一种表达BVDV-E0的重组牛肠道病毒的构建方法与初步应用
阅读：259发布：2023-12-23
专利汇可以提供一种表达BVDV-E0的重组牛肠道病毒的构建方法与初步应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种表达BVDV-E0的重组 牛 肠道病毒的构建方法及其初步应用，所述感染性克隆毒株是通过反向遗传操作的方法获得BEV BJ101毒株的全长cDNA克隆并获得拯救毒株rBEV后，将BVDV的E0序列插入到BEV全长cDNA中，获得可稳定表达外源基因E0的重组牛肠道病毒。所述rBEV-E0重组病毒的初步应用，将分离纯化后的重组病毒免疫6～8周龄的SPF级别的Balb/c雌鼠，在不同时间点收集其血清样本进行检测，小鼠不但可以稳定表达E0蛋白，并能对其产生有效的免疫应答。本发明的重组病毒可同时用于BEV和BVDV的防控，也为其他外源基因提供了合适的的rBEV插入位点，为后续外源基因的插入、重组病毒的制备等研究提供有效的技术平台。，下面是一种表达BVDV-E0的重组牛肠道病毒的构建方法与初步应用专利的具体信息内容。
1.一种表达牛病毒性腹泻病毒E0基因(BVDV-E0)的BEV重组病毒，包括牛肠道病毒，所述牛肠道病毒的感染性克隆毒株是BEV BJ101株的克隆毒株，具有SEQ ID NO.1所示的全基因序列，其特征在于：所述感染性克隆毒株是通过反向遗传操作的方法获得BEV BJ101毒株的全长cDNA克隆并获得拯救毒株rBEV后，将优化后的牛病毒性腹泻病毒E0序列插入到BEV全长cDNA中，获得可稳定表达外源基因E0的重组牛肠道病毒，所述E0序列具有如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的一种表达BVDV-E0的重组牛肠道病毒其特征在于：在所述BEV全长cDNA的非结构蛋白2C和3A之间插入优化后的牛病毒性腹泻病毒E0序列。
3.根据权利要求2所述的一种表达BVDV-E0的重组牛肠道病毒,其特征在于:所述牛病毒性腹泻病毒的E0基因的优化包括在构建好的含有GpBSK-rBEV的质粒的2A和3C基因序列之间插入牛病毒性腹泻病毒的E0基因，对E0的基因序列先进行哺乳动物密码子优化，再在其
5’端添加合成GCCGGCCGC NotI酶切位点序列，在其3’端添加合成TCTAGA XbaI酶切位点序列(SEQ ID NO.2所示)，以便于通过NotI、XbaI双酶切后与引入NotI、XbaI双酶切位点的GpBSK-rBEV的质粒进行连接。
4.根据权利要求3所述的一种表达BVDV-E0的重组牛肠道病毒,其特征在于:在构建好的含有GpBSK-rBEV的质粒的2C和3A基因序列之间通过重叠PCR的方法引入NotI和XbaI双酶切位点.所述重叠延伸PCR引物包括3对引物对，分别为：P23-F,P23-2AF和EcoR5-R，从5’端到
3’端，引物对的具体序列如下：
P23-F:
GCAATAGGCGTTATAACATTGGGAACGTCCTCGAGGCACTCTTCCAGGGCGGCCGCTACCCATACG ACP23-2AF:
GGCGGCCGCTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTTCTAGACTGACCACATTGGGCCCAGTTTGCTACAAACCCCTC
EcoR5-R:
CCAGGGCCTCCAAGCCTTCAGTAC 。
5.根据权利要求2所述的一种表达BVDV-E0的重组牛肠道病毒,其特征在于:所述GpBSK-rBEV质粒为插入全长BEV BJ101全基因序列的GpBSK重组载体。
6.如权利要求1所述的一种表达BVDV-E0的重组牛肠道病毒动物实验的免疫应答的应用。
0
一种表达BVDV-E的重组牛肠道病毒的构建方法与初步应用
技术领域
[0001] 本发明属于兽用生物制品技术领域，涉及一种重组牛肠道病毒，尤其涉及一种表达BVDV-E0的重组牛肠道病毒(表达牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)E0蛋白)的构建方法及其初步应用。
背景技术
[0002] 20世纪50年代首次从牛体内分离到BEV，随后在负鼠、宽吻海豚、骆驼和羊驼等动物体内也分离到该病毒。BEV的病原性不明显，感染宿主后引起腹泻、呼吸困难和繁殖障碍。BEV为单股正链RNA病毒，属于肠病毒属，小RNA病毒科。肠道病毒属共12种型，BEV属于肠道病毒E型或F型。BEV基因组大小约7500bp，基因组包含5’非编码区、ORF、3’非编码，ORF编码结构蛋白(P1区编码的VP1,VP2,VP3和VP4)、非结构蛋白(P2区编码的2A,2B,2C以及P3区编码的3A,3B,3C和3D)。目前研究表明BEV具有稳定的物理性状、能够抵抗肠道酸性环境、可通过肠道途径进入宿主体内，且该病毒无毒力或毒力较弱。这些特性使BEV成为较好的疫苗候选载体。
[0003] 牛病毒性腹泻/粘膜病是由牛病毒性腹泻病毒引起的传染病,各种年龄的牛均易感染、以犊牛易感性最高,给我国乃至全球养殖产业带来了严重的经济损失。在BVDV病毒的结构蛋白中,E0蛋白保守性很高,并含有中和表位,产生的中和抗体具有中和BVDV的能力，被认为是BVDV亚单位疫苗的重要靶标抗原。
发明内容
[0004] 针对上述问题，本发明的目的就在于提供一种表达BVDV-E0的重组牛肠道病毒的构建方法及其初步应用。
[0005] 本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
[0006] 本发明包括牛肠道病毒，所述牛肠道病毒的感染性克隆毒株是BEV BJ101株的克隆毒株，具有SEQ ID NO.1所示的全基因序列，其特征在于：所述感染性克隆毒株是通过反向遗传操作的方法获得BEV BJ101毒株的全长cDNA克隆并获得拯救毒株rBEV后，将优化后的牛病毒性腹泻病毒E0序列插入到BEV全长cDNA中，获得可稳定表达外源基因E0的重组牛肠道病毒，所述E0序列具有如SEQ ID NO.2所示。
[0007] 具体地，在所述BEV全长cDNA的非结构蛋白2C和3A之间插入优化后的牛病毒性腹泻病毒E0序列。
[0008] 进一步地，所述牛病毒性腹泻病毒的E0基因的优化包括在构建好的含有GpBSK-rBEV的质粒的2A和3C基因序列之间插入牛病毒性腹泻病毒的E0基因，对E0的基因序列先进行哺乳动物密码子优化，再在其5’端添加合成GCCGGCCGC NotI酶切位点序列，在其3’端添加合成TCTAGA XbaI酶切位点序列(SEQ ID NO.2所示)，以便于通过NotI、XbaI双酶切后与引入NotI、XbaI双酶切位点的GpBSK-rBEV的质粒进行连接。
[0009] 具体地，在构建好的含有GpBSK-rBEV的质粒的2C和3A基因序列之间通过重叠PCR的方法引入NotI和XbaI双酶切位点.所述重叠延伸PCR引物包括3对引物对，分别为：P23-F,P23-2AF和EcoR5-R，从5’端到3’端，引物对的具体序列如下：
[0010] P23-F:
[0011] GCAATAGGCGTTATAACATTGGGAACGTCCTCGAGGCACTCTTCCAGGGCGGCCGCTACCCATACGAC[0012] P23-2AF:
[0013] GGCGGCCGCTACCCATACGACGTCCCAGACTACGCTTCTAGACTGACCACATTGGGCCCAGTTTGCTACAAACCCCTC
[0014] EcoR5-R:
[0015] CCAGGGCCTCCAAGCCTTCAGTAC
[0016] 作为优选，所述GpBSK-rBEV质粒为插入全长BEV BJ101全基因序列的GpBSK重组载体。
[0018] 本发明的有益效果在于：
[0019] 本发明对表达BVDV-E0的重组牛肠道病毒的初步应用，将分离纯化后的重组病毒免疫6～8周龄的SPF级别的Balb/c雌鼠，在不同时间点收集其血清样本进行检测，小鼠不但可以稳定表达E0蛋白，并能对其产生有效的免疫应答。附图说明
[0020] 下面结合附图和具体实施方式对发明作进一步详细说明。
[0021] 图1为重叠PCR引入双酶切位点的核酸电泳结果图；
[0022] 图2为pUC57-E0和GpBSK-rBEV双酶切结果图；
[0023] 图3为正常细胞和接毒的病变细胞的对比图；
[0024] 图4为重组病毒rBEV-E0进行核酸电泳检测结果图；
[0025] 图5A为重组病毒rBEV-E0和rBEV进行Western Blot鉴定结果中的VP1条带图；
[0026] 图5B为重组病毒rBEV-E0和rBEV进行Western Blot鉴定结果图中的E0条带图；
[0027] 图6为rBEV-E0感染细胞IFA检测结果图；
[0028] 图7为rBEV-E0磷钨酸负染电镜结果图；
[0029] 图8为重组病毒rBEV-E0的一步生长曲线图；
[0030] 图9为重组病毒免疫小鼠后产生VP1抗体的ELISA检测结果；
[0031] 图10重组病毒免疫小鼠后产生E0抗体的ELISA检测结果。
具体实施方式
[0032] 本实施例中，未注明具体条件的实验方法，均为常规实验方法。如《精编分子生物学实验指南》(F.M奥斯伯R布伦特R.E.金斯顿D.D穆尔等主编，金由辛.包慧中.赵丽云等译校.北京：科学出版社，2008)中所述的方法进行。
[0033] 实施例1表达BVDV-E0的重组牛肠道病毒基因组全长cDNA克隆的构建与鉴定1.GpBSK-rBEV质粒的2C和3A基因序列之间引入双酶切位点
[0034] 在构建好的含有GpBSK-rBEV的质粒的2C和3A基因序列之间通过重叠PCR的方法引入NotI和XbaI双酶切位点，引物见表1。首先以GpBSK-rBEV质粒为模板，以P23-2AF和EcoR5-R为引物(预扩增片段长度1270bp)，按照 HS(Premix)的说明书进行PCR，扩增产物通过10倍稀释后取1ul作为模板，以P23-F和EcoR5-R为引物(预扩增片段长度1317bp)，再使用 HS(Premix)进行PCR，核酸电泳结果如图1所示，纯化PCR产物后，在利
用XhoI和EcoRV限制性内切酶对其进行双酶切(酶切体系如下：1μg，重组质粒；10μL，5×CutSmart buffer；1μL，XhoI；1μL，EcoRV；加入RNase Free dH2O至50μL。37℃酶切反应3h，
65℃20min使限制性内切酶失活，冰上冷却，琼脂糖凝胶回收纯化)最后通过T4连接酶与同样经过XhoI和EcoRV双酶切的GpBSK-rBEV的质粒进行连接，获得了在2C和3A基因序列之间引入NotI和XbaI双酶切位点的GpBSK-rBEV质粒。
用XhoI和EcoRV限制性内切酶对其进行双酶切(酶切体系如下：1μg，重组质粒；10μL，5×CutSmart buffer；1μL，XhoI；1μL，EcoRV；加入RNase Free dH2O至50μL。37℃酶切反应3h，
65℃20min使限制性内切酶失活，冰上冷却，琼脂糖凝胶回收纯化)最后通过T4连接酶与同样经过XhoI和EcoRV双酶切的GpBSK-rBEV的质粒进行连接，获得了在2C和3A基因序列之间引入NotI和XbaI双酶切位点的GpBSK-rBEV质粒。
[0035] 表1重叠PCR引物
[0036]
[0037]
[0038] 2.基因合成牛病毒性腹泻病毒的E0基因
[0039] 在构建好的含有GpBSK-rBEV的质粒的2A和3C基因序列之间插入牛病毒性腹泻病毒的E0基因，对E0的基因序列(SEQ ID NO.1所示)进行哺乳动物密码子优化，在其5’端添加合成GCCGGCCGC NotI酶切位点序列，在其3’端添加合成TCTAGA XbaI酶切位点序列，将整个合成的基因序列连接到pUC57质粒载体上，命名为pUC57-E0，这样以便于通过NotI、XbaI双酶切后与引入NotI、XbaI双酶切位点的GpBSK-rBEV的质粒进行连接。
[0040] 2.构建GpBSK-rBEV-E0质粒
[0041] 如图2所示，对pUC57-E0质粒和GpBSK-rBEV质粒分别进行NotI、XbaI双酶切，酶切体系如下：1ug，重组质粒；10μL，5×CutSmart buffer；1μL，NotI；1μL，XbaI；加入RNase Free dH2O至50μL，37℃酶切反应3h，65℃20min使限制性内切酶失活，冰上冷却，经纯化后用T4连接酶16℃连接过夜，转入JM109感受态细胞中，挑选阳性克隆并进行测序，将正确的质粒命名为GpBSK-rBEV-E0。
[0042] 3重组质粒线性化及纯化
[0043] 3.1重组质粒的大量制备
[0044] 将鉴定阳性的菌液扩大培养200mL，按照艾德莱PhasePrep EndoFree Maxi Kit说明书提取质粒，具体操作步骤如下：菌液装入离心管中，10000g 4℃离心5min，弃掉上清。加入5mL P1溶液(已经加入RNase A),充分混匀细菌悬液，室温放置5min。加入5mL P2溶液，缓慢上下倒立离心管8次，切忌剧烈晃动引起基因组DNA断裂，室温放置5min直到菌液变得清凉粘稠。加入5mL P3溶液，立即颠倒混匀溶液，有白色絮状物出现，12000g 4℃离心10min，将上清移入新的离心管中。加入10mL异丙醇溶液，充分混匀液体，12000g 4℃离心10min，缓慢倒掉上清，沥干液体。加入5mL 70％乙醇溶液，12000g 4℃10min，倒掉上清，待沉淀干燥。加入1.4mL P1溶液，吹打管底和沉淀溶解质粒，将溶液移入到2个新的1.5mL的EP管中，60℃水浴15min消化残留RNA。取55μLA液，混合均匀，加入80μL刚刚融化的内毒素清除剂，充分混匀，冰浴10min，中间晃动几次。42℃水浴5min，12000g温室离心5min，溶液分为两层，吸取上层水相至新的1.5mL的EP管中，注意不要吸到蓝色含有内毒素等杂质的油相。加入750μL的B溶液，慢慢混合，12000g 4℃离心10min，弃上清。加入1mL 70％乙醇，12000g 4℃离心2min，弃上清，重复此步骤一次，沥干液体，彻底去除乙醇。加入50μL TE，充分吹打溶解质粒。
[0045] 3.2重组质粒单酶切线性化
[0046] 通过EcoR I对全长重组质粒GpBSK-rBEV-E0进行线性化。酶切体系如下：10μg，重组质粒；40μL，5×CutSmart buffer；8μL，EcoRI-HF；加入RNase Free dH2O至200μL。37℃酶切反应3h，65℃20min使限制性内切酶失活，冰上冷却，琼脂糖凝胶回收线性质粒。
[0047] 3.3乙醇沉淀回收线性化DNA
[0048] 应用乙醇沉淀回收方法纯化重组质粒单酶切产物，具体步骤如下：加入1/10体积的预冷的乙酸钠溶液(3mol/L，pH5.2)和2倍体积的预冷无水乙醇溶液，混匀后，-80℃作用30min。12000r/min 4℃离心30min，在超净台中小心去除上清。加入1mL 70％乙醇溶液，
12000r/min 4℃离心5min，弃掉上清，重复此操作，之后沥干溶液，使乙醇充分挥发。加入20μL RNase Free dH2O充分溶解DNA，测量DNA浓度，当OD260/280为1.8～2.0时用于下一步转染，-80℃保存备用。
12000r/min 4℃离心5min，弃掉上清，重复此操作，之后沥干溶液，使乙醇充分挥发。加入20μL RNase Free dH2O充分溶解DNA，测量DNA浓度，当OD260/280为1.8～2.0时用于下一步转染，-80℃保存备用。
[0049] 4.转染
[0050] 4.1细胞培养
[0051] 将能够稳定表达T7聚合酶的BSR细胞系(BSR-T7细胞系)复苏于10％的DMEM细胞培养液中，传代培养至其生长稳定，接种到六孔板中进行后续转染实验。
[0052] 4.2转染BSR细胞系
[0053] 将线性化的GpBSK-rBEV转染BSR-T7细胞系，按照jetPRIME操作方法进行转染，具体按照说明说操作步骤：将BSR-T7细胞接种到六孔板中，待细胞融合度为80％时，清洗细胞完毕后，每孔加入2mL 2％DMEM。取200μL jetPRIME buffer至灭菌的1.5mL的EP管中，加入2μg的DNA，轻轻混匀。加入4μL jetPRIME，轻轻混合均匀，低速离心10s，室温反应10min。取200μL以上试剂滴加至六孔板中，轻轻混匀，放在37℃5％细胞培养箱中培养。6h后换成2％DMEM的维持液，每隔12h观察转染效果，待有BEV典型细胞病变时收获毒处理，如图3所示为正常细胞和接毒的病变细胞的对比图。
[0054] 5重组病毒rBEV-E0的鉴定
[0055] 5.1重组病毒的传代培养
[0056] 将获得的重组病毒在MDBK细胞上进行传代培养，待出现CPE后，收获的病毒培养液-80℃保存。
[0057] 5.2PCR鉴定
[0058] 提取重组病毒的基因组，进行反转录。设计BEV的特异性检测引物(BEV-F/R)和能够扩增E0的检测引物(E0-F/R)(表2)，利用康为世纪生物技术有限公司的2×Taq MasterMix(Dye)进行PCR，具体操作步骤如下：反应体系(25μL，2×Taq MasterMix(Dye)；2μL，M-F(10μM)；2μL，M-R(10μM)；2μL，cDNA；19μL，ddH2O)。反应程序(94℃，2min；30个循环×(94℃,30s；55℃，30s；72℃，24s)；72℃，2min)。
[0059] 表2检测BVDV-E0和BEV-VP1基因的引物
[0060]
[0061] 如图4所示，PCR产物进行胶回收，送苏州金唯智公司测序。琼脂糖凝胶电泳观察结果表明：重组病毒既能扩增出BEV的特异性检测片段，又能扩增出含有E0的片段。
[0062] 5.3重组病毒基因组测序
[0063] 使用上述表2能够扩增病毒全基因组的引物，利用Q5High-Fidelity PCR Kit扩增病毒基因组，将纯化后的PCR产物连接pEASY-Blunt zero载体，转化入JM109感受态中，挑选阳性质粒测序。测序结果表明，重组病毒与rBEV相比，只是多插入了E0基因。
[0064] 5.4Western Blot鉴定
[0065] 本发明应用Western Blot方法鉴定重组牛肠道病毒。具体操作步骤如下所述：将rBEV-E0和rBEV病毒液接种到在六孔板中生长状态良好的MDBK细胞上。病毒接种12h后倒掉培养液，用冰浴的PBS溶液清洗细胞三遍。向每孔中加入200μL的RPIA(添加2μL蛋白酶抑制剂)，混匀放在冰上裂解30min，期间轻晃几次。将反应液转移到新的1.5mL的EP管中，12000r/min 4℃离心5min，收集上清。80μL溶液与20μL的5×变性液充分混匀，沸水加热
10min，其余蛋白样品-80℃保存。
10min，其余蛋白样品-80℃保存。
[0066] 每孔上样10μL，进行SDS-PAGE电泳，结束后进行湿转，按顺序组装：负极(黑色)-滤纸-胶-NC膜-滤纸-正极(红色)(事先将膜、滤纸用转印缓冲液浸润)，组装好将其放入转印槽中，添加转印缓冲液，将整个转印装置置于冰浴环境中，350mA转印约1.5h。
[0067] 转印结束后，将NC膜取出，用TBST冲洗3次，一共15min。将NC膜放到5％脱脂乳溶液中，4℃作用8h。之后取出NC膜，用TBST洗涤3次，5min/次，加入TBST稀释的鼠源抗VP1的4B2单抗，置于摇床中80r/min 25℃反应2h。一抗反应结束后，取出NC膜，用TBST洗涤3次，5min/次，加入TBST稀释的HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，置于摇床中80r/min 25℃反应1h。配置显色液，在干净的15mL离心管中依次加入2mL Buffer、100μL溶液A、100μL溶液B和100μL溶液C，充分混匀，避光放置。待二抗反应结束后，取出NC膜，用TBST洗涤3次，5min/次，在阴暗处将显色液覆盖在NC膜上，条带出现后加入去离子水进行观察并记录结果。如图5A和图5B所示，结果表明：重组病毒rBEV-E0既可以观察到VP1条带(图5A)，又可以观察到E0条带(图5B)，而rBEV只有VP1条带而没有E0条带(图5A和图5B)。
[0068] 5.5间接免疫荧光鉴定
[0069] 将MDBK细胞接种于48孔板中，待细胞长成单层后接毒，同时设立未接毒的细胞作为阴性对照，24h后，弃去培养液，加入冰浴的PBS清洗细胞3次，加入200μL4％甲醛4℃固定30min，弃去固定液，加入PBS清洗3次，5min/次，加入100μL鼠源抗VP1的4B2单抗，37℃作用
1h，加入PBS清洗3次，5min/次，加入PBS 100倍稀释的FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，37℃孵育1h，避光保存，如图6所示，用荧光显微镜观察结果表明:重组毒可观察到特异性荧光，而对照组没有荧光，说明病毒rBEV-E0拯救成功。
1h，加入PBS清洗3次，5min/次，加入PBS 100倍稀释的FITC标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，37℃孵育1h，避光保存，如图6所示，用荧光显微镜观察结果表明:重组毒可观察到特异性荧光，而对照组没有荧光，说明病毒rBEV-E0拯救成功。
[0070] 5.6电镜观察
[0071] 将分离纯化后的拯救病毒在MDBK细胞上培养，出现80％CPE后收获500mL病毒液，先通过4℃差速离心：4000r/min 10min，8000r/min 10min，12000r/min10min，去除杂质，再经过0.22um滤器过滤，之后用浓缩杯浓缩病毒液到15mL，然后经过分子筛纯化病毒，最后再用10kD的浓缩管将病毒液浓缩到2mL，浓缩好的病毒液交由中国农科院加工所做透射电镜观察。如图7所示电镜观察到BEV的病毒颗粒，没有囊膜，直径为25～30nm的球形。
[0072] 5.7拯救病毒TCID50测定
[0073] 测定拯救病毒在MDBK细胞上的半数感染量，将经过纯化并且稳定传代的第10代拯救病毒用无血清DMEM做10倍倍比梯度稀释(10-1～10-11)，然后将每个稀释度的病毒液分别加入到96孔细胞培养板上，100μL/孔，每个稀释度重复7孔，无血清DMEM做阴性对照。放到细胞培养箱中感染1h后，弃上清，1×PBS清洗，加入100μL含2％胎牛血清DMEM维持液培养。逐日观察至48h，记录每个稀释度出现病变的情况。按Reed-Muench法计算病毒的TCID50。结果表明拯救病毒的TCID50为10-6/0.1mL。
[0074] 5.8拯救病毒生长曲线测定
[0075] 将亲本毒和重组病毒rBEV-E0按照100TCID50分别接种于MDBK细胞上，37℃作用2h，用PBS洗去未吸附的病毒，加入含有2％FBS的DMEM培养基，在接毒后3、6、12、24、36和48h取样，反复冻融3次，收获病毒液，测定取样时间的病毒TCID50并制作病毒的生长曲线。如图8所示，结果表明重组病毒与亲本毒具有相似的生长特性。
[0076] 小鼠感染模型的建立
[0077] 将18只6～8周龄Balb/c雌鼠随机分为两组，每组6只。试验组每只腹腔注射108TCID50的rBEV-E0病毒液，阳性对照组免疫相同剂量的BVDV，同时设立空白对照组，每天观察小鼠活动情况。在免前第0d，免后第7、14、21、28d时取小鼠血液分离血清，进行BEV-VP1和BVDV-E0抗体的ELISA检测。以OD450值为纵坐标，攻毒天数为横坐标，如图9和图10所示，实验组(rBEV-E0)和阳性对照组(rBEV)免后7天均出现VP1抗体，其中rBEV在第14-21天达到较高的抗体水平，rBEV-E0在第21天前后才达到与其相应的抗体水平。对于E0抗体的检测，在检测的时间点里抗体水平与阳性对照相近，但均低一些，综上，rBEV-E0免疫小鼠产生了有效的免疫应答。
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