖重组MVA核酸序列，其中将对应于MVA基因组中C7的位置(例如，SEQ ID NO:2的位置18,407至18,859)的核酸序列用包含编码特定目的基因(SG)的开放阅读框的异源核酸序列替换，所述目的基因是如人Fms样酪氨酸激酶3配体(hFlt3L)(“MVAΔC7L-hFlt3L”)。在一些实施方案中，异源核酸序列还包含编码可选择标记的开放阅读框。在一些实施方案中，可选择标记是GFP蛋白。如本文所用，“MVAΔC7L”意指缺少功能性C7L基因且具有感染性但无复制性的MVA缺失突变体，并且其逃避宿主免疫系统的能力进一步受损。在本文使用术语“VACVΔC7L”以指代如下牛痘突变型病毒或包含所述病毒的疫苗，在其中C7基因不表达，表达水平低至无作用，或表达的蛋白质无功能(例如，是无效突变)。如本文所用，“VACVΔC7L”涵盖不表达功能性C7蛋白的重组牛痘病毒(VACV)。在一些实施方案中，牛痘病毒衍生自Western Reserve(WR)毒株。在一些实施方案中，ΔC7L突变体包括代替全部或大部分C7L基因序列的异源序列。例如，如本文所用，“VACVΔC7L”涵盖重组牛痘病毒核酸序列，其中将对应于VACV基因组中C7的位置(例如，SEQ ID NO:1的位置15,716至16,168)的核酸序列用包含编码特定目的基因(SG)的开放阅读框的异源核酸序列替换，所述目的基因是如人Fms样酪氨酸激酶3配体(hFlt3L)基因(“VACVΔC7L-hFlt3L”)。在一些实施方案中，异源核酸序列还包含编码可选择标记的开放阅读框。在一些实施方案中，可选择标记是GFP蛋白。
[0079] 如本文所用，“转移”是指癌症从其原发部位扩散到体内的相邻组织或远端位置。癌细胞(包括癌症干细胞)可以脱离原发性肿瘤，穿透淋巴管和血管，在血流中循环，并且在体内其他部位的正常组织中生长。转移是一个顺序过程，取决于肿瘤细胞(或癌症干细胞)从原发性肿瘤中脱落、穿过血流或淋巴管并且在远端部位停止。一旦到达另一个部位，癌细胞就会重新穿透血管或淋巴管壁，继续繁殖并且最终形成新的肿瘤(转移性肿瘤)。在一些实施方案中，将这种新的肿瘤称为转移性(或继发性)肿瘤。
[0080] 如本文所用，“MVA”意指“改良安卡拉牛痘”，并且是指衍生自安卡拉毒株并且开发用作疫苗和疫苗佐剂的牛痘的高度减毒的毒株。通过连续传代鸡胚细胞从野生型安卡拉毒株中分离出原始的MVA。如此处理后，它失去了约15％的野生型牛痘基因组，包括其在灵长类动物(包括人)细胞中有效复制的能力。(Mayr等人,Zentralbl Bakteriol B 167,375-390(1978))。天花疫苗接种株MVA：标记，遗传结构，肠胃外疫苗接种获得的经验以及在防御机制减弱的生物体中的行为。MVA被认为是适合作为重组载体开发的候选物，用于针对传染性疾病或肿瘤的基因或疫苗接种递送。(Verheust等人,Vaccine30(16),2623-2632(2012))。MVA具有长度为178kb的基因组并且其序列首先公开于Antoine等人,Virol.244(2):365-396(1998)。序列还公开于Genbank U94848.1(SEQ ID NO:2)。临床级MVA可从丹麦的Bavarian Nordic A/S Kvistgaard商购和公开获得。此外，MVA可从马里兰州罗克维尔的ATCC和法国巴黎的CMCN(巴斯德国家微生物研究所(Institut Pasteur Collection Nationale des Microorganismes))获得。
[0081] 如本文所用，“溶瘤病毒”是指优先感染癌细胞，在此类细胞中复制并且通过其复制过程诱导癌细胞裂解的病毒。天然存在的溶瘤病毒的非限制性例子包括水泡性口炎病毒、呼肠孤病毒以及工程化以具有肿瘤选择性的病毒，如腺病毒、新城疫病毒和单纯疱疹病毒(参见例如，Nemunaitis,J.Invest New Drugs.17(4):375-86(1999)；Kirn,DH等人Nat Rev Cancer.9(1):64-71(2009)；Kirn等人Nat.Med.7:781(2001)；Coffey等人Science282:1332(1998))。牛痘病毒感染许多类型的细胞，但是由于肿瘤细胞具有促进复制的新陈代谢，展现出某些途径的激活(其也有利于复制)并且创造出逃避先天免疫系统的环境的事实，因此优先在肿瘤细胞中复制。
[0082] 如本文所用，当在治疗性物质或组合物的给予的背景下使用时，“肠胃外”包括除通过消化道给予以外的任何给予途径。与本文公开的方法特别相关的是静脉内(包括例如通过肝门静脉进行肝递送)、瘤内或鞘内给予。
[0083] 如本文所用，“药学上可接受的载体和/或稀释剂”或“药学上可接受的赋形剂”包括但不限于任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。此类介质和试剂用于生物学活性物质的用途是本领域熟知的。下文提供了赋形剂的进一步细节。补充活性成分(如抗微生物剂，例如抗真菌剂)也可以掺入组合物中。
[0084] 如本文所用，“药学上可接受的赋形剂”是指当给予动物或人时不产生不利、过敏或其他不良反应的物质和组合物。如本文所用，所述术语包括所有惰性的、无毒的、液体或固体的填充剂或稀释剂(只要它们不以不适当的负面方式与本发明的治疗性物质反应)、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、防腐剂等，例如液体药物载体(例如，无菌水、盐水、糖溶液、Tris缓冲液、乙醇和/或某些油)。
[0085] 如本文所用，障碍或病症的“预防”(“prevention”、“prevent”或“preventing”)是指如下一种或多种化合物，其在统计学样品中，相对于未治疗的对照样品降低所治疗样品中的障碍或病症的发生率，或者相对于未治疗的对照样品延迟障碍或病症的一种或多种症状的发作。
[0086] 如本文所用，“实体瘤”是指除血液系统癌症(如淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤)以外的所有肿瘤性细胞生长和增殖以及所有癌前和癌性细胞和组织。实体瘤的例子包括但不限于：软组织肉瘤如纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤和其他骨瘤(例如，骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、肾母细胞瘤(Wilms’tumor)、宫颈癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、脑/CNS肿瘤(例如，星形胶质细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、儿童肿瘤如非典型畸胎瘤/横纹肌样瘤、生殖细胞瘤、胚胎瘤、室管膜瘤)、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。本公开文本的组合物和方法将有用的一些最常见的实体瘤包括：头颈癌、直肠腺癌、神经胶质瘤、成神经管细胞瘤、尿路上皮癌、胰腺癌、子宫(例如，子宫内膜癌、输卵管癌)卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、非小细胞肺癌(鳞状和腺癌)、小细胞肺癌、黑素瘤、乳腺癌、导管原位癌、肾细胞癌和肝细胞癌、肾上腺肿瘤(例如，肾上腺皮质癌)、食道癌、眼癌(例如，黑素瘤、视网膜母细胞瘤)、胆囊癌、胃肠道癌、肾母细胞瘤、心癌、头颈癌、喉癌和下咽癌、口腔癌(例如，嘴、口、唾液腺)、鼻咽癌、神经母细胞瘤、腹膜癌、垂体癌、卡波西肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、小肠癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、阴道肿瘤和前述任一种的转移瘤。
[0087] 如本文所用，术语“受试者”、“个体”或“患者”可以是个体生物体、脊椎动物、哺乳动物或人。在一些实施方案中，“受试者”意指可能患有癌症并且当由此痛苦时需要治疗的任何动物(哺乳动物、人或其他)患者。
[0088] 如本文所用，“协同治疗效果”是指由至少两种药剂的组合产生，并且超过原本由单独给予药剂产生的治疗效果的大于累加的治疗效果。例如，较低剂量的一种或多种药剂可以用于治疗疾病或障碍，从而导致治疗功效增加和副作用降低。
[0089] 如本文所用的“治疗”(“treating”、“treat”、“treated”或“treatment”)涵盖治疗受试者(如人)的本文所述的疾病或障碍，并且包括：(i)抑制疾病或障碍，即阻止其发展；(ii)缓解疾病或障碍，即引起障碍的消退；(iii)减缓障碍的进展；和/或(iv)抑制、缓解或减缓疾病或障碍的一种或多种症状的进展。
[0090] 还应当理解，所述的医学疾病和病症的各种治疗或预防模式旨在意指“实质性的”，其包括完全的以及少于完全的治疗或预防，并且其中实现一些生物学或医学上相关的结果。
[0091] 如本文所用，“肿瘤免疫”是指肿瘤逃避免疫系统的识别和清除的一个或多个过程。因此，作为治疗概念，当减轻或消除这种逃避时，“治疗”肿瘤免疫，并且肿瘤被免疫系统识别并且攻击(后者在本文中称为“抗肿瘤免疫”)。肿瘤识别的一个例子是肿瘤结合，并且肿瘤攻击的例子是肿瘤减小(数量、大小或二者)和肿瘤清除。
[0092] 如本文所用，“T细胞”是指胸腺衍生的淋巴细胞，其参与多种细胞介导的适应性免疫反应。
[0093] 如本文所用，“辅助T细胞”是指CD4+T细胞；辅助T细胞识别与MHC II类分子结合的抗原。辅助T细胞至少有两种类型，Th1和Th2，它们产生不同的细胞因子。
[0094] 如本文所用，“细胞毒性T细胞”是指通常在其表面带有CD8分子标记(CD8+)并且通过破坏在其表面具有特异性抗原分子的靶T细胞而在细胞介导的免疫中起作用的T细胞。细胞毒性T细胞还会释放颗粒酶，一种丝氨酸蛋白酶，它可以经由穿孔素形成的孔进入靶T细胞并且诱导细胞凋亡(细胞死亡)。颗粒酶作为细胞毒性表型的标记。细胞毒性T细胞的其他名称包括CTL、细胞溶解性T细胞、细胞溶解性T淋巴细胞、杀伤性T细胞或杀伤性T淋巴细胞。细胞毒性T细胞的靶标可以包括病毒感染的细胞、被细菌或原生动物寄生虫感染的细胞或癌细胞。大多数细胞毒性T细胞在其细胞表面具有CD8蛋白存在。CD8被吸引到I类MHC分子部分。通常，细胞毒性T细胞是CD8+细胞。
[0095] 如本文所用，“肿瘤浸润的白细胞”是指患有癌症(如黑素瘤)的受试者的如下白细胞，其驻留于循环中或以其他方式已经离开循环(血液或淋巴液)并且已经迁移到肿瘤中。
[0096] 如本文所用，“载体”包括当与适当的控制元件结合时能够复制并且可以在细胞之间转移基因序列的任何遗传元件，如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、人工染色体、病毒、病毒体等。因此，所述术语包括克隆和表达运载体以及病毒载体。在一些实施方案中，预期有用的载体是待转录的核酸区段位于启动子的转录控制下的那些载体。“启动子”是指被细胞的合成机器或引入的合成机器识别的启动基因的特异性转录所需的DNA序列。短语“可操作地定位”、“可操作地连接”、“在控制之下”或“在转录控制之下”意指启动子相对于核酸而言处于正确的位置和方向，以控制基因的RNA聚合酶的启动和表达。术语“表达载体或构建体”意指含有核酸的任何类型的遗传构建体，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。在一些实施方案中，表达包括核酸的转录，例如以从转录的基因产生生物学活性多肽产物或抑制性RNA(例如，shRNA、miRNA)。在SEQ ID NO:4中显示了根据本发明技术的pCB-C7L-GFP载体的非限制性例子。
[0097] 在本文使用术语“毒力”以指代病原体引起疾病的相对能力。在本文使用术语“减弱的毒力”或“降低的毒力”以指代病原体引起疾病的相对能力降低。
[0098] II.免疫系统和癌症
[0099] 恶性肿瘤固有地对常规疗法具有抗性，并且提出了重大的治疗挑战。免疫疗法已经成为一个不断发展的研究领域，并且是治疗某些类型的癌症的另外的选择。免疫疗法方法所基于的基本原理是可以刺激免疫系统以识别肿瘤细胞，并且靶向它们进行破坏。
[0100] 大量研究支持在癌症进展中免疫系统组成部分差异存在的重要性(Jochems等人,Exp Biol Med,236(5):567-579(2011))。临床数据表明，高密度的肿瘤浸润的淋巴细胞与改善的临床结果相联系(Mlecnik等人,Cancer Metastasis Rev.；30:5-12,(2011))。在多种类型的癌症中已经报道了在强大的淋巴细胞浸润和患者存活期之间的相关性，所述癌症包括黑素瘤、卵巢癌、头颈癌、乳腺癌、尿路上皮癌、结直肠癌、肺癌、肝细胞癌、胆囊癌和食道癌(Angell等人,Current Opinion in Immunology,25:1-7,(2013))。肿瘤免疫浸润物包括巨噬细胞、树突细胞(DC)、单核细胞、嗜中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞、幼稚和记忆淋巴细胞、B细胞和效应T细胞(T淋巴细胞)，主要负责识别肿瘤细胞表达的抗原和随后通过细胞毒性T细胞破坏肿瘤细胞。
[0101] 尽管通过癌细胞呈递抗原，并且存在可能对肿瘤细胞潜在发生反应的免疫细胞，但是在许多情况下，免疫系统未被激活或肯定地被抑制。此现象的关键是肿瘤通过迫使免疫系统的细胞抑制免疫系统的其他细胞来保护自身免受免疫应答影响的能力。肿瘤发展出许多免疫调节机制来逃避抗肿瘤免疫应答。例如，肿瘤细胞分泌免疫抑制性细胞因子(如TGF-β)或者在肿瘤病变中诱导免疫细胞(如CD4+T调节性细胞和巨噬细胞)分泌这些细胞因子。肿瘤还具有使CD4+T细胞偏向表达调节表型的能力。总的结果是T细胞应答受损和细胞凋亡诱导受损或CD8+细胞毒性T细胞的抗肿瘤免疫能力降低。此外，MHC I类在肿瘤细胞表面的肿瘤相关表达改变使它们对免疫应答“不可见”(Garrido等人Cancer Immunol.Immunother.59(10),1601-1606(2010))。抑制抗原呈递功能和树突细胞(DC)此外有助于逃避抗肿瘤免疫(Gerlini等人Am.J.Pathol.165(6),1853-1863(2004))。
[0102] 此外，肿瘤微环境的局部免疫抑制性质以及免疫编辑可以导致不表达靶抗原的癌细胞亚群逃逸。因此，找到能促进免疫系统的抗肿瘤活性的保存和/或恢复的方法将具有重大的治疗益处。
[0103] 免疫检查点已经牵涉肿瘤介导的抗肿瘤免疫的下调，并且用作治疗靶标。已经证明T细胞功能障碍与抑制性受体CTLA-4和程序性死亡1多肽(PD-1)(CD28受体家族的成员)的诱导表达同时发生。PD-1是CD28受体家族的抑制性成员，所述家族除了PD-1外还包括CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。然而，尽管抗CTLA-4(伊匹单抗)和抗PD-1药物(例如，派姆单抗和纳武单抗)的临床使用、甚至监管审批强调了关于在黑素瘤的治疗中免疫疗法的使用的承诺，但是患者对这些免疫疗法的反应有限。专注于阻断T细胞中的这些抑制性信号(例如，CTLA-4、PD-1和PD-1的配体PD-L1)的临床试验显示，逆转T细胞抑制对于成功的免疫疗法至关重要(Sharma等人,Science 348(6230),56-61(2015)；Topalian等人,Curr Opin Immunol.24(2),202-217(2012))。这些观察结果强调了需要开发利用免疫系统对抗癌症的新型治疗方法。
[0104] III.痘病毒
[0105] 痘病毒(如工程化的牛痘病毒)在转移癌的溶瘤疗法方面处于最前沿(Kirn等人,Nature Review Cancer 9,64-71(2009))。牛痘病毒是大的DNA病毒，其具有快速的生命周期和到远端组织的有效血源性播散(Moss,在Fields Virology(Lippincott Williams&Wilkins,2007),第2905-2946页)。痘病毒非常适合作为在癌细胞中表达多个转基因并且因此增强治疗功效的载体(Breitbach等人,Current pharmaceutical biotechnology 13,1768-1772(2012))。临床前研究和临床试验已经证明了使用溶瘤性牛痘病毒和其他痘病毒用于治疗传统疗法难以治疗的晚期癌症的功效(Park等人,Lacent Oncol 9,533-542(2008)；Kirn等人,PLoS Med 4,e353(2007)；Thorne等人,J Clin Invest117,3350-3358(2007))。基于痘病毒的溶瘤疗法的优势在于通过细胞裂解、细胞凋亡和坏死的组合杀死癌细胞。它还会触发先天免疫传感途径，这促进免疫细胞向肿瘤的募集和抗肿瘤适应性免疫应答的形成。目前处于临床试验的溶瘤性牛痘毒株(例如JX-594)是复制性毒株。它们使用如下野生型牛痘，其具有胸苷激酶的缺失以增强肿瘤选择性，并且具有转基因(如粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))的表达以刺激免疫应答(Breitbach等人,Curr Pharm Biotechnol 13,1768-1772(2012))。然而，许多研究显示，野生型牛痘对抗原呈递细胞(APC)具有免疫抑制作用(Engelmayer等人,J Immunol 163,6762-6768(1999)；Jenne等人,Gene therapy 7,1575-1583(2000)；P.Li等人,J Immunol 175,6481-6488(2005)；Deng等人,J Virol 80,9977-9987(2006))，并且因此增加了肿瘤本身的免疫抑制和免疫逃避作用。
[0106] 牛痘病毒(Western Reserve毒株；WR)基因组序列在SEQ ID NO:1中列出，并且由GenBank登录号AY243312.1给出。
[0107] IV.改良安卡拉牛痘(MVA)
[0108] 改良安卡拉牛痘(MVA)病毒是痘病毒科中正痘病毒属的成员。MVA是通过在牛痘病毒的安卡拉毒株(CVA)的鸡胚成纤维细胞(CEF)上连续进行大约570次传代而产生的(Mayr等人,Infection 3,6-14(1975))。这些长期传代的结果是，所得的MVA病毒含有大量的基因组缺失，并且宿主细胞高度限于禽类细胞(Meyer等人,J.Gen.Virol.72,1031-1038(1991))。在各种动物模型中都显示出所得的MVA是显著无毒性的(Mayr等人,Dev.Biol.Stand.41,225-34(1978))。
[0109] MVA的安全性和免疫原性已经在临床试验中进行了广泛的测试和记录，特别是针对人类天花病。这些研究包括超过120,000名个体，并且已经证明在人中具有出色的功效和安全性。此外，与其他基于牛痘的疫苗相比，MVA具有减弱的毒力(传染性)，同时其触发良好的特异性免疫应答。因此，由于诱导特异性免疫应答的能力，已经将MVA建立为安全的疫苗载体。
[0110] 由于上述特征，MVA成为了开发工程化的MVA载体(用于重组基因表达和疫苗)的有吸引力的候选物。作为疫苗载体，已经针对多种病理病症对MVA进行了研究，所述病理病症包括HIV、结核病和疟疾以及癌症(Sutter等人,Curr Drug Targets Infect Disord 3:263-271(2003)；Gomez等人,Curr Gene Ther 8:97-120(2008))。
[0111] 已经证明，人单核细胞衍生的树突细胞(DC)的MVA感染会导致DC激活，其特征在于共刺激分子的上调和促炎细胞因子的分泌(Drillien等人,J Gen Virol 85:2167-2175(2004))。在此方面，MVA与标准野生型牛痘病毒(WT-VAC)不同，后者无法激活DC。树突细胞可以分为两种主要的亚型：常规树突细胞(cDC)和浆细胞样树突细胞(pDC)。前者(特别是CD103+/CD8α+亚型)特别适合将抗原交叉呈递至T细胞；后者是I型IFN的强大生产者。
[0112] 人细胞的病毒感染导致由I型干扰素(尤其是干扰素-α(α))介导的先天免疫应答(第一道防线)的激活。这通常会导致免疫学“级联”的激活，激活的T细胞(CTL和辅助细胞)的募集和增殖，并且最终产生抗体。然而，病毒表达抑制宿主免疫应答的因子。MVA是比WT-VAC更好的免疫原，并且在哺乳动物细胞中复制能力很差。(参见例如，Brandler等人,J.Virol.84,5314-5328(2010))。
[0113] 然而，MVA不是完全无复制性的，并且含有一些残留的免疫抑制活性。然而，已经显示出MVA可延长所治疗受试者的存活期。
[0114] MVA基因组序列在SEQ ID NO:2中列出，并且由GenBank登录号U94848.1给出。
[0115] V.牛痘病毒C7蛋白和具有C7缺失的MVA(MVAΔC7L)
[0116] 牛痘病毒C7蛋白是在哺乳动物细胞中牛痘病毒的生命周期的重要宿主范围因子。在几乎所有感染哺乳动物宿主的痘病毒中都存在C7L同源物。宿主范围基因C7L和K1L二者的缺失使得病毒不能在人细胞中复制(Perkus等人,Virology,1990)。当敲除SAMD9时，缺乏K1L和C7L二者的突变型病毒获得了在人HeLa细胞中复制的能力(Sivan等人,mbio,2015)。
已经发现K1和C7二者均与SAMD9相互作用(Sivan等人,mbio,2015)。IRF1的过表达导致C7L和K1L双缺失的牛痘病毒的宿主限制性(Meng等人Journal of Virology,2012)。C7和K1二者在体外均与SAMD9相互作用(Sivan等人,mbio,2015)。C7是否直接调节IFN的产生或信号传导尚不清楚。I型IFN在病毒感染的宿主防御中起重要作用，但是，C7在IFN途径的免疫调节中的作用尚不清楚。
已经发现K1和C7二者均与SAMD9相互作用(Sivan等人,mbio,2015)。IRF1的过表达导致C7L和K1L双缺失的牛痘病毒的宿主限制性(Meng等人Journal of Virology,2012)。C7和K1二者在体外均与SAMD9相互作用(Sivan等人,mbio,2015)。C7是否直接调节IFN的产生或信号传导尚不清楚。I型IFN在病毒感染的宿主防御中起重要作用，但是，C7在IFN途径的免疫调节中的作用尚不清楚。
[0117] 不希望受理论的束缚，据信牛痘C7是I型IFN诱导和IFN信号传导的抑制剂。TANK结合激酶1(TBK1)是丝氨酸/苏氨酸激酶，其在诱导对各种病原体相关分子模式(PAMP)(包括核酸)的先天免疫应答中起关键作用。一方面，RIG-I样受体(如RIG-I和MDA5，其分别检测5'三磷酸RNA和dsRNA)与线粒体蛋白质IPS-1或MAVS相互作用，从而导致TBK1的激活和磷酸化。内体dsRNA与Toll样受体3(TLR3)结合，这导致TRIF和TRAF3的募集以及TBK1的激活。另一方面，胞质DNA可以通过胞质DNA传感器环状GMP-AMP合酶(cGAS)检测，这导致环状GMP-AMP(cGAMP)的产生。cGAMP进而与内质网(ER)定位衔接子STING结合，从而导致TBK1的募集和激活。TBK1磷酸化转录因子IRF3，其易位至细胞核以激活IFNB基因表达。不希望受理论的束缚，据信C7抑制通过多种刺激进行的IFNB诱导，所述刺激物包括RNA病毒、DNA病毒、聚(I:C)、免疫刺激DNA(ISD)。C7可能在TBK1/IRF3复合物水平上发挥其抑制作用。一旦被分泌，I型IFN就与IFNAR结合，这导致JAK/STAT信号传导途径的激活。磷酸化的STAT1和STAT2易位至细胞核，在其中它们与IRF9一起激活IFN刺激基因(ISG)的表达。不希望受理论的束缚，据信除了具有抑制IFNB诱导的能力外，C7还可以通过其与STAT2的相互作用来阻断IFNAR信号传导，从而防止IFN-β诱导的STAT2磷酸化。不希望受理论的束缚，据信牛痘C7具有I型IFN产生和信号传导的双重抑制作用。如本文所述，从WT牛痘缺失C7L(VACVΔC7L)导致病毒的减毒，并且从MVA缺失C7L(MVAΔC7L)导致与MVA相比免疫刺激功能的增强。
[0118] 在一方面，本公开文本证明异位C7表达阻断STING、TBK1或IRF3诱导的IFNB和ISRE(干扰素刺激应答元件)启动子激活。在另一方面，本公开文本显示过表达C7的鼠或人巨噬细胞细胞系对DNA或RNA刺激物或者DNA或RNA病毒感染具有减弱的先天免疫应答。在一些实施方案中，C7的过表达也减弱由IFN-β处理诱导的ISG基因表达。在一些实施方案中，具有C7L缺失的MVA(MVAΔC7L)感染cDC比MVA诱导更高水平的I型IFN。在一些实施方案中，C7经由阻止Stat2磷酸化来阻断IFN-β诱导的Janus激酶/信号转导蛋白和转录激活子(JAK/STAT)信号传导途径。通过举例的方式而是通过限制的方式，如共免疫沉淀研究所证明，显示C7与Stat2直接相互作用。
[0119] 下文提供了由GenBank登录号AAB96405.1(SEQ ID NO:3)给出的说明性全长牛痘病毒C7宿主范围蛋白。
[0120] 1 mgiqhefdii ingdialrnl qlhkgdnygc klkiisndyk klkfrfiirp dwseidevkg[0121] 61 ltvfannyav kvnkvddtfy yviyeavihl ynkkteiliy sddenelfkh yypyislnmi[0122] 121 skkykvkeen ysspyiehpl ipyrdyesmd
[0123] VI.Fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)
[0124] 在1994年克隆出了人Flt3L(Fms样酪氨酸激酶3配体)，它是刺激骨髓细胞增殖的I型跨膜蛋白(Lyman等人,1994)。已经在多种临床前和临床环境中探究了hFlt3L的用途，所述临床前和临床环境包括干细胞动员以准备进行骨髓移植、癌症免疫疗法(如树突细胞的扩增)以及疫苗佐剂。已经在超过500名人类受试者中测试了重组人Flt3L(rhuFlt3L)并且其是具有生物活性的、安全的以及良好耐受的(Fong等人,1998；Maraskovsky等人,2000；Shackleton等人,2004；He等人,2014；Anandasabapathy等人,2015)。在理解生长因子Flt3L在DC子集(包括CD8α+/CD103+DC和pDC)的发育中的关键作用方面已经取得了很大的进展(McKenna等人,2000；Waskow等人,2008；Liu等人,2007；2009；Naik等人,2006；Ginhoux等人,2009)。
[0125] 自发交叉引发肿瘤抗原特异性CD8+T细胞需要CD103+/CD8α+DC(Hildner等人,2008；Ginhoux等人,2009；Zhang等人,2015；Spranger等人,2015)。Broz等人报道CD103+DC稀疏地存在于肿瘤内，并且它们与大量的肿瘤相关巨噬细胞竞争肿瘤抗原。CD103+DC能够独特地刺激幼稚以及激活的CD8+T细胞，并且对于过继性T细胞疗法的成功至关重要(Broz等人Cancer Cell,26(5):638-52,2014)。Spranger等人报道致癌性信号传导途径WNT/β-连环蛋白的激活导致肿瘤内CD103+DC和抗肿瘤T细胞的减少(Spranger等人,2015)。Flt3L培养的骨髓衍生的树突细胞(BMDC)的瘤内递送导致对抗CTLA-4和抗PD-L1免疫疗法的组合的反应性(Spranger等人,2015)。全身给予Flt3L(CD103+DC的生长因子)和瘤内注射聚I:C(TLR3激动剂)扩增并且激活了肿瘤内的CD103+DC群体，并且克服了鼠黑素瘤和MC38结肠癌模型中的免疫疗法抗性，或增强了对所述免疫疗法的反应性(Salmon等人,2016；Sanchez-Paulete等人,2016)。
[0126] 在各种实体瘤中肿瘤新抗原的最新发现指示，实体瘤带有通常因人而异的独特的新抗原(Castle等人,Cancer Res 72,1081-1091(2012)；Schumacher等人,Science 348,69-74(2015))。本文公开的重组病毒不通过表达肿瘤抗原发挥其活性。本发明的重组MVA病毒的瘤内递送允许肿瘤新抗原的有效交叉呈递和肿瘤内抗肿瘤适应性免疫的产生(并且还全身地扩展)，并且因此在产生针对肿瘤的免疫应答方面导致利用肿瘤分化抗原和通过肿瘤细胞表达的新抗原进行“原位癌症疫苗接种”。
[0127] 尽管肿瘤内存在通过体细胞突变产生的新抗原，但是肿瘤抗原特异性T细胞的功能通常受到多种抑制机制的约束(Mellman等人,Nature 480,480-489(2011))。例如，激活的T细胞上的细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)的上调可以与T细胞共刺激物CD28竞争，以与树突细胞(DC)上的CD80(B71)/CD86(B7.2)相互作用，从而抑制T细胞激活和增殖。CTLA-4也在调节性T(Treg)细胞上表达，并且在介导Treg的抑制功能中起重要作用(Wing等人,Science 322,271-275(2008)；Peggs等人,J Exp Med 206,1717-1725(2009))。另外，PD-L/PD-L2在肿瘤细胞上的表达可能导致CD28家族抑制性受体PD-1的激活，从而导致T细胞枯竭。利用针对抑制性受体(如CTLA-4和程序性死亡1多肽(PD-1))的抗体的免疫疗法在动物研究中显示出显著的临床前活性并且在患有转移性癌症的患者中显示出临床反应，并且已经获得FDA的批准用于转移性黑素瘤、非小细胞肺癌以及肾细胞癌的治疗(Leach等人,Science 271,1734-1746(1996)；Hodi等人,NEJM 363,711-723(2010)；Robert等人,NEJM 364,2517-2526(2011)；Topalian等人,Cancer Cell27,450-461(2012)；Sharma等人,Science 348(6230),56-61(2015))。
[0128] VII.黑素瘤
[0129] 黑素瘤(最致命的癌症之一)是美国和全球增长最快的癌症。在大多数情况下，晚期黑素瘤对常规疗法(包括化学疗法和放射)具有抗性。因此，患有转移性黑素瘤的人具有非常差的预后，预期寿命只有6到10个月。约50％的黑素瘤在BRAF(关键的促肿瘤基因)中具有突变的发现为这种疾病的靶向疗法打开了大门。使用BRAF抑制剂的早期临床试验显示，在有BRAF突变的黑素瘤患者中反应显著，但不幸的是无法持续。因此，迫切需要针对这些患者以及无BRAF突变的其他黑素瘤患者的替代治疗策略。
[0130] 人类病理学数据指示黑素瘤病变内T细胞浸润物的存在与更长的患者存活期正相关(Oble等人Cancer Immun.9,3(2009))。免疫系统在针对黑素瘤的保护中的重要性进一步得到了免疫疗法(如免疫激活剂IFN-α2b和IL-2)的部分成功的支持(Lacy等人Expert Rev Dermatol 7(1):51-68(2012))，并且进一步得到了患有转移性黑素瘤的患者对免疫检查点疗法(包括抗CTLA-4和抗PD-1/PD-L1，单独的药剂或组合疗法)的空前临床反应的支持(Sharma和Allison,Science 348(6230),56-61(2015)；Hodi等人,NEJM 363(8),711-723(2010)；Wolchok等人,Lancet Oncol.11(6),155-164(2010)；Topalian等人,NEJM 366(26),2443-2454(2012)；Wolchok等人,NEJM 369(2),122-133(2013)；Hamid等人,NEJM 369(2),134-144(2013)；Tumeh等人,Nature515(7528),568-571(2014))。然而，许多患者对仅免疫检查点阻断疗法无反应。
[0131] VIII.肿瘤免疫中的I型IFN和胞质DNA传感途径
[0132] I型IFN在宿主抗肿瘤免疫中起重要作用(Fuertes等人,Trends Immunol 34,67-73(2013))。IFNAR1缺陷型小鼠在植入肿瘤细胞后更容易患上肿瘤；自发的肿瘤特异性T细胞启动在IFNAR1缺陷型小鼠中也存在缺陷(Diamond等人,J Exp Med 208,1989-2003(2011)；Fuertes等人,J Exp Med 208,2005-2016(2011))。最近的研究显示，胞质DNA传感途径在肿瘤衍生的DNA的先天免疫传感中很重要，所述先天免疫传感导致抗肿瘤CD8+T细胞免疫的形成(Woo等人,Immunity 41,830-842(2014))。此途径在放射诱导的抗肿瘤免疫中也起作用(Deng等人,Immunity 41,843-852(2014))。尽管可以在患有癌症的患者体内检测到自发的抗肿瘤T细胞应答，但是在大多数患者体内癌症最终克服了宿主抗肿瘤免疫。改变肿瘤免疫抑制性微环境的新型策略将有益于癌症疗法。
[0133] IX.免疫应答
[0134] 除了通过上调特定的免疫系统活性(如抗体和/或细胞因子的产生、或细胞介导的免疫的激活)来诱导免疫应答外，免疫应答还可以包括抑制、减弱或任何其他下调可检测的免疫，以重建稳态并且防止对宿主自身器官和组织的过度伤害。在一些实施方案中，根据本公开文本的方法诱导的免疫应答产生效应CD8+(抗肿瘤细胞毒性CD8+)T细胞或激活的T辅助细胞或二者，它们可以直接或间接地导致肿瘤细胞死亡或肿瘤细胞丧失繁殖能力。
[0135] 可以通过检测多种熟知的免疫学参数中的任一种来确定通过本公开文本的组合物和方法对免疫应答的诱导(Takaoka等人,Cancer Sci.94:405-11(2003)；Nagorsen等人,Crit.Rev.Immunol.22:449-62(2002))。因此，可以通过许多熟知的测定(包括免疫测定)中的任一种来证实免疫应答的诱导。此类测定包括但不必限于体内、离体或体外确定可溶性免疫球蛋白或抗体、可溶性介体(如细胞因子、趋化因子、激素、生长因子等)以及其他可溶性小肽、碳水化合物、核苷酸和/或脂质介体；如通过免疫系统的细胞的功能或结构特性改变确定的细胞激活状态变化，例如细胞增殖、运动性改变、细胞内阳离子梯度或浓度(如钙)改变；细胞多肽的磷酸化或去磷酸化；诱导专门的活性，如特定的基因表达或细胞溶解行为；免疫系统细胞的细胞分化，包括改变的表面抗原表达谱或细胞凋亡(程序性细胞死亡)+ +的发作；或可以检测免疫应答的存在的任何其他标准。例如，可以通过与CD4 、CD8或NK细胞结合的特异性抗体来检测区分免疫细胞类型的细胞表面标记。可以检测到的其他标记和细胞组分包括但不限于干扰素γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子(TNF)、IFN-α、IFN-β(IFNB)、IL-6和CCL5。用于检测免疫应答的常用方法包括但不限于流式细胞术、ELISA、免疫组织化学。进行这些和类似测定的程序是众所周知的，并且可以在例如Letkovits(Immunology Methods Manual:The Comprehensive Sourcebook of Techniques,Current Protocols in Immunology,1998)中找到。
[0136] X.本发明技术的药物组合物和制剂
[0137] 本文公开了包含MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的药物组合物，其可以含有载体或稀释剂，所述载体或稀释剂可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、盐水、Tris缓冲液、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。例如，通过使用包衣(如卵磷脂)、通过在分散液的情况下维持所需的粒度以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。防止微生物的作用可以通过多种抗细菌剂和抗真菌剂和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等)来实现。在一些实施方案中，包括等渗剂(例如，糖或氯化钠)以及缓冲剂。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶或载体分子)可以实现可注射组合物的延长吸收。其他赋形剂可以包括润湿剂或乳化剂。通常，对于本领域技术人员清楚的是，可以包括适合于可注射制剂的赋形剂。
[0138] 包含MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的药物组合物和制剂可以通过常规混合、溶解、制粒、乳化、封装、包埋或冻干过程来制造。可以使用一种或多种生理学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或助剂以常规方式配制药物病毒组合物，所述载体、稀释剂、赋形剂或助剂有助于配制适合于体外、体内或离体使用的病毒制剂。所述组合物可以与一种或多种另外的生物学活性剂(例如，GM-CSF的平行给予)组合，并且可以用药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂配制，以产生适合于肠胃外或瘤内给予的本公开文本的药物(包括生物)或兽药组合物。
[0139] 如本领域技术人员所理解的，许多类型的配制品都是可能的。如本领域所公认的，所选择的具体类型取决于所选择的给予途径。例如，通常设计全身配制品用于通过注射(例如，静脉内)给予，并且设计那些配制品用于瘤内递送。在一些实施方案中，全身或瘤内配制品是无菌的。
[0140] 根据需要，无菌可注射溶液是通过如下方式来制备：将MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L掺入所需量的具有本文列举的各种其他成分的适当溶剂中，然后进行合适的灭菌手段。通常，分散液是通过如下方式来制备：将各种无菌活性成分掺入无菌媒介物中，所述媒介物含有基础分散介质和来自上文所列举的那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法为真空干燥和冷冻干燥技术，其由先前无菌过滤的溶液产生病毒和任何另外的所需成分的粉末。
[0141] 在一些实施方案中，可以将本公开文本的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L组合物配制在水性溶液中，或者配制在生理相容性溶液或缓冲液(如汉克氏溶液、林格氏溶液、甘露糖醇溶液或生理盐水缓冲液)中。在某些实施方案中，MVAΔC7L或MVAΔC7L-hFlt3L组合物中的任一种均可以含有配方剂，如悬浮剂、稳定剂、渗透剂或分散剂、缓冲剂、冻干保护剂或防腐剂，如聚乙二醇、聚山梨醇酯80、1-十二烷基六氢-2H-氮杂卓-2-酮(月桂氮酮(laurocapran))、油酸、柠檬酸钠、Tris HCl、右旋糖、丙二醇、甘露糖醇、聚山梨醇酯聚乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯( -20)、异丙基肉豆蔻酸酯、苯甲醇、异丙醇、乙醇、蔗糖、海藻糖和可以用于本公开文本的任何组合物中的本领域通常已知的其他此类配方剂。(Pramanick等人,Pharma Times 45(3),65-76(2013))。
[0142] 可以配制本公开文本的生物或药物组合物，以允许在将组合物给予受试者后，所述组合物中所含的病毒可以用于感染肿瘤细胞。可以通过多种完善的技术(如基于抗体的测定(例如，ELISA、免疫组织化学等))监测在给予后血清、肿瘤和其他组织(如果需要)中的病毒水平。
[0143] 可以将本发明的重组病毒以在约10mM Tris、140mM NaCl(pH 7.7)中配制的3.5x 107PFU/ml的滴度在-80℃下保存。为了制备疫苗注射液，例如，可以将102-108或102-109个病毒颗粒在安瓿瓶(优选玻璃安瓿瓶)中在2％蛋白胨和1％人白蛋白的存在下在100ml的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中冻干。可替代地，可以通过逐步冷冻干燥配制品中的重组病毒来产生可注射制剂。此配制品可以含有另外的添加剂，如甘露糖醇、葡聚糖、糖、甘氨酸、乳糖或聚乙烯吡咯烷酮或其他添加剂，如适合于体内给予的抗氧化剂或惰性气体、稳定剂或重组蛋白质(例如，人血清白蛋白)。然后将玻璃安瓿瓶密封，并且可以在4℃和室温之间保存几个月。
在一些实施方案中，将安瓿瓶在低于-20℃的温度下保存。
在一些实施方案中，将安瓿瓶在低于-20℃的温度下保存。
[0144] 为了治疗，可以将冻干物溶解于水性溶液(如生理盐水或Tris缓冲液)中，并且全身地或瘤内地给予。给予的模式、剂量和给予次数可以由本领域技术人员优化。
[0145] 根据本公开文本的药物组合物可以包含另外的佐剂。如本文所用，“佐剂”是指增强、增加或加强宿主对肿瘤抗原的免疫应答的物质。典型的佐剂可以是铝盐(如氢氧化铝或磷酸铝)、Quil A、细菌细胞壁肽聚糖、病毒样颗粒、多糖、toll样受体、纳米珠粒等(Aguilar等人(2007),Vaccine 25:3752-3762)。
[0146] XI.包含重组MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L病毒的试剂盒
[0147] 本公开文本提供了包含一种或多种组合物的试剂盒，所述组合物包含本文所述的重组MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L病毒中的一种或多种。所述试剂盒可以包含重组MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的一个或多个容器或小瓶以及向待治疗的受试者给予重组MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的说明书。所述说明书可以指示用于给予一种或多种如下文提供的组合物的剂量方案。
[0148] 在一些实施方案中，所述试剂盒还可以包含另外的组合物，其包含用于与重组MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L组合物联合给予的检查点抑制剂。
[0149] XII.MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的有效量和剂量
[0150] 通常，尽管可以给予更低或更高的剂量，向受试者给予在约106至约1010个噬斑形成单位(pfu)范围内的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L剂量。在一些实施方案中，剂量范围是从约102至约1010pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约
3 10 4 10
10至约10 pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约10至约10 pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约105至约1010pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约106至约1010pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约107至约1010pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约108至约1010pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约109至约1010pfu。在一些实施方案中，剂量是
7 9
约10至约10pfu。根据所使用的特定pfu滴定方法，pfu与病毒颗粒的等效性可能有所不同。
通常，pfu等于约5至100个病毒颗粒，而0.69PFU是约1TCID50。能以一个或多个分剂量持续规定的时间段并且以规定的给予频率来给予治疗有效量的M MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L。
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10至约10 pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约10至约10 pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约105至约1010pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约106至约1010pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约107至约1010pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约108至约1010pfu。在一些实施方案中，剂量范围是从约109至约1010pfu。在一些实施方案中，剂量是
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约10至约10pfu。根据所使用的特定pfu滴定方法，pfu与病毒颗粒的等效性可能有所不同。
通常，pfu等于约5至100个病毒颗粒，而0.69PFU是约1TCID50。能以一个或多个分剂量持续规定的时间段并且以规定的给予频率来给予治疗有效量的M MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L。
[0151] 例如，对于本领域技术人员清楚的是，根据本公开文本的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的治疗有效量可以根据诸如受试者的疾病状态、年龄、性别、体重和一般状况以及MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L在特定受试者体内引起所需免疫应答的能力(受试者对疗法的反应)等因素而变化。在将MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L递送给受试者时，剂量也将取决于诸如一般医疗状况、以前的病史、疾病类型和进展、肿瘤负担、肿瘤中存在或不存在肿瘤浸润的免疫细胞等因素而变化。
[0152] 在一些实施方案中，以剂量单位形式配制本公开文本的组合物可能是有利的，以便于给予和剂量均匀。如本文所用的“剂量单位形式”是指适合作为待治疗的哺乳动物受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位含有经计算与所需的药学上或兽医学上可接受的载体联合可产生所需治疗效果的预定量的活性材料。
[0153] XIII.MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的给予和治疗方案
[0154] 通常将药物组合物配制为与其预期的给予途径相容。可以使用不止一种途径来实现MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的给予。给予途径的例子包括但不限于肠胃外(例如，静脉内、肌内、腹膜内、皮内、皮下)、瘤内、鞘内、鼻内、全身、透皮、离子电渗疗法、皮内、眼内或局部给予。在一个实施方案中，在需要直接的局部反应的情况下，例如通过瘤内注射将MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L直接给予至肿瘤。此外，MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的给予途径可以变化，例如使用瘤内注射进行第一次给予，并且经由静脉内注射进行随后的给予或其任何组合。可以持续规定的时间段并且以规定的给予频率来给予治疗有效量的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L注射剂。在某些实施方案中，可以与其他治疗性治疗结合使用MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L。例如，针对患有大块原发性肿瘤的受试者，可以在新辅助(术前)或辅助(术后)环境中给予MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L。预期这样优化的治疗方案将诱导针对肿瘤的免疫应答，并且在诸如手术等首发治疗之前或之后减轻受试者的肿瘤负担。此外，可以与其他治疗性治疗(如化学疗法或放射)结合给予MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L。
[0155] 在某些实施方案中，至少每周或每月给予一次MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L病毒，但是可以根据需要更频繁地给予，如每周两次持续数周、数月、数年或甚至无限期，只要益处持续存在。如果可以耐受并且如果它们产生持续或增加的益处，则考虑更频繁的给予。本发明方法的益处包括但不限于以下：减少癌细胞数量、减小肿瘤大小、根除肿瘤、抑制癌细胞向外周器官的浸润、抑制或稳定或根除转移性生长、抑制或稳定肿瘤生长以及稳定或改善生活质量。此外，益处可以包括诱导针对肿瘤的免疫应答、激活效应CD4+T细胞、增加效应CD8+T细胞或减少调节性CD4+细胞。例如，在黑素瘤的背景下，或者益处可以是黑素瘤初次诊断的一、二、三、四、五年或更多年之内没有复发或转移。可以对结肠癌和其他实体瘤进行类似的评估。
[0156] 在某些其他实施方案中，在体内、离体或在体外用MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L治疗肿瘤块或肿瘤细胞。
[0157] XIV.载体
[0158] 在一些实施方案中，使用基于pCB质粒的载体插入在牛痘合成早期和晚期启动子(PsE/L)控制下的特定目的基因(SG)(如鼠GM-CSF(mGM-CSF)或人Flt3L(hFlt3L))。已经描述了构建载体的方法(参见M.Puhlmann,C.K.Brown,M.Gnant,J.Huang,S.K.Libutti,H.R.Alexander,D.L.Bartlett,Vaccinia as a vector for tumor-directed gene therapy:Biodistribution of a thymidine kinase-deleted mutant.Cancer Gene Therapy,7(1),66-73(2000))。说明性pCB-C7L-GFP载体核酸序列在SEQ ID NO:4中给出。将在牛痘P7.5启动子控制下的绿色荧光蛋白(GFP)用作可选择标记。在一些实施方案中，这些表达盒的两侧侧接C7基因的部分序列。除了C7基因座外，还可以使用病毒内其他合适的基因座。在质粒DNA和MVAΔC7L基因组DNA的C7基因座处发生的同源重组导致将SG和GFP表达盒插入MVAΔC7L基因组DNAC7基因座中，以产生MVAΔC7L-hFlt3L。在一些实施方案中，将MVA基因组序列(SEQID NO:2)的位置18,407至18,859用包含一个或多个开放阅读框的异源核酸序列替换，所述开放阅读框编码可选择标记(如GFP)和目的基因(SG)(如hFlt3L)。类似地，在一些实施方案中，在质粒DNA和VACVΔC7L基因组DNA的C7基因座处发生的同源重组导致将SG和GFP表达盒插入VACVΔC7L基因组DNAC7基因座中，以产生VACVΔC7L-hFlt3L。在一些实施方案中，将VACV基因组序列(SEQ ID NO:1)的位置15,716至16,168用包含一个或多个开放阅读框的异源核酸序列替换，所述开放阅读框编码可选择标记(如GFP)和目的基因(SG)(如hFlt3L)。通过GFP选择富集重组病毒并且进行4-5轮噬斑纯化，直到获得适当的没有污染的MVAΔC7L或VACVΔC7L的重组病毒。
[0159] 应当理解，可以使用适合于整合到MVAΔC7L或VACVΔC7L基因组中的任何其他表达载体，以及MVA的替代启动子、调节元件、可选择标记、切割位点、非必需插入区。在一些实施方案中，可选择标记是报告蛋白，其中所述报告蛋白是生物发光蛋白、荧光蛋白或化学发光蛋白。在一些实施方案中，报告蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。在一些实施方案中，可选择标记是黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(gpt)。MVA编码在线性基因组的末端的许多免疫调节基因，包括C11、C7、K3、F1、F2、F4、F6、F8、F9、F11、F14.5、J2、A46、C16。可以缺失这些基因以潜在地增强病毒的免疫激活特性，并且允许插入转基因。
[0160] 实验性实施例
[0161] 通过以下实施例进一步说明本发明技术，所述实施例不应被解释为以任何方式进行限制。
[0162] 一般材料和方法
[0163] 病毒和细胞系。使牛痘病毒(VACV)的Western Reserve(WR)毒株繁殖，并且在37℃下在BSC40(非洲绿猴肾细胞)单层上确定病毒滴度。将BSC40细胞在补充有5％胎牛血清(FBS)的杜氏改良伊格尔培养基中培养。MVA病毒由Gerd Sutter(慕尼黑大学)慷慨提供，并且使其在BHK-21(幼仓鼠肾细胞，ATCC CCL-10)细胞中繁殖。MVA可商购和/或公开获得。将病毒通过36％的蔗糖垫纯化。将BHK-21在含有10％FBS、0.1mM非必需氨基酸(NEAA)和50mg/ml庆大霉素的伊格尔最小必需培养基(伊格尔MEM，可以从Life Technologies购买，Cat#11095-080)中培养。最初从I.Fidler(MD Anderson Cancer Center)获得鼠黑素瘤细胞系B16-F10。将B16-F10细胞维持在RPMI 1640培养基中，所述培养基补充有10％FBS、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.1mM NEAA、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和10mM HEPES缓冲液。使所有细胞在37℃下在5％CO2培养箱中生长。人胚肾293T细胞来自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。使它们在补充有10％FBS的DMEM中生长。使RAW264.7鼠巨噬细胞细胞系在补充有10％FBS的DMEM中生长。使THP-1细胞在补充有10％FBS的RPMI 1640中生长。为了使THP-1分化为巨噬细胞，在使其经受实验条件之前，将它们用PMA(10ng/ml)处理48h。
[0164] 除非另外指示，否则本文所用的细胞和细胞系可商购或公开获得。
[0165] WT VACV和VACVΔC7L的多步生长曲线。将BSC40细胞用IFN-β以1000U/ml的终浓度处理或假处理12h。然后将细胞用WT VACV或VACVΔC7L以0.05的MOI感染。然后将细胞刮入培养基中并且在指定的时间收集。在三个循环的冻融和后续超声处理之后，通过在BSC40细胞上的噬斑测定来确定收集的样品中的病毒滴度。
[0166] C7表达质粒的构建。IFN-β报告质粒(pIFN-β-luc)和ISRE报告质粒(p-ISRE-luc)由Michaela Gack(芝加哥大学)提供。通过PCR从VACV WR基因组扩增VACV C7L，并且将其亚克隆到pcDNA3.1和PQCXIP中。为了构建flag标记的C7表达质粒，将flag序列插入C7的C末端中并且亚克隆到pcDNA3.1.中。
[0167] 双重萤光素酶报告物测定。根据制造商的说明(Promega)，使用双重萤光素酶报告物测定系统测量萤光素酶活性。简言之，将包括萤火虫萤光素酶报告构建体、海肾萤光素酶报告构建体以及其他表达构建体的表达质粒转染到HEK293T细胞中。转染后24h，收集细胞并且使其裂解。将20μl细胞裂解物与50μl的LARII一起孵育以测量萤火虫萤光素酶活性，然后与50μl的Stop&Glo试剂一起孵育以测量海参萤光素酶活性。通过将在IFNB或ISRE启动子下的萤火虫萤光素酶活性相对于来自对照质粒pRL-TK的海肾萤光素酶活性归一化，以任意单位表示相对萤光素酶活性。通过将在某种测试条件下的相对萤光素酶活性除以在背景条件下的相对萤光素酶活性来计算诱导倍数。
[0168] 表达牛痘C7的逆转录病毒的产生。将HEK293T细胞传代到6孔板中。第二天，将细胞用三种质粒与10μl lipofectamine 2000转染：VSVG(1μg)；gag/pol(2μg)；和PQCXIP-C7(2μg)。2天后，收集细胞上清液，并且通过0.45μm过滤器过滤并且在-80℃下保存。
[0169] 稳定表达牛痘C7的HEK293T细胞系的产生。将HEK293T细胞传代到6孔板中。第二天，将细胞用表达C7的逆转录病毒以5的MOI感染。2天后，将培养基用含有1.2μg/ml的嘌呤霉素的新鲜DMEM培养基替换。一周后，存活细胞是稳定表达C7的细胞。使用抗C7抗体通过Western印迹分析验证了C7的表达。
[0170] 稳定表达牛痘C7的RAW264.7细胞系的产生。将RAW264.7细胞传代到6孔板中。第二天，将细胞用表达C7的逆转录病毒以5的MOI感染。2天后，将培养基用含有5μg/ml的嘌呤霉素的新鲜DMEM培养基替换。一周后，存活细胞是稳定表达C7的细胞。使用抗C7抗体通过Western印迹分析验证了C7的表达。
[0171] 稳定表达牛痘C7的THP-1细胞系的产生。将THP-1细胞传代到6孔板中。第二天，将细胞用表达C7的逆转录病毒以5的MOI感染。2天后，将培养基用含有5μg/ml的嘌呤霉素的新鲜RPMI-1640培养基替换。三周后，存活细胞是稳定表达C7的细胞。使用抗C7抗体通过Western印迹分析验证了C7的表达。
[0172] 重组VACVΔC7病毒的产生。将BSC40细胞传代到6孔板中。第二天，将细胞用牛痘病毒WR株以0.2的MOI感染。1-2h后，将细胞用0.75μg pC7-GFP与2μl lipofectamine 2000转染。2天后，收集细胞并且冻融三次。为了选择纯VACVΔC7，将BSC40细胞用上述病毒混合物感染，然后在显微镜下基于GFP表达选择噬斑。在几轮选择之后，所有噬斑均为GFP阳性。进行PCR以确认不存在C7。
[0173] 重组MVAΔC7L病毒的产生。将BHK21细胞传代到6孔板中。第二天，将细胞用MVA以0.2的MOI感染。1-2h后，将细胞用0.75μg pC7-GFP与2μl lipofectamine 2000转染。2天后，收集细胞并且冻融三次。为了选择纯MVAΔC7，将BHK21细胞用上述收集的病毒原液感染，然后在显微镜下基于GFP表达选择噬斑。在4-6轮选择之后，所有噬斑均为GFP阳性。扩增GFP阳性MVAΔC7L克隆，并且通过PCR分析确认C7L基因的检测。PCR引物序列如下：正向引物5’-ATGGGTATACAGCACGAATTC-3’(SEQ ID NO:5)和反向引物5’-TTAATCCATGGACTCATAATC-3’(SEQ ID NO:6)。
[0174] 骨髓衍生的树突细胞(BMDC)的产生。通过如下方式来收集来自小鼠胫骨和股骨的骨髓细胞：首先从骨骼中除去肌肉，然后使用0.5cc U-100胰岛素注射器(Becton Dickinson)用含10％FCS的RPMI冲洗细胞。离心后，将细胞重悬于ACK裂解缓冲液(Lonza)中，以便通过将细胞在冰上孵育1-3min来裂解红细胞。然后将细胞收集，重悬于新鲜培养基中，并且通过40μm细胞滤器(BD Biosciences)过滤。计数细胞数量。为了产生GM-CSF-BMDC，将骨髓细胞(每15cm细胞培养皿中500万个细胞)在GM-CSF(30ng/ml，由Sloan Kettering Institute的Monoclonal Antibody Core实验室生产)的存在下在CM中培养10-12天。CM是补充有10％胎牛血清(FBS)、100单位/ml青霉素、100μg/ml链霉素、0.1mM必需和非必需氨基酸，2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和10mM HEPES缓冲液的RPMI 1640培养基。通过将50％的旧培养基用新鲜培养基替换，每2天饲喂细胞，并且每3-4天重新铺板以除去贴壁细胞。仅将非贴壁细胞用于实验。
[0175] Western印迹分析。骨髓衍生的树突细胞(BMDC)是根据方案(Dai等人,2014)产生的。将来自WT和KO小鼠的BMDC(1x 106)用MVA或MVAΔC7L以10的MOI(感染复数)感染。制备全细胞裂解物。使等量的蛋白质经受十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，并且将多肽转移到硝酸纤维素膜上。使用各自的抗体(Cell Signaling)确定TBK-1的磷酸化、TBK-1、IRF3的磷酸化、IRF3和STING水平。将抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GADPH)或抗β-肌动蛋白抗体(Cell Signaling)用作上样对照。
[0176] 共免疫沉淀。将HEK293T细胞传代到10cm板中。第二天，将细胞用flag-STAT1或flag-STAT2与pcDNA3.1-C7-HA一起转染。两天后，将细胞在冰上的Pierce IP裂解缓冲液中裂解30min。对于IFN处理组，在细胞裂解之前，将细胞用1000U/ml IFNB处理45min。将HA抗体(Sigma H3663)添加到细胞裂解液中至终浓度1μg/ml，并且在4℃下孵育过夜。第二天，添加蛋白质A-琼脂糖，并且在4℃下孵育2h。将琼脂糖用IP裂解缓冲液洗涤三次。最后，将蛋白质在98℃下变性5min。
[0177] 小鼠。从Jackson Laboratory购买6和10周龄之间的雌性C57BL/6J小鼠，并且将其用于制备骨髓衍生的树突细胞，并且作为体内实验的对照小鼠。将这些小鼠饲养在Sloan Kettering Institute的动物实验室中。严格按照美国国立卫生研究院的实验动物的护理和使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)中的建议执行所有程序。所述方案得到了Sloan-Kettering Cancer Institute的动物实验伦理委员会(Committee on the Ethics of Animal Experiments)的批准。STINGGt/Gt小鼠是在Russell Vance实验室(加利福尼亚大学伯克利分校)中产生的。
[0178] WT C57BL/6小鼠和STINGGt/Gt小鼠的WT VACV或VACVΔC7L鼻内感染。每组中麻醉10只WT小鼠，并且用WT VACV以2x 103、2x 104、2x 105或2x 106pfu，以及用VACVΔC7L以2x 105、2x 106或2x 107pfu的渐增剂量进行鼻内感染，各自以10μl接种至两个鼻孔。监测小鼠并且每天称重。将STINGGt/Gt小鼠用WT VACV以2x 104pfu或用VACVΔC7L以2x 105pfu感染。
对失去30％初始重量的小鼠实施安乐死。确定Kaplan-Meier存活曲线。
对失去30％初始重量的小鼠实施安乐死。确定Kaplan-Meier存活曲线。
[0179] 双侧肿瘤植入模型和瘤内注射重组MVAΔC7L或MVA。简言之，将B16-F10黑素瘤细胞皮内植入C57BL/6小鼠的左右侧腹(右侧腹5x 105，左侧腹1x 105)。肿瘤植入后9天，为右侧腹较大的肿瘤瘤内注射2x 107pfu的MVA或MVAΔC7L。每周两次测量肿瘤大小并且重复注射肿瘤。监测小鼠的存活。
[0180] VACV C7特异性多克隆抗体的产生。将C7 cDNA克隆到细菌表达载体pET28-N-His-SUMO中。将C7表达质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。使从单个转化体扩增的细菌培养物(2升)在37℃下在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB肉汤中生长，直到A600达到0.8。将培养物调节至0.5mM异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，然后在18℃下伴随恒定振荡孵育20h。通过离心收获细胞，并且将其重悬于缓冲液A(50mM Tris-HCl(pH 7.5)、500mM NaCl、20mM咪唑、10％甘油)中。通过超声处理将细胞裂解，并且通过以15000rpm离心45min将不溶性材料除去。将上清液与5ml的Ni-NTA树脂(Qiagen)(其已经用缓冲液A平衡)混合1h。将树脂倒入重力流柱中，然后用60ml的缓冲液A洗涤。将吸附的蛋白质用在缓冲液A中的300mM咪唑逐步洗脱。通过SDS-PAGE监测洗脱级分的多肽组成，并且合并含有每种重组蛋白质的峰级分。
将洗脱液在含有50mM Tris-HCl(pH 8)、200mM NaCl、2mM DTT、2mM EDTA、10％甘油和0.1％Triton X-100的缓冲液中透析，然后在-80℃下保存。在Pocono Rabbit Farm and Laboratory(PRF&L)中进行兔免疫以产生C7特异性兔抗体。为兔皮下注射不完全弗氏佐剂(IFA)中的100μg的纯化的C7蛋白加Mighty快速免疫刺激剂，四次，间隔两周，持续两个月。
使用亲和纯化从兔血清中纯化C7抗体。
将洗脱液在含有50mM Tris-HCl(pH 8)、200mM NaCl、2mM DTT、2mM EDTA、10％甘油和0.1％Triton X-100的缓冲液中透析，然后在-80℃下保存。在Pocono Rabbit Farm and Laboratory(PRF&L)中进行兔免疫以产生C7特异性兔抗体。为兔皮下注射不完全弗氏佐剂(IFA)中的100μg的纯化的C7蛋白加Mighty快速免疫刺激剂，四次，间隔两周，持续两个月。
使用亲和纯化从兔血清中纯化C7抗体。
[0181] 统计学。将双尾非配对学生t检验用于研究中两组的比较。通过对数秩(Mantel-Cox)检验分析存活数据。认为显著的p值在图中指示如下：*，p<0.05；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。在每个图例中都讨论了研究中包含的动物数量。
[0182] 实施例1：牛痘C7抑制STING、TBK1和IRF3介导的IFN基因诱导。
[0183] 将双重萤光素酶测定系统用于评价牛痘C7在HEK293T细胞中的STING、TBK1或IRF3诱导的IFNB启动子激活的调节中的作用，所述HEK293T细胞是用SV40大T抗原转化的人胚肾细胞系。将HEK293T细胞用表达IFNB萤火虫萤光素酶报告物的质粒、表达海肾萤光素酶的对照质粒pRL-TK、STING和如所指示的牛痘C7L转染。转染后24h进行双萤光素酶测定。通过将萤火虫萤光素酶活性相对于海肾萤光素酶活性归一化，以任意单位表示相对萤光素酶活性。与在没有STING的对照样品中的IFNB启动子活性相比，STING的过表达导致IFNB启动子活性的30倍诱导。渐增量的C7L表达质粒的共转染导致STING诱导的IFNB启动子活性显著降低(图1A)。类似地，与对照相比，TBK1的过表达导致IFNB启动子活性的400倍诱导。渐增量的C7L表达质粒(250ng)的共转染导致TBK1诱导的IFNB启动子活性降低90％以上(图1B)。IRF3是干扰素调节转录因子(IRF)家族的成员，并且是IFNB启动子的必需转录因子。C7的过表达也导致IRF3诱导的IFNB启动子活性降低70％(图1C)，然而C7的过表达未能降低IRF3-5D诱导的IFNB启动子活性(图1D)。IRF3-5D是IRF3的磷酸化活性突变体。图1E和1F显示牛痘C7与转录因子IRF3相互作用。这些结果指示，C7在IRF3磷酸化中起抑制作用，并且C7不能阻断磷酸化的IRF3的活性。
[0184] 实施例2：牛痘C7抑制聚I:C(TLR3)或TRIF介导的IFN基因诱导。
[0185] TBK1-IRF3轴对于从多种传感途径进行信号转导很重要，所述传感途径包括cGAS-cGAMP-STING、RIG-I或MDA5-MAVS、TLR3-TRIF和TLR4-TRIF。为了测试牛痘C7是否具有TRIF信号传导的抑制作用，诸位发明人用TLR3表达质粒、IFN-β-luc报告物和渐增量的C7表达质粒(10ng、50ng或250ng)转染了HEK293T细胞。24h后，将细胞用聚I:C(5μg/ml)处理。聚I:C处理后24h测定萤光素酶活性。与空载体对照相比，TLR3的转染和用聚I:C处理导致IFNB启动子活性的9倍诱导(图2A)。C7的过表达导致聚(I:C)/TLR3诱导的IFNB启动子活性降低多达90％(图2A)。为了测试C7是否也抑制TRIF诱导的IFNB启动子活性，将HEK293T细胞用TRIF表达质粒转染，与空载体对照相比，其导致IFNB启动子活性的500倍诱导(图2B)。C7的过表达导致TRIF诱导的IFNB启动子活性降低70％以上(图2B)。RIG-I或MDA5-MAVS信号传导对于RNA刺激的Ⅰ型IFN产生是必需的。MAVS过表达诱导高IFNB萤光素酶信号。与对照相比，它是约500倍的诱导。C7还将MAVS诱导的萤光素酶信号阻断了70％。这些结果指示，在HEK293T细胞中C7的过表达对STING、聚(I:C)、TRIF、TBK1和IRF3诱导的IFNB启动子活性发挥抑制作用。相比之下，C7的过表达不能抑制组成型地激活的磷酸化的IRF3-5D。由于TBK1/IRF3是这些不同的DNA和RNA传感途径的共同节点，因此C7可能靶向导致IRF3激活的步骤，从而导致IRF3磷酸化和核转位的失败。
[0186] 实施例3：在免疫细胞中牛痘C7的过表达抑制IFNB基因诱导。
[0187] 为了评估牛痘C7在免疫细胞中的IFNB基因诱导中的作用，我们产生了两种稳定表达牛痘C7的细胞系，包括鼠巨噬细胞RAW264.7和人THP-1。THP-1是人单核细胞白血病细胞系，其已经广泛用于研究人单核细胞和巨噬细胞的功能和免疫调节。简言之，将RAW264.7和THP-1用含有在CMV启动子和嘌呤霉素选择标记下的牛痘C7表达构建体的逆转录病毒转导。具有药物选择标记的空载体也用于产生对照细胞系。获得抗药性细胞并且将其用于以下实验。在将表达C7或具有空载体的THP-1稳定细胞系用于实验之前，使它们通过佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA；20ng/ml)分化3天。将细胞用仙台病毒(SeV)、热灭活的MVA(H-MVA)感染，或用聚I:C孵育，或用ISD(Invivogen)转染。24h后，通过定量实时PCR测量IFNB基因表达水平。在RAW264.7和THP-1细胞中，SeV感染均诱导了最高水平的IFNB基因表达，并且牛痘C7的过表达导致IFNB基因表达降低了60％(图3A和C)。牛痘C7还使在RAW264.7和THP-1细胞中的聚(I:C)诱导的IFNB基因表达减弱50％以上。类似地，牛痘C7将在RAW264.7和THP-
1细胞中热iMVA诱导的IFNB基因表达降低了60％。SeV是负义的单链RNA病毒，属于副粘病毒科。SeV可以通过细胞质RNA传感器视黄酸诱导型基因I(RIG-I)和黑素瘤分化相关基因5(MDA-5)来检测(Kato等人2005；Gitlin等人,2010)，这导致MAVS/TBK1/IRF3轴的激活。聚(I:C)激活内体dsRNA传感器TLR3，这导致TRIF/TBK1/IRF3轴的激活。H-MVA激活胞质DNA传感器cGAS，这导致第二信使环状GMP-AMP(cGAMP)的产生以及STING/TBK1/IRF3轴的激活(Dai等人,Science immunology,印刷中)。综上所述，这些结果指示牛痘C7抑制巨噬细胞中的多种先天免疫传感途径。
1细胞中热iMVA诱导的IFNB基因表达降低了60％。SeV是负义的单链RNA病毒，属于副粘病毒科。SeV可以通过细胞质RNA传感器视黄酸诱导型基因I(RIG-I)和黑素瘤分化相关基因5(MDA-5)来检测(Kato等人2005；Gitlin等人,2010)，这导致MAVS/TBK1/IRF3轴的激活。聚(I:C)激活内体dsRNA传感器TLR3，这导致TRIF/TBK1/IRF3轴的激活。H-MVA激活胞质DNA传感器cGAS，这导致第二信使环状GMP-AMP(cGAMP)的产生以及STING/TBK1/IRF3轴的激活(Dai等人,Science immunology,印刷中)。综上所述，这些结果指示牛痘C7抑制巨噬细胞中的多种先天免疫传感途径。
[0188] 实施例4：重组MVAΔC7L病毒的产生。
[0189] 为了进一步证实C7在免疫调节中的作用，设计了产生缺失了C7L基因的MVAΔC7L病毒的策略。构建pC7LGFP载体(SEQ ID NO:4)以将特定目的基因插入MVA的C7L基因座中。在这种情况下，将在牛痘P7.5启动子控制下的GFP用作选择标记。将表达盒两侧侧接C7侧翼区域(C7-L和C7-R)的部分序列(图4A)。将BHK21细胞用表达LacZ的MVA病毒以0.05的MOI感染1h，然后用上述质粒DNA转染。在48h收集感染的细胞。将重组病毒(GFP插入C7基因座中)通过绿色荧光鉴定(图4B)。将阳性克隆噬斑纯化4-5次。进行PCR分析以确认重组病毒MVAΔC7L已经丢失C7基因(图4C)。
[0190] 实施例5：鼠cDC和人THP-1细胞的MVAΔC7L感染比MVA诱导更高水平的IFNB基因表达和TBK1和IRF3的磷酸化。
[0191] 常规树突细胞(cDC)的MVA感染已经显示经由cGAS/STING/IRF3依赖性机制诱导I型IFN。为了测试C7是否在胞质DNA传感途径的诱导中起抑制作用，分析了骨髓衍生的DC(BMDC)对MVAΔC7L与MVA的先天免疫应答。将BMDC用MVAΔC7L或MVA以10的MOI感染。在感染后3h和6h收集细胞。通过定量PCR分析确定IFNB基因表达水平。在感染后3h和6h，cDC中MVAΔC7L诱导的IFNB基因表达水平明显高于MVA(图5A)。来自MVAΔC7L感染的cDC的上清液中的IFN-β蛋白水平也高于来自MVA感染的cDC的上清液中的IFN-β蛋白水平(图5B)。Western印迹分析证明，MVAΔC7L感染诱导的TBK1和IRF3的磷酸化水平高于MVA，这表明TBK1可能是C7的靶标(图5D)。为了测试MVAΔC7L是否在人免疫细胞中诱导更高水平的IFNB基因激活，采用了广泛使用的分化的THP-1细胞。将THP-1细胞用MVAΔC7L或MVA以10的MOI感染，并且在感染后3h和6h收集细胞。在THP-1细胞中，MVAΔC7L感染诱导的IFNB基因表达水平高于MVA(图5C)。这些结果指示，C7是可能在TBK1水平上拮抗胞质DNA传感途径的抑制剂。因此，这些结果显示，MVAΔC7L有用于诱导先天免疫应答的方法。
[0192] 实施例6：牛痘C7减弱I型IFN诱导的JAK-STAT信号传导途径。
[0193] 分析了C7是否对IFN-β诱导的干扰素刺激基因(ISG)激活具有任何抑制作用。在此实施例中，使用了ISRE-luc报告物。简言之，将HEK293T细胞用ISRE-luc报告物和对照质粒pRL-TK以及渐增量的表达牛痘C7的质粒转染，所述ISRE-luc报告物在ISRE一旦被激活时即表达萤火虫萤光素酶，并且所述对照质粒pRL-TK在ISRE一旦被激活时即表达海肾萤光素酶。转染后24h，将细胞用IFN-β再处理24h。然后收集细胞，并且确定萤火虫萤光素酶相对于海肾萤光素酶的相对水平。将变化倍数定义为相对水平。C7的过表达导致ISRE激活减少高达75％(图6B)。
[0194] 实施例7：牛痘C7的过表达拮抗IFN-β诱导的ISG表达。
[0195] 分析了HEK293T细胞(图7A)或RAW264.7细胞(图7B)中过表达牛痘C7是否会拮抗IFN-β诱导的ISG基因表达。已经描述了表达牛痘C7的RAW264.7细胞(实施例3)。将HEK293T细胞用含有牛痘C7L和药物选择标记-嘌呤霉素的逆转录病毒转导。几轮药物选择后，产生了表达牛痘C7的稳定HEK293T细胞系。具有药物选择标记的空载体也用于产生对照细胞系。将表达C7或具有空载体的稳定细胞系用IFN-β处理16h。通过定量实时PCR测量ISG15 mRNA水平。与空载体对照细胞系相比，C7的异位表达导致ISG15基因表达减少。这些结果进一步支持牛痘C7下调IFN-β诱导的ISG表达。
[0196] 实施例8：与MVA相比，在BMDC中MVAΔC7L诱导更高水平的ISG表达。
[0197] 分析了MVAΔC7L是否比MVA诱导更高水平的干扰素刺激基因(ISG)表达。将BMDC用MVAΔC7L或MVA以10的MOI感染。在感染后12和24h收集细胞。提取mRNA，并且通过定量实时PCR确定ISG15和Mx1的表达水平。在感染后12和24h，MVAΔC7L感染比MVA诱导更高水平的ISG15和Mx1(图8A和B)。因此，这些结果显示，MVAΔC7L有用于诱导先天免疫应答的方法。
[0198] 实施例9：MVAΔC7L不能表达C7并且不能抑制IFN-β诱导的STAT2磷酸化。
[0199] 在大肠杆菌BL21(DE3)中表达和纯化牛痘C7蛋白，并且通过在兔中免疫产生抗C7多克隆兔抗体。将抗C7抗体通过亲和柱纯化。为了验证在MVA感染的细胞中C7的表达以及在MVAΔC7L感染的细胞中C7表达的损失，将HeLa细胞用MVA或MVAΔC7L以10的MOI感染。在感染后4和12h收集细胞。进行Western印迹分析。在感染后4和12h，MVA感染导致C7表达，然而MVAΔC7L感染的细胞没有可检测的C7蛋白(图9A)。这与图4C中的PCR结果一致，即C7L基因已从MVAΔC7L中缺失。
[0200] 结合I型IFN后，IFNAR激活JAK/STAT途径，从而导致Stat1和Stat2转录因子的磷酸化和激活，这进而激活数百种ISG的表达，从而导致建立抗病毒状态。为了测试MVA感染是否抑制IFN-β诱导的JAK-STAT途径激活，使用了TBK1-/-MEF细胞。在MEF中MVA诱导的IFNB基因诱导依赖于TBK1。因此，在TBK1-/-细胞中，消除了MVA对IFNB基因诱导的影响。在用鼠IFN-β以1000U/ml的终浓度处理指定的时间之前，将TBK1-/-细胞用MVA或MVAΔC7L以10的MOI感染6h。IFN-β处理导致STAT2磷酸化的快速诱导，STAT2的磷酸化在MVA感染的细胞中减少，但是在MVAΔC7L感染的细胞中不受影响(图9B)。与在HeLa细胞中观察到的情况相似，在MVA感染的MEF中检测到C7，但是在MVAΔC7L感染的细胞中没有检测到。这些结果指示，C7通过防止STAT2磷酸化来抑制IFNAR介导的JAK-STAT途径激活。
[0201] 实施例10：牛痘C7蛋白与STAT2相互作用。
[0202] 进行共免疫沉淀测定以确定牛痘C7是否通过与Stat1或Stat2相互作用来下调此途径。简言之，将HEK293T细胞用Flag标记的人STAT1或STAT2与HA标记的C7共转染，然后用IFN-β处理或假处理45min。制备全细胞裂解物(WCL)，并且将其用抗FLAG和抗HA抗体印迹，证明了STAT1或STAT2和C7-HA在转染细胞中的表达(图10A)。用抗HA抗体免疫沉淀全细胞裂解物后，然后用抗Flag抗体探测与C7-HA蛋白相互作用的蛋白质。这些结果显示，仅Flag标记的STAT2被抗C7-HA从全细胞裂解物中拉下(图10B)。
[0203] 实施例11：具有C7L缺失的重组牛痘病毒(VACVΔC7L)的产生。
[0204] 使用pC7LGFP载体(SEQ ID NO:4)将在牛痘P7.5启动子控制下的GFP插入MVA的C7L基因座中。将表达盒两侧侧接C7侧翼区域(C7-L和C7-R)的部分序列。将BSC40细胞用表达的WT牛痘病毒以0.05的MOI感染1h，然后用上述质粒DNA转染。在48h收集感染的细胞。将重组病毒(GFP插入C7基因座中)通过绿色荧光鉴定。在BSC40细胞上将阳性克隆噬斑纯化4-5次。进行PCR分析以确认重组病毒VACVΔC7L已经丢失C7基因(图11A和11B)。
[0205] 实施例12：VACVΔC7L具有比WT VACV小的噬斑大小，并且对IFN抑制敏感。
[0206] 为了研究WT VACV和VACVΔC7L之间是否存在任何表型差异，以及它们是否对IFN抑制敏感，在用两种病毒以指定剂量(PFU)感染之前，将BSC40细胞用IFN-β(1000U/ml)预处理或假处理12h。在不存在IFN-β预处理的情况下，VACVΔC7L的噬斑大小比WT VACV小。在存在IFN-β预处理的情况下，WT VACV的噬斑大小有所减小，并且VACVΔC7L的噬斑大小进一步减小并且几乎不可见(图12A)。与WT VACV相比VACVΔC7L的噬斑大小减小可能是由于VACVΔC7L的复制能力降低或其扩散到邻近细胞的能力降低所致。为了区分这两种可能性，进行了多步生长实验，其中在用两种病毒以0.05的MOI感染之前，将BSC40细胞用IFN-β(1000U/ml)预处理或假处理12h。在不同时间收集细胞并且确定病毒滴度。在不存在IFN-β预处理的情况下，在感染48h期间，WT VACV的滴度从1.5x 105增加到7.0x 108(增加了1000倍以上)；然而在感染的前48h期间，VACVΔC7L的滴度从1.5x 105增加到4.5x 107(增加了约300倍)。
在存在IFN-β预处理的情况下，在感染的48h期间，WTVACV的滴度从1.2x 105增加到9.0x 107(增加了700倍以上)；然而在感染的前48h期间，VACVΔC7L的滴度从6.0x 104增加到8.0x
105(增加了约15倍)(图12B)。这些结果证明，VACVΔC7L在BSC40细胞上的复制能力降低，并且对IFN抑制敏感。
在存在IFN-β预处理的情况下，在感染的48h期间，WTVACV的滴度从1.2x 105增加到9.0x 107(增加了700倍以上)；然而在感染的前48h期间，VACVΔC7L的滴度从6.0x 104增加到8.0x
105(增加了约15倍)(图12B)。这些结果证明，VACVΔC7L在BSC40细胞上的复制能力降低，并且对IFN抑制敏感。
[0207] 实施例13：VACVΔC7L在鼠鼻内感染模型中高度减毒。
[0208] 将在鼻内感染不同剂量的WT VACV后C57BL/6J小鼠的重量减轻与在感染VACVΔC7L后C57BL/6J小鼠观察到的重量减轻进行比较。每只小鼠以2x103PFU进行WT VACV感染导致在感染后第7天重量减轻超过10％，并且在感染后第14天所有小鼠重量均增加并且恢复(图13A和13B)。每只小鼠以2x 104PFU进行WT VACV感染导致在感染后第7天和第8天重量减轻约20％，并且在感染后第14天所有小鼠重量均增加并且恢复(图13A和13B)。每只小鼠以5
2x10 PFU进行WT VACV感染导致在感染后第8天和第9天重量减轻约30％，并且在感染后第
14天，6/10的小鼠重量增加并且缓慢恢复大部分减轻的重量，然而4/10小鼠死亡(图13A和
13B)。每只小鼠以2x 105PFU进行WT VACV感染导致100％致死率(图13A和13B)。相比之下，以最高剂量(2x 107PFU)进行VACVΔC7L感染导致重量减轻不到20％，并且所有小鼠在感染后11至12天均恢复了重量(图13C和13D)。这些结果指示，在鼠鼻内感染模型中，C7是毒力因子，而VACVΔC7L是高度减毒的。
2x10 PFU进行WT VACV感染导致在感染后第8天和第9天重量减轻约30％，并且在感染后第
14天，6/10的小鼠重量增加并且缓慢恢复大部分减轻的重量，然而4/10小鼠死亡(图13A和
13B)。每只小鼠以2x 105PFU进行WT VACV感染导致100％致死率(图13A和13B)。相比之下，以最高剂量(2x 107PFU)进行VACVΔC7L感染导致重量减轻不到20％，并且所有小鼠在感染后11至12天均恢复了重量(图13C和13D)。这些结果指示，在鼠鼻内感染模型中，C7是毒力因子，而VACVΔC7L是高度减毒的。
[0209] 实施例14：在STINGGt/Gt小鼠中，VACVΔC7L感染并未导致死亡率增加。
[0210] STINGGt/Gt小鼠更易受WT VACV感染。用WT VACV以2x 105PFU感染在WT C57BL/6J小鼠中导致50％的致死率，然而所有STINGGt/Gt小鼠均在此剂量下死于WT VACV感染(图14A和14B)。相比之下，与WT年龄匹配的对照小鼠相比，以2x 105PFU进行VACVΔC7L感染导致WT小鼠重量减轻不到5％，而STINGGt/Gt小鼠重量减轻略多。所有小鼠均在感染中存活(图14C和
14D)。由于VACVΔC7L感染的衰减，可能会将VACVΔC7L感染限制在鼻内感染模型中的感染的肺组织上，而STING缺乏并没有显著影响感染的严重性或其向血液和远端器官的传播。
14D)。由于VACVΔC7L感染的衰减，可能会将VACVΔC7L感染限制在鼻内感染模型中的感染的肺组织上，而STING缺乏并没有显著影响感染的严重性或其向血液和远端器官的传播。
[0211] 实施例15：VACVΔC7L感染的小鼠产生了针对致死性WT VACV攻击的免疫。
[0212] 为了测试在WT或STINGGt/Gt小鼠中鼻内感染VACVΔC7L是否导致全身抗病毒免疫的形成，将存活的小鼠(初次感染后6周)和初试WT对照小鼠用WT VACV感染的致死剂量以2x 106PFU攻击。所有初试WT小鼠均在感染后8或9天死亡，然而先前感染的WT或STINGGt/Gt小鼠均未减轻初始重量的5％以上，并且它们都在攻击中存活(图15A和B)。这些结果指示，在WT或STING缺陷型小鼠中先前感染VACVΔC7L导致全身抗病毒免疫的形成。
[0213] 实施例16：在鼻内感染模型中，MVAΔC7L感染在STAT2-/-和IFNAR1-/-小鼠中获得了毒力。
[0214] 为了测试VACVΔC7L病毒是否在STAT2-/-或IFNAR1-/-小鼠中获得了毒力，将WT、-/- -/- 7STAT2 或IFNAR1 小鼠用VACVΔC7L以2x 10 pfu的剂量鼻内感染，并且监测其重量减轻和随时间的存活。发现与WT小鼠相比，STAT2-/-和IFNAR1-/-小鼠对VACVΔC7L感染高度易感，重量迅速减轻，疾病严重和死亡(图16A和16B)。STAT2-/-和IFNAR1-/-小鼠的中值存活时间分别为7天和8天(图16B)。P＝0.0145(n＝5)时，此差异具有统计学意义。在用VACVΔC7L以2x
107pfu感染后第4天，比较WT、STAT2-/-或IFNAR1-/-小鼠的各种组织中的病毒滴度。发现WT小鼠的VACVΔC7L感染导致肺部的局部感染，而没有病毒的传播或病毒血症。相比之下，在STAT2-/-或IFNAR1-/-小鼠中，VACVΔC7L感染导致肺中的病毒滴度更高。还观察到在感染后第4天，在STAT2-/-和IFNAR1-/-小鼠中，病毒血症和病毒向各个远端器官(包括肝、脾和脑)的传播(图16C)。与WT小鼠相比，MDA5-/-小鼠的VACVΔC7L病毒感染导致重量减轻更多，并且在感染后第4天MDA5-/-小鼠的肺中的病毒滴度是WT小鼠的肺中的病毒滴度的100倍(图16A和
16C)。然而，所有MDA5-/-小鼠都逐渐增重，并且在感染中存活(图16A和16B)。
107pfu感染后第4天，比较WT、STAT2-/-或IFNAR1-/-小鼠的各种组织中的病毒滴度。发现WT小鼠的VACVΔC7L感染导致肺部的局部感染，而没有病毒的传播或病毒血症。相比之下，在STAT2-/-或IFNAR1-/-小鼠中，VACVΔC7L感染导致肺中的病毒滴度更高。还观察到在感染后第4天，在STAT2-/-和IFNAR1-/-小鼠中，病毒血症和病毒向各个远端器官(包括肝、脾和脑)的传播(图16C)。与WT小鼠相比，MDA5-/-小鼠的VACVΔC7L病毒感染导致重量减轻更多，并且在感染后第4天MDA5-/-小鼠的肺中的病毒滴度是WT小鼠的肺中的病毒滴度的100倍(图16A和
16C)。然而，所有MDA5-/-小鼠都逐渐增重，并且在感染中存活(图16A和16B)。
[0215] 为了确定在STAT2-/-或IFNAR1-/-小鼠中VACVΔC7L病毒的LD50(50％的感染的小鼠死于感染的剂量)，将这些小鼠用各种剂量的VACVΔC7L鼻内感染。发现在VACVΔC7L的2x 105pfu剂量下，5/5的STAT2-/-小鼠和5/5的IFNAR1-/-小鼠重量迅速减轻并且死亡。在VACVΔC7L的2x 103pfu剂量下，1/5的STAT2-/-小鼠和1/5的IFNAR1-/-小鼠在分别为9天和11天的中值存活时间死亡。在VACVΔC7L的2x 102pfu剂量下，5/5的STAT2-/-小鼠和5/5的IFNAR1-/-小鼠存活。估计STAT2-/-和IFNAR1-/-小鼠中VACVΔC7L的LD50约为1000pfu(图16D-16G)。
[0216] 实施例17：在鼻内感染模型中在MDAS5-/-STINGGt/Gt小鼠中，VACVΔC7L感染获得了毒力。
[0217] 与WT对照相比，以2x 107pfu进行VACVΔC7L感染导致MDA5-/-或STINGGt/Gt小鼠重量减轻更多。为了测试VACVΔC7L病毒是否在MDA5-/-STINGGt/Gt小鼠中获得了毒力，将/ Gt/Gt Gt/Gt 7MDA5--STING 、STING 或WT年龄匹配的对照小鼠用VACVΔC7L病毒以2x 10pfu感染。
观察到MDA5-/-STINGGt/Gt比STINGGt/Gt或WT小鼠的重量减轻更多(图17A)，并且5/5的小鼠死于VACVΔC7L感染(图17B)。这些结果指示，MDA5介导的胞质dsRNA传感途径和STING介导的胞质DNA传感途径在宿主防御VACVΔC7L感染中起协同作用。
观察到MDA5-/-STINGGt/Gt比STINGGt/Gt或WT小鼠的重量减轻更多(图17A)，并且5/5的小鼠死于VACVΔC7L感染(图17B)。这些结果指示，MDA5介导的胞质dsRNA传感途径和STING介导的胞质DNA传感途径在宿主防御VACVΔC7L感染中起协同作用。
[0218] 实施例18：鼻内感染VACVΔC7L导致树突细胞(DC)、嗜中性粒细胞、CD8+和CD4+T细胞流入被感染肺的支气管肺泡腔中。
[0219] 为了理解在鼻内感染模型中VACVΔC7L与WT VACV相比毒力显著降低的情况，对WT VACV或VACVΔC7L感染的小鼠的支气管肺泡灌洗液(BAL)进行了免疫细胞分析。将小鼠用VACV以2x 105pfu或用VACVΔC7L以2x 107pfu感染，或用PBS假感染。在感染或PBS处理后3和6天收集BAL。观察到在PBS假感染的小鼠的BAL中，Siglec F+CD11c+肺部驻留肺泡巨噬细胞+ + +
包含大部分的CD45细胞。在感染后第6天，WT VACV感染导致Siglec FCD11c巨噬细胞的绝对数量减少，而不影响BAL中的其他骨髓细胞群(图18A-18C)。相比之下，在感染后第6天，VACVΔC7L感染导致CD45+骨髓细胞大量流入支气管肺泡腔中。观察到在VACVΔC7L感染后，cDC和嗜中性粒细胞被募集到支气管肺泡腔中，而在WT VACV感染的情况下未被募集(图+
18D-18I)。在感染后第6天，cDC的百分比从来自PBS假处理的小鼠的BAL中占CD45 细胞的
1.7％增加到来自VACVΔC7L感染的小鼠的BAL中占CD45+细胞的16％(图18D-18F)。在VACVΔC7L感染的肺的BAL中，其他骨髓细胞(如嗜中性粒细胞)也有所增加(图18G-18I)。DC对于将病毒抗原呈递给幼稚T细胞以在引流淋巴结中产生抗病毒T细胞很重要。在VACVΔC7L感+ +
染后第6天，在BAL中，DC向肺泡腔募集增加与CD4和CD8T细胞的增加正相关。在病毒感染后第6天，CD4+T细胞占CD45+细胞的百分比从来自PBS假处理小鼠的BAL中的0.1％增加到来自VACVΔC7L感染的小鼠的BAL中的11％(图18L-18M)。最引人注目的是，与WT VACV感染的小鼠相比，VACVΔC7L感染导致更高百分比的CD8+T细胞的募集(在VACVΔC7L感染的小鼠中CD8+T细胞占CD45+T细胞的38％对比在WT VACV感染的小鼠中CD8+T细胞占CD45+的2％)(图
18J-18K)。综上所述，这些结果指示，VACVΔC7L感染导致树突细胞、嗜中性粒细胞、CD8+和CD4+T细胞募集到被感染肺的支气管肺泡腔中，然而WT VACV感染则不会。
包含大部分的CD45细胞。在感染后第6天，WT VACV感染导致Siglec FCD11c巨噬细胞的绝对数量减少，而不影响BAL中的其他骨髓细胞群(图18A-18C)。相比之下，在感染后第6天，VACVΔC7L感染导致CD45+骨髓细胞大量流入支气管肺泡腔中。观察到在VACVΔC7L感染后，cDC和嗜中性粒细胞被募集到支气管肺泡腔中，而在WT VACV感染的情况下未被募集(图+
18D-18I)。在感染后第6天，cDC的百分比从来自PBS假处理的小鼠的BAL中占CD45 细胞的
1.7％增加到来自VACVΔC7L感染的小鼠的BAL中占CD45+细胞的16％(图18D-18F)。在VACVΔC7L感染的肺的BAL中，其他骨髓细胞(如嗜中性粒细胞)也有所增加(图18G-18I)。DC对于将病毒抗原呈递给幼稚T细胞以在引流淋巴结中产生抗病毒T细胞很重要。在VACVΔC7L感+ +
染后第6天，在BAL中，DC向肺泡腔募集增加与CD4和CD8T细胞的增加正相关。在病毒感染后第6天，CD4+T细胞占CD45+细胞的百分比从来自PBS假处理小鼠的BAL中的0.1％增加到来自VACVΔC7L感染的小鼠的BAL中的11％(图18L-18M)。最引人注目的是，与WT VACV感染的小鼠相比，VACVΔC7L感染导致更高百分比的CD8+T细胞的募集(在VACVΔC7L感染的小鼠中CD8+T细胞占CD45+T细胞的38％对比在WT VACV感染的小鼠中CD8+T细胞占CD45+的2％)(图
18J-18K)。综上所述，这些结果指示，VACVΔC7L感染导致树突细胞、嗜中性粒细胞、CD8+和CD4+T细胞募集到被感染肺的支气管肺泡腔中，然而WT VACV感染则不会。
[0220] 实施例19：I型IFN信号传导对于CD8 T细胞浸润到支气管肺泡腔是必需的。
[0221] 在用VACVΔC7L以2x 105pfu感染后第5天，检查了WT、STAT2-/-或IFNAR1-/-小鼠的BAL中的CD8+T细胞群。发现尽管在WT小鼠中鼻内感染VACVΔC7L病毒导致CD8+T细胞募集进入BAL中，但是在STAT2-/-或IFNAR-/-小鼠中CD8+T细胞的数量却可忽略，这指示对于将CD8+T细胞募集到支气管肺泡腔中，与IFNAR1和JAK/STAT途径相比，I型IFN信号传导至关重要(图19A-19B)。
[0222] 实施例20：鼻内感染VACVΔC7L导致CD8+和CD4+T细胞募集进入肺实质中。
[0223] 为了检查鼻内感染WT VACV或VACVΔC7L对肺实质中CD8+和CD4+T细胞的影响，将WT C57BL6/J小鼠用WT VACV或VACVΔC7L以2x 105pfu感染。感染后6天收集肺，并且用胶原酶D消化。将单细胞悬浮液用抗CD45、抗CD3、抗CD4和抗CD8抗体染色，并且FACS分析显示VACVΔ+ +C7L感染导致肺实质中的CD8T细胞增加了2倍以上，然而WT VACV感染导致CD8T细胞占CD45+T细胞的百分比变化很小(图20A)。VACVΔC7L感染导致肺实质中CD4+T细胞占CD45+T细胞的百分比略有增加，然而WT VACV感染导致肺实质中CD4+T细胞占CD45+T细胞的百分比显著降低(图20B)。
[0224] 实施例21：鼻内感染VACVΔC7L导致牛痘病毒B8R特异性CD8+T细胞的产生并且募集进入肺和支气管肺泡腔中。
[0225] 为了测试募集到BAL和肺实质的CD8+T细胞是否是病毒特异性的，将B8R20-27肽TSYKFESV(SEQ ID NO:8)脉冲的BMDC添加到来自用WT VACV以2x 105pfu或VACVΔC7L以2x 105pfu感染的小鼠的肺的单细胞悬浮液中。在将细胞固定并透化并且用抗IFN-γ抗体染色之前，在布雷菲德菌素A(5μg/ml)的存在下将它们孵育6h。与WT VACV病毒感染相比，VACVΔC7L感染导致肺实质中的IFN-γ+CD8+T细胞百分比更高(图21A)。在将细胞固定并透化并且用抗IFN-γ抗体染色之前，在布雷菲德菌素A(5μg/ml)的存在下，将用B8R20-27 TSYKFESV(SEQ ID NO:8)或用OVA257-264 SIINFEKL(SEQ ID NO:7)脉冲的BMDC与来自VACVΔC7L感染的小鼠的BAL的细胞一起孵育6h。图21B显示BAL中的CD8+T细胞与B8R20-27 TSYKFESV(SEQ ID NO:8)反应，但不与无关肽OVA257-264 SIINFEKL(SEQ ID NO:7)反应。这些结果指示，VACVΔC7L感染导致病毒特异性T细胞的产生并且将它们募集进入肺实质和BAL中。
[0226] 实施例22：宿主防御急性VACVΔC7L鼻内感染不需要CD8+T细胞。
[0227] 为了测试宿主防御急性VACVΔC7L感染是否需要CD8+T细胞，我们通过在第-1、+1、++3和+5天时腹膜内递送抗CD8抗体(200μg/小鼠)耗竭了CD8 T细胞，并且在第0天将小鼠用VACVΔC7L病毒以2x 107pfu感染。CD8+T细胞耗竭的效率通过CD8+T细胞耗竭或假耗竭小鼠的外周血的FACS分析来验证。观察到CD8+T细胞耗竭并不影响小鼠的重量减轻或存活(图
22A和22B)，这指示针对急性VACVΔC7L感染的保护不需要CD8+T细胞。
22A和22B)，这指示针对急性VACVΔC7L感染的保护不需要CD8+T细胞。
[0228] 实施例23：鼻内感染VACVΔC7L导致IFN-β、促炎细胞因子和趋化因子释放到支气管肺泡腔中。
[0229] 鉴于T细胞介导的适应性免疫可能在宿主针对急性VACVΔC7L感染的保护中没有发挥重要作用，分析了对WT VACV或VACVΔC7L感染的先天免疫应答。在鼻内感染后1和3天收集BAL，并且通过ELISA测试IFN-β的浓度，并且通过Luminex Multiplex测定测试其他细胞因子和趋化因子的水平。与感染后第1天收集的BAL中的IFN-β浓度水平相比，VACVΔC7L感染增加了感染后第3天收集的BAL中的IFN-β浓度水平，然而WT VACV感染则未能诱导(图23A)。Luminex测定显示，与感染后第1天收集的BAL中的MCP-1(CCL-2)、IP-10(CXCL10)、MIG(CXCL9)和IFN-β的浓度相比，VACVΔC7L感染还增加了感染后第3天收集的BAL中的MCP-1(CCL-2)、IP-10(CXCL10)、MIG(CXCL9)和IFN-β的浓度。(图23B和23C)。这些结果指示，VACVΔC7L感染导致IFN-β以及促炎细胞因子和趋化因子释放进入BAL中，然而WTVACV感染则没有。
[0230] 实施例24：在IFNβ/YFP报告小鼠中，VACVΔC7L感染诱导从II型肺泡上皮细胞(AECII)产生IFN-β。
[0231] 为了测试鼻内感染VACVΔC7L后，哪些细胞群负责产生IFN-β，将WT小鼠和IFNB/黄色荧光蛋白(YFP)报告小鼠用VACVΔC7L以2x 107pfu感染。在Locksley博士的实验室中产生了IFNB/YFP敲入小鼠(其中YFP由通过内部核糖体进入位点与内源性IFNβmRNA相连的双顺反子mRNA表达)，并且所述小鼠为在单细胞水平上跟踪IFN-β产生细胞提供了工具(Scheu等人,2008)。感染后48h，收集感染小鼠的肺并且在1％低熔点琼脂的存在下在室温(RT)下用分散酶消化30min。产生单细胞悬浮液并且进行FACS分析。观察到大多数IFN-β/YFP+细胞位于CD45-细胞群中(图24)。其中，EpCAM+细胞群具有最高的IFN-β/YFP+细胞百分比。当排除+ +CD31 细胞(内皮细胞)和Tla 细胞(I型肺泡上皮细胞；AECI)时，观察到II型肺泡上皮细胞(AECII)具有最高的IFN-β/YFP+细胞百分比(图24)。结果指示，鼻内感染VACVΔC7L后，AECII是促成IFN-β产生的最重要细胞类型。
[0232] 实施例25：VACVΔC7L感染诱导从肺II型肺泡上皮细胞产生IFN-β、CCL4和CCL5。
[0233] 为了测试肺AECII对WT VACV与VACVΔC7L感染的先天免疫应答，通过FACS对CD45-CD16-CD32-CD31-EpCAMhiCD104+细胞进行分选来分离谱系阴性上皮细胞祖细胞(LNEP)(图25A)。将这些细胞在角质形成细胞生长因子的存在下在基质胶包被的24孔板上培养4天。分化的细胞表达表面活性剂C，其是AECII的标记(图25B)。将细胞用WT VACV或VACVΔC7L病毒以10的MOI感染，并且在12h收集细胞用于RNA提取和定量实时PCR分析。与WTVACV相比，VACVΔC7L感染诱导了更高水平的Ifnb、Ccl4、Ccl5基因表达(图25C)。感染后24h收集被感染的AECII上清液，并且测试其IFN-β、CCL4和CCL5水平。AECII的VACVΔC7L感染诱导IFN-β、CCL4和CCL5分泌到上清液中，然而WT VACV感染则未能诱导(图25D)。这些结果指示，VACVΔC7L感染激活肺AECII的先天免疫传感机制，从而导致IFN-β、CCL4和CCL5的产生。
[0234] 实施例26：鼻内施用IFN-β使小鼠免于致死性VACV感染。
[0235] 为了测试肺支气管肺泡腔中的IFN-β是否足以保护小鼠免受WT VACV的致死性感染，将WT C57BL/6J小鼠用WT VACV以2x 106pfu鼻内感染，然后每只小鼠鼻内施用1μg重组IFN-β或施用PBS。监测小鼠的重量减轻和存活。发现所有未经IFN-β处理的WT VACV感染的小鼠均死亡，然而所有经IFN-β处理的小鼠仅短暂地重量减轻并且存活。这些结果指示，在肺AEC中，IFN-β处理足以限制VACV的致死性攻击。
[0236] 实施例27：在B16-F10鼠黑素瘤细胞中，MVAΔC7L比MVA引起更强的先天免疫应答。
[0237] 为了测试在鼠B16-F10黑素瘤细胞中MVAΔC7L是否比MVA诱导更强的先天免疫应答，将B16-F10细胞用MVAΔC7L或MVA以10的MOI感染。在感染后8和48h收集细胞。定量实时PCR分析显示，与MVA相比，MVAΔC7L诱导了更高水平的Ifnb、Ccl4、Ccl5和Cxcl10基因表达(图27A-27D)。这些结果指示，在肿瘤细胞中，MVAΔC7L比MVA具有更高的免疫刺激性。因此，这些结果显示，MVAΔC7L有用于诱导先天免疫应答的方法。
[0238] 实施例28：在双侧B16-F10肿瘤植入模型中，瘤内(IT)注射MVAΔC7L比MVA更有效。
[0239] 基于相对于MVA，MVAΔC7L诱导更高水平的I型IFN、促炎细胞因子和趋化因子的能力，在体内鼠肿瘤模型中评估了MVAΔC7L充当比MVA更强的免疫刺激剂的能力。使用了鼠双侧B16-F10肿瘤植入模型。简言之，将B16-F10黑素瘤细胞皮内植入C57B/6小鼠的左右侧腹(右侧腹5x 105，左侧腹1x 105)。肿瘤植入后9天，每两周一次将2x 107PFU的MVA或MVAΔC7L注射进右侧腹较大的肿瘤内(图28A)。初始注射的和未注射的肿瘤的体积在图28C和28D中示出。在用PBS处理的小鼠中，肿瘤生长迅速，这导致早期死亡(图28B)。与PBS相比，瘤内注射MVAΔC7L或MVA导致肿瘤生长延迟和存活提高(图28B)。在根除已注射的肿瘤并且延迟对侧未注射的肿瘤生长方面，瘤内注射MVAΔC7L比MVA更有效(图28C和28D)，这导致与MVA处理的小鼠相比，MVAΔC7L处理的小鼠的存活提高(图28B)。因此，这些结果显示，MVAΔC7L有用于治疗实体瘤的方法。
[0240] 实施例29：与MVA相比，瘤内注射MVAΔC7L诱导更强的CD8+和CD4+免疫应答。
[0241] 为了测试与MVA相比，在注射的和未注射的远端肿瘤中IT MVAΔC7L是否诱导更高水平的激活的CD8+和CD4+T细胞，诸位发明人在双侧B16-F10黑素瘤植入模型中进行了以下实验。肿瘤植入后，将较大的肿瘤用MVA或MVAΔC7L或PBS注射两次，间隔三天。在第二次注射后2天，收获注射的和未注射的远端肿瘤。分析了活的肿瘤浸润的淋巴细胞(TIL)。在注射的肿瘤中，IT MVA和MVAΔC7L均诱导了高水平的激活的颗粒酶+CD8+和CD4+T细胞(图29A)。另外，在注射的肿瘤的引流淋巴结中，与IT MVA处理的小鼠相比，IT MVAΔC7L引起了更高百分比的TRP2+CD8+T细胞(图29C)。在未注射的肿瘤中，与IT MVA相比，IT MVAΔC7L诱导了更高水平的颗粒酶+CD8+和CD4+T细胞(图29B)。在未注射的肿瘤的引流淋巴结中，与MVA处理的小鼠相比，MVAΔC7L处理的小鼠中也存在更高百分比的TRP2+CD8+T细胞(图29D)。这些结果指示，在注射的和未注射的肿瘤以及TDLN中，与MVA相比，IT MVAΔC7L均产生了更强的抗肿瘤CD8+和CD4+T细胞免疫应答。
[0242] 实施例30：用于癌症免疫疗法的MVAΔC7L-hFlt3L重组病毒的产生。
[0243] 使用pC7LhFlt3L-GFP载体将具有在牛痘合成早期和晚期启动子(PsE/L)控制下的人Flt3L(hFlt3L)和在牛痘P7.5启动子控制下的GFP的表达盒插入MVA的C7L基因座中。将表达盒两侧侧接C6R和C8R。表1提供了侧接C6R和C8R序列的示例性表达盒，其包含在牛痘合成早期和晚期启动子(PsE/L)的控制下的hFlt3L和在牛痘P7.5启动子控制下的GFP。将鸡胚成纤维细胞(CEF)用MVA以0.05的MOI感染1h，然后用上述质粒DNA转染(图30A)。在48h收集感染的细胞。将重组病毒(GFP插入C7基因座中)通过绿色荧光鉴定。在CEF上将阳性克隆噬斑纯化4-5次。进行PCR分析以确认重组病毒MVAΔC7L-hFlt3L具有GFP-hFlt3L盒的插入(图30B)。对插入的质粒DNA进行PCR扩增和测序，以验证插入物的序列。
[0244] 使用多步生长测定测试了重组MVAΔC7L-hFlt3L病毒在BHK21细胞和CEF中的复制能力。简言之，将BHK21和CEF用MVAΔC7L-hFlt3L以0.05的MOI感染。在感染后1、24、48和72h收集细胞。在BHK21细胞上确定病毒滴度。在BHK21和CEF中，MVAΔC7L-hFlt3L均强劲复制(图30C)。
[0245] 表1.插入以替换MVA基因组中的C7基因的侧接C6和C8序列的包含在牛痘p7.5启动子控制下的GFP和在牛痘合成早期和晚期启动子(PsE/L)控制下的hFlt3L基因的基因表达盒(SEQ ID NO:9)。
[0246]
[0247] 实施例31：通过重组MVAΔC7L-hFlt3L病毒表达转基因人Flt3L和GFP。
[0248] 为了测试重组病毒MVAΔC7L-hFlt3L是否表达两个转基因hFlt3L和GFP，将BHK21、B16-F10鼠黑素瘤、SK-MEL28、SK-MEL31和SK-MEL146人黑素瘤细胞用MVAΔC7L(表达GFP)或MVAΔC7L-hFlt3L(表达GFP)以10的MOI感染。感染后24h收集细胞，并且通过FACS分析hFlt3L和GFP的表达。在感染的细胞上，MVAΔC7L-hFlt3L感染诱导了更高水平的GFP和hFlt3L表达(图31)。
[0249] 实施例32：MC38鼠结肠腺癌细胞的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L感染诱导I型IFN和炎性细胞因子/趋化因子的产生。
[0250] 为了确定在其他类型的实体瘤细胞中MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L是否触发类似的应答，在MC38结肠腺癌细胞中测试了MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L诱导I型IFN途径的能力。将MC38细胞用MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L以10的MOI感染，或用假感染对照感染。在感染后22h收集上清液。使用ELISA分析MC38细胞中IFN-β、IL-6、CCL4、CCL5和CXCL10的水平。实时PCR分析将评估MC38细胞中的Ifnb、1l6、Ccl4、Ccl5、Cxcl10基因表达水平。Western印迹分析将评估感染后22h在MC38细胞中IRF3的磷酸化水平。预期这些实验将显示本发明的治疗的功效不限于黑素瘤，并且本发明技术的组合物可以用作治疗实体瘤的免疫治疗剂。因此，此实施例将显示MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L有用于诱导先天免疫应答以治疗实体瘤的方法。
[0251] 实施例33：MC38鼠结肠腺癌细胞的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L感染诱导细胞凋亡。
[0252] 为了研究在MC38鼠结肠腺癌细胞中MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L是否也触发细胞凋亡，将MC38细胞用MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L以10的MOI感染，或用假感染对照感染。预期Western印迹分析将显示MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L触发PARP从116kDa的全长蛋白质切割为89kDa的片段。还预期MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L将在不同类型的癌细胞中触发细胞凋亡。预期这些实验将指示由本发明的病毒引起的免疫应答一直持续到细胞凋亡，从而导致癌细胞死亡，从而进一步将目前公开的治疗证实作为治疗黑素瘤、结肠癌、一般癌症和实体瘤的可行方法。因此，此实施例将显示MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L有用于治疗实体瘤的方法。
[0253] 实施例34：在结肠癌的鼠模型中，MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L抑制肿瘤发生。
[0254] 为了测试在其他实体瘤中MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L是否能够抑制肿瘤生长，在鼠结肠癌植入模型中测试了MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L的抗肿瘤作用。结肠癌是与黑素瘤不相关的肿瘤的代表。将2x 105个MC38结肠癌细胞皮内植入C57B/6小鼠的右侧腹中。允许肿瘤形成7天，然后将MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L(2x 107)或PBS对照瘤内注射到小鼠中。在注射前(第0天)和注射后长达45天测量肿瘤，并且根据以下公式计算肿瘤体积：l(长)x w(宽)x h(高)/2。预期用MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L处理的肿瘤明显小于PBS处理的肿瘤。此外，预期用MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L处理的小鼠展现出提高的存活，如通过用PBS或MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L注射的荷瘤小鼠的Kaplan-Meier存活曲线所证明。共同地，这些结果将显示在结肠癌以及黑素瘤的背景下，MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L维持抑制肿瘤发生和肿瘤生长的能力。因此，这些结果将证明MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L在各种实体瘤中均有效地促进抗肿瘤作用，并且本发明技术的应用不限于黑素瘤，而是可以外推到其他各种来源的实体瘤。因此，此实施例将显示MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L有用于治疗实体瘤的方法。
[0255] 实施例35：在单侧黑素瘤植入模型中，瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L与腹膜内递送免疫检查点阻断抗体的组合。
[0256] 本发明病毒的瘤内注射将用于增强当前免疫疗法(如免疫检查点(例如，抗CTLA-4抗体)的阻断)的治疗效果，将荷瘤小鼠用MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的瘤内注射与抗CTLA-4抗体的腹膜内递送的组合进行处理。简言之，将B16-F10黑素瘤细胞(2x 105)皮内植入WT C57B/6小鼠的右侧腹中。肿瘤植入后十天，将小鼠用以下组合处理：PBS+同种型对照，PBS+抗CTLA-4抗体，MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L+同种型对照和MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L+抗CTLA-4。预期与单独的免疫检查点阻断或者单独的MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L处理相比，用MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L和抗CTLA-4抗体处理将产生优越的治疗功效。因此，此实施例将显示包含MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L与免疫检查点阻断剂的组合的组合物有用于治疗实体瘤的方法。
[0257] 实施例36：在双侧黑素瘤植入模型中，瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L与腹膜内递送免疫检查点阻断的组合。
[0258] 分析了在双侧B16-F10黑素瘤模型(其还模拟患有转移性疾病的个体)中，瘤内注射的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的治疗效果以及所述处理是否增强免疫检查点阻断疗法(如抗CTLA-4、抗PD-1或抗PD-L1抗体)。简言之，将B16-F10黑素瘤细胞皮内植入C57B/6小鼠的左右侧腹(右侧腹5x 105，左侧腹1x 105)。肿瘤植入后8天，将MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L(2x 107pfu的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L)或PBS瘤内注射进右侧腹较大的肿瘤中，每周两次。将四组小鼠用MVAΔC7L处理，将四组小鼠用MVAΔC7L-hFlt3L处理，将四组小鼠用VACVΔC7L处理，并且将四组小鼠用VACVΔC7L-hFlt3L处理，每组接受同种型对照或者抗CTLA-4或抗PD-1或抗PD-L1抗体的腹膜内递送。
[0259] 预期与瘤内注射单独的检查点抑制剂或者单独的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L相比，MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的瘤内注射和检查点抑制剂(以抗CTLcomA-4、抗PD-1和抗PD-L1抗体为代表)的全身递送的组合将进一步延迟生长或根除未注射的肿瘤。
[0260] 预期结果将显示MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的瘤内递送克服了在转移性B16黑素瘤模型中对免疫检查点阻断的治疗抗性，这很好地预示了将这种方法转移到人类疗法的有益结果。因此，此实施例将显示包含MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L与免疫检查点阻断剂的组合的组合物有用于治疗实体瘤的方法。
[0261] 实施例37：在双侧MC38结肠腺癌植入模型中，瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L与腹膜内递送免疫检查点阻断的组合。
[0262] 涉及瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的实验将显示在另一种双侧肿瘤植入模型(其模拟患有转移性疾病的受试者)中免疫检查点阻断疗法(如抗CTLA-4、抗或抗PD-L1)的治疗效果增强。简言之，将MC38结肠腺癌细胞皮内植入C57B/6小鼠的左右侧腹(右侧腹5x 105，左侧腹1x 105)。肿瘤植入后8天，将MVAΔC7L、MVA7
ΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L(2x 10pfu的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L)或PBS瘤内注射进右侧腹较大的肿瘤中，每周两次。将三组小鼠用PBS处理，每组接受同种型对照或者抗CTLA-4或抗PD-L1抗体的腹膜内递送。对于MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L中的每一种，将另外三组小鼠用MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L处理，每组接受同种型对照或者抗CTLA-4或抗PD-L1抗体的腹膜内递送。然后将每组分为也用MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L处理的亚组。也将提供仅用病毒处理的对照。
ΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L(2x 10pfu的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L)或PBS瘤内注射进右侧腹较大的肿瘤中，每周两次。将三组小鼠用PBS处理，每组接受同种型对照或者抗CTLA-4或抗PD-L1抗体的腹膜内递送。对于MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L中的每一种，将另外三组小鼠用MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L处理，每组接受同种型对照或者抗CTLA-4或抗PD-L1抗体的腹膜内递送。然后将每组分为也用MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L处理的亚组。也将提供仅用病毒处理的对照。
[0263] 将监测和评价每组小鼠的注射的和未注射的肿瘤的肿瘤体积。此外，将监测每个处理组的存活。
[0264] 预期MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的瘤内递送与检查点阻断(以抗CTLA-4抗体的腹膜内递送为代表)的组合或者MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的瘤内递送与抗PD-1/PD-L1的腹膜内递送的组合将导致根除未注射的远端肿瘤的效率高于MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L。因此，预期这些结果显示与单独的检查点阻断或单独的病毒相比，使用MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L和免疫检查点阻断的组合改善转移性实体瘤的治疗。更具体地说，预期注射的和未注射的肿瘤的大小均将减小，甚至根除至比任何一种类型的单一疗法所达到的程度更大的程度，并且预期结果将持续存在至少45天以上，从而验证了用于原发性和转移性实体瘤治疗的组合方法。因此，此实施例将显示包含MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L与免疫检查点阻断剂的组合的组合物有用于治疗实体瘤的方法。
[0265] 实施例38：在双侧B16-F10植入模型中，瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L与腹膜内递送免疫检查点阻断抗CTLA-4抗体的组合。
[0266] 此实施例将评估MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L与免疫检查点阻断(以抗CTLA-4抗体为代表)(以1/10的剂量用于腹膜内递送)的共给予将在严格的双侧肿瘤植入模型中达到抗肿瘤作用。简言之，将B16-F10黑素瘤细胞皮内植入5 5
C57B/6小鼠的左右侧腹(右侧腹5x 10 ，左侧腹1x 10)。肿瘤植入后8天，将MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L(2x 107pfu的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L)或PBS瘤内注射进右侧腹较大的肿瘤中，每周两次。将MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L中的每一种的三组小鼠用MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L处理，每组接受：(i)腹膜内递送抗CTLA-4(100μg/小鼠)、(ii)瘤内递送同种型抗体(10μg/小鼠)或(iii)瘤内递送抗CTLA-4抗体(10μg/小鼠)。
C57B/6小鼠的左右侧腹(右侧腹5x 10 ，左侧腹1x 10)。肿瘤植入后8天，将MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L(2x 107pfu的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L)或PBS瘤内注射进右侧腹较大的肿瘤中，每周两次。将MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L中的每一种的三组小鼠用MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L处理，每组接受：(i)腹膜内递送抗CTLA-4(100μg/小鼠)、(ii)瘤内递送同种型抗体(10μg/小鼠)或(iii)瘤内递送抗CTLA-4抗体(10μg/小鼠)。
[0267] 将监测和评价注射的和未注射的肿瘤的肿瘤体积。诸位发明人预期MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L和检查点阻断(抗CTLA-4抗体，以10μg/小鼠)的瘤内共注射将与MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的瘤内注射和抗CTLA-4抗体(100μg/小鼠)的腹膜内递送的组合的治疗效果相当。预期MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L和大幅降低的剂量的免疫检查点阻断的共给予可以达到与MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的瘤内递送与较高剂量的抗CTLA-4抗体的全身递送的组合类似的全身抗肿瘤作用。因此，此实施例将显示包含MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L与免疫检查点阻断剂的组合的组合物有用于治疗实体瘤的方法。
[0268] 实施例39：在双侧MC38肿瘤植入模型中，瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L和VACVΔC7L-hFlt3L是有效的。
[0269] 为了分析MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L在不同的实体瘤模型中的抗肿瘤功效，将5x 105，个MC38结肠癌细胞皮内植入C57B/6小鼠的右侧腹中，并且将1x 105个细胞皮内植入C57B/6小鼠的左侧腹中。允许肿瘤生长7-8天，然后将MVAΔC7L或MVAΔC7L-hFlt3L(2x 107pfu)或者PBS对照注射进较大的肿瘤中，每周两次。
[0270] 预期瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L延长中值存活期。预期在双侧MC38肿瘤植入模型中，MVAΔC7L-hFlt3L或VACVΔC7L-hFlt3L将比MVAΔC7L或VACVΔC7L更有效。因此，预期包含MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的组合物将有用于治疗实体瘤的方法。
[0271] 实施例40：在鼠三阴性乳腺癌4T1双侧植入模型中，瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L也有效。
[0272] 除了B16-F10鼠黑素瘤和MC38结肠腺癌模型外，还研究了瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L在三阴性乳腺癌(TNBC)4T1双侧肿瘤植入模型的治疗中是否具有功效。简言之，将4T1鼠三阴性乳腺癌(TNBC)细胞皮内植入BALB/c小鼠的左右侧腹(右侧腹2.5x 105，左侧腹5x 104)。肿瘤植入后5天，为右侧腹较大的肿瘤注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L(2x 107pfu)，每周两次。每天监测小鼠，并且每周测量两次肿瘤大小。监测小鼠的存活。预期与PBS处理的肿瘤相比，瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L将导致注射的肿瘤的肿瘤体积减小。这些结果将显示在双侧4T1乳腺癌模型中，瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L有效延迟肿瘤生长并且延长被治疗小鼠的存活期。基于这些结果，预期在这种双侧4T1植入模型中，MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L与免疫检查点阻断(如抗CTLA-4或抗PD-1/PD-L1抗体)的组合将比单独的病毒疗法更有效。
[0273] 实施例41：在鼠前列腺癌TRAMP-C2单侧肿瘤植入模型(其需要STING)中，瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L是有效的。
[0274] 研究了瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L在鼠前列腺腺癌TRAMP-C2单侧肿瘤植入模型的治疗中是否具有功效。简言之，将TRAMP-C2细胞皮内植入STINGGt/Gt小鼠和年龄匹配的WT C57B/6对照的剃毛的右侧腹中(在50μl PBS中1x 106个细胞/小鼠)。肿瘤植入后17天，为右侧腹的肿瘤(直径约3-4mm)注射PBS或者MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L(2x 107pfu)，每周两次。每天监测小鼠，并且每周测量两次肿瘤大小。监测小鼠的存活。预期与PBS处理的肿瘤相比，瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L导致WT小鼠的注射的肿瘤的肿瘤体积显著减小，但是这在STING缺陷型小鼠中效果较差。预期在WT和STINGGt/Gt小鼠中，MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L将均具有抗肿瘤作用。因此，预期包含MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的组合物将有用于治疗实体瘤的方法。
[0275] 实施例42：在双侧B16-F10黑素瘤植入模型中，瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L也是有效的。
[0276] 为了测试瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L在双侧B16-F10植入模型中是否发挥抗肿瘤作用，将MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L或者PBS注射进较大的肿瘤中，每周两次，并且监测肿瘤大小和存活。预期相对于PBS组，瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L将根除或延迟注射的和未注射的肿瘤的肿瘤生长，并且延长中值存活期。这些结果将显示，在双侧肿瘤植入模型中，瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L对抗肿瘤也是有效的。因此，预期包含MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的组合物将有用于治疗实体瘤的方法。
[0277] 实施例43：在双侧B16-F10黑素瘤植入模型中，瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L与全身递送免疫检查点的组合具有协同抗肿瘤作用。
[0278] 此实施例将测试在双侧B16-F10黑素瘤植入模型中，MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的瘤内注射与免疫检查点阻断的全身递送的组合是否将比单独的病毒疗法导致更好地杀死肿瘤并且提高存活。肿瘤植入后8天，将MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L病毒注射进右侧腹较大的肿瘤中，每周两次。将四组小鼠用MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L处理，每组接受同种型对照或者抗CTLA-4或抗PD-1或抗PD-L1抗体的腹膜内递送。预期与PBS组相比，用MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L+同种型处理将显著延长存活期。
预期与单独的瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L相比，MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的瘤内注射与抗CTLA-4、抗PD-1和抗PD-L1抗体的全身递送的组合在根除或延迟注射的和未注射的肿瘤的生长方面具有协同作用。因此，预期包含单独的或与免疫检查点阻断剂组合的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的组合物将有用于治疗实体瘤的方法。
预期与单独的瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L相比，MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的瘤内注射与抗CTLA-4、抗PD-1和抗PD-L1抗体的全身递送的组合在根除或延迟注射的和未注射的肿瘤的生长方面具有协同作用。因此，预期包含单独的或与免疫检查点阻断剂组合的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的组合物将有用于治疗实体瘤的方法。
[0279] 实施例44：瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L导致抗肿瘤CD8+T细胞免疫的产生，其在抗CTLA-4抗体的存在下增强。
[0280] 通过使用酶联免疫斑点(ELISpot)检查了在单独地或在存在腹膜内递送抗CTLA-4抗体的情况下用瘤内注射MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L处理后，存活的小鼠是否对B16-F10和MC38结肠癌产生了抗肿瘤记忆T细胞免疫。简言之，从脾细胞中分离CD8+T细胞，并且在抗IFN-γ包被的BD ELISPOT板微孔中，将1x 105个细胞在37℃下培养过夜。将CD8+T细胞用γ辐射器辐照的B16-F10或MC38细胞刺激，并且用抗IFN-γ抗体检测细胞因子分泌。预期具有免疫原性的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L牛痘感染导致在B16-F10和MC38癌细胞中均存在的肿瘤抗原的有效交叉呈递，这导致异源肿瘤交叉保护的形成。因此，预期包含单独的或与免疫检查点阻断剂组合的MVAΔC7L、MVAΔC7L-hFlt3L、VACVΔC7L或VACVΔC7L-hFlt3L的组合物将有用于治疗实体瘤的方法。
[0281] 参考文献
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[0363] 等效物
[0364] 在本申请中描述的具体实施方案方面本发明技术并不受限，旨在将所述实施方案作为本发明技术单独方面的单一说明。对于本领域技术人员清楚的是，可以在不背离本发明技术的精神和范围的情况下，对本发明技术进行多种修改和改变。本领域技术人员根据前述描述将清楚，除了本文列举的方法和装置外，在本发明技术范围内的功能上等效的方法和装置。此类修改和改变旨在落于所附权利要求的范围内。本发明技术仅由所附权利要求的条款以及此类权利要求授权的等效物的全部范围来限定。应当理解，本发明技术不限于具体方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，它们当然可以改变。还应当理解，本文所用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，而不旨在是限制性的。
[0365] 另外，在本公开文本的特征或方面按马库什群组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员应认识到，本公开文本也从而按马库什群组的任何单独成员或成员亚组来描述。
[0366] 本领域技术人员应理解，出于任何和所有目的，特别是就提供书面描述而言，本文公开的所有范围还涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。任何所列范围都可以容易地识别为充分描述相同范围并且使得相同范围能分解为至少相等的二分之一、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性例子，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。同样本领域技术人员应理解，诸如“高达(upto)”、“至少(at least)”、“大于(greater than)”、“小于(less than)”等所有言辞都包括所述数字并且涉及随后可以分解为如上文所讨论的子范围的范围。最后，本领域技术人员应理解，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1、2或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1、2、3、4或5个细胞的组等等。
[0368] 其他实施方案在以下权利要求中提出。
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