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一种具有增强性功能作用的牛大力提取物及其制备方法与用途

阅读：447发布：2024-02-10

专利汇可以提供一种具有增强性功能作用的牛大力提取物及其制备方法与用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及中药提取技术及应用领域，旨在公开一种具有增强性功能作用的提取物。它是由以下重量份的原料混合而成的混合物：牛大力多糖3～5份、牛大力总黄酮 1～3份，牛大力生物碱 1～3份。本发明的还公开了该种具有增强性功能作用的牛大力提取物的制备方法，利用该方法制备出的牛大力提取物能最大程度的提取出牛大力的有效成分。本发明还提供了该种提取物的用途。，下面是一种具有增强性功能作用的牛大力提取物及其制备方法与用途专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种具有增强性功能作用的牛大力提取物，其特征在于，它是由以下重量份的原料混合而成的混合物：牛大力多糖3～5份、牛大力总黄酮1～3份，牛大力生物碱1～3份。
2.根据权利要求1所述的一种具有增强性功能作用的牛大力提取物，其特征在于，是由以下重量份的原料组成的混合物：牛大力多糖4份、牛大力总黄酮3份，牛大力生物碱2份。
3.权利要求1至2所述的一种具有增强性功能作用的牛大力提取物的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：
(1)超声波辅助复合酶提取：将牛大力根粉碎过筛得牛大力粗粉，往牛大力粗粉添加水并搅拌均匀，添加复合酶进行酶解，将混合液置于超声场中进行处理，完成处理后灭活复合酶后得酶解液，冷却后过滤得滤渣A1和滤液A2；
(2)醇沉：将步骤(1)所得滤液A2浓缩后加入乙醇并静置后，置于离心机中离心，后保留沉淀，得牛大力多糖；
(3)乙醇分段提取：将步骤(1)所得滤渣A1加入酸性的乙醇后进行提取，冷却后过滤，得滤渣B1和滤液B2，将滤渣B1加入中性的乙醇后进行提取，冷却后过滤，得滤渣C1和滤液C2；
将滤渣C1中加入碱性的乙醇后进行提取，冷却后过滤，得滤渣D1和滤液D2；
(4)浓缩：将步骤(3)所得滤液B2、滤液C2、滤液D2混合，浓缩后得牛大力浓缩液；
(5)阳离子交换树脂吸附：将步骤(4)所得的浓缩液过滤，经强酸性阳离子交换树脂充分吸附后，洗去水溶性杂质，再进行洗脱，收集洗脱液E，再用含氨水的乙醇进行洗脱，收集洗脱液F，将洗脱液E浓缩干燥得牛大力总黄酮，将洗脱液F浓缩干燥得牛大力生物碱；
(6)混合：将步骤(2)所得的牛大力多糖以及步骤(5)所得的牛大力总黄酮和牛大力生物碱按比例混合均匀后得牛大力提取物。
4.根据权利要求3所述的一种具有增强性功能作用的牛大力提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，往牛大力粗粉添加8～16倍体积的水，所添加的复合酶包括纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶，所述的纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的添加量分别为牛大力粗粉质量的0.4～0.8％、0.2～0.6％和0.6～1.0％，所述复合酶的pH值为5.5～7.0，酶解温度为45～60℃，超声功率为200～350W，处理时间为1～3h；酶解液冷却后用0.8μm的滤膜过滤。
5.根据权利要求1所述的一种具有增强性功能作用的牛大力提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，滤液A2浓缩至原体积的1/4，往浓缩液中加入浓度为95％的乙醇至最后乙醇的浓度为80％，恒温3～6℃静置6～10h；离心机的转速为3000rpm，离心时间为
20min。
6.根据权利要求1所述的一种具有增强性功能作用的牛大力提取物，其特征在于，所述步骤(3)中，往滤渣A1中加入4～16倍体积、pH值为1～6、浓度为50～90％的乙醇，提取温度为70～80℃，提取时间为0.5～2h，冷却后用0.8μm的滤膜过滤；往滤渣B1中加4～16倍体积、pH值为6～8、浓度为50～90％的乙醇，提取温度为70～80℃，提取时间为0.5～2h，冷却后用
0.8μm的滤膜过滤；往滤渣C1中加4～16倍体积、pH值为8～12、浓度为50～90％的乙醇，提取温度为70～80℃，提取时间为0.5～2h，冷却后用0.8μm的滤膜过滤；所述乙醇的pH值采用磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液进行调节。
7.根据权利要求1所述的一种具有增强性功能作用的牛大力提取物，其特征在于，所述步骤(4)中，将滤液B2、滤液C2和滤液D2的混合液浓缩时的温度为40～50℃，蒸汽压力<
0.3MPa。
8.根据权利要求1所述的一种具有增强性功能作用的牛大力提取物，其特征在于，所述步骤(5)中，使用蒸馏水洗去水溶性杂质，其流速为4～6Bv/h，使用5～10倍重量、浓度为50～90％的乙醇进行洗脱后收集洗脱液E，其流速为1～3Bv/h，使用含浓度为1～5％的氨水、浓度为50～90％的乙醇进行洗脱后收集洗脱液F，其流速为1～3Bv/h，所使用的强酸性阳离子交换树脂为001×7型或D001型强酸性阳离子交换树脂。
9.根据权利要求1所述的一种具有增强性功能作用的牛大力提取物，其特征在于，所述步骤(6)中，牛大力多糖、牛大力总黄酮和牛大力生物碱的混合比例为3～5：1～3：1～3。
10.权利要求1所述的一种具有增强性功能作用的牛大力提取物的用途，其特征在于，将所述的牛大力提取物应用在增强性功能药物或保健品中。

说明书全文

一种具有增强性功能作用的牛大力提取物及其制备方法与

用途

技术领域

[0001] 本发明涉及中药提取技术及应用领域，更具体地说，尤其涉及一种具有增强性功能作用的牛大力提取物；本发明还涉及该提取物的制备方法以及用途。

背景技术

[0002] 性功能障碍是由遗传、健康状况、激素水平、年龄、疾病(包括慢性病、神经精神系统疾患、内分泌疾病、生殖器官病变)等多种原因引起的，药物、长期大量酗酒或吸毒者，也会出现性功能障碍。男性性功能障碍主要包括性欲障碍、阴茎勃起障碍、性交障碍。目前市售的性功能增强药物多种多样，欧美国家主要是采用合成药物或激素、作用强烈，长时间服用容易产生耐药性，毒副作用较大，严重损害患者肝肾功能；亚洲一些国家特别是东亚地区使用的壮阳药物大部分为天然中药制剂，有一定疗效，但是药物不宜长期大量服用。因此，提供一种新型的具有性功能增强作用的药食同源产品具有重要意义。

[0003] 牛大力为豆科崖豆藤属植物美丽崖豆藤Millettia speciosa Champ.的干燥根，主要含有生物碱、多糖及黄酮类等多种化学成分。牛大力作为我国岭南地区著名的药食两用植物、两广地区道地药材，已被收录于《广西省中药材标准》和《广东省中药材标准》，在民间将其作为煲汤原料，滋补养身，用于四肢无力，产后虚弱等症状，牛大力还被用于做药膳、药酒，具有显著的壮阳、强筋骨功效。中医也认为，牛大力性味甘平，归肺，肾经，具有强筋活络，补虚润肺之功效，临床用于治疗腰肌劳损、肺热咳嗽、阳痿、遗精等疾病。现代药理学研究表明，牛大力具有免疫调节、抗氧化、抗炎、抗疲劳、抵抗肺损伤等作用。目前，国内外均未见牛大力提取物在增强性功能作用方面的相关研究报道。

[0004] 目前，牛大力提取物制备工艺主要为传统的水提或醇提法，如专利公开号为CN106236825A的发明专利公开了牛大力与其提取物在抗抑郁上的应用，提取物制备采用简单的水回流提取法，获得的牛大力提取物可用于制备抗抑郁药物或保健品；专利公开号为CN103040924A的发明专利公开了牛大力提取物及其在制备骨质疏松药物中的应用，使用乙醇回流提取、有机溶剂萃取获得相应提取物，提取物改善骨质疏松效果显著；此外，专利公开号为CN105432898A的发明专利公开了一种牛大力提取物复合茶及其制备方法，牛大力提取物制备过程包括连续逆流超声提取，酶解，超滤等过程，以上牛大力提取工艺均存在有效成分不全、浓度低、纯度低或杂质较多等问题。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种具有增强性功能作用的牛大力提取物，该提取物具有增强性功能作用。本发明还提供了该种提取物的制备方法，利用该方法制备出的牛大力提取物能最大程度的提取出牛大力的有效成分。本发明还提供了该种提取物的用途。

[0006] 本发明采用的第一技术方案如下：

[0007] 一种具有增强性功能作用的牛大力提取物，它是由以下重量份的原料混合而成的混合物：牛大力多糖3～5份、牛大力总黄酮1～3份，牛大力生物碱1～3份。

[0008] 本发明采用的第二技术方案如下：

[0009] 一种具有增强性功能作用的牛大力提取物的制备方法，包括如下制备步骤：

[0010] (1)超声波辅助复合酶提取：将牛大力根粉碎过筛得牛大力粗粉，往牛大力粗粉添加水并搅拌均匀，添加复合酶进行酶解，将混合液置于超声场中进行处理，完成处理后灭活复合酶后得酶解液，冷却后过滤得滤渣A1和滤液A2；

[0011] (2)醇沉：将步骤(1)所得滤液A2浓缩后加入乙醇并静置后，置于离心机中离心，后保留沉淀，得牛大力多糖；

[0012] (3)乙醇分段提取：将步骤(1)所得滤渣A1加入酸性的乙醇后进行提取，冷却后过滤，得滤渣B1和滤液B2，将滤渣B1加入中性的乙醇后进行提取，冷却后过滤，得滤渣C1和滤液C2；将滤渣C1中加入碱性的乙醇后进行提取，冷却后过滤，得滤渣D1和滤液D2；

[0013] (4)浓缩：将步骤(3)所得滤液B2、滤液C2、滤液D2混合，浓缩后得牛大力浓缩液；

[0014] (5)阳离子交换树脂吸附：将步骤(4)所得的浓缩液过滤，经强酸性阳离子交换树脂充分吸附后，洗去水溶性杂质，再进行洗脱，收集洗脱液E，再用含氨水的乙醇进行洗脱，收集洗脱液F，将洗脱液E浓缩干燥得牛大力总黄酮，将洗脱液F浓缩干燥得牛大力生物碱；

[0015] (6)混合：将步骤(2)所得的牛大力多糖以及步骤(5)所得的牛大力总黄酮和牛大力生物碱按比例混合均匀后得牛大力提取物。

[0016] 本发明采用的第三技术方案如下：

[0017] 一种具有增强性功能作用的牛大力提取物的用途，将所述的牛大力提取物应用在增强性功能药物或保健品中。

[0018] 与现有技术相比，本发明具有的有益效果为：

[0019] 本发明的一种具有增强性功能作用的牛大力提取物，它是由以下重量份的原料混合而成的混合物：牛大力多糖3～5份、牛大力总黄酮1～3份，牛大力生物碱1～3份。本发明的一种具有增强性功能作用的牛大力提取物，用于治疗男性性功能障碍，效果明显，且增强体力。

[0020] 本发明的一种具有增强性功能作用的牛大力提取物的制备方法，所使用的复合酶组成成分纤维素酶和木聚糖酶可破坏细胞壁，促进胞内有效成分充分溶出，此外，还可降解胞壁中纤维素和木聚糖为寡糖或葡萄糖，提高多糖得率；蛋白酶可降解蛋白质，有利于去除蛋白质杂质。采用酸性、中性、碱性乙醇溶液对牛大力粉末进行分段提取，能最大程度的保证牛大力中碱性、中性、酸性有效成分都尽可能被提取出来。使用离子交换树脂吸附分离黄酮和生物碱，易于操作，分离效率高，所用试剂对环境无污染。附图说明

[0021] 图1为本发明的对比试验中牛大力提取物对小鼠性行为的影响；

[0022] 图2为本发明的对比试验中牛大力提取物对小鼠负重游泳时间的影响。

具体实施方式

[0023] 下面结合具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

[0024] 一种具有增强性功能作用的牛大力提取物，它是由以下重量份的原料混合而成的混合物：牛大力多糖3～5份、牛大力总黄酮1～3份，牛大力生物碱1～3份。

[0025] 其中，是由以下重量份的原料组成的混合物：牛大力多糖4份、牛大力总黄酮3份，牛大力生物碱2份。

[0026] 一种具有增强性功能作用的牛大力提取物的制备方法，包括如下制备步骤：

[0027] (1)超声波辅助复合酶提取：将牛大力根粉碎过筛得牛大力粗粉，往牛大力粗粉添加水并搅拌均匀，添加复合酶进行酶解，将混合液置于超声场中进行处理，完成处理后灭活复合酶后得酶解液，冷却后过滤得滤渣A1和滤液A2。

[0028] 其中，往牛大力粗粉添加8～16倍体积的水，所添加的复合酶包括纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶，所述的纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的添加量分别为牛大力粗粉质量的0.4～0.8％、0.2～0.6％和0.6～1.0％，所述复合酶的pH值为5.5～7.0，酶解温度为45～60℃，超声功率为200～350W，处理时间为1～3h；酶解液冷却后用0.8μm的滤膜过滤。

[0029] (2)醇沉：将步骤(1)所得滤液A2浓缩后加入乙醇并静置后，置于离心机中离心，后保留沉淀，得牛大力多糖。

[0030] 其中，滤液A2浓缩至原体积的1/4，往浓缩液中加入浓度为95％的乙醇至最后乙醇的浓度为80％，缓慢加入，边加边搅拌，恒温3～6℃静置6～10h；离心机的转速为3000rpm，离心时间为20min。

[0031] (3)乙醇分段提取：将步骤(1)所得滤渣A1加入酸性的乙醇后进行提取，冷却后过滤，得滤渣B1和滤液B2，将滤渣B1加入中性的乙醇后进行提取，冷却后过滤，得滤渣C1和滤液C2；将滤渣C1中加入碱性的乙醇后进行提取，冷却后过滤，得滤渣D1和滤液D2。

[0032] 其中，往滤渣A1中加入4～16倍体积、pH值为1～6、浓度为50～90％的乙醇，提取温度为70～80℃，提取时间为0.5～2h，冷却后用0.8μm的滤膜过滤；往滤渣B1中加4～16倍体积、pH值为6～8、浓度为50～90％的乙醇，提取温度为70～80℃，提取时间为0.5～2h，冷却后用0.8μm的滤膜过滤；往滤渣C1中加4～16倍体积、pH值为8～12、浓度为50～90％的乙醇，提取温度为70～80℃，提取时间为0.5～2h，冷却后用0.8μm的滤膜过滤；所述乙醇的pH值采用磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液进行调节。

[0033] (4)浓缩：将步骤(3)所得滤液B2、滤液C2、滤液D2混合，浓缩后得牛大力浓缩液。其中，将滤液B2、滤液C2和滤液D2的混合液浓缩时的温度为40～50℃，蒸汽压力<0.3MPa。

[0034] (5)阳离子交换树脂吸附：将步骤(4)所得的浓缩液过滤，经强酸性阳离子交换树脂充分吸附后，洗去水溶性杂质，再进行洗脱，收集洗脱液E，再用含氨水的乙醇进行洗脱，收集洗脱液F，将洗脱液E浓缩干燥得牛大力总黄酮，将洗脱液F浓缩干燥得牛大力生物碱。

[0035] 其中，使用蒸馏水洗去水溶性杂质，其流速为4～6Bv/h，使用5～10倍重量、浓度为50～90％的乙醇进行洗脱后收集洗脱液E，其流速为1～3Bv/h，使用含浓度为1～5％的氨水、浓度为50～90％的乙醇进行洗脱后收集洗脱液F，其流速为1～3Bv/h，所使用的强酸性阳离子交换树脂为001×7型或D001型强酸性阳离子交换树脂。使用离子交换树脂吸附法替代传统有机溶剂萃取法分离黄酮和生物碱，可解决其操作繁琐、分离效率低及有机溶剂用量大的问题。

[0036] (6)混合：将步骤(2)所得的牛大力多糖以及步骤(5)所得的牛大力总黄酮和牛大力生物碱按比例混合均匀后得牛大力提取物。牛大力多糖、牛大力总黄酮和牛大力生物碱的混合比例为3～5：1～3：1～3。

[0037] 本发明的一种具有增强性功能作用的牛大力提取物的制备方法，所使用的复合酶组成成分纤维素酶和木聚糖酶可破坏细胞壁，促进胞内有效成分充分溶出，此外，还可降解胞壁中纤维素和木聚糖为寡糖或葡萄糖，提高多糖得率；蛋白酶可降解蛋白质，有利于去除蛋白质杂质。采用酸性、中性、碱性乙醇溶液对牛大力粉末进行分段提取，能最大程度的保证牛大力中碱性、中性、酸性有效成分都尽可能被提取出来。使用离子交换树脂吸附分离黄酮和生物碱，易于操作，分离效率高，所用试剂对环境无污染。

[0038] 一种具有增强性功能作用的牛大力提取物的用途是将所述的牛大力提取物应用在增强性功能药物或保健品中。所述的牛大力提取物为片剂、胶囊剂或颗粒剂。本发明有次公开牛大力具有壮阳、养肾补虚、强筋活络等功效，目前尚未发现牛大力在这些功能的相关研究或应用。本发明的牛大力提取物要解决的技术问题是提供一种用于增强性功能和缓解体力疲劳的牛大力提取物，该提取物具有显著改善性能力、缓解体力疲劳的功效，还具有无任何毒副作用、服用方便和易于推广应用等优点，可用于治疗男性性功能障碍，效果明显，且增强体力，提供了一种潜在的增强性功能的药物或保健品。

[0039] 实施例1

[0040] (1)超声波辅助复合酶提取：将牛大力根粉碎过筛得牛大力粗粉，向牛大力粗粉添加12倍体积的水，搅拌均匀，添加复合酶进行酶解，将混合液置于超声场中进行处理，所添加的复合酶包括纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶，所述纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的添加量依次为牛大力粗粉质量的0.8％、0.4％、1.0％，所述复合酶的pH值为6.0，酶解温度为50℃，超声功率为350W，处理时间为2h，处理完后灭活复合酶后得酶解液，冷却后用0.8μm滤膜过滤，得滤渣A1和滤液A2。

[0041] (2)醇沉：将步骤(1)所得滤液A2浓缩至原体积的1/4，往浓缩液中加入浓度为95％的乙醇至最后乙醇的浓度为80％，缓慢加入，边加边搅拌，恒温4℃静置10h后，置于离心机以3000rpm转速离心20min后保留沉淀得牛大力多糖。

[0042] (3)乙醇分段提取：将步骤(1)所得滤渣A1加入10倍体积、pH值为4、浓度为70％的乙醇作为酸性溶剂进行提取，提取温度为75℃，提取时间为1.5h，冷却后用0.8μm滤膜过滤，得滤渣B1和滤液B2。将滤渣B1加入10倍体积、pH值为7、浓度为70％的乙醇作为中性溶剂进行提取，提取温度为75℃，提取时间为1.5h，冷却后用0.8μm滤膜过滤，得滤渣C1和滤液C2。将滤渣C1中加入10倍体积、pH值为10、浓度为70％的乙醇作为碱性溶剂进行提取，提取温度为75℃，提取时间为1.5h，冷却后用0.8μm滤膜过滤，得滤渣D1和滤液D2。酸性、中性、碱性乙醇溶液的pH值采用磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液进行调节。

[0043] (4)浓缩：将步骤(3)所得滤液B2、滤液C2、滤液D2混合均匀后，在温度为45℃、蒸汽压力<0.3MPa的状态下浓缩至原体积的1/5，得牛大力浓缩液。

[0044] (5)阳离子交换树脂吸附：将步骤(4)所得的浓缩液过滤，经强酸性阳离子交换树脂充分吸附后，先用蒸馏水以5Bv/h的流速洗去水溶性杂质，再用8倍重量、浓度为80％的乙醇以2Bv/h的流速进行洗脱，收集脱液E，再用含氨水3％的氨水、浓度为80％的乙醇以2Bv/h的流速进行洗脱，收集洗脱液F，将洗脱液E在减压状态下浓缩干燥得牛大力总黄酮，将洗脱液F在减压状态下浓缩干燥得牛大力生物碱。所使用的强酸性阳离子交换树脂为001×7型强酸性阳离子交换树脂。

[0045] (6)混合：将步骤(2)所得的牛大力多糖以及步骤(5)所得的牛大力总黄酮和牛大力生物碱按比例混合均匀后得牛大力提取物。牛大力多糖、牛大力总黄酮和牛大力生物碱的混合比例为4：3：2。

[0046] 实施例2

[0047] (1)超声波辅助复合酶提取：将牛大力根粉碎过筛得牛大力粗粉，向牛大力粗粉添加8倍体积的水，搅拌均匀，添加复合酶进行酶解，将混合液置于超声场中进行处理，所添加的复合酶包括纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶，所述纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的添加量依次为牛大力粗粉质量的0.4％、0.6％、0.6％，所述复合酶的pH值为6.5，酶解温度为45℃，超声功率为200W，处理时间为1h，处理完后灭活复合酶后得酶解液，冷却后用0.8μm滤膜过滤，得滤渣A1和滤液A2。

[0048] (2)醇沉：将步骤(1)所得滤液A2浓缩至原体积的1/4，往浓缩液中加入浓度为95％的乙醇至最后乙醇的浓度为80％，缓慢加入，边加边搅拌，恒温3℃静置6h后，置于离心机以3000rpm转速离心20min后保留沉淀得牛大力多糖。

[0049] (3)乙醇分段提取：将步骤(1)所得滤渣A1加入4倍体积、pH值为1、浓度为50％的乙醇作为酸性溶剂进行提取，提取温度为70℃，提取时间为0.5h，冷却后用0.8μm滤膜过滤，得滤渣B1和滤液B2。将滤渣B1加入4倍体积、pH值为6、浓度为50％的乙醇作为中性溶剂进行提取，提取温度为70℃，提取时间为0.5h，冷却后用0.8μm滤膜过滤，得滤渣C1和滤液C2。将滤渣C1中加入4倍体积、pH值为8、浓度为50％的乙醇作为碱性溶剂进行提取，提取温度为70℃，提取时间为0.5h，冷却后用0.8μm滤膜过滤，得滤渣D1和滤液D2。酸性、中性、碱性乙醇溶液的pH值采用磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液进行调节。

[0050] (4)浓缩：将步骤(3)所得滤液B2、滤液C2、滤液D2，在温度为45℃、蒸汽压力<0.3MPa的状态下浓缩至原体积的1/4，得牛大力浓缩液。

[0051] (5)阳离子交换树脂吸附：将步骤(4)所得的浓缩液过滤，经强酸性阳离子交换树脂充分吸附后，先用蒸馏水以4Bv/h的流速洗去水溶性杂质，再用5倍重量、浓度为50％的乙醇以1Bv/h的流速进行洗脱，收集脱液E，再用含氨水1％的氨水、浓度为50％的乙醇以1Bv/h的流速进行洗脱，收集洗脱液F，将洗脱液E在减压状态下浓缩干燥得牛大力总黄酮，将洗脱液F在减压状态下浓缩干燥得牛大力生物碱。所使用的强酸性阳离子交换树脂为D001型强酸性阳离子交换树脂。

[0052] (6)混合：将步骤(2)所得的牛大力多糖以及步骤(5)所得的牛大力总黄酮和牛大力生物碱按比例混合均匀后得牛大力提取物。牛大力多糖、牛大力总黄酮和牛大力生物碱的混合比例为5：1：1。

[0053] 实施例3

[0054] (1)超声波辅助复合酶提取：将牛大力根粉碎过筛得牛大力粗粉，向牛大力粗粉添加16倍体积的水，搅拌均匀，添加复合酶进行酶解，将混合液置于超声场中进行处理，所添加的复合酶包括纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶，所述纤维素酶、木聚糖酶和中性蛋白酶的添加量依次为牛大力粗粉质量的0.6％、0.2％、0.8％，所述复合酶的pH值为7.0，酶解温度为60℃，超声功率为300W，处理时间为3h，处理完后灭活复合酶后得酶解液，冷却后用0.8μm滤膜过滤，得滤渣A1和滤液A2。

[0055] (2)醇沉：将步骤(1)所得滤液A2浓缩至原体积的1/4，往浓缩液中加入浓度为95％的乙醇至最后乙醇的浓度为80％，缓慢加入，边加边搅拌，恒温6℃静置8h后，置于离心机以3000rpm转速离心20min后保留沉淀得牛大力多糖。

[0056] (3)乙醇分段提取：将步骤(1)所得滤渣A1加入16倍体积、pH值为6、浓度为90％的乙醇作为酸性溶剂进行提取，提取温度为80℃，提取时间为2h，冷却后用0.8μm滤膜过滤，得滤渣B1和滤液B2。将滤渣B1加入16倍体积、pH值为8、浓度为90％的乙醇作为中性溶剂进行提取，提取温度为80℃，提取时间为2h，冷却后用0.8μm滤膜过滤，得滤渣C1和滤液C2。将滤渣C1中加入16倍体积、pH值为12、浓度为90％的乙醇作为碱性溶剂进行提取，提取温度为80℃，提取时间为2h，冷却后用0.8μm滤膜过滤，得滤渣D1和滤液D2。酸性、中性、碱性乙醇溶液的pH值采用磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液进行调节。

[0057] (4)浓缩：将步骤(3)所得滤液B2、滤液C2、滤液D2混合均匀后，在温度为45℃、蒸汽压力<0.3MPa的状态下浓缩至原体积的1/6，得牛大力浓缩液。

[0058] (5)阳离子交换树脂吸附：将步骤(4)所得的浓缩液过滤，经强酸性阳离子交换树脂充分吸附后，先用蒸馏水以6Bv/h的流速洗去水溶性杂质，再用10倍重量、浓度为95％的乙醇以3Bv/h的流速进行洗脱，收集脱液E，再用含氨水5％的氨水、浓度为95％的乙醇以3Bv/h的流速进行洗脱，收集洗脱液F，将洗脱液E在减压状态下浓缩干燥得牛大力总黄酮，将洗脱液F在减压状态下浓缩干燥得牛大力生物碱。所使用的强酸性阳离子交换树脂为001×7型强酸性阳离子交换树脂。

[0059] (6)混合：将步骤(2)所得的牛大力多糖以及步骤(5)所得的牛大力总黄酮和牛大力生物碱按比例混合均匀后得牛大力提取物。牛大力多糖、牛大力总黄酮和牛大力生物碱的混合比例为3：2：3。

[0060] 对比试验

[0061] 选用实施例1、2、3中的牛大力提取物，进行以下实验：

[0062] 1研究方法

[0063] 1.1分组与给药

[0064] 选取100只体重为(25±2)g的ICR纯系雄性小鼠，适应性饲养2天后，随机分为空白对照组、阳性对照组、牛大力提取物1、2、3组五组，每组20只。阳性对照组小鼠每天灌胃引阳索胶囊，四川省育林制药有限公司生产(国药准字Z20080094)，主要生产药材为淫羊藿和五味子，引阳索胶囊去胶囊壳，用适量生理盐水溶解药物粉末，给药剂量为4g/kg，牛大力提取物1组灌胃本发明实施例1获得的牛大力提取物，牛大力提取物2组灌胃本发明实施例2获得的牛大力提取物，牛大力提取物3组灌胃本发明实施例3获得的牛大力提取物，均用适量生理盐水溶解，给药剂量均为4g/kg，空白对照组同时灌胃等体积生理盐水。每天给药一次，灌胃量为0.2ml/10g，连续给药30天。

[0065] 1.2交配试验

[0066] 末次给药1h后，每组随机选择10只小鼠进行性功能相关试验，试验在弱光、安静的环境中进行，观察时间为20：00～23：00，雌性小鼠于试验前48h皮下注射5μg苯甲酸雌二醇，并于试验前4h皮下注射5μg孕酮诱发动情。交配实验进行时先向交配箱(30cm×15cm×15cm)中放入1只雄性小鼠，适应5min后立即放入1只进入发情期的雌性小鼠。记录小鼠自合笼起到首次骑跨的发生时间(即骑跨潜伏期)、自合笼起到首次交配的发生时间(即交配潜伏期)、及20min内发生骑跨和交配的次数。

[0067] 1.3性功能相关脏器指数及生化指标检测

[0068] 去眼球采血后立即处死，分离睾丸、附睾、前列腺、精囊腺和包皮腺等器官，用分析天平称重并记录，计算相应指数(脏器重量mg/小鼠体质量10g)；取附睾，剪碎并用PBS缓冲液反复洗涤，使精子充分游离出来，于37℃水浴中孵育30min，吸取20μl精子悬液加入380μl PBS中，摇匀后，显微镜下以白细胞计数方法进行附睾悬液中的精子数量计数；剥离小鼠阴茎两侧海绵体，加组织裂解液充分裂解后，测定海绵体中环磷鸟苷(cGMP)和磷酸二酯酶5(PDE5)含量；测定血清睾酮、一氧化氮(NO)水平，相关操作步骤均按照试剂盒说明书进行。

[0069] 1.4抗疲劳试验

[0070] 末次给药2h后，每组随机选择10只小鼠进行抗疲劳试验，每只小鼠尾部负自身体质量5％的铅块，置于游泳槽内游泳，水深40cm，水温(25±1)℃，记录自游泳开始至小鼠头部入水持续8s不能游出水面的时间。将负重游泳至力竭的小鼠常规饲养2天，期间不给药，在水温(25±1)℃无负重游泳30min后，去眼球采血后立即处死，取大腿肌肉组织，用生理盐水洗净，匀浆后离心，测定肌肉组织中琥珀酸脱氢酶活性；测定血清中尿素氮含量、乳酸脱氢酶活力，相关操作步骤均按照试剂盒说明书进行。

[0071] 2研究结果

[0072] 2.1牛大力提取物改善性行为

[0073] 将空白对照组、阳性对照组、牛大力提取物1、2、3组的骑跨次数和交配次数统计分析后得图1。由图1可知，与空白对照组比较，阳性对照组、提取物各组的骑跨次数、交配次数均明显增多，差异均具有统计学意义(P<0.05)；阳性对照组、提取物各组的骑跨潜伏期、交配潜伏期则显著短于空白对照组(P<0.05)；与阳性对照组比较，提取物各组的骑跨次数、交配次数、骑跨潜伏期、交配潜伏期变化均不显著(P>0.05)。结果表明牛大力提取物可显著改善小鼠性行为，增加交配次数，缩短交配潜伏期，效果与引阳索胶囊相当。

[0074] 2.2牛大力提取物对性器官脏器指数的影响

[0075] 将空白对照组、阳性对照组、牛大力提取物1、2、3组中小鼠性器官脏器的睾丸指数、附睾指数、前列腺-精囊腺指数、包皮腺指数情况分析统计如下：

[0076] 表1牛大力提取物对小鼠性器官脏器指数的影响(mg/10g，n＝10)

[0077]组别睾丸附睾前列腺+精囊腺包皮腺
空白对照组 58.3±2.9 11.6±0.8 84.2±5.3 27.4±1.5
阳性对照组 59.6±3.1 10.7±0.9 83.7±4.9 27.6±1.2
提取物1组 57.1±3.2 11.8±0.7 85.1±4.8 27.1±1.7
提取物2组 58.8±2.7 11.3±0.9 84.6±5.1 26.8±1.4
提取物3组 57.4±3.5 10.9±0.8 84.9±4.6 27.5±1.6

[0078] 由表1可知，与空白对照组比较，阳性对照组、提取物各组的睾丸指数、附睾指数、前列腺-精囊腺指数、包皮腺指数变化均不显著(P>0.05)。结果表明牛大力提取物对性器官脏器指数影响不明显。

[0079] 2.3牛大力提取物提高阴茎勃起能力作用及相关机制

[0080] 由睾丸间质细胞分泌的睾酮能够通过调节性功能相关基因的表达促进一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)的合成，进而催化左旋精氨酸向NO转化，而NO又能够通过抑制PDE5的产生，促进鸟苷酸环化酶(Guanosine Cyclase，GC)的合成来降低cGMP在体内的水解，阴茎小动脉和海绵体平滑肌得以舒张，血液迅速泵入海绵窦而引起勃起发生，通过其关键因子含量测定能够间接反映勃起能力。将空白对照组、阳性对照组、牛大力提取物1、2、3组中小鼠的血清睾酮、NO水平及附睾精子数量进行统计分析如下：

[0081] 表2牛大力提取物对小鼠血清睾酮、NO水平及附睾精子数量的影响(n＝10)[0082]

[0083] 注：与空白对照组比较，*P<0.05。

[0084] 由表2可知，与空白对照组比较，阳性对照组、提取物各组的血清睾酮、NO水平及附睾精子数量均明显增大，差异均具有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较，提取物各组的血清睾酮、NO含量及附睾精子数量变化均不明显(P>0.05)。结果表明牛大力提取物可显著增强小鼠性功能，增加精子数量，效果与引阳索胶囊相当。

[0085] 将空白对照组、阳性对照组、牛大力提取物1、2、3组中小鼠的海绵体cGMP和PDE5含量进行统计分析如下：

[0086] 表3牛大力提取物对小鼠海绵体cGMP和PDE5含量的影响(n＝10)

[0087]组别 cGMP(nmol/L) PGE5(pg/mL)
空白对照组 25.3±2.1 341.6±25.7
阳性对照组 32.1±2.7* 258.1±19.4*
提取物1组 33.0±3.2* 237.2±17.3*
提取物2组 31.5±2.9* 265.4±20.1*
提取物3组 32.6±2.4* 252.8±21.6*

[0088] 注：与空白对照组比较，*P<0.05。

[0089] 由表3可知，与空白对照组比较，阳性对照组、提取物各组的cGMP含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；阳性对照组、提取物各组的PGE5含量则显著低于空白对照组(P<0.05)；与阳性对照组比较，提取物各组的cGMP、PGE5水平变化均不显著(P>0.05)。结果表明牛大力提取物可一定程度上增强小鼠阴茎勃起功能，效果与引阳索胶囊相当。

[0090] 2.4牛大力提取物抗疲劳作用及机制

[0091] 尿素氮是由于机体内糖、脂肪代谢供能不足，蛋白质分解产生的代谢产物，机体疲劳时，血清尿素氮水平升高。长时间耐力运动，可能导致肌细胞膜损伤和通透性增加，致使乳酸脱氢酶渗入到血液中，使血液乳酸脱氢酶活力大大升高，乳酸脱氢酶活性越强，肌肉组织损伤越严重。琥珀酸脱氢酶为有氧代谢三羧酸循环中的关键酶，提高肌肉有氧代谢能力是增强机体抗耐疲劳的关键，而肌肉的有氧代谢能力可通过检测有氧代谢相关酶的活力来反映。将空白对照组、阳性对照组、牛大力提取物1、2、3组中小鼠负重游泳的时间、负重游泳后血清尿素氮含量、乳酸脱氢酶活性及肌肉琥珀酸脱氢酶活性指数进行统计分析，分别得图2和表4。

[0092] 表4牛大力提取物对小鼠负重游泳后血清尿素氮含量、乳酸脱氢酶活性及肌肉琥珀酸脱氢酶活性的影响(n＝10)

[0093]

[0094] 注：与空白对照组比较，*P<0.05。

[0095] 由图2、表4可知，与空白对照组比较，阳性对照组、提取物各组的负重游泳时间显著延长、血清尿素氮含量降低、血清乳酸脱氢酶活性减弱、肌肉琥珀酸脱氢酶活性则增强，差异比较均具有统计学意义(P<0.05)；与阳性对照组比较，提取物各组的负重游泳时间、血清尿素氮含量、血清乳酸脱氢酶活性及肌肉琥珀酸脱氢酶活性变化均不明显(P>0.05)。结果表明牛大力提取物可延长小鼠负重游泳时间，增强其抗疲劳能力，效果与引阳索胶囊相当。

[0096] 3研究结论

[0097] 本发明获得的牛大力提取物使雄性小鼠血清睾酮和NO含量、海绵体cGMP水平升高，海绵体PDE5水平降低，精子数量增多，小鼠骑跨潜伏期、交配潜伏期缩短，20min内骑跨次数和交配次数增加，小鼠负重游泳时间延长，血清尿素氮含量降低，血清乳酸脱氢酶活性减弱，肌肉琥珀酸脱氢酶活性增强。以上结果说明牛大力提取物可改善性行为、增强阴茎勃起能力和抗疲劳能力，以上作用与补肾壮阳药物引阳索胶囊相当。

[0098] 以上所述仅为本发明的较佳实施方案，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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