对抗葡萄球菌感染的疫苗构建体及其用途
阅读：916发布：2020-05-16
专利汇可以提供对抗葡萄球菌感染的疫苗构建体及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种式(I)的融合构建体：X-A-接头-B-Z(I)，其中：(1)A与B是相同或不同的，且独立地为：(a)一种多肽，其包含：基于NCBI参考序列NC_002951.2中所述的金黄色葡萄球菌COL(SACOL)基因组的基因命名法，如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中任一个中所述的SACOL0029多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:185)、如图22D中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中任一个中所述的SACOL0442多肽、SACOL0718多肽(SEQ ID NO:186)、如图23I-J中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109至120)中任一个中所述的SACOL0720多肽、SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、SACOL1611多肽(SEQ ID NO:189)、如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:152至164)中任一个中所述的SACOL1867多肽、SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944多肽(SEQ ID NO:190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽(SEQ ID NO:192)、SACOL2385多肽(SEQ ID NO:50)或SACOL2599多肽(SEQ ID NO:193)；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包括(a)或(b)的至少13个连续 氨 基酸的免疫原性 片段 的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体具有至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽；(2)该接头是至少一个氨基酸的氨基酸序列或不存在；(3)X不存在或是至少一个氨基酸的氨基酸序列；及(4)Z不存在或是至少一个氨基酸的氨基酸序列。本发明还提供了包含该融合物的组合物及 试剂 盒 以及这些融合物、组合物及试剂盒的用途。，下面是对抗葡萄球菌感染的疫苗构建体及其用途专利的具体信息内容。
1.一种式(I)的融合构建体，
X-A-接头-B-Z(I)
其中：
(1)A与B相同或不同，且独立地为：
(a)基于NCBI参考序列NC_002951.2中所述的金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)COL(SACOL)基因组中的基因命名法，包含以下的多肽：如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中的任一个中所述的SACOL0029多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:
185)、如图22D中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的SACOL0442多肽、SACOL0718多肽(SEQ ID NO:186)、如图23I-K中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109至
120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽、SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、SACOL1611多肽(SEQ ID NO:189)、如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:152至164)中的任一个中所述的SACOL1867多肽、SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944多肽(SEQ ID NO:190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽(SEQ ID NO:192)、SACOL2385多肽(SEQ ID NO:50)或SACOL2599多肽(SEQ ID NO:193)；
(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；
(c)包含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；
(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或
(e)包括含有(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽；
(2)该接头是含至少一个氨基酸的氨基酸序列或不存在；
(3)X不存在或是含至少一个氨基酸的氨基酸序列；及
(4)Z不存在或是含至少一个氨基酸的氨基酸序列。
2.权利要求1的构建体，其中(1)(a)是包含如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中的任一个中所述的SACOL0029多肽、如图22D中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的SACOL0442多肽、如图23I-K中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及
109至120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽或如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:152至164)中的任一个中所述的SACOL1867多肽的多肽。
3.权利要求2的构建体，其中A与B中至少一个是(a)包含如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中任一个中所述的SACOL0029多肽的多肽；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含有(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽；且A与B中的另一个是(a')包含如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:152至164)中的任一个中所述的SACOL1867多肽的多肽；(b')由来自与编码(a')的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c')包含(a')或(b')的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d')包含与(a')至(c')中的任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e')包括含有(a')至(c')中任一个的至少12个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽。
4.权利要求2的构建体，其中A与B中的至少一个是(a)包含如图22D中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的SACOL0442多肽的多肽；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含有(a)至(d)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽；且A与B中的另一个是(a')包含如图23I-K中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽的多肽；(b')由来自与编码(a')的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c')包含(a')或(b')的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d')包含与(a')至(c')中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e')包括含有(a')至(d')中任一个的至少12个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽。
5.权利要求2的构建体，其中A与B相同或不同且是(a)包含如图23I-K中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽的多肽；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含有(a)至(d)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽。
6.权利要求1至2及4中任一项的构建体，其中所述免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列中的一个或多个：KDTINGKSNKSRNW(SEQ ID NO:34)；及KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)。
7.权利要求6的构建体，其中所述免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列中的一个或多个：
STQNSSSVQDKQLQKVEEVPNNSEKALVKKLYDRYSKDTINGKSNKSRNWVYSERPLNENQVRIHLEGTYTVAGRVYTPKRNITLNKEVVTLKELDHIIRFAHISYGLYMGEHLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTADIKNVTFKLVKSVNDIEQV(SEQ ID NO:30)；
DKQLQKVEEVPNNSEKALVKKLYDRYSKDTINGKSNKSRNWVYSERPLNENQVRIHLEGTYTVAGRVYTPKRNITLNKEVVTLKELDHIIRFAHISYGLYMGEHLPKGNIVINTK(SEQ ID NO:32)；及DKQLQKVEEVPNNSEKALVKKLYDRYSKDTINGKSNKSRNWVYSERPLNENQVRIHLEGTYTVAGRVYTPKRNITLNKEVVTLKELDHIIRFAHISYGLYMGEHLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTADIKNVTFKLVKSVNDIEQV(SEQ ID NO:33)。
8.权利要求1至2及4至5中任一项的构建体，其中所述免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列中的一个或多个：QFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:21)；TIKDQQKANQLAS(SEQ ID NO:
22)；
KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO:23)；及DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24)。
9.权利要求8的构建体，其中所述免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列中的一个或多个：
RASLSSEIKYTAPHDVTIKDQQKANQLASELNNQKIPHFYNYKEVIHTKLYKDNLFDVKAKEPYNVTITSDKYIPNTDLKRGQADLFVAEGSIKDLVKHKKHGKAIIGTKKHHVNIKLRKDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKDYQEIRKYTKAKHIVSQFGFDLKHKKDALALEKAKNKVDKSIETRSEAISSISSLTG(SEQ ID NO:12)；
ASLSSEIKYTAPHDVTIKDQQKANQLASELNNQKIPHFYNYKEVIHTKLYKDNLFDVKAKEPYNVTITSDKYIPNTDLKRGQADLFVAEGSIKDLVKHKKHGKAIIGTKKHHVNIKLRKDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKDYQEIRKYTKAKHIVSQFGFDLKHKKDALALEKAKNKVDKSIETRSEAISSISSLTG(SEQ ID NO:13)；
ASLSSEIKYTAPHDVTIKDQQKANQLASELNNQKIPHFYNYKEVIHTKLYKDNLFDVKAKEPYNVTITSDKYIPNTDLKRGQADLFVAEGSIKDLVKHKKHGKAIIGTKKHHVNIKLRKDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKDYQE(SEQ ID NO:14)；
KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKDYQEIRKYTKAKHIVSQFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:15)；
KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKDY(SEQ ID NO:17)；
KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKD(SEQ ID NO:16)；
KDINKIYFM TDVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:19)；
KHIVSQFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:20)及
SQFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:18)。
10.权利要求1至3中任一项的构建体，其中所述免疫原性片段(c')包含以下氨基酸序列中的一个或多个：PYNGVVSFKDATGF(SEQ ID NO:165)；AHPNGDKGNGGIYK(SEQ ID NO:167)；
SISDYPGDEDISVM(SEQ ID NO:169)；RGPKGFNFNENVQA(SEQ ID NO:172)；
QFESTGTIKRIKDN(SEQ ID NO:175)；及GNSGSPVLNSNNEV(SEQ ID NO:178)。
11.权利要求10的构建体，其中所述免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列：
TQVKDTNIFPYNGVVSFKDATGFVIGKNTIITNKHVSKDYKVGDRITAHPNGDKGNGGIYKIKSISDYPGDEDISVMNIEEQAVERGPKGFNFNENVQAFNFAKDAKVDDKIKVIGYPLPAQNSFKQFESTGTIKRIKDNILNFDAYIEPGNSGSPVLNSNNEVIGVVYGGIGKIGSEYNGAVYFTPQIKDFIQKHIEQ(SEQ ID NO:39)。
12.权利要求1至11中任一项的构建体，其中所述接头包含至少四个选自以下的相同或不同氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及赖氨酸。
13.权利要求1至12中任一项的构建体，其中所述接头包含(GGGGS)n(SEQ ID NO:67)、(ERKYK)n(SEQ ID NO:61)；或(EAAAK)n(SEQ ID NO:63)，其中n＝1至5。
14.权利要求1至13中任一项的构建体，其中所述X包括6至10个氨基酸的聚组氨酸。
15.权利要求1至13中任一项的构建体，其中所述X不存在。
16.权利要求1至15中任一项的构建体，其中所述Z不存在。
17.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1至16中任一项的构建体。
18.一种载体，其包含权利要求17的分离的核酸。
19.一种宿主细胞，其包含权利要求18的载体。
20.权利要求19的细胞，其是金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的减毒存活形式。
21.权利要求20的细胞，其中所述金黄色葡萄球菌的减毒存活形式具有稳定小菌落变体(small colony variant；SCV)表型。
22.权利要求21的细胞，其中具有稳定SCV表型的该金黄色葡萄球菌的减毒存活形式是ΔhemBΔ720金黄色葡萄球菌。
23.一种组合物，其包含：
(A)至少一种权利要求1至16中任一项定义的构建体；至少一种权利要求17定义的核酸分子；至少一种权利要求18定义的载体；或至少一种权利要求19至22中任一项定义的细胞；
及
(B)(i)权利要求1至11中任一项所定义的多肽；
(ii)减毒活金黄色葡萄球菌；
(iii)可药用的赋形剂；
(iv)佐剂；或
(v)(i)至(iv)中至少两种的组合。
24.权利要求23的组合物，其中所述金黄色葡萄球菌的减毒存活形式表达：
(a)基于NCBI参考序列NC_002951.2中所述的金黄色葡萄球菌COL(SACOL)基因组中的基因命名法，包含以下的多肽：如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中的任一个中所述的SACOL0029多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:185)、如图22D中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的SACOL0442多肽、SACOL0718多肽(SEQ ID NO:186)、如图23I-J中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽、SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、SACOL1611(SEQ ID NO:189)、如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:152至164)中的任一个中所述的SACOL1867多肽、SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944多肽(SEQ ID NO:
190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽(SEQ ID NO:192)、SACOL2385多肽(SEQ ID NO:50)或SACOL2599多肽(SEQ ID NO:193)；
(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；
(c)包含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽；
(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽；或
(e)包括含有(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽。
25.权利要求23或24的组合物，其中所述金黄色葡萄球菌的减毒存活形式具有稳定小菌落变体(SCV)表型。
26.权利要求23至25中任一项的组合物，其中所述佐剂包含矾、油、皂素、环状-二鸟苷-
5'-单磷酸(c-di-GMP)、聚磷腈、吲哚力西丁(indolicidin)、病原体相关分子模式(PAMPS)、脂质粒或其中至少两种的组合。
27.一种用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)的方法，所述方法包括向该哺乳动物给予有效量的权利要求1至16中任一项定义的构建体；权利要求17定义的核酸分子；权利要求18定义的载体；权利要求19至22中任一项定义的细胞；或权利要求23至26中任一项定义的组合物。
28.权利要求27的方法，其中所述葡萄球菌IMI是由一种或多种金黄色葡萄球菌株引起。
29.权利要求27或28的方法，其中该哺乳动物是母牛。
30.有效量的(i)权利要求1至16中任一项定义的构建体；(ii)权利要求17定义的核酸分子；(iii)权利要求18定义的载体；权利要求19至22中任一项定义的细胞；(iv)权利要求
23至26中任一项定义的组合物；或(v)(i)至(iv)中至少两种的组合用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)的用途。
31.权利要求30的用途，其中所述葡萄球菌IMI是由一种或多种金黄色葡萄球菌株引起。
32.权利要求30或31的用途，其中所述哺乳动物是母牛。
33.权利要求1至16中任一项定义的构建体；权利要求17定义的核酸分子；权利要求18定义的载体；权利要求19至22中任一项定义的细胞；权利要求23至26中任一项定义的组合物或其中至少两种的组合，其用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)。
34.权利要求33的构建体、核酸分子、载体、细胞、组合物或组合，其中该葡萄球菌IMI是由一或多种金黄色葡萄球菌株引起。
35.权利要求33或34的构建体、核酸分子、载体、细胞或组合物，其中该哺乳动物是母牛。
36.一种用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)的试剂盒，其包含：
(A)(i)至少一种权利要求1至16中任一项定义的构建体；(ii)至少一种权利要求17定义的核酸分子；(iii)至少一种权利要求18定义的载体；(iv)至少一种权利要求19至22中任一项定义的细胞；或(v)(i)至(iv)中至少两种的组合，及
(B)(i)权利要求1至11中任一项所定义的多肽；
(ii)减毒活金黄色葡萄球菌；
(iii)可药学用的赋形剂；
(iv)佐剂；
(v)有关使用该试剂盒预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)的说明书；或
(vi)(i)至(v)中至少两种的组合。
对抗葡萄球菌感染的疫苗构建体及其用途
[0002] 不适用
[0004] 不适用
技术领域
[0005] 本发明是关于针对葡萄球菌感染的疫苗构建体及其用途。更具体言的，本发明是关于针对葡萄球菌感染，诸如牛乳房内感染 (intramammary infection；IMI)的组合抗原
的疫苗构建体及其用途。
的疫苗构建体及其用途。
[0007] 依照37C.F.R.1.821(c)，在此一起提交2017年10月5日创建且大小为 278千字节的命名为SEQUENCE LISTING USP62411120_ST25的符合 ASCII的文本文件形式的序列表。
前述文件的内容以全文引用的方式并入本文中。
前述文件的内容以全文引用的方式并入本文中。
背景技术
[0008] 牛乳腺炎(Bovine mastitis)是乳制品制造者最常见且花费最大的疾病，且金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)被认为是最常导致该疾病发生的可传播细菌(Sears
等人,2003)。葡萄球菌IMI可导致乳腺炎，很难治疗且常常会复发(Sandholm等人,1990)。
等人,2003)。葡萄球菌IMI可导致乳腺炎，很难治疗且常常会复发(Sandholm等人,1990)。
[0009] 已广泛地研究用于预防及控制金黄色葡萄球菌IMI的疫苗开发，不过迄今为止，尚无调配物展示具有预防功效。此很可能归因于疫苗靶不足(Middleton,2008；Middleton
2009)、能够引起乳腺炎的菌株具有较高多样性(Buzzola,2007；Kerro-Dego,2006；
Middleton,2008)或无法引起适当免疫反应(Bharathan,2011；Ferens,2000；Fowler,2014； Proctor,2012)。已越来越多地了解到，仅仅基于疫苗诱导的抗体的免疫可能很重要，但不足以诱导对抗金黄色葡萄球菌的保护作用(Middleton 2008；Middleton 2009)。看起来，基于Th1及Th17型反应的细胞介导的免疫(cell mediated immunity；CMI)可能是完成保护必
需的(Fowler, 2014；Lin,2009；Proctor,2012；Spellberg,2012)。
2009)、能够引起乳腺炎的菌株具有较高多样性(Buzzola,2007；Kerro-Dego,2006；
Middleton,2008)或无法引起适当免疫反应(Bharathan,2011；Ferens,2000；Fowler,2014； Proctor,2012)。已越来越多地了解到，仅仅基于疫苗诱导的抗体的免疫可能很重要，但不足以诱导对抗金黄色葡萄球菌的保护作用(Middleton 2008；Middleton 2009)。看起来，基于Th1及Th17型反应的细胞介导的免疫(cell mediated immunity；CMI)可能是完成保护必
需的(Fowler, 2014；Lin,2009；Proctor,2012；Spellberg,2012)。
[0010] 在长期感染的母牛中，细菌在活体外对抗生素的敏感性对于治疗功效预测较差(Owens等人,1997)。尽管在乳腺炎治疗后的感染归因于新获得的菌株，但其通常是初始感
染性生物体存留的结果(Sandholm等人, 1990；Myllys等人,1997)。因此，现有疗法通常无法消除感染且特别需要发现预防或治疗葡萄球菌IMI的新颖方法。
染性生物体存留的结果(Sandholm等人, 1990；Myllys等人,1997)。因此，现有疗法通常无法消除感染且特别需要发现预防或治疗葡萄球菌IMI的新颖方法。
[0011] 已注意到可商购的金黄色葡萄球菌疫苗缺乏疫苗功效及保护能力 (Middleton,2008)。因此，特别需要使用已知在IMI期间表达的高效金黄色葡萄球菌抗原作为疫苗组分
以防止IMI及乳腺炎。
以防止IMI及乳腺炎。
[0012] 本发明试图满足这些及其他需求。
[0013] 本发明说明提及多种文献，其内容以全文引用的方式并入本文中。
发明内容
[0014] 在第一方面中，本发明提供显示出经增加免疫原性的融合多肽及其作为针对葡萄球菌IMI的疫苗的用途。
[0015] 葡萄球菌(诸如金黄色葡萄球菌)IMI的特征是金黄色葡萄球菌存留在宿主细胞内的能力。详言的，金黄色葡萄球菌小菌落变体(small colony variant；SCV)一般不会产生侵袭性感染且可被内化于宿主细胞中。因此，在另一方面中，本发明提供基于SCV的表型方面的用于疫苗目的的减毒活金黄色葡萄球菌株，以提供对抗此类菌株的免疫反应且增加疫
苗保护功效。
苗保护功效。
[0016] 在一方面中，本发明提供以下各项：
[0017] 第1项：一种式(I)的融合构建体：X-A-接头-B-Z(I)，其中：(1)A与 B相同或不同且独立地为：(a)基于NCBI参考序列NC_002951.2中所述的金黄色葡萄球菌COL(SACOL)基因组中的基因命名法，包含以下的多肽：如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中的任一个中所述的SACOL0029多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:185)、如图22D 中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的 SACOL0442多肽、SACOL0718多肽(SEQ ID NO:186)、如图23I-K中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的
SACOL0720多肽、SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、
SACOL1611多肽(SEQ ID NO:189)、如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:152至164)中的任
一个中所述的SACOL1867 多肽、SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944多肽(SEQ ID
NO:190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽(SEQ ID NO:192)、SACOL2385多肽(SEQ ID NO:50)或SACOL2599多肽 (SEQ ID NO:193)；(b)由来自与编码(a)的多肽的基
因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性
片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序
列的多肽；或(e)包括含有(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多
肽；(2)该接头是含至少一个氨基酸的氨基酸序列或不存在；(3)X不存在或是含至少一个氨基酸的氨基酸序列；及(4)Z不存在或含至少一个氨基酸的氨基酸序列。
SACOL0720多肽、SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、
SACOL1611多肽(SEQ ID NO:189)、如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:152至164)中的任
一个中所述的SACOL1867 多肽、SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944多肽(SEQ ID
NO:190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽(SEQ ID NO:192)、SACOL2385多肽(SEQ ID NO:50)或SACOL2599多肽 (SEQ ID NO:193)；(b)由来自与编码(a)的多肽的基
因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性
片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序
列的多肽；或(e)包括含有(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多
肽；(2)该接头是含至少一个氨基酸的氨基酸序列或不存在；(3)X不存在或是含至少一个氨基酸的氨基酸序列；及(4)Z不存在或含至少一个氨基酸的氨基酸序列。
[0018] 第2项：如第1项的构建体，其中(1)(a)是包含如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中的任一个中所述的SACOL0029多肽、如图22D中所描绘的序列(SEQ ID NO:
29及82至92)中的任一个中所述的 SACOL0442多肽、如图23I-K中所描绘的序列(SEQ ID
NO:11及109至 120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽或如图25D中所描绘的序列 (SEQ
ID NO:152至164)中的任一个中所述的SACOL1867多肽的多肽。
29及82至92)中的任一个中所述的 SACOL0442多肽、如图23I-K中所描绘的序列(SEQ ID
NO:11及109至 120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽或如图25D中所描绘的序列 (SEQ
ID NO:152至164)中的任一个中所述的SACOL1867多肽的多肽。
[0019] 第3项：如第2项的构建体，其中A与B中的至少一个是(a)包含如图 24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中的任一个中所述的 SACOL0029多肽的多肽；(b)由来自与
编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连续
氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％
同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含有(a)至(c)中任一个的至少13 个连续氨基酸的
免疫原性变体的多肽；且A与B中的另一个是(a')包含如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:
152至164)中的任一个中所述的 SACOL1867多肽的多肽；(b')由来自与编码(a')的多肽的
基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c')包含(a')或(b')的至少13个连续氨基酸的免疫
原性片段的多肽；(d')包含与(a')至(c')中的任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的
氨基酸序列的多肽；或(e')包括含有(a')至(d')中任一个的至少12个连续氨基酸的免疫原
性变体的多肽。
编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连续
氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％
同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含有(a)至(c)中任一个的至少13 个连续氨基酸的
免疫原性变体的多肽；且A与B中的另一个是(a')包含如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:
152至164)中的任一个中所述的 SACOL1867多肽的多肽；(b')由来自与编码(a')的多肽的
基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c')包含(a')或(b')的至少13个连续氨基酸的免疫
原性片段的多肽；(d')包含与(a')至(c')中的任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的
氨基酸序列的多肽；或(e')包括含有(a')至(d')中任一个的至少12个连续氨基酸的免疫原
性变体的多肽。
[0020] 第4项：如第2项的构建体，其中A与B中的至少一个是(a)包含如图 22D中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的 SACOL0442多肽的多肽；(b)由来自与
编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连续
氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％
同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免
疫原性变体的多肽；且A与B中的另一个是(a')包含如图 23I-K中所描绘的序列(SEQ ID
NO:11及109至120)中的任一个中所述的 SACOL0720多肽的多肽；(b')由来自与编码(a')的
多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c')包括含(a')或(b')的至少13个连续氨基
酸的免疫原性片段的多肽；(d')包含与(a')至(c')中的任一个的多肽的序列总体至少60％
同一性的氨基酸序列的多肽；或(e')包括含有(a')至(d')中任一个的至少12个连续氨基酸
的免疫原性变体的多肽。
编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连续
氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％
同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免
疫原性变体的多肽；且A与B中的另一个是(a')包含如图 23I-K中所描绘的序列(SEQ ID
NO:11及109至120)中的任一个中所述的 SACOL0720多肽的多肽；(b')由来自与编码(a')的
多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c')包括含(a')或(b')的至少13个连续氨基
酸的免疫原性片段的多肽；(d')包含与(a')至(c')中的任一个的多肽的序列总体至少60％
同一性的氨基酸序列的多肽；或(e')包括含有(a')至(d')中任一个的至少12个连续氨基酸
的免疫原性变体的多肽。
[0021] 第5项：如第2项构建体，其中A与B相同或不同且是(a)包含如图 23I-K中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的 SACOL0720多肽的多肽；(b)由来自
与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连
续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少
60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含有(a)至(d)中任一个的至少13 个连续氨基
酸的免疫原性变体的多肽。
与编码(a)的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包含(a)或(b)的至少13个连
续氨基酸的免疫原性片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少
60％同一性的氨基酸序列的多肽；或(e)包括含有(a)至(d)中任一个的至少13 个连续氨基
酸的免疫原性变体的多肽。
[0022] 第6项：如第1至2及4项中任一项的构建体，其中该免疫原性片段 (d)包含以下氨基酸序列中的一或多个：KDTINGKSNKSRNW(SEQ ID NO:34)；及KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID
NO:1)。
NO:1)。
[0023] 第7项：如第6项的构建体，其中该免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列中的一或多个：
[0024] STQNSSSVQDKQLQKVEEVPNNSEKALVKKLY
[0025] DRYSKDTINGKSNKSRNWVYSERPLNENQVRIHLEGTYTVAGRV YTPKRNITLNKEVVTLKELDHIIRFAHISYGLYMGEHLPKGNIVIN TKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTADIKNVTFKLVKSVNDIEQ V(SEQ
ID NO:30)；
ID NO:30)；
[0026] DKQLQKVEEVPNNSEKALVKKLYDRYSKDTINGKSNKSRN WVYSERPLNENQVRIHLEGTYTVAGRVYTPKRNITLNKEVVTLK ELDHIIRFAHISYGLYMGEHLPKGNIVINTK(SEQ ID NO:32)；及 DKQL
[0027] QKVEEVPNNSEKALVKKLYDRYSKDTINGKSNKSRNWVYSERPL NENQVRIHLEGTYTVAGRVYTPKRNITLNKEVVTLKELDHIIRFA HISYGLYMGEHLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKI
NTADIKNVTFKLVKSVNDIEQV(SEQ ID NO:33)。
NTADIKNVTFKLVKSVNDIEQV(SEQ ID NO:33)。
[0028] 第8项：如第1至2及4项至第5项中任一项的构建体，其中该免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列中的一或多个：
[0029] QFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:21)；TIKDQQKANQLAS(SEQ ID NO:22)；KDINKIYFMT DVDL(SEQ ID NO:23)；及
[0030] DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24)。
[0031] 第9项：如第8项的构建体，其中该免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列中的一或多个：RASLSSEIKYTAPHDVTIKDQQKANQLASEL NNQKIPHFYNYKEVIHTKLYKDNLFDVKAKEPYNVTITS
DKYIPN TDLKRGQADLFVAEGSIKDLVKHKKHGKAIIGTKKHHVNIKLRK DINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKD
YQEIRKYTKAKHIVSQFGFDL KHKKDALALEKAKNKVDKSIETRSEAISSISSLTG(SEQ ID NO: 12)；
ASLSSEI
DKYIPN TDLKRGQADLFVAEGSIKDLVKHKKHGKAIIGTKKHHVNIKLRK DINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKD
YQEIRKYTKAKHIVSQFGFDL KHKKDALALEKAKNKVDKSIETRSEAISSISSLTG(SEQ ID NO: 12)；
ASLSSEI
[0032] KYTAPHDVTIKDQQKANQLASELNNQKIPHFYNYKEVIHTKLYK DNLFDVKAKEPYNVTITSDKYIPNTDLKRGQADLFVAEGSIKDLV KHKKHGKAIIGTKKHHVNIKLRKDINKIYFMTDVDLGGPTFVLN DKDYQEIR
KYTKAKHIVSQFGFDLKHKKDALALEKAKNKVDKSI ETRSEAISSISSLTG(SEQ ID NO:13)；
KYTKAKHIVSQFGFDLKHKKDALALEKAKNKVDKSI ETRSEAISSISSLTG(SEQ ID NO:13)；
[0033] ASLSSEIKYTAPHDVTIKDQQKANQLASEL
[0034] NNQKIPHFYNYKEVIHTKLYKDNLFDVKAKEPYNVTITSDKYIPN TDLKRGQADLFVAEGSIKDLVKHKKHGKAIIGTKKHHVNIKLRK DINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKDYQE(SEQ ID NO:14)；
[0035] KDINKIYFMT
[0036] DVDLGGPTFVLNDKDYQEIRKYTKAKHIVSQFGFDLKHKKDALA (SEQ ID NO:15)；KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKD(SEQ ID NO:16)；KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLNDKDY(SEQ ID NO:
[0037] 17)；KDINKIYFMTDVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:19)；
[0038] SQFGFDLK HKKDALA(SEQ ID NO:18)；及
[0039] KHIVSQFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:20)。
[0040] 第10项：如第1项至第3项中任一项的构建体，其中该免疫原性片段 (c')包含以下氨基酸序列中的一或多个：PYNGVVSFKDATGF(SEQ ID NO:165)；AHPNGDKGNGGIYK(SEQ ID
NO:167)；SISDYP GDEDISVM(SEQ ID NO:169)；RGPKGFNFNENVQA(SEQ ID NO: 172)；
QFESTGTIKRIKDN(SEQ ID NO:175)；及 GNSGSPVLNSNNEV(SEQ ID NO:178)。
NO:167)；SISDYP GDEDISVM(SEQ ID NO:169)；RGPKGFNFNENVQA(SEQ ID NO: 172)；
QFESTGTIKRIKDN(SEQ ID NO:175)；及 GNSGSPVLNSNNEV(SEQ ID NO:178)。
[0041] 第11项：如第10项的构建体，其中该免疫原性片段(d)包含以下氨基酸序列：
[0042] TQVKDTNIFPYNGVVSFKDATGFVIGKNTIITNKHVSKDY
[0043] KVGDRITAHPNGDKGNGGIYKIKSISDYPGDEDISVMNIEEQAVER GPKGFNFNENVQAFNFAKDAKVDDKIKVIGYPLPAQNSFKQFEST GTIKRIKDNILNFDAYIEPGNSGSPVLNSNNEVIGVVYGGIGKIGSE
YNGAVYFTPQIKDFIQKHIEQ(SEQ ID NO:39)。
YNGAVYFTPQIKDFIQKHIEQ(SEQ ID NO:39)。
[0044] 第12项：如第1项至第11项中任一项的构建体，其中该接头包含至少四个选自由以下组成的群的相同或不同氨基酸：甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及赖氨酸。
[0045] 第13项：如第1项至第12项中任一项的构建体，其中该接头包含 (GGGGS)n(SEQ ID NO:67)、(ERKYK)n(SEQ ID NO:61)；或 (EAAAK)n(SEQ ID NO:63)，其中n＝1至5。
[0046] 第14项：如第1项至第13项中任一项的构建体，其中该X包括含6至10个氨基酸的聚组氨酸。
[0047] 第15项：如第1项至第13项中任一项的构建体，其中该X不存在。
[0048] 第16项：如第1项至第15项中任一项的构建体，其中该Z不存在。
[0049] 第17项：一种分离的核酸分子，其编码如第1项至第16项中任一项的构建体。
[0050] 第18项：一种载体，其包含如第17项的分离的核酸。
[0051] 第19项：一种宿主细胞，其包含如第18项的载体。
[0052] 第20项：如第19项的细胞，其是金黄色葡萄球菌的减毒存活形式。
[0053] 第21项：如第20项的细胞，其中该金黄色葡萄球菌的减毒存活形式具有稳定小菌落变体(SCV)表型。
[0054] 第22项：如第21项的细胞，其中该具有稳定SCV表型的金黄色葡萄球菌的减毒存活形式是ΔhemBΔ720S金黄色葡萄球菌。
[0055] 第23项：一种组合物，其包含：(A)至少一种如第1项至第16项的构建体；至少一种如第17项的核酸分子；至少一种如第18项的载体；或至少一种如第19项至第22项中任一项的细胞；及(B)(i)如第1项至第11项中任一项所定义的多肽；(ii)减毒活金黄色葡萄球菌；
(iii)可药用的赋形剂；(iv)佐剂；或(v)(i)至(iv)中至少两种的组合。
(iii)可药用的赋形剂；(iv)佐剂；或(v)(i)至(iv)中至少两种的组合。
[0056] 第24项：如第23项的组合物，其中该金黄色葡萄球菌的减毒存活形式表达：(a)基于NCBI参考序列NC_002951.2中所述的金黄色葡萄球菌 COL(SACOL)基因组中的基因命名
法，包含以下的多肽：如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中的任一个中所述的 SACOL0029多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:185)、如图22D中所描绘的序列(SEQ ID
NO:29及82至92)中的任一个中所述的SACOL0442 多肽、SACOL0718多肽(SEQ ID NO:186)、
如图23I-K中所描绘的序列 (SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的SACOL0720多
肽、 SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、SACOL1611(SEQ ID NO:189)、如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:152至164)中的任一个中所述的
SACOL1867多肽、 SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944多肽(SEQ ID NO:190)、
SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽(SEQ ID NO:192)、SACOL2385多肽(SEQ
ID NO:50)或SACOL2599多肽(SEQ ID NO:193)；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的
操纵子的基因编码的多肽；(c)包括含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的
多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多
肽；或(e)包括含(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽。
法，包含以下的多肽：如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中的任一个中所述的 SACOL0029多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:185)、如图22D中所描绘的序列(SEQ ID
NO:29及82至92)中的任一个中所述的SACOL0442 多肽、SACOL0718多肽(SEQ ID NO:186)、
如图23I-K中所描绘的序列 (SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的SACOL0720多
肽、 SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、SACOL1611(SEQ ID NO:189)、如图25D中所描绘的序列(SEQ ID NO:152至164)中的任一个中所述的
SACOL1867多肽、 SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944多肽(SEQ ID NO:190)、
SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽(SEQ ID NO:192)、SACOL2385多肽(SEQ
ID NO:50)或SACOL2599多肽(SEQ ID NO:193)；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因相同的
操纵子的基因编码的多肽；(c)包括含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的
多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多
肽；或(e)包括含(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽。
[0057] 第25项：如第23项或第24项的组合物，其中该金黄色葡萄球菌的减毒存活形式具有稳定小菌落变体(SCV)表型。
[0058] 第26项：如第23项至第25项中任一项的组合物其中该佐剂包含矾、油(例如乳化油、矿物油)、皂素(例如Quil-ATM)、环状-二鸟苷-5'-单磷酸(c-di-GMP)、聚磷腈、吲哚力西丁(indolicidin)、病原体相关分子模式(PAMPS)或其中至少两种的组合。
[0059] 第27项：一种用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染 (IMI)的方法，该方法包含向该哺乳动物投与有效量的如第1项至第16项中任一项的构建体；如第17项的
核酸分子；如第18项的载体；如第19项至第22项中任一项的细胞；或如第23项至第26项中任一项的组合物。
核酸分子；如第18项的载体；如第19项至第22项中任一项的细胞；或如第23项至第26项中任一项的组合物。
[0060] 第28项：如第27项的方法，其中该葡萄球菌IMI是由一或多种金黄色葡萄球菌株引起。
[0061] 第29项：如第27项或第28项的方法，其中该哺乳动物是母牛。
[0062] 第30项：一种有效量的(i)如第1项至第16项中任一项的构建体；(ii) 如第17项的核酸分子；(iii)如第18项的载体；如第19项至第22项中任一项的细胞；(iv)如第23项至第
26项中任一项的组合物；或(v)(i)至(iv)中至少两种的组合的用途，其是用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)。
26项中任一项的组合物；或(v)(i)至(iv)中至少两种的组合的用途，其是用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)。
[0063] 第31项：如第30项的用途，其中该葡萄球菌IMI是由一或多种金黄色葡萄球菌株引起。
[0064] 第32项：如第30项或第31项的用途，其中该哺乳动物是母牛。
[0065] 第33项：如第1项至第16项中任一项的构建体；如第17项的核酸分子；如第18项的载体；如第19项至第22项中任一项的细胞；如第23项至第26项中任一项的组合物或其中至
少两种的组合，其是用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)。
少两种的组合，其是用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)。
[0066] 第34项：如第33项的构建体、核酸分子、载体、细胞、组合物或组合，其中该葡萄球菌IMI是由一或多种金黄色葡萄球菌株引起。
[0067] 第35项：如第33项或第34项的构建体、核酸分子、载体、细胞或组合物，其中该哺乳动物是母牛。
[0068] 第36项：一种用于预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染 (IMI)的试剂盒，其包含：(A)(i)至少一种如第1项至第16项中任一项的构建体；(ii)至少一种如第17项核酸分子；(iii)至少一种如第18项的载体；(iv)至少一种如第19项至第22项中任一项的细胞；或(v)(i)至(iv)中至少两种的组合，及(B)(i)如第1项至第11项中任一项所定义的多
肽； (ii)减毒活金黄色葡萄球菌；(iii)可药用的赋形剂；(iv)佐剂；(v)有关使用该试剂盒预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)的说明书；或(vi)(i)至(v)中至少两
种的组合。
附图说明
肽； (ii)减毒活金黄色葡萄球菌；(iii)可药用的赋形剂；(iv)佐剂；(v)有关使用该试剂盒预防及/或治疗哺乳动物的葡萄球菌乳房内感染(IMI)的说明书；或(vi)(i)至(v)中至少两
种的组合。
附图说明
[0069] 在附图中：
[0070] 图1A-D.显示在第二次免疫接种之后四周(在即将实验性感染之前)，经疫苗接种(9)及安慰剂(10)母牛对疫苗中各抗原,即SACOL0029、 SACOL0442、SACOL0720、SACOL1867、SACOL1912及 SACOL2385的血清总IgG(图1A)、IgG1(图1B)及IgG2(图1C)效价。在图1D中，呈现经疫苗接种的母牛的IgG2/IgG1比率。在图1A、B及C 中，空心圆(○)表示经疫苗接种的母牛的资料，黑色正方形(■)表示安慰剂母牛的资料。每一符号表示一头母牛的效价。水平线表示中值：虚线表示经疫苗接种的母牛的中值，而连续线表示安慰剂母牛的中值。在图 1A、B及C中，经疫苗接种的母牛的效价高于安慰剂母牛的效价 (P<0.0001)。在图1D中，符号表示每头母牛的IgG2/IgG1比率。水平线表示中值。不同字母显示统计差异。＊＊＊，P<0.001。
[0071] 图2.显示在针对各抗原第二次免疫接种之后四周，来自经疫苗接种的母牛(9)及安慰剂母牛(10)的血液CD4+细胞的抗原依赖性增殖情况。每个符号表示在与阳性对照
(ConA)或各抗原，即SACOL0029、 SACOL0442、SACOL0720、SACOL1867、SACOL1912及
SACOL2385一起培育一周之后，每头母牛中增殖的CD4+细胞的百分含量。空心圆(○)表示经疫苗接种的母牛的资料，黑色正方形(■)表示安慰剂母牛的资料。水平线表示中值：虚线表示经疫苗接种的母牛的中值，而连续线表示安慰剂母牛的中值。统计分析：SAS的混合程序。
符号＊显示针对抗原SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720及 SACOL1912，疫苗接种组与安慰剂组的间的统计差异(＊，P<0.05)。此外，对于除抗原SACOL0720的外的所有抗原，经疫苗接种的母牛及安慰剂母牛的CD8+细胞增殖类似，对于抗原SACOL0720，在经疫苗接种的母牛中观察到较高CD8+细胞增殖(数据未显示)。
(ConA)或各抗原，即SACOL0029、 SACOL0442、SACOL0720、SACOL1867、SACOL1912及
SACOL2385一起培育一周之后，每头母牛中增殖的CD4+细胞的百分含量。空心圆(○)表示经疫苗接种的母牛的资料，黑色正方形(■)表示安慰剂母牛的资料。水平线表示中值：虚线表示经疫苗接种的母牛的中值，而连续线表示安慰剂母牛的中值。统计分析：SAS的混合程序。
符号＊显示针对抗原SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720及 SACOL1912，疫苗接种组与安慰剂组的间的统计差异(＊，P<0.05)。此外，对于除抗原SACOL0720的外的所有抗原，经疫苗接种的母牛及安慰剂母牛的CD8+细胞增殖类似，对于抗原SACOL0720，在经疫苗接种的母牛中观察到较高CD8+细胞增殖(数据未显示)。
[0072] 图3.显示在奶牛中进行的实验性金黄色葡萄球菌乳房内感染。在第二次免疫接种之后四周及4天，在晚间挤奶时将63个菌落形成单位 (CFU)的金黄色葡萄球菌输注至经疫
苗接种的母牛(9)及安慰剂母牛 (10)4个乳区中的3个中(第1天，图3中的箭头)。在早晨挤
奶时取得无菌牛奶样品且由Valacta(Ste-Anne-de-Bellevue,QC)测定体细胞计数 (SCC)。
空心圆(○)及虚线表示经疫苗接种的母牛的资料，而黑色正方形 (■)及连续线表示安慰
剂母牛的资料。每个空心圆表示经疫苗接种母牛的所有经感染乳区(27个)的平均SCC，而每个正方形表示安慰剂母牛所有经感染乳区(30个乳区)的平均SCC。在激发时间段内，发现牛奶中的体细胞计数在经疫苗接种母牛中明显低于安慰剂母牛(＊＊＊；P<0.001)。
苗接种的母牛(9)及安慰剂母牛 (10)4个乳区中的3个中(第1天，图3中的箭头)。在早晨挤
奶时取得无菌牛奶样品且由Valacta(Ste-Anne-de-Bellevue,QC)测定体细胞计数 (SCC)。
空心圆(○)及虚线表示经疫苗接种的母牛的资料，而黑色正方形 (■)及连续线表示安慰
剂母牛的资料。每个空心圆表示经疫苗接种母牛的所有经感染乳区(27个)的平均SCC，而每个正方形表示安慰剂母牛所有经感染乳区(30个乳区)的平均SCC。在激发时间段内，发现牛奶中的体细胞计数在经疫苗接种母牛中明显低于安慰剂母牛(＊＊＊；P<0.001)。
[0073] 图4A-C.图4A显示CFU与每头母牛的SCC的间的相关性，且图4B 显示针对SACOL0442的血清IgG1效价与每头母牛的SCC的间的相关性。每个符号表示一头母牛的资
料。在图4A中，其表示自感染开始至结束3个经感染乳区的平均SCC及CFU。在图4B中，其表示自感染开始至结束3个经感染乳区的平均SCC以及在第二次免疫接种之后四周及即将实验
性感染之前针对SACOL0442的血清IgG1效价。空心圆表示经疫苗接种的母牛的资料，且黑色正方形表示安慰剂母牛的资料。SCC/ml 与CFU/ml的间存在较强相关性且SCC与针对
SACOL0442的IgG1效价的间存在负相关性。在图4C中，显示在实验性感染之后十天(第二次
免疫接种之后6周)，每头母牛的SCC或CFU相对于针对SACOL0029的牛奶IgG2效价之间的相
关性。每个符号表示在实验性感染之后十天一头母牛的数据。在早晨挤奶时取得无菌牛奶
样品且藉由10倍稀释并涂铺于胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)板上来测定金黄色葡萄球菌活菌计
数，同时由 Valacta(Ste-Anne-de-Bellevue,QC)测定SCC。每头母牛的SCC及CFU数据是在
实验性感染之后十天3经感染乳区的平均数据。用于测定牛奶 IgG2效价的牛奶样品系在实
验性感染之后10天(第二次免疫接种之后6 周)，来自每头母牛的4个乳区的等体积牛奶的
混合物。黑色正方形(■) 表示安慰剂母牛的资料，空心圆(○)表示经疫苗接种的母牛的资料。
料。在图4A中，其表示自感染开始至结束3个经感染乳区的平均SCC及CFU。在图4B中，其表示自感染开始至结束3个经感染乳区的平均SCC以及在第二次免疫接种之后四周及即将实验
性感染之前针对SACOL0442的血清IgG1效价。空心圆表示经疫苗接种的母牛的资料，且黑色正方形表示安慰剂母牛的资料。SCC/ml 与CFU/ml的间存在较强相关性且SCC与针对
SACOL0442的IgG1效价的间存在负相关性。在图4C中，显示在实验性感染之后十天(第二次
免疫接种之后6周)，每头母牛的SCC或CFU相对于针对SACOL0029的牛奶IgG2效价之间的相
关性。每个符号表示在实验性感染之后十天一头母牛的数据。在早晨挤奶时取得无菌牛奶
样品且藉由10倍稀释并涂铺于胰蛋白酶大豆琼脂(TSA)板上来测定金黄色葡萄球菌活菌计
数，同时由 Valacta(Ste-Anne-de-Bellevue,QC)测定SCC。每头母牛的SCC及CFU数据是在
实验性感染之后十天3经感染乳区的平均数据。用于测定牛奶 IgG2效价的牛奶样品系在实
验性感染之后10天(第二次免疫接种之后6 周)，来自每头母牛的4个乳区的等体积牛奶的
混合物。黑色正方形(■) 表示安慰剂母牛的资料，空心圆(○)表示经疫苗接种的母牛的资料。
[0074] 图5.显示经疫苗接种的母牛对包含融合抗原SACOL0029及 SACOL1867(显示为SACOL0029-1867)以及抗原SACOL0442及 SACOL0720的疫苗中各抗原的血清总IgG效价。在
ELISA中，靶抗原是SACOL0029-1867、SACOL0029、SACOL1867、SACOL0442及 SACOL0720。每个空心圆表示在第二次免疫接种之后四周11头母牛各自的效价，而每个黑色菱形表示免疫前
效价。水平线表示中值：实线表示免疫前血清，点线表示在免疫接种之后四周取得的样品。
经疫苗接种的母牛的效价高于免疫前血清的效价(＊＊，P<0.01；对于测试的其他抗
原，＊＊＊，P<0.001)。
ELISA中，靶抗原是SACOL0029-1867、SACOL0029、SACOL1867、SACOL0442及 SACOL0720。每个空心圆表示在第二次免疫接种之后四周11头母牛各自的效价，而每个黑色菱形表示免疫前
效价。水平线表示中值：实线表示免疫前血清，点线表示在免疫接种之后四周取得的样品。
经疫苗接种的母牛的效价高于免疫前血清的效价(＊＊，P<0.01；对于测试的其他抗
原，＊＊＊，P<0.001)。
[0075] 图6显示免疫接种相等摩尔量的融合蛋白(SACOL0029-1867；融合物)、独立蛋白质的组合(SACOL0029+SACOL1867；组合)、单独 SACOL0029蛋白质(0029)或单独SACOL1867蛋
白质(1867)的小鼠中针对SACOL1867抗原的血清总IgG效价。空心圆(○)表示免疫前效价资
料，黑色正方形(■)表示免疫效价资料。对于免疫前效价，相等地混合各免疫接种组中5只小鼠的间的免疫前血清以获得免疫前池效价，以每组一个空心圆表示。对于免疫效价，每个正方形符号表示一只小鼠的效价。水平线表示中值：黑色线表示免疫血清的中值，而虚线
(及空心圆) 表示免疫前血清池的中值。融合物、组合及1867组中经疫苗接种小鼠的效价高于免疫前小鼠的效价P<0.001)，且发现仅接受SACOL0029单价抗原的小鼠的效价与免疫前
池针对SACOL1867的效价无明显不同。显示融合物组相对于组合及两个单价疫苗组的免疫
效价的间的统计显著性 (＊＊＊：P<0.001)。
白质(1867)的小鼠中针对SACOL1867抗原的血清总IgG效价。空心圆(○)表示免疫前效价资
料，黑色正方形(■)表示免疫效价资料。对于免疫前效价，相等地混合各免疫接种组中5只小鼠的间的免疫前血清以获得免疫前池效价，以每组一个空心圆表示。对于免疫效价，每个正方形符号表示一只小鼠的效价。水平线表示中值：黑色线表示免疫血清的中值，而虚线
(及空心圆) 表示免疫前血清池的中值。融合物、组合及1867组中经疫苗接种小鼠的效价高于免疫前小鼠的效价P<0.001)，且发现仅接受SACOL0029单价抗原的小鼠的效价与免疫前
池针对SACOL1867的效价无明显不同。显示融合物组相对于组合及两个单价疫苗组的免疫
效价的间的统计显著性 (＊＊＊：P<0.001)。
[0076] 图7.针对SACOL0442的氨基酸序列片段
[0077] (GEHLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTAD，SEQ ID NO:2)中所含B细胞表位序列KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO: 1)且自免疫接种由SACOL0442及SACOL0720编码的肽的
融合物 KDGGKYTLESHKELQEAAAKEAAAKKDINKIYFMTDVDLGGPTF VLND(SEQ ID NO:3)(第1组)
或由SACOL0442编码的肽 KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)(第2组)的小鼠获得的血清总
IgG(如在ELISA分析法中藉由O.D.450nm所量测)。每组由4只动物(n ＝4)构成，间隔2周向
这些动物注射等摩尔量的序列 KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)(对应于第1组100μg KDG
GKYTLESHKELQEAAAKEAAAKKDINKIYFMTDVDLGGPTF VLND(SEQ ID NO:3)及第2组31.25μg
KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1))，且由最后一次注射之后一周收集的血液制备血清。
ELISA 分析法是用稀释100000倍的血清样品进行且使用来自SACOL0442的片段(GEHLPKGN
IVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTAD， (SEQ ID NO:2))作为含有肽表位KDGGKYTLESHKELQ
(SEQ ID NO: 1)的靶抗原。个体资料在图上以圆形表示且中值以线条表示。发现各组的间
的差异是统计显著的(p<0.0286，Kuskal-Wallis检验， GraphPadPrismTM 7.00)。
融合物 KDGGKYTLESHKELQEAAAKEAAAKKDINKIYFMTDVDLGGPTF VLND(SEQ ID NO:3)(第1组)
或由SACOL0442编码的肽 KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)(第2组)的小鼠获得的血清总
IgG(如在ELISA分析法中藉由O.D.450nm所量测)。每组由4只动物(n ＝4)构成，间隔2周向
这些动物注射等摩尔量的序列 KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)(对应于第1组100μg KDG
GKYTLESHKELQEAAAKEAAAKKDINKIYFMTDVDLGGPTF VLND(SEQ ID NO:3)及第2组31.25μg
KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1))，且由最后一次注射之后一周收集的血液制备血清。
ELISA 分析法是用稀释100000倍的血清样品进行且使用来自SACOL0442的片段(GEHLPKGN
IVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTAD， (SEQ ID NO:2))作为含有肽表位KDGGKYTLESHKELQ
(SEQ ID NO: 1)的靶抗原。个体资料在图上以圆形表示且中值以线条表示。发现各组的间
的差异是统计显著的(p<0.0286，Kuskal-Wallis检验， GraphPadPrismTM 7.00)。
[0078] 图8A-B.金黄色葡萄球菌ATCC29213及Δ720菌株中hemB缺失。(图 8A)藉由同源重组且用ermA卡匣替代使野生型(WT)病毒株ATCC29213 及其同基因突变株Δ720中的hemB基
因缺失，由此分别建立突变株ΔhemB及Δ720ΔhemB。粗线及数字表示B中所描绘的亲本(1)及hemB缺失(2)菌株的PCR扩增区。(图8B)WT菌株及其同基因ΔhemB突变株的 PCR产物(用
Δ720及Δ720ΔhemB菌株获得类似结果)。
因缺失，由此分别建立突变株ΔhemB及Δ720ΔhemB。粗线及数字表示B中所描绘的亲本(1)及hemB缺失(2)菌株的PCR扩增区。(图8B)WT菌株及其同基因ΔhemB突变株的 PCR产物(用
Δ720及Δ720ΔhemB菌株获得类似结果)。
[0079] 图9A-C.显示金黄色葡萄球菌ΔhemB、Δ720及ΔhemBΔ720突变对 MAC-T细胞感染性的影响。用四种菌株分别感染MAC-T细胞3小时，接着将其与溶葡球菌酶一起再培育30
分钟(t＝3小时)、12小时或24小时，并溶解以量测存活细胞内细菌(CFU)。t＝3小时在细胞内发现的(图 9A)针对Δ720及(图9B)针对ΔhemBΔ720突变株的初始接种物的相对回收
率。结果分别根据所获得的关于ATCC 29213(WT)或ΔhemB的结果标准化，且以平均值加SD
表示(＊＊，P≤0.01；＊＊＊，P≤0.001；不成对t检验)。(图9C)在12小时(左)及24小时(右)针对WT及突变株的细胞内CFU 的平均值加SD。使用双因素变异数分析(two-way ANOVA)及
Tukey多重比较检验(＊：P≤0.05；＊＊＊：P≤0.001)。所有值指示三个独立实验的平均值，各一式三份进行。
分钟(t＝3小时)、12小时或24小时，并溶解以量测存活细胞内细菌(CFU)。t＝3小时在细胞内发现的(图 9A)针对Δ720及(图9B)针对ΔhemBΔ720突变株的初始接种物的相对回收
率。结果分别根据所获得的关于ATCC 29213(WT)或ΔhemB的结果标准化，且以平均值加SD
表示(＊＊，P≤0.01；＊＊＊，P≤0.001；不成对t检验)。(图9C)在12小时(左)及24小时(右)针对WT及突变株的细胞内CFU 的平均值加SD。使用双因素变异数分析(two-way ANOVA)及
Tukey多重比较检验(＊：P≤0.05；＊＊＊：P≤0.001)。所有值指示三个独立实验的平均值，各一式三份进行。
[0080] 图10.显示在MAC-T细胞内金黄色葡萄球菌ATCC 29213(WT)及同基因突变株随时间持续存在。用四种菌株分别感染MAC-T细胞3小时，接着将其与溶葡球菌酶一起再培育30
分钟、12小时或24小时，并溶解以量测细胞内细菌(CFU)。细胞内细菌CFU是以转换成以10为底的对数值之后的初始接种物的百分含量表示(Log10CFU/ml)。值指示三个独立的一式三
份实验的平均值加标准偏差。
分钟、12小时或24小时，并溶解以量测细胞内细菌(CFU)。细胞内细菌CFU是以转换成以10为底的对数值之后的初始接种物的百分含量表示(Log10CFU/ml)。值指示三个独立的一式三
份实验的平均值加标准偏差。
[0081] 图11A-B.显示经金黄色葡萄球菌ATCC 29213(WT)及同基因突变株感染的MAC-T细胞的活力。用四种菌株分别感染MAC-T细胞3小时，接着将其与溶葡球菌酶一起培育12小时
(A)或24小时(B)。接着，利用 Kubica等人,2008中所描述的方法进行MTT活力分析。结果报导为相对于未感染细胞的活力百分比且以一式三份进行的三个独立实验的平均值加SD表
示。带有(Φ)符号的统计显著性是与WT相比较(双因素变异数分析及Tukey多重比较检
验：＊或Φ：P≤0.05；＊＊：P≤0.01；＊＊＊： P≤0.001；ΦΦΦΦ：P≤0.0001)。
(A)或24小时(B)。接着，利用 Kubica等人,2008中所描述的方法进行MTT活力分析。结果报导为相对于未感染细胞的活力百分比且以一式三份进行的三个独立实验的平均值加SD表
示。带有(Φ)符号的统计显著性是与WT相比较(双因素变异数分析及Tukey多重比较检
验：＊或Φ：P≤0.05；＊＊：P≤0.01；＊＊＊： P≤0.001；ΦΦΦΦ：P≤0.0001)。
[0082] 图12.显示用亲本(WT)及ΔhemBΔ720(ΔΔ)菌株处理的鼠类IMI。如先前所描述感染小鼠且在感染之后指定小时数(h)或天数(D)收集腺体。每个条柱表示一组腺体的细菌
CFU计数的中值，且范围是以线条指示。除WT菌株(2个腺体：仅一只小鼠存活)外，在D7使用每组最少六个腺体。在特定时间点时小鼠的死亡率是由箭头指示。星号指示自腺体清除Δ
hemBΔ720(低于每个腺体10CFU的检测限)。
CFU计数的中值，且范围是以线条指示。除WT菌株(2个腺体：仅一只小鼠存活)外，在D7使用每组最少六个腺体。在特定时间点时小鼠的死亡率是由箭头指示。星号指示自腺体清除Δ
hemBΔ720(低于每个腺体10CFU的检测限)。
[0083] 图13.在感染之后的前24小时，双重突变株(Δ720ΔhemB)刺激乳腺中嗜中性球的流入量达到与WT类似的水平。如材料及方法中所描述，感染小鼠，且对照组(PBS)小鼠接受无菌PBS注射。如材料及方法中所描述，在指定时间收集腺体，均质化且针对MPO活性进行动力学分析。每个点表示一个腺体的MPO单位数，其显示为以腺体的公克数调整的原始值。平均值由粗线表示。
[0084] 图14.在用金黄色葡萄球菌ATCC 29213(WT)及双重突变株Δ720ΔhemB(ΔΔ)进行小鼠IMI之后24小时，较大R4及L4乳腺的目测炎症。如材料及方法中所描述，感染小鼠，且对照组(PBS)小鼠接受无菌 PBS注射。图片显示在24小时之后收集的腺体。在各图中，显示R4(左) 及L4(右)腺体。
[0085] 图15A.在清除双重突变株Δ720ΔhemB之后，嗜中性球浸润恢复正常水平。如材料及方法中所描述，感染小鼠，且对照组(PBS)小鼠接受无菌PBS注射。如材料及方法中所描
述，在指定时间采集腺体，均质化且针对MPO活性进行动力学分析。条柱表示以腺体的公克数调整的一组6个腺体(PBS对照组4个)的平均MPO单位数，且误差条说明标准偏差。感染后
第4天与第12天组的间的统计显著性由(Φ)符号显示。使用单因素变异数分析及Tukey多重
比较检验(ΦΦ：P≤0.01；NS：各组的间无显著差异)。
述，在指定时间采集腺体，均质化且针对MPO活性进行动力学分析。条柱表示以腺体的公克数调整的一组6个腺体(PBS对照组4个)的平均MPO单位数，且误差条说明标准偏差。感染后
第4天与第12天组的间的统计显著性由(Φ)符号显示。使用单因素变异数分析及Tukey多重
比较检验(ΦΦ：P≤0.01；NS：各组的间无显著差异)。
[0086] 图15B-C.用减毒活双重突变株(Δ720ΔhemB)免疫接种小鼠刺激针对常见spa类型的金黄色葡萄球菌牛乳腺炎分离株的较强体液反应。如先前所描述对小鼠免疫接种：在
初始免疫接种之前(免疫前)及增强免免疫接种之后十天(免疫)，收集血清。图15B.IgG效价随减毒活菌株Δ720GΔhemB剂量增加而升高：每个点表示一只小鼠针对Δ720GΔhemB 全
细胞提取物的总IgG效价。免疫效价的中值由粗线表示且虚线表示免疫前效价。将效价与相应免疫前效价相比较(双因素变异数分析及Tukey 多重比较检验：＊＊＊＊：P≤0.0001)。
图15C.免疫接种减毒活突变株Δ720GΔhemB赋予针对常见spa类型的乳腺炎菌株共有的组
分的IgG效价。每个点表示一只小鼠针对指定菌株的全细胞提取物的总IgG效价。免疫效价
的中值由粗线表示且虚线表示免疫前效价。将所有免疫效价与其相应免疫前效价相比较(P
≤0.0001)且在临床菌株的间进行比较(双因素变异数分析及Sidak多重比较检验：NS：无显著差异)。
初始免疫接种之前(免疫前)及增强免免疫接种之后十天(免疫)，收集血清。图15B.IgG效价随减毒活菌株Δ720GΔhemB剂量增加而升高：每个点表示一只小鼠针对Δ720GΔhemB 全
细胞提取物的总IgG效价。免疫效价的中值由粗线表示且虚线表示免疫前效价。将效价与相应免疫前效价相比较(双因素变异数分析及Tukey 多重比较检验：＊＊＊＊：P≤0.0001)。
图15C.免疫接种减毒活突变株Δ720GΔhemB赋予针对常见spa类型的乳腺炎菌株共有的组
分的IgG效价。每个点表示一只小鼠针对指定菌株的全细胞提取物的总IgG效价。免疫效价
的中值由粗线表示且虚线表示免疫前效价。将所有免疫效价与其相应免疫前效价相比较(P
≤0.0001)且在临床菌株的间进行比较(双因素变异数分析及Sidak多重比较检验：NS：无显著差异)。
[0087] 图16.显示免疫接种蛋白质混合物(由5μg抗原SACOL0029、 SACOL0442、SACOL0720及SACOL0029-1867融合物构成)、单独105 CFU减毒活菌株Δ720ΔhemB或该蛋白质混合物与Δ720ΔhemB菌株的组合的小鼠针对SACOL0029-1867融合蛋白的总血清IgG效价。空心圆
(○) 表示免疫前效价资料，黑色正方形(■)表示免疫效价资料。每个符号表示一只小鼠的效价。水平线表示中值：黑色线表示免疫血清的中值，而虚线表示免疫前血清的中值。蛋白质混合物组及组合组中经疫苗接种小鼠的效价高于免疫前小鼠的效价(P<0.001)。显示组
合组与两个其他经疫苗接种小鼠组的免疫效价的间的统计显著性(＊＊：P<0.01)。
(○) 表示免疫前效价资料，黑色正方形(■)表示免疫效价资料。每个符号表示一只小鼠的效价。水平线表示中值：黑色线表示免疫血清的中值，而虚线表示免疫前血清的中值。蛋白质混合物组及组合组中经疫苗接种小鼠的效价高于免疫前小鼠的效价(P<0.001)。显示组
合组与两个其他经疫苗接种小鼠组的免疫效价的间的统计显著性(＊＊：P<0.01)。
[0088] 图17.显示免疫接种蛋白质混合物(由5μg抗原SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720及SACOL0029-1867融合物构成)、单独105 CFU减毒活菌株Δ720ΔhemB或该蛋白质混合物
与Δ720ΔhemB菌株的组合的小鼠针对SACOL0029的总血清IgG效价。空心圆(○)表示免疫
前效价资料，黑色正方形(■)表示免疫效价资料。每个符号表示一只小鼠的总IgG效价。水平线表示中值：黑色线表示免疫血清的中值，而虚线表示免疫前血清的中值。显示三个小鼠组的免疫效价与免疫前效价的间的统计显著性(＊＊：P<0.01)。
与Δ720ΔhemB菌株的组合的小鼠针对SACOL0029的总血清IgG效价。空心圆(○)表示免疫
前效价资料，黑色正方形(■)表示免疫效价资料。每个符号表示一只小鼠的总IgG效价。水平线表示中值：黑色线表示免疫血清的中值，而虚线表示免疫前血清的中值。显示三个小鼠组的免疫效价与免疫前效价的间的统计显著性(＊＊：P<0.01)。
[0089] 图18.显示免疫接种SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720及 SACOL0029-1867蛋白质混合物、单独105CFU减毒活菌株Δ720ΔhemB 或该蛋白质混合物与Δ720ΔhemB的组合的
小鼠针对葡萄球菌表面蛋白质ClfA的总血清IgG效价。空心圆(○)表示免疫前效价资料，黑色正方形 (■)表示免疫效价资料。每个符号表示一只小鼠的效价。水平线表示中值：黑色线表示免疫血清的中值，而虚线表示免疫前血清的中值。显示免疫前效价与免疫效价的间
的统计显著性(＊：P<0.05)。
小鼠针对葡萄球菌表面蛋白质ClfA的总血清IgG效价。空心圆(○)表示免疫前效价资料，黑色正方形 (■)表示免疫效价资料。每个符号表示一只小鼠的效价。水平线表示中值：黑色线表示免疫血清的中值，而虚线表示免疫前血清的中值。显示免疫前效价与免疫效价的间
的统计显著性(＊：P<0.05)。
[0090] 图19.以下显示免疫接种该蛋白质混合物或该蛋白质混合物与减毒Δ720ΔhemB活菌株的组合的小鼠针对SACOL0029-1867融合多肽的血清 IgG2a/IgG1效价比率。
[0091] 图20.显示针对SACOL0029抗原的血清比率。空心正方形(□)表示免疫前效价资料，黑色正方形(■)表示免疫效价资料。每个符号表示一只小鼠的效价比。水平线表示中
值。显示蛋白质混合物组与组合组的间的统计显著性(＊：P<0.05；＊＊：P<0.01)。
值。显示蛋白质混合物组与组合组的间的统计显著性(＊：P<0.05；＊＊：P<0.01)。
[0092] 图21A-J.I.SACOL0029聚核苷酸(全长序列SEQ ID NO:4)及多肽 (全长、片段及变体序列SEQ ID NO:5至9)。选定的表位加阴影及/或加粗显示；II.SACOL0720聚核苷酸(全长序列SEQ ID NO:10)及多肽(全长、片段及变体序列SEQ ID NO:11至27)。选定的表位加阴影显示； III.SACOL0442聚核苷酸(全长序列SEQ ID NO:28)及多肽(全长、片段及变体序列
SEQ ID NO:29至36及1)。选定的表位加阴影显示；IV. SACOL1867聚核苷酸(全长序列SEQ
ID NO:37)及多肽(全长、片段及变体序列SEQ ID NO:38至41)。选定的表位加阴影显示。预测的跨膜 (http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html)结构域加粗显示；V.
SACOL1912聚核苷酸(全长序列SEQ ID NO:42)及多肽(全长及变体序列SEQ ID NO:43至
44)。选定的表位加阴影显示(参见例如，SEQ ID NO:45至48)；VI.SACOL2385聚核苷酸(全长SEQ ID NO:49)及多肽(全长及变体序列SEQ ID NO:50至51)。选定的表位加阴影显示(参见
例如，SEQ ID NO:52至53)；VII.融合物：(i)SACOL0029-1867融合聚核苷酸序列(SEQ ID
NO:54及56)及多肽序列(SEQ ID NO:55、57至58)。在聚核苷酸及多肽序列中，加双下划线的序列(若存在)是聚组氨酸序列，斜体序列是SACOL0029片段的序列，加单下划线的序列是接头序列且加粗序列是SACOL1867片段的序列；(ii)SACOL0720-720融合多肽序列(SEQ ID
NO:27)。在多肽序列中，加双下划线的序列(若存在)是聚组氨酸序列，斜体序列是
SACOL0720片段的序列且加单下划线的序列是接头序列；(iii)SACOL0442-720融合多肽序
列(SEQ ID NO:3)。在聚核苷酸及多肽序列中，加双下划线的序列(若存在)是聚组氨酸序
列，斜体序列是SACOL0442片段的序列，加单下划线的序列是接头序列且加粗序列是
SACOL0720片段的序列；及VIII.接头序列(SEQ ID NO:59 至70)。
SEQ ID NO:29至36及1)。选定的表位加阴影显示；IV. SACOL1867聚核苷酸(全长序列SEQ
ID NO:37)及多肽(全长、片段及变体序列SEQ ID NO:38至41)。选定的表位加阴影显示。预测的跨膜 (http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html)结构域加粗显示；V.
SACOL1912聚核苷酸(全长序列SEQ ID NO:42)及多肽(全长及变体序列SEQ ID NO:43至
44)。选定的表位加阴影显示(参见例如，SEQ ID NO:45至48)；VI.SACOL2385聚核苷酸(全长SEQ ID NO:49)及多肽(全长及变体序列SEQ ID NO:50至51)。选定的表位加阴影显示(参见
例如，SEQ ID NO:52至53)；VII.融合物：(i)SACOL0029-1867融合聚核苷酸序列(SEQ ID
NO:54及56)及多肽序列(SEQ ID NO:55、57至58)。在聚核苷酸及多肽序列中，加双下划线的序列(若存在)是聚组氨酸序列，斜体序列是SACOL0029片段的序列，加单下划线的序列是接头序列且加粗序列是SACOL1867片段的序列；(ii)SACOL0720-720融合多肽序列(SEQ ID
NO:27)。在多肽序列中，加双下划线的序列(若存在)是聚组氨酸序列，斜体序列是
SACOL0720片段的序列且加单下划线的序列是接头序列；(iii)SACOL0442-720融合多肽序
列(SEQ ID NO:3)。在聚核苷酸及多肽序列中，加双下划线的序列(若存在)是聚组氨酸序
列，斜体序列是SACOL0442片段的序列，加单下划线的序列是接头序列且加粗序列是
SACOL0720片段的序列；及VIII.接头序列(SEQ ID NO:59 至70)。
[0093] 图22A-D呈现I.全长SACOL0442及直是同源物的多个聚核苷酸序列 (SEQ ID NO:71至72、28、73至81)比对；II.全长SACOL0442、直是同源物的多个多肽序列(SEQ ID NO:29及82至92)比对及由此得到的共有序列。在这些序列中，「＊」表示该行中的残基在比对的所有序列中均一致，「:」表示观察到保守取代且「.」表示观察到半保守取代。亦呈现由这些比对得到的共有序列，其中X是任何氨基酸。在这些多肽序列中，选定的表位是加阴影显示(参见例如，SEQ ID NO:1、34、93至97)。
[0094] 图23A-K呈现I.全长SACOL0720及直是同源物的多个聚核苷酸序列 (SEQ ID NO:98至104、10及105至108)比对；II.全长SACOL0720、直是同源物的多个多肽序列(SEQ ID
NO:11及109至120)比对及由此得到的共有序列。。在这些序列中，「＊」表示该行中的残基在比对的所有序列中均一致「，:」表示观察到保守取代且「.」表示观察到半保守取代。亦呈现由这些比对得到的共有序列，其中X是任何氨基酸。在这些多肽序列中，选定的表位是加阴影显示(参见例如，SEQ ID NO:22、19及 21)。
NO:11及109至120)比对及由此得到的共有序列。。在这些序列中，「＊」表示该行中的残基在比对的所有序列中均一致「，:」表示观察到保守取代且「.」表示观察到半保守取代。亦呈现由这些比对得到的共有序列，其中X是任何氨基酸。在这些多肽序列中，选定的表位是加阴影显示(参见例如，SEQ ID NO:22、19及 21)。
[0095] 图24呈现全长SACOL0029、直是同源物的多个多肽序列(SEQ ID NO:5及121至131)比对及由此得到的共有序列。在这些序列中「，＊」表示该行中的残基在比对的所有序列中均一致，「:」表示观察到保守取代且「.」表示观察到半保守取代。亦呈现由这些比对得到的共有序列，其中X是任何氨基酸。在这些多肽序列中，选定的表位是加阴影显示(参见例如，SEQ ID NO:132至139)。加粗的表位藉由BCPredTM鉴别。加阴影的表位藉由AAp预测鉴别。
[0096] 图25A-D.呈现I-全长SACOL1867及直是同源物的多个聚核苷酸序列(SEQ ID NO:140至151)比对；II-全长SACOL1867、直是同源物的多个多肽序列(SEQ ID NO:152至164)比对及由此得到的共有序列。在这些序列中，「＊」表示该行中的残基在比对的所有序列中均一致，「:」表示观察到保守取代且「.」表示观察到半保守取代。亦呈现由这些比对得到的共有序列，其中X是任何氨基酸。在多肽序列中，选定的表位是加阴影显示(参见例如，SEQ ID NO:165至180)且信号肽结构域及/或跨膜结构域的末端用线标记(信号肽及/或跨膜结构域
自分泌形式分离)。
自分泌形式分离)。
[0097] 图26.I-全长SACOL1715(hemB)的聚核苷酸序列(SEQ ID NO:181)；及II-全长SACOL1715(hemB)的氨基酸序列(SEQ ID NO:182)。
[0098] 图27.I-全长ClfA(NWMN_0756,newman)的聚核苷酸序列(SEQ ID NO:183)；及II-全长ClfA的氨基酸序列(SEQ ID NO:184)。
具体实施方式
[0099] 本发明显示，两种抗原的融合物在免疫反应中产生出人意料的协同作用。
[0100] 此外，本发明亦经由hemB(完全缺失，由此减小反突变成侵袭性表型的可能(Tuchscherr,2011))使葡萄球菌的SCV表型稳定，使其能够用作疫苗递送系统。HemB编码
HemB蛋白质/单体，其组合以产生胆色素原合成酶或胺基乙酰丙酸酯脱水酶[EC
4.2.1.24]。此外，藉由使本发明的抗原，即基因SACOL0720失活实现进一步减毒，先前已显示该抗原在阳离子肽抗性(Falord,2012；Kawada-Matsuo,2011；Meehl,2007)及在活体内
IMI期间(Allard,2013)对于金黄色葡萄球菌极为重要。因此，表达本发明的构建体的该减
毒双重突变株可用于针对IMI的免疫接种及保护。
HemB蛋白质/单体，其组合以产生胆色素原合成酶或胺基乙酰丙酸酯脱水酶[EC
4.2.1.24]。此外，藉由使本发明的抗原，即基因SACOL0720失活实现进一步减毒，先前已显示该抗原在阳离子肽抗性(Falord,2012；Kawada-Matsuo,2011；Meehl,2007)及在活体内
IMI期间(Allard,2013)对于金黄色葡萄球菌极为重要。因此，表达本发明的构建体的该减
毒双重突变株可用于针对IMI的免疫接种及保护。
[0101] 通用定义
[0102] 呈现的标题及其他标识符，例如(a)、(b)、(i)、(ii)等，仅为了方便阅读本说明书及申请专利范围。在本说明书或申请专利范围中使用标题或其他标识符未必需要按字母或数字次序或者步骤或要素呈现的次序进行步骤或要素。
[0103] 在本说明书中，广泛地利用多个术语。为了提供对本说明书及申请专利范围(包括给出的此类术语的范畴)的清楚且一致的理解，提供以下定义。
[0104] 当在申请专利范围及/或说明书中与术语「包含」一词结合使用时，使用词语「一个(种)(a/an)」可意谓「一个(种)」，但其亦与「一或多个(种)」、「至少一个(种)」及「一个(种)或多于一个(种)」的含义相符。
[0105] 在本申请案全文中，术语「约」用于指示值包括用于测定该值的装置或方法的误差的标准偏差。一般而言，术语「约」意图指示至多10％的可能变化。因此，一个值的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、 8％、9％及10％的变化包括在术语「约」内。除非另外指明，否则在一个范围之前使用术语「约」适用于该范围的两端。
[0106] 如本说明书及申请专利范围中所使用，词语「包含(comprising)」 (及包含的任何形式，诸如「包含(comprise)」及「包含 (comprises)」)、「具有(having)」(及具有的任何形式，诸如「具有 (have)」及「具有(has)」)、「包括(including)」(及包括的任何形式，诸如「包括(includes)」及「包括(include)」)或「含有(containing)」(及含有的任何形式，诸如「含有(contains)」及「含有(contain)」为包容性或开放性的且不排除其他未列出的要素或方法步骤。
[0108] 多肽、核酸及递送系统
[0109] 如本文所使用，术语「疫苗」是指能够在宿主体内诱导/引发免疫反应且允许治疗及/或预防感染及/或疾病的任何化合物/试剂「( 疫苗组分」)或其组合。因此，此类试剂的非限制性实例包括蛋白质、多肽、蛋白质/多肽片段、免疫原、抗原、肽表位、表位，蛋白质、肽或表位以及分开添加或以相邻序列形式(诸如在核酸疫苗中)添加的核酸、基因或基因部分
(编码所关注多肽或蛋白质或其片段)的混合物，及类似物。
(编码所关注多肽或蛋白质或其片段)的混合物，及类似物。
[0110] 在本发明的一方面中，提供一种式I的融合构建体：
[0111] X-A-接头-B-Z(式(I))，
[0112] 其中A与B相同或不同且各自独立地为本发明的抗原多肽(亦即，其天然多肽、片段或变体)。
[0113] 在一具体实施例中，A及/或B是(a)包含以下的多肽：如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中的任一个中所述的SACOL0029 多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:
185)、如图22D中所描绘的序列 (SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的SACOL0442
多肽、 SACOL0718多肽(SEQ ID NO:186)、如图23I-J中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109
至120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽、 SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、SACOL1611(SEQ ID NO:189)、如图25D中所描绘的序列 (SEQ ID
NO:152至164)中的任一个中所述的SACOL1867多肽、如图 21G-V中所述的SACOL1912多肽
(SEQ ID NO:43)、SACOL1944(SEQ ID NO:190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、
SACOL2365多肽 (SEQ ID NO:192)、如图21H上的VI中所述的SACOL2385多肽(SEQ ID NO:
50)或SACOL2599多肽(SEQ ID NO:193)。在一具体实施例中，以上多肽(a)是如以上所定义
TM
多肽的分泌或细胞外片段。可以使用例如软件TMpred (ExPASy)
185)、如图22D中所描绘的序列 (SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的SACOL0442
多肽、 SACOL0718多肽(SEQ ID NO:186)、如图23I-J中所描绘的序列(SEQ ID NO:11及109
至120)中的任一个中所述的SACOL0720多肽、 SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、SACOL1611(SEQ ID NO:189)、如图25D中所描绘的序列 (SEQ ID
NO:152至164)中的任一个中所述的SACOL1867多肽、如图 21G-V中所述的SACOL1912多肽
(SEQ ID NO:43)、SACOL1944(SEQ ID NO:190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、
SACOL2365多肽 (SEQ ID NO:192)、如图21H上的VI中所述的SACOL2385多肽(SEQ ID NO:
50)或SACOL2599多肽(SEQ ID NO:193)。在一具体实施例中，以上多肽(a)是如以上所定义
TM
多肽的分泌或细胞外片段。可以使用例如软件TMpred (ExPASy)
[0114] http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html、
[0115] http://www.psort.org/psortb/index.html
[0116] http://www.enzim.hu/hmmtop/html/submit.html及/或SignlP 4.1
[0117] (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)预测跨膜结构域。TMpredTM及SignalIP 4.1预测SACOL0720的细胞外结构域为：AA 310至508； SACOL0442为AA 36至203。
Enzim预测出跨膜结构域SACOL1867(1- 40)，因此细胞外结构域为：AA 41至239，而
Enzim预测出跨膜结构域SACOL1867(1- 40)，因此细胞外结构域为：AA 41至239，而
[0118] http://www.psort.org/psortb/index.html预测SACOL1867是细胞外蛋白质。由于以上提及的跨膜及/或信号肽结构域是推定的，故本发明涵盖本文呈现的抗原(例如
SACOL1867)具有或不具有信号肽及/或跨膜结构域的情形且涵盖相应细胞外片段。在一个
实施例中，以上提及的多肽是通常在细菌(例如金黄色葡萄球菌)的表面分泌或表达的多
肽。
SACOL1867)具有或不具有信号肽及/或跨膜结构域的情形且涵盖相应细胞外片段。在一个
实施例中，以上提及的多肽是通常在细菌(例如金黄色葡萄球菌)的表面分泌或表达的多
肽。
[0119] 本发明所涵盖的本文中所列金黄色葡萄球菌基因及其编码的抗原多肽的Genbank登录编号描绘于下表I中：
[0120] 表I：本文所描述的IMI相关金黄色葡萄球菌基因及编码多肽的 GenBank登录编号
[0121]
[0122]
[0123]
[0124] 由比对某些上文所列的多肽得到的共有序列呈现于图21至25中。在这些共有序列的具体实施例中，共有序列(例如图21至25中的共有序列) 中的每个X定义为任何氨基酸，
或当在比对中呈现的一或多种直是同源物中不存在该位置时不存在。在这些共有序列的具
体实施例中，共有序列中的每个X定义为构成该比对中呈现的直是同源物中对应位置中的
氨基酸中的任一个的保守或半保守取代的任何氨基酸，或当在该比对中呈现的一或多种直
是同源物中不存在该位置时不存在。在图21至25中，保守取代是以符号「:」指示，且半保守取代是以符号「.」指示。在另一个实施例中，每个X是指与该比对中呈现的直是同源物中对应位置中的氨基酸残基中的任一个属于相同种类的任何氨基酸，或当在该比对中呈现的一
或多种直是同源物中不存在该位置时不存在。在另一个实施例中，每个X是指在该比对中呈现的直是同源物中的对应位置中的任何氨基酸，或当在该比对中呈现的一或多种直是同源
物中不存在该位置时不存在。在一具体实施例中，A及/或B是满足这些共有序列中的任一个或其片段的多肽。
或当在比对中呈现的一或多种直是同源物中不存在该位置时不存在。在这些共有序列的具
体实施例中，共有序列中的每个X定义为构成该比对中呈现的直是同源物中对应位置中的
氨基酸中的任一个的保守或半保守取代的任何氨基酸，或当在该比对中呈现的一或多种直
是同源物中不存在该位置时不存在。在图21至25中，保守取代是以符号「:」指示，且半保守取代是以符号「.」指示。在另一个实施例中，每个X是指与该比对中呈现的直是同源物中对应位置中的氨基酸残基中的任一个属于相同种类的任何氨基酸，或当在该比对中呈现的一
或多种直是同源物中不存在该位置时不存在。在另一个实施例中，每个X是指在该比对中呈现的直是同源物中的对应位置中的任何氨基酸，或当在该比对中呈现的一或多种直是同源
物中不存在该位置时不存在。在一具体实施例中，A及/或B是满足这些共有序列中的任一个或其片段的多肽。
[0125] 保守氨基酸突变可以包括氨基酸的添加、缺失或取代；保守氨基酸取代在本文中定义为一个氨基酸残基经具有类似化学特性(例如大小、电荷或极性)的另一氨基酸残基取
代。此类保守氨基酸取代可以为碱性、中性、疏水性或酸性氨基酸经同一组的另一氨基酸取代(参见例如下表II)。术语「碱性氨基酸」意谓侧链pK值大于7的亲水性氨基酸，其在生理pH下通常带正电。碱性氨基酸包括组氨酸(His或H)、精氨酸 (Arg或R)及赖氨酸(Lys或K)。术语「中性氨基酸」(又称「极性氨基酸」)意谓侧链在生理pH下不带电，但在具有的至少一个键中两个原子共同共有的电子对更靠近这些原子的一的亲水性氨基酸。极性氨基酸包括丝氨
酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr 或Y)、天冬酰胺(Asn或N)及谷氨酰胺(Gln或Q)。术语「疏水性氨基酸」(又称「非极性氨基酸」)意图包括根据Eisenberg标准化共有疏水性标度(normalized consensus hydrophobicity scale)(1984)，展现大
于零的疏水性的氨基酸。疏水性氨基酸包括脯氨酸(Pro或P)、异亮氨酸(He或 I)、苯丙氨酸(Phe或F)、缬氨酸(VaI或V)、亮氨酸(Leu或L)、色氨酸 (Trp或W)、甲硫氨酸(Met或M)、丙氨酸(Ala或A)及甘氨酸(GIy或G)。「酸性氨基酸」是指具有pK值小于7的侧链的亲水性氨基酸，其在生理 pH下通常带负电。酸性氨基酸包括谷氨酸(GIu或E)及天冬氨酸(Asp或 D)。
代。此类保守氨基酸取代可以为碱性、中性、疏水性或酸性氨基酸经同一组的另一氨基酸取代(参见例如下表II)。术语「碱性氨基酸」意谓侧链pK值大于7的亲水性氨基酸，其在生理pH下通常带正电。碱性氨基酸包括组氨酸(His或H)、精氨酸 (Arg或R)及赖氨酸(Lys或K)。术语「中性氨基酸」(又称「极性氨基酸」)意谓侧链在生理pH下不带电，但在具有的至少一个键中两个原子共同共有的电子对更靠近这些原子的一的亲水性氨基酸。极性氨基酸包括丝氨
酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、半胱氨酸(Cys或C)、酪氨酸(Tyr 或Y)、天冬酰胺(Asn或N)及谷氨酰胺(Gln或Q)。术语「疏水性氨基酸」(又称「非极性氨基酸」)意图包括根据Eisenberg标准化共有疏水性标度(normalized consensus hydrophobicity scale)(1984)，展现大
于零的疏水性的氨基酸。疏水性氨基酸包括脯氨酸(Pro或P)、异亮氨酸(He或 I)、苯丙氨酸(Phe或F)、缬氨酸(VaI或V)、亮氨酸(Leu或L)、色氨酸 (Trp或W)、甲硫氨酸(Met或M)、丙氨酸(Ala或A)及甘氨酸(GIy或G)。「酸性氨基酸」是指具有pK值小于7的侧链的亲水性氨基酸，其在生理 pH下通常带负电。酸性氨基酸包括谷氨酸(GIu或E)及天冬氨酸(Asp或 D)。
[0126] 半保守氨基酸是一个残基经具有类似空间构形但不共有化学特性的另一残基置换。半保守取代的实施例将包括半胱氨酸经丙氨酸或亮氨酸取代；丝氨酸经天冬酰胺取代；
缬氨酸经苏氨酸取代；或脯氨酸经丙氨酸取代。
缬氨酸经苏氨酸取代；或脯氨酸经丙氨酸取代。
[0127] 下表II指示氨基酸所属各氨基酸种类。
[0128]
[0129]
[0130] 氨基酸或核苷酸序列的间的相似性及同一性可以藉由比较比对序列中的每个位置测定。用于比较相似
[0131] 性及/或同一性的序列的最佳比对可以使用多种算法，例如使用此项技术中熟知的多序列比对程序/软件，诸如ClustalWTM、SAGATM、 UGENETM或T-coffeeTM进行。多序列比对的实施例描述于以下实施例中且描绘于图21A至25中。
[0132] 基因操纵子
[0133] 在另一个实施例中，A及/或B是(b)由来自与编码如上文所定义的(a) 的多肽的基因相同的操纵子的基因编码的多肽。举例而言， SACOL0718是来自与SACOL0720相同的操纵子的基因。
[0134] 片段
[0135] 在另一个实施例中，A及/或B是(c)包括含如上文所定义的(a)或(b) 的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段的多肽。
[0136] 蛋白质/多肽的免疫原性片段定义为蛋白质/多肽中能够在宿主体内诱导/引发免疫反应的部分。在一个实施例中，免疫原性片段能够引发与该蛋白质/多肽种类相同但未必量相同的免疫反应。蛋白质/多肽的免疫原性片段较佳包含该蛋白质/多肽的一或多个表
位。蛋白质/多肽的表位定义为该蛋白质/多肽中能够引发特异性抗体及/或带有能够特异
性结合该表位的受体的免疫细胞(例如T细胞或B细胞)的至少约4或5个氨基酸长度的片段。
存在两种不同类型的表位：线性表位及构形表位。线性表位包含一段连续氨基酸。构形表位通常是由在适当位置折迭且一起形成适当折迭的蛋白质中的表位的若干段连续氨基酸形
成。如本文所使用，免疫原性片段是指这些表位类型中的一种或两种。在单独使用免疫原性片段(亦即，不与较大多肽构建体融合(例如与其他抗原片段融合))的一个实施例中，蛋白
质/多肽的免疫原性片段包含至少16个氨基酸残基。在另一实施例中，免疫原性片段包含天然蛋白质/多肽的至少16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、
34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、
59、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或160个连续氨基酸。在一具体实施例中，该片段具有该天然蛋白质/多肽的至少18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、
33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46,47、48、49、50或50或更多个连续氨基酸。
在至少一个免疫原性片段形成较大多肽构建体的一部分 (例如与其他抗原多肽、片段或其
变体融合)的一个实施例中，该免疫原性片段包含该多肽的至少13个连续氨基酸残基。不受此限制，本发明所涵盖的片段包括含以下中的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段：如图
21中所示的SACOL029(及SACOL029直是同源物(例如图24中所描绘)中的相应片段)；如图21
中所示的SACOL0442(及SACOL0442直是同源物 (例如图22中所描绘)中的相应片段)；如图
21中所示的SACOL0720(及 SACOL0720直是同源物(例如图23中所描绘)中的相应片段)；及
如图21 中所示的SACOL1867(及SACOL1867直是同源物(例如图25中所描绘)中的相应片
段)。在另一个实施例中，本发明所涵盖的片段包括含本发明的抗原蛋白质/多肽(如以上所定义的多肽(a))的至少一个表位的免疫原性片段。在另一个实施例中，本发明所涵盖的片
段包括含至少一个如图 21至25中的任一个中所描绘的抗原蛋白质/多肽中的任一种中描
绘(加阴影)的表位的免疫原性片段。不受此限制，一个序列中的表位可以用软件，诸如
BCPredTM、AAPTM、FBCPredTM及ABCPredTM预测。
位。蛋白质/多肽的表位定义为该蛋白质/多肽中能够引发特异性抗体及/或带有能够特异
性结合该表位的受体的免疫细胞(例如T细胞或B细胞)的至少约4或5个氨基酸长度的片段。
存在两种不同类型的表位：线性表位及构形表位。线性表位包含一段连续氨基酸。构形表位通常是由在适当位置折迭且一起形成适当折迭的蛋白质中的表位的若干段连续氨基酸形
成。如本文所使用，免疫原性片段是指这些表位类型中的一种或两种。在单独使用免疫原性片段(亦即，不与较大多肽构建体融合(例如与其他抗原片段融合))的一个实施例中，蛋白
质/多肽的免疫原性片段包含至少16个氨基酸残基。在另一实施例中，免疫原性片段包含天然蛋白质/多肽的至少16、17、 18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、 33、
34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、
59、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150或160个连续氨基酸。在一具体实施例中，该片段具有该天然蛋白质/多肽的至少18、19、20、21、22、 23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、
33、34、35、36、37、 38、39、40、41、42、43、44、45、46,47、48、49、50或50或更多个连续氨基酸。
在至少一个免疫原性片段形成较大多肽构建体的一部分 (例如与其他抗原多肽、片段或其
变体融合)的一个实施例中，该免疫原性片段包含该多肽的至少13个连续氨基酸残基。不受此限制，本发明所涵盖的片段包括含以下中的至少13个连续氨基酸的免疫原性片段：如图
21中所示的SACOL029(及SACOL029直是同源物(例如图24中所描绘)中的相应片段)；如图21
中所示的SACOL0442(及SACOL0442直是同源物 (例如图22中所描绘)中的相应片段)；如图
21中所示的SACOL0720(及 SACOL0720直是同源物(例如图23中所描绘)中的相应片段)；及
如图21 中所示的SACOL1867(及SACOL1867直是同源物(例如图25中所描绘)中的相应片
段)。在另一个实施例中，本发明所涵盖的片段包括含本发明的抗原蛋白质/多肽(如以上所定义的多肽(a))的至少一个表位的免疫原性片段。在另一个实施例中，本发明所涵盖的片
段包括含至少一个如图 21至25中的任一个中所描绘的抗原蛋白质/多肽中的任一种中描
绘(加阴影)的表位的免疫原性片段。不受此限制，一个序列中的表位可以用软件，诸如
BCPredTM、AAPTM、FBCPredTM及ABCPredTM预测。
[0137] 在一个实施例中，以上提及的免疫原性片段包含在至少两种不同的金黄色葡萄球菌菌株中保守(亦即，一致)的序列。在其他实施例中，以上提及的免疫原性片段包含在至少
3、4、5、6、7、8、9或10种不同金黄色葡萄球菌菌株中保守(亦即，一致)的序列。在另一个实施例中，以上提及的金黄色葡萄球菌菌株是COL、RF122、NCTC 8325、JH1、 JH9、Newman、Mu3、Mu50、USA300-FPR3757、N315、MW2或 MSSA476。在一个实施例中，以上提及的金黄色葡萄球菌菌株与牛乳腺炎有关(例如RF122)。
3、4、5、6、7、8、9或10种不同金黄色葡萄球菌菌株中保守(亦即，一致)的序列。在另一个实施例中，以上提及的金黄色葡萄球菌菌株是COL、RF122、NCTC 8325、JH1、 JH9、Newman、Mu3、Mu50、USA300-FPR3757、N315、MW2或 MSSA476。在一个实施例中，以上提及的金黄色葡萄球菌菌株与牛乳腺炎有关(例如RF122)。
[0138] 变体
[0139] 在另一个实施例中，以上提及的多肽或与该多肽大体上同一性的多肽是在至少两种不同金黄色葡萄球菌菌株中表达。如本文所使用，大体上一致是指多肽的氨基酸序列具
有至少60％同一性，在实施例中具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、
93％、94％、 95％、96％、97％、98％或99％同一性。在其他实施例中，多肽的氨基酸序列与其所比较的其他多肽具有至少60％、65％、70％,71％、 72％、73％、74％、75％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、 86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、
97％、98％或99％同一性。
有至少60％同一性，在实施例中具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、
93％、94％、 95％、96％、97％、98％或99％同一性。在其他实施例中，多肽的氨基酸序列与其所比较的其他多肽具有至少60％、65％、70％,71％、 72％、73％、74％、75％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、 86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、 96％、
97％、98％或99％同一性。
[0140] 在另一个实施例中，A及/或B是(d)包含与如以上所定义的(a)至(c) 中的任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序列的多肽。在其他实施例中，该氨基酸与(a)(例如在其全长内)至少65％、70％、 75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、 97％、98％或99％一致。在其他实施例中，该氨基酸与(a)至少60％、 65％、70％,
71％、72％、73％、74％、75％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。举例而言，图21至 25的比对中呈现的抗原直是同源物与其所比较的抗原或片段不一致，但存在一定同一性。这些
图中呈现的共有序列体现此类同一性百分比。
96％、 97％、98％或99％一致。在其他实施例中，该氨基酸与(a)至少60％、 65％、70％,
71％、72％、73％、74％、75％、80％、81％、82％、 83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、
90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致。举例而言，图21至 25的比对中呈现的抗原直是同源物与其所比较的抗原或片段不一致，但存在一定同一性。这些
图中呈现的共有序列体现此类同一性百分比。
[0141] 在另一个实施例中，A及/或B是(e)包括含(a)至(d)中任一个的至少 13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽。蛋白质/多肽的免疫原性变体定义为蛋白质/多肽中能够在宿
主体内诱导/引发免疫反应的部分。一般技术者应了解，具有非天然存在的修饰(例如免疫
原性变体)且能够诱导对未修饰试剂具有特异性的免疫反应(例如能够诱导产生能够识别
该未修饰的试剂的抗体)的试剂(蛋白质/多肽、其片段)亦在术语「疫苗组分」的范围内。举例而言，本发明的疫苗组分可以经修饰以增强其活性、稳定性及/或生物利用率，及/或减小其毒性。可以例如藉由用包含酸性侧链的另一氨基酸替代包含酸性侧链的氨基酸、用另一
大体积氨基酸替代大体积氨基酸、用包含碱性侧链的另一氨基酸替代包含碱性侧链的氨基
酸及类似方式进行保守氨基酸取代。熟习此项技术者完全能够产生蛋白质/多肽的变体。此是例如经由筛选肽文库或藉由肽改变程序进行。根据本发明的免疫原性变体具有与该蛋白
质种类基本上相同但量未必相同的免疫原性特性。本发明的蛋白质/多肽的免疫原性变体
可以例如包含融合蛋白及/或嵌合蛋白。举例而言，预测作为外毒素、肠毒素或超抗原的本文中所鉴别的蛋白质(例如SACOL0442)的生物功能可以潜在地干扰哺乳动物免疫系统及抗
体产生，及/或在宿主中显示某种毒性。尽管在免疫接种期间，将SACOL0442多肽与例如
SACOL0720组合使用时未观察到此类干扰，但其可用于改变用于疫苗接种的蛋白质或多肽，由此降低外毒素的生物活性。为此目的，可用化学试剂(例如甲醛) 使外毒素失活。亦可使用分子生物学技术使外毒素活性所涉及的推定区域缺失或突变，同时不丧失免疫原性
(Chang等人,2008)。另一实施例是将基于氨基酸的组分与核酸(例如分开添加或以相邻序
列形式添加的基因或基因部分)碳水化合物，诸如在微生物多醣胶囊或生物膜中所发现的
碳水化合物偶联或混合。变体的其他实施例包括在N或C末端包含或在抗原序列内插入可用
于纯化(例如亲和纯化)或用作间隔子或接头的寡肽的本文所描述的抗原或其片段。可用于
亲和纯化的寡肽的实施例包括聚组氨酸标签(例如包括或不包括RGS标签的6至10个组氨酸
残基(例如 HHHHHH、RGSHHHHHH或RGSHHHHHGS)。该his标签之后亦可为适合于促进使用内肽酶移除聚组氨酸标签的氨基酸序列。如式(I)中所述的「X」及/或「Z」区段亦可以包含此类可用于纯化的寡肽及/或适合于促进移除此类可用于纯化的寡肽的序列。
主体内诱导/引发免疫反应的部分。一般技术者应了解，具有非天然存在的修饰(例如免疫
原性变体)且能够诱导对未修饰试剂具有特异性的免疫反应(例如能够诱导产生能够识别
该未修饰的试剂的抗体)的试剂(蛋白质/多肽、其片段)亦在术语「疫苗组分」的范围内。举例而言，本发明的疫苗组分可以经修饰以增强其活性、稳定性及/或生物利用率，及/或减小其毒性。可以例如藉由用包含酸性侧链的另一氨基酸替代包含酸性侧链的氨基酸、用另一
大体积氨基酸替代大体积氨基酸、用包含碱性侧链的另一氨基酸替代包含碱性侧链的氨基
酸及类似方式进行保守氨基酸取代。熟习此项技术者完全能够产生蛋白质/多肽的变体。此是例如经由筛选肽文库或藉由肽改变程序进行。根据本发明的免疫原性变体具有与该蛋白
质种类基本上相同但量未必相同的免疫原性特性。本发明的蛋白质/多肽的免疫原性变体
可以例如包含融合蛋白及/或嵌合蛋白。举例而言，预测作为外毒素、肠毒素或超抗原的本文中所鉴别的蛋白质(例如SACOL0442)的生物功能可以潜在地干扰哺乳动物免疫系统及抗
体产生，及/或在宿主中显示某种毒性。尽管在免疫接种期间，将SACOL0442多肽与例如
SACOL0720组合使用时未观察到此类干扰，但其可用于改变用于疫苗接种的蛋白质或多肽，由此降低外毒素的生物活性。为此目的，可用化学试剂(例如甲醛) 使外毒素失活。亦可使用分子生物学技术使外毒素活性所涉及的推定区域缺失或突变，同时不丧失免疫原性
(Chang等人,2008)。另一实施例是将基于氨基酸的组分与核酸(例如分开添加或以相邻序
列形式添加的基因或基因部分)碳水化合物，诸如在微生物多醣胶囊或生物膜中所发现的
碳水化合物偶联或混合。变体的其他实施例包括在N或C末端包含或在抗原序列内插入可用
于纯化(例如亲和纯化)或用作间隔子或接头的寡肽的本文所描述的抗原或其片段。可用于
亲和纯化的寡肽的实施例包括聚组氨酸标签(例如包括或不包括RGS标签的6至10个组氨酸
残基(例如 HHHHHH、RGSHHHHHH或RGSHHHHHGS)。该his标签之后亦可为适合于促进使用内肽酶移除聚组氨酸标签的氨基酸序列。如式(I)中所述的「X」及/或「Z」区段亦可以包含此类可用于纯化的寡肽及/或适合于促进移除此类可用于纯化的寡肽的序列。
[0142] 在具体实施例中，免疫原性片段包含多肽(a)的至少一个表位。不受此限制，在某些实施例中，免疫原性片段包含如图21至25中呈现的序列中所描绘(加阴影)的多肽(a)的
至少一个表位。在其他具体实施例中，变体是如图21至25中所揭示。
至少一个表位。在其他具体实施例中，变体是如图21至25中所揭示。
[0143] 接头
[0144] 在融合蛋白结构域的间插入接头可以藉由增大结构域的间的距离，缓解构建体不同区段(例如抗原片段)的间的潜在排斥力，使蛋白质折迭改善及/或恢复来增加生物活性。
可以使用不同的多肽接头序列且已知其具有独特的特性，诸如可挠性、刚性或可裂解接头。
本发明涵盖使用任何此类接头，包括例如Chen等人,Adv Drug Deliv Rev.(2013), 65
(10):1357-69中所列接头中的任一种。本文中的实施例提供有关所用特定接头的说明(亦
即，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:60)、 ERKYK(SEQ ID NO:61)或/及EAAAKEAAAK(SEQ ID
NO:62))，亦即富含维持两个连接的结构域的间的距离且改善其折迭的小亲水性氨基酸的
可挠性接头结构。
可以使用不同的多肽接头序列且已知其具有独特的特性，诸如可挠性、刚性或可裂解接头。
本发明涵盖使用任何此类接头，包括例如Chen等人,Adv Drug Deliv Rev.(2013), 65
(10):1357-69中所列接头中的任一种。本文中的实施例提供有关所用特定接头的说明(亦
即，GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:60)、 ERKYK(SEQ ID NO:61)或/及EAAAKEAAAK(SEQ ID
NO:62))，亦即富含维持两个连接的结构域的间的距离且改善其折迭的小亲水性氨基酸的
可挠性接头结构。
[0145] 在另一个具体实施例中，Fc包含CH2结构域、CH3结构域及铰链区。在另一个具体实施例中，Fc是选自由以下组成的群的免疫球蛋白的恒定结构域：IgG-1、IgG-2、IgG-3、IgG-3及IgG-4。在另一个具体实施例中，Fc是免疫球蛋白IgG-1的恒定结构域。
[0146] 可以在融合物的相邻抗原的间包括接头(例如，在包含两个抗原的融合物中有1个接头、在包含三个抗原的融合物中有2个接头、在包含四个抗原的融合物中有三个接头等)。
在使用较大蛋白质结构域的融合物中，接头可能较大且可包含片段可结晶区域(Fc)。
在使用较大蛋白质结构域的融合物中，接头可能较大且可包含片段可结晶区域(Fc)。
[0147] 在一具体实施例中，接头是含至少一个氨基酸的氨基酸序列或不存在。在一具体实施例中，接头包含至少三个(至少4、5、6、7、8、9或 10个)选自由以下组成的群的氨基酸：
甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及赖氨酸。在一具体实施例中，接头是(EAAAK)n(SEQ ID NO:63)；(GGGGS)n(SEQ ID NO:67)；或(XPXPXP)n(SEQ ID NO:69)，其中x是任何氨基酸；其中n是1至5中的任一个，更具体言的为1、2、3、4或5；EAAAKEAAAK(SEQ ID NO:62)； EAAAKEAAAKEAAAK(SEQ ID NO:64)；GGGGS(SEQ ID NO:67)； GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:68)；
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:60)；XPXPXP(SEQ ID NO:69)，其中x是任何氨基酸；
XPXPXPXPXPXP(SEQ ID NO:70)，其中x是任何氨基酸； ERKYK(SEQ ID NO:61)；ERKYKERKYK(SEQ ID NO:65)； ERKYKERKYKERKYK(SEQ ID NO:66)。在一更具体的实施例中，接头是
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:60)、ERKYK(SEQ ID NO:61)或EAAAKEAAAK(SEQ ID NO:62)。
甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸及赖氨酸。在一具体实施例中，接头是(EAAAK)n(SEQ ID NO:63)；(GGGGS)n(SEQ ID NO:67)；或(XPXPXP)n(SEQ ID NO:69)，其中x是任何氨基酸；其中n是1至5中的任一个，更具体言的为1、2、3、4或5；EAAAKEAAAK(SEQ ID NO:62)； EAAAKEAAAKEAAAK(SEQ ID NO:64)；GGGGS(SEQ ID NO:67)； GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:68)；
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:60)；XPXPXP(SEQ ID NO:69)，其中x是任何氨基酸；
XPXPXPXPXPXP(SEQ ID NO:70)，其中x是任何氨基酸； ERKYK(SEQ ID NO:61)；ERKYKERKYK(SEQ ID NO:65)； ERKYKERKYKERKYK(SEQ ID NO:66)。在一更具体的实施例中，接头是
GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:60)、ERKYK(SEQ ID NO:61)或EAAAKEAAAK(SEQ ID NO:62)。
[0148] 构建体的N及C末端
[0149] X及Z各自独立地不存在或为含至少一个氨基酸的氨基酸序列。不受此限制，其可为由选殖策略产生的一或多个氨基酸、用于便利构建体纯化的氨基酸(例如聚组氨酸)、适
合于促进使用内肽酶移除纯化标签的氨基酸。在融合构建体包含三个或三个以上抗原多肽
的具体实施例中，X及/或Z中的任一个亦可包括另一抗原(抗原C、抗原D等)的序列及视情况至少一个其他接头的序列。X及/或Z包含一或多个其他抗原且视情况包含接头的此等具体
实施例可以更特定地例如以式(II)或(III)说明，如在融合物包含至少3个抗原时，遵循X'-C-接头1-A-接头2-B-Z'(II)；或在融合物包含至少4个抗原时，遵循X'-C-接头1-A-接头2-B-接头3-D- Z'(III)。在式(II)及(III)中，X'、Z'、接头1、接头2及带有接头3的情形是相同或不同的且独立地如本文所定义的式(I)中的X、Z及接头所定义。
合于促进使用内肽酶移除纯化标签的氨基酸。在融合构建体包含三个或三个以上抗原多肽
的具体实施例中，X及/或Z中的任一个亦可包括另一抗原(抗原C、抗原D等)的序列及视情况至少一个其他接头的序列。X及/或Z包含一或多个其他抗原且视情况包含接头的此等具体
实施例可以更特定地例如以式(II)或(III)说明，如在融合物包含至少3个抗原时，遵循X'-C-接头1-A-接头2-B-Z'(II)；或在融合物包含至少4个抗原时，遵循X'-C-接头1-A-接头2-B-接头3-D- Z'(III)。在式(II)及(III)中，X'、Z'、接头1、接头2及带有接头3的情形是相同或不同的且独立地如本文所定义的式(I)中的X、Z及接头所定义。
[0150] 因此，在具体实施例中，融合构建体包含2、3、4或更多个抗原多肽(及具有其他接头的情形)。在一更具体的实施例中且不受此限制，融合构建体可以为SACOL0029_SACOL0442；SACOL0029_ SACOL0720；SACOL0029_SACOL1867；SACOL0029_ SACOL0720_
SACOL1867；SACOL0029_SACOL1867_SACOL0442； SACOL0029_SACOL0720_SACOL0442；
SACOL0442_SACOL0029_ SACOL0720；SACOL0442_SACOL0029_SACOL1867； SACOL0442_
SACOL1867_SACOL0720；SACOL0720_SACOL0442_ SACOL1867；或SACOL0029_SACOL1867_
SACOL0720_ SACOL0442，或抗原多肽呈任何其他次序的前述构建体中的任一种。
SACOL1867；SACOL0029_SACOL1867_SACOL0442； SACOL0029_SACOL0720_SACOL0442；
SACOL0442_SACOL0029_ SACOL0720；SACOL0442_SACOL0029_SACOL1867； SACOL0442_
SACOL1867_SACOL0720；SACOL0720_SACOL0442_ SACOL1867；或SACOL0029_SACOL1867_
SACOL0720_ SACOL0442，或抗原多肽呈任何其他次序的前述构建体中的任一种。
[0151] 组合
[0152] 本发明的构建体可以作为本发明的组合物(例如疫苗)的唯一免疫原性组分使用，或与一或多种其他融合构建体、免疫原性多肽、其片段或变体及/或减毒活细菌(例如金黄
色葡萄球菌)(表达或不表达融合构建体及/或多肽、其片段或变体)组合使用。
色葡萄球菌)(表达或不表达融合构建体及/或多肽、其片段或变体)组合使用。
[0153] 该一或多种融合构建体可为包括如上文所定义的另一融合构建体的任何免疫原性融合构建体(参见例如实施例14)。
[0154] 用于本发明的组合物中的一或多个免疫原性多肽、其片段或变体可为造成如本文所定义的本发明的组合物的免疫原性的任何多肽、片段或变体。不受此限制，此类多肽、片段或变体包括(a)包含以下的多肽：如图24中所描绘的序列(SEQ ID NO:5及121至131)中的
任一个中所述的 SACOL0029多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:185)、如图22D中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的SACOL0442 多肽、SACOL0718多肽(SEQ ID NO:186)、如图23I-K中所描绘的序列 (SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的
SACOL0720多肽、SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、
SACOL1611(SEQ ID NO:189)、如图25D中所描绘的序列 (SEQ ID NO:152至164)中的任一个
中所述的SACOL1867多肽、 SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944多肽(SEQ ID NO:
190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽(SEQ ID NO:192)、SACOL2385多肽(SEQ ID NO:50)或SACOL2599多肽 (SEQ ID NO:193)；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因
相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包括含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性
片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序
列的多肽；或(e)包括含(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽，如上文所定义。不受此限制，任何此类多肽、片段或变体均涵盖实施例1至14及21至26中所例示的组合物(例如疫苗#1至#8)中所包的多肽、片段或变体。
任一个中所述的 SACOL0029多肽、SACOL0264多肽(SEQ ID NO:185)、如图22D中所描绘的序列(SEQ ID NO:29及82至92)中的任一个中所述的SACOL0442 多肽、SACOL0718多肽(SEQ ID NO:186)、如图23I-K中所描绘的序列 (SEQ ID NO:11及109至120)中的任一个中所述的
SACOL0720多肽、SACOL1353多肽(SEQ ID NO:187)、SACOL1416多肽(SEQ ID NO:188)、
SACOL1611(SEQ ID NO:189)、如图25D中所描绘的序列 (SEQ ID NO:152至164)中的任一个
中所述的SACOL1867多肽、 SACOL1912多肽(SEQ ID NO:43)、SACOL1944多肽(SEQ ID NO:
190)、SACOL2144多肽(SEQ ID NO:191)、SACOL2365多肽(SEQ ID NO:192)、SACOL2385多肽(SEQ ID NO:50)或SACOL2599多肽 (SEQ ID NO:193)；(b)由来自与编码(a)的多肽的基因
相同的操纵子的基因编码的多肽；(c)包括含(a)或(b)的至少13个连续氨基酸的免疫原性
片段的多肽；(d)包含与(a)至(c)中任一个的多肽的序列总体至少60％同一性的氨基酸序
列的多肽；或(e)包括含(a)至(c)中任一个的至少13个连续氨基酸的免疫原性变体的多肽，如上文所定义。不受此限制，任何此类多肽、片段或变体均涵盖实施例1至14及21至26中所例示的组合物(例如疫苗#1至#8)中所包的多肽、片段或变体。
[0155] 减毒活细菌
[0156] 用于本发明的组合物中的减毒活细菌(例如金黄色葡萄球菌)可以独立于本发明的融合构建体及/或多肽、其片段变体，或作为(亦即，可以表达)此类本发明的融合构建体及/或多肽、其片段或变体的容器。
[0157] 不受此限制，如本文中所说明，在本发明的组合情形中有用的减毒活细菌包括具有至少一个引起毒力(例如Δ720)或促成宿主健康(例如代谢基因)的基因突变或缺失的葡
萄球菌(例如金黄色葡萄球菌)。不受此限制，此类基因可为Novick 2003、Novick 2008或
Maresso及Schneewind 2008中所鉴别的基因中的任一个。
萄球菌(例如金黄色葡萄球菌)。不受此限制，此类基因可为Novick 2003、Novick 2008或
Maresso及Schneewind 2008中所鉴别的基因中的任一个。
[0158] 在另一实施例中，可以藉由具有稳定的SCV表型使减毒活细菌进一步减毒。如本文所使用，术语「SCV表型」是指具有引起生长减慢、毒力因子表达改变及内化至宿主细胞中的能力的功能异常的氧化代谢的细菌。如本文所使用，术语《稳定SCV表型》用于表示保持SCV表型，亦即无法产生侵袭性反突变体(亦即，反突变成正常生长表型)的SCV菌株。此类稳定SCV金黄色葡萄球菌可以藉由使下表III中所列基因中的任一个突变或缺失(例如ΔhemB)
来产生。不受限制，本发明涵盖使用实施例 15至25中所例示的稳定SCV金黄色葡萄球菌。如本文所使用，突变包括一或多个核苷酸的取代、缺失及/或插入，以防止由本发明的基因编码的多肽的表达或防止功能性多肽的表达。在一个较佳实施例中，突变防止多肽的表达。在另一个具体实施例中，在相同金黄色葡萄球菌的减毒活菌株或灭活菌株中的两个突变是缺
失或插入。预期在本发明基因的一的任何位置具有防止多肽表达的突变的金黄色葡萄球菌
突变菌株可以用作根据本发明的减毒活疫苗。减毒活疫苗，亦即包含呈减毒存活形式的根
据本发明的细菌的疫苗，相较于灭活疫苗的优势在于，其最佳地模拟天然感染方式。此外，其复制能力允许以较低细菌量进行疫苗接种；其数量将自动增加，直至其达到免疫系统的
触发量。自该时刻起，免疫系统将被触发且最终将除去细菌。然而，使用减毒活细菌的微小不足的处可在于，固有地存留一定程度的毒力。此未必为实际不足的处，只要毒力程度是可接受的，亦即只要该疫苗至少减少细菌感染(例如IMI)症状即可。当然，减毒活疫苗残留的毒力越低，则在疫苗接种期间/之后，疫苗接种对体重增加的影响越小。
来产生。不受限制，本发明涵盖使用实施例 15至25中所例示的稳定SCV金黄色葡萄球菌。如本文所使用，突变包括一或多个核苷酸的取代、缺失及/或插入，以防止由本发明的基因编码的多肽的表达或防止功能性多肽的表达。在一个较佳实施例中，突变防止多肽的表达。在另一个具体实施例中，在相同金黄色葡萄球菌的减毒活菌株或灭活菌株中的两个突变是缺
失或插入。预期在本发明基因的一的任何位置具有防止多肽表达的突变的金黄色葡萄球菌
突变菌株可以用作根据本发明的减毒活疫苗。减毒活疫苗，亦即包含呈减毒存活形式的根
据本发明的细菌的疫苗，相较于灭活疫苗的优势在于，其最佳地模拟天然感染方式。此外，其复制能力允许以较低细菌量进行疫苗接种；其数量将自动增加，直至其达到免疫系统的
触发量。自该时刻起，免疫系统将被触发且最终将除去细菌。然而，使用减毒活细菌的微小不足的处可在于，固有地存留一定程度的毒力。此未必为实际不足的处，只要毒力程度是可接受的，亦即只要该疫苗至少减少细菌感染(例如IMI)症状即可。当然，减毒活疫苗残留的毒力越低，则在疫苗接种期间/之后，疫苗接种对体重增加的影响越小。
[0159] 表III：与SCV表型有关的金黄色葡萄球菌基因的Genbank登录编号(Kahl,2014)
[0160]
[0161]
[0162] 核酸
[0163] 本发明的核酸较佳包含可操作地连接至基因表达所需的调控组件，诸如启动子、起始密码子、终止密码子、强化子及聚腺苷酸化信号的编码一或多种上述蛋白质/多肽(或
其片段)的核苷酸序列。较佳选择的调控组件在欲投与其的物种中是可操作的。在具体实施例中，核酸是如图21 至25中所描绘。
其片段)的核苷酸序列。较佳选择的调控组件在欲投与其的物种中是可操作的。在具体实施例中，核酸是如图21 至25中所描绘。
[0164] 在本发明的内容内有向哺乳动物活体内投与本发明的核酸(例如核酸疫苗、DNA或RNA疫苗)以使得在该哺乳动物中表达一或多种所关注的蛋白质/多肽(或其片段)。
[0165] 递送系统
[0166] 本发明疫苗的核酸可以为「裸」DNA或可以可操作地并入载体中。可以使用此项技术中熟知的方法，诸如直接注射DNA、受体介导的DNA吸收、病毒介导的转染或非病毒转染及基于脂质的转染在活体内将核酸递送至细胞中，所有这些方法皆可涉及使用载体。已使用
直接注射在活体内将裸DNA引入至细胞中(参见例如，Acsadi等人(1991) Nature 332:815-
818；Wolff等人(1990)Science 247:1465-1468)。可以使用用于在活体内将DNA注射至细胞中的递送装置(例如「基因枪」)。此类装置可以为可商购的(例如购自BioRad)。亦可藉由使裸DNA与偶合至细胞表面受体的配体的阳离子，诸如聚赖氨酸形成复合物，将该DNA 引入细胞中(参见例如，Wu,G.及Wu,C.H.(1988)J.Biol.Chem.263: 14621；Wilson等人(1992)
J.Biol.Chem.267:963-967；及美国专利第 5,166,320号)。DNA-配体复合物与受体的结合
可以促进受体介导的内吞作用引起的DNA吸收。DNA-配体复合物连接至破坏内体的腺病毒
衣壳，由此释放细胞质中的物质，可以用于避免该复合物经细胞内溶酶体降解(参见例如，Curiel等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 8850；Cristiano等人(1993)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2122-2126)。
直接注射在活体内将裸DNA引入至细胞中(参见例如，Acsadi等人(1991) Nature 332:815-
818；Wolff等人(1990)Science 247:1465-1468)。可以使用用于在活体内将DNA注射至细胞中的递送装置(例如「基因枪」)。此类装置可以为可商购的(例如购自BioRad)。亦可藉由使裸DNA与偶合至细胞表面受体的配体的阳离子，诸如聚赖氨酸形成复合物，将该DNA 引入细胞中(参见例如，Wu,G.及Wu,C.H.(1988)J.Biol.Chem.263: 14621；Wilson等人(1992)
J.Biol.Chem.267:963-967；及美国专利第 5,166,320号)。DNA-配体复合物与受体的结合
可以促进受体介导的内吞作用引起的DNA吸收。DNA-配体复合物连接至破坏内体的腺病毒
衣壳，由此释放细胞质中的物质，可以用于避免该复合物经细胞内溶酶体降解(参见例如，Curiel等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88: 8850；Cristiano等人(1993)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2122-2126)。
[0167] 有用递送载体包括可生物降解微胶囊、免疫刺激性复合物(ISCOM) 或脂质粒，及经遗传工程改造的减毒活载体，诸如细胞、病毒或细菌。
[0168] 脂质粒载体是单层或多层囊泡，具有由亲脂性物质形成的膜部分及内部含水部分。含水部分在本发明中用于容纳欲递送至靶细胞中的聚核苷酸材料。脂质粒形成材料较
佳一般具有阳离子基团，诸如四级铵基团；及一或多个亲脂性基团，诸如具有约6至约30个碳原子的饱和或不饱和烷基。一组适合材料描述于欧洲专利公开案第0187702号中且亦论
述于Wolff等人的美国专利第6,228,844号中，其相关揭示内容以引用的方式并入。许多其
他适合的脂质粒形成阳离子脂质化合物描述于文献中。参见例如，L.Stamatatos等人,
Biochemistry 27:3917 3925 (1988)；及H.Eibl等人,Biophysical Chemistry 10:261
271(1979)。或者，可以利用微球体，诸如聚丙交酯-共乙交酯可生物降解微球体。如此项技术中所知，核酸构建体是用脂质粒或微球体封装或以其他方式形成复合物以将核酸递送至
组织。
佳一般具有阳离子基团，诸如四级铵基团；及一或多个亲脂性基团，诸如具有约6至约30个碳原子的饱和或不饱和烷基。一组适合材料描述于欧洲专利公开案第0187702号中且亦论
述于Wolff等人的美国专利第6,228,844号中，其相关揭示内容以引用的方式并入。许多其
他适合的脂质粒形成阳离子脂质化合物描述于文献中。参见例如，L.Stamatatos等人,
Biochemistry 27:3917 3925 (1988)；及H.Eibl等人,Biophysical Chemistry 10:261
271(1979)。或者，可以利用微球体，诸如聚丙交酯-共乙交酯可生物降解微球体。如此项技术中所知，核酸构建体是用脂质粒或微球体封装或以其他方式形成复合物以将核酸递送至
组织。
[0169] 较佳病毒载体包括噬菌体、疱疹病毒、腺病毒、脊髓灰质炎病毒、牛痘病毒、缺陷性反转录病毒、腺相关病毒(AAV)及禽痘。转型带有外源DNA构建体的病毒载体的方法在此项技术中亦有充分描述。参见以上Sambrook及Russell。
[0170] 如上所指出，可以藉由转染或转型将核酸(例如DNA或RNA)并入宿主，诸如活体外或离体宿主细胞(例如免疫细胞，诸如树突状细胞)，或如上所指出的减毒微生物宿主(例如减毒金黄色葡萄球菌、SCV等，参见例如实施例25至26)中，且可以将表达所关注多肽(例如多个抗原或其对应片段的融合物及/或单一抗原或其片段)的经转染或经转型的细胞或微
生物投与个体。在投与后，细胞将在个体中表达所关注蛋白质或多肽 (或其变体或片段)，该蛋白质或多肽继而将诱导针对该蛋白质、多肽或其片段的免疫反应。
生物投与个体。在投与后，细胞将在个体中表达所关注蛋白质或多肽 (或其变体或片段)，该蛋白质或多肽继而将诱导针对该蛋白质、多肽或其片段的免疫反应。
[0171] 使用减毒活细菌免疫接种及/或递送本发明的特定构建体或抗原混合物代表一种改善免疫反应的值得关注的方法(Griffiths及Khader, 2014)。仿真天然感染的减毒活生
物体以一种有效的方式刺激免疫系统，引发广泛且稳定的免疫反应，由此产生血清及黏膜
抗体，以及协同作用以防止疾病的效应及记忆T细胞(Detmer及Glenting,2006；
Kollaritsch等人,2000；Pasetti等人,2011)。如此项技术中所知，适合减毒活细菌载体的实施例包括金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门杆菌 (Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、志贺杆菌属(Shigella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属
(Lactobacillus)、卡介苗 (Bacille Calmette-Guerin，BCG)、大肠杆菌(Escherichia
coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、弯曲杆菌属(Campylobacter)或任何其他适合的细菌载体。转型带有外源DNA构建体的活细菌载体的方法在此项技术中有充分描述。参见例如，Joseph Sambrook及David W.Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第3版,
Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)。本发明涵盖
使用包含减毒活细菌(例如表达本发明的构建体的ΔhemBΔ720金黄色葡萄球菌)作为唯一
免疫原性组分或其与各自表达本发明的另一多肽、片段或变体(例如 SACOL0442、
SACOL0720或其片段或变体)的其他减毒活细菌的组合的组合物。
物体以一种有效的方式刺激免疫系统，引发广泛且稳定的免疫反应，由此产生血清及黏膜
抗体，以及协同作用以防止疾病的效应及记忆T细胞(Detmer及Glenting,2006；
Kollaritsch等人,2000；Pasetti等人,2011)。如此项技术中所知，适合减毒活细菌载体的实施例包括金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门杆菌 (Salmonella typhimurium)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、志贺杆菌属(Shigella)、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属
(Lactobacillus)、卡介苗 (Bacille Calmette-Guerin，BCG)、大肠杆菌(Escherichia
coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、弯曲杆菌属(Campylobacter)或任何其他适合的细菌载体。转型带有外源DNA构建体的活细菌载体的方法在此项技术中有充分描述。参见例如，Joseph Sambrook及David W.Russell,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第3版,
Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(2001)。本发明涵盖
使用包含减毒活细菌(例如表达本发明的构建体的ΔhemBΔ720金黄色葡萄球菌)作为唯一
免疫原性组分或其与各自表达本发明的另一多肽、片段或变体(例如 SACOL0442、
SACOL0720或其片段或变体)的其他减毒活细菌的组合的组合物。
[0172] 组合物
[0173] 本文所描述的多肽、核酸及递送系统(例如包含核酸或载体的宿主细胞)可以调配成组合物。如本文所使用，术语「可药用」是指疫苗组分(例如赋形剂、载剂、佐剂)及组合物是生理上可耐受的且当投与个体时通常不会产生过敏性或类似不良反应，诸如反胃、眩晕
及类似不良反应。较佳地，如本文所使用，术语「可药用」意谓经联邦政府或洲政府的监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出适用于动物及人类。术语「赋形剂」是指可以与本发明的疫苗组分一起投与的稀释剂、载剂或媒剂。可采用无菌水或生理食盐水溶液以
及右旋糖水溶液及甘油溶液作为载剂，特别是对于可注射溶液而言。
及类似不良反应。较佳地，如本文所使用，术语「可药用」意谓经联邦政府或洲政府的监管机构批准或在美国药典或其他公认的药典中列出适用于动物及人类。术语「赋形剂」是指可以与本发明的疫苗组分一起投与的稀释剂、载剂或媒剂。可采用无菌水或生理食盐水溶液以
及右旋糖水溶液及甘油溶液作为载剂，特别是对于可注射溶液而言。
[0174] 在一个实施例中，本发明的药剂是与佐剂或免疫刺激剂组合投与。可以改善各组分的功效以产生免疫反应的适合佐剂或免疫刺激剂包括 (但不限于)油(例如矿物油、乳化
油，诸如MONTANIDETM或 EMULSIGENTM-D)、金属盐(例如矾、氢氧化铝或磷酸铝)、阳离子肽 (Bowdish等人,2005；Hancock等人,2000)，诸如吲哚力西丁(吲哚力西丁)、由母牛的免疫细胞产生的阳离子肽(Falla等人,1996))、天然及人造微生物组分(例如细菌脂醣、弗氏佐剂
(Freund's adjuvants)、胞壁酰二肽(MDP)、环状二鸟苷-5'-单磷酸(c-di-GMP))、病原体相关分子模式 (PAMPS)(诸如表面多醣、脂多醣、聚糖、肽聚糖或微生物DNA(例如 CpG))、植物组分(诸如皂苷(例如Quil-ATM))，及/或一或多种具有载剂作用的物质(例如膨润土、乳胶粒TM
子、脂质粒、ISCOM 、DNA及聚磷腈(PCPP)共聚物)。亦可免疫接种含有经由TLR信号传导以刺激促炎性细胞介素的抗原加配体的合成奈米粒子(诸如由可生物降解合成聚合物，如聚(D,
L-乳酸-共-乙醇酸)制造的奈米粒子)(Kasturi等人,2011)。
油，诸如MONTANIDETM或 EMULSIGENTM-D)、金属盐(例如矾、氢氧化铝或磷酸铝)、阳离子肽 (Bowdish等人,2005；Hancock等人,2000)，诸如吲哚力西丁(吲哚力西丁)、由母牛的免疫细胞产生的阳离子肽(Falla等人,1996))、天然及人造微生物组分(例如细菌脂醣、弗氏佐剂
(Freund's adjuvants)、胞壁酰二肽(MDP)、环状二鸟苷-5'-单磷酸(c-di-GMP))、病原体相关分子模式 (PAMPS)(诸如表面多醣、脂多醣、聚糖、肽聚糖或微生物DNA(例如 CpG))、植物组分(诸如皂苷(例如Quil-ATM))，及/或一或多种具有载剂作用的物质(例如膨润土、乳胶粒TM
子、脂质粒、ISCOM 、DNA及聚磷腈(PCPP)共聚物)。亦可免疫接种含有经由TLR信号传导以刺激促炎性细胞介素的抗原加配体的合成奈米粒子(诸如由可生物降解合成聚合物，如聚(D,
L-乳酸-共-乙醇酸)制造的奈米粒子)(Kasturi等人,2011)。
[0175] 本发明的疫苗组分可以医药组合物形式投与。医药组合物可以单位剂型投与。可以采用任何适当的投与途径，例如非经肠、皮下、肌肉内、乳房内、颅内、眶内、眼、室内、囊内、关节内、脊柱内、脑池内、腹膜内、鼻内、气雾剂或经口投与。具体投药途径的实施例包括非经肠，例如静脉内、皮内、皮下、乳房内；口(例如吸入)；经皮(表面)；经黏膜及直肠投与。
[0176] 可以采用习知医药实践提供适合调配物或组合物以在存在或不存在佐剂情况下将此类疫苗组分投与个体。此项技术中熟知的用于制备医药组合物及调配物的方法见于例
如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,(第20版)A.R.Gennaro A R.编,
2000,Lippincott: Philadelphia中。用于非经肠投与的调配物可例如含有赋形剂、无菌水或生理食盐水、聚伸烷基二醇(诸如聚乙二醇)、miglyol、植物来源的油或氢化萘。可使用生物可兼容、可生物降解丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物
控制化合物的释放。其他可能用于本发明化合物的非经肠递送系统包括乙烯乙酸乙烯酯共
聚物粒子、渗透泵、可植入输注系统及脂质粒。用于吸入或乳房内注射的调配物可以含有赋形剂，例如乳糖，或可以为含有例如聚氧化乙烯-9-月桂基醚、miglyol、甘胆酸酯及脱氧胆酸酯的水溶液，或可以为油性溶液(例如石蜡油)以鼻滴剂形式或以凝胶形式投与。
如Remington:The Science and Practice of Pharmacy,(第20版)A.R.Gennaro A R.编,
2000,Lippincott: Philadelphia中。用于非经肠投与的调配物可例如含有赋形剂、无菌水或生理食盐水、聚伸烷基二醇(诸如聚乙二醇)、miglyol、植物来源的油或氢化萘。可使用生物可兼容、可生物降解丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物
控制化合物的释放。其他可能用于本发明化合物的非经肠递送系统包括乙烯乙酸乙烯酯共
聚物粒子、渗透泵、可植入输注系统及脂质粒。用于吸入或乳房内注射的调配物可以含有赋形剂，例如乳糖，或可以为含有例如聚氧化乙烯-9-月桂基醚、miglyol、甘胆酸酯及脱氧胆酸酯的水溶液，或可以为油性溶液(例如石蜡油)以鼻滴剂形式或以凝胶形式投与。
[0177] 治疗性调配物可以呈液体溶液或悬浮液形式；对于经口投与，调配物可以呈锭剂或胶囊形式；且对于鼻内调配物，呈粉末、鼻滴剂或气雾剂形式。用于非经肠、皮内、乳房内或皮下施用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，诸如注射用水、生理食盐水溶液、不挥发性油(例如石蜡油)、聚乙二醇、甘油、丙二醇、miglyol或其他合成溶剂；抗细菌剂，诸如苯甲醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，诸如乙二胺四乙酸；还原剂，诸如二硫苏糖醇；缓冲剂，诸如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；及用于调整张力的试剂，诸如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱，诸如盐酸或氢氧化钠调节pH值。非经肠制剂可封装于由玻璃或塑料制成的安瓿、抛弃式注射器或多剂量小瓶中。
[0178] 适合于注射使用的医药组合物包括无菌水溶液(在水溶性情况下)或分散液及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内或乳房内投与，适合载剂包
括生理食盐水、抑菌水、CremophorTM ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)。
括生理食盐水、抑菌水、CremophorTM ELTM(BASF,Parsippany,N.J.)或磷酸盐缓冲生理食盐水(PBS)。
[0179] 口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用载剂。其可以封装于明胶胶囊中或压缩成锭剂或饲料形式。出于经口投与疫苗的目的，活性组分可并有赋形剂且以锭剂、糖衣锭或胶囊或以饲料形式使用。可包括医药学上兼容的黏合剂及/或佐剂物质作为组合物的一部
分。锭剂、丸剂、胶囊、糖衣锭及类似物可含有以下成分或具有类似性质的化合物中的任一种：黏合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如褐藻酸、PrimogelTM或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或sterotes；助流剂，诸如胶状二氧化硅；
甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
分。锭剂、丸剂、胶囊、糖衣锭及类似物可含有以下成分或具有类似性质的化合物中的任一种：黏合剂，诸如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，诸如淀粉或乳糖；崩解剂，诸如褐藻酸、PrimogelTM或玉米淀粉；润滑剂，诸如硬脂酸镁或sterotes；助流剂，诸如胶状二氧化硅；
甜味剂，诸如蔗糖或糖精；或调味剂，诸如胡椒薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
[0180] 对于藉由吸入投药，疫苗组分是以气雾剂喷雾形式自含有适合推进剂(例如气体，诸如二氧化碳)的加压容器，或喷雾器递送。
[0181] 亦可藉由经黏膜或经皮方式全身性投药。对于经黏膜或经皮投药，在调配物中使用适于渗透障壁的渗透剂。此类渗透剂一般为此项技术中已知的，且对于经黏膜投药，包括例如清洁剂、胆汁盐及梭链孢酸衍生物。经黏膜投药可经由使用经鼻喷雾或栓剂实现。对于经皮投药，如此项技术中一般所知，将活性化合物调配成软膏、油膏、凝胶或乳膏形式。
[0182] 亦可使用脂质粒悬浮液(包括靶向特定细胞类型的脂质粒)作为可药用的载剂。
[0184] 静脉内、肌肉内、皮下、乳房内或经口投与是较佳的使用形式。以有效量投与本发明的组分的剂量取决于特定活性成分的性质、宿主及个体的要求以及施用模式。
[0185] 微生物靶
[0186] 本发明的多肽、核酸及递送系统可以用作针对葡萄球菌感染，包括引起乳房内感染(IMI)的葡萄球菌感染的抗微生物剂。在一个较佳实施例中，葡萄球菌感染是由金黄色葡萄球菌引起。
[0187] 免疫接种多肽、核酸、载体、细胞、组合物及递送系统的方法
[0188] 本发明的方法、用途、医药组合物及试剂盒涵盖被动及主动免疫接种。
[0189] 被动免疫接种是注射先前针对病原体(或本文所描述的抗原)产生的抗体或抗血清，以便保护或治愈感染或将来感染的接受体动物。保护作用在数周过程内衰退，在此期间用多肽、核酸或递送系统(例如如上文所描述)主动免疫接种将有时间产生持续保护性反
应。用于被动免疫接种的血清可以藉由使用如本文中所描述的多肽、核酸或递送系统免疫
接种供体动物来产生。该含有针对抗原的抗体的血清可以直接使用或在适当条件下储存。
其可以用于对抗急性感染(例如IMI)或作为预防 (Tuchscherr等人,2008)。在被动免疫接
种中使用抗体或血清可以与其他药剂，诸如抗生素组合以增加当前正在进展的感染的治愈
率或增加对抗即将发生的感染的保护。
应。用于被动免疫接种的血清可以藉由使用如本文中所描述的多肽、核酸或递送系统免疫
接种供体动物来产生。该含有针对抗原的抗体的血清可以直接使用或在适当条件下储存。
其可以用于对抗急性感染(例如IMI)或作为预防 (Tuchscherr等人,2008)。在被动免疫接
种中使用抗体或血清可以与其他药剂，诸如抗生素组合以增加当前正在进展的感染的治愈
率或增加对抗即将发生的感染的保护。
[0190] 主动免疫接种是向个体投与如本文中所描述的多肽、核酸或递送系统。
[0191] 根据本发明的教示鉴别的组分具有预防及/或治疗价值，诸如其可以用于产生免疫反应以预防及/或对抗疾病或病状，且更特定而言的，与微生物感染有关的疾病或病状。
[0192] 如本文所使用，术语「预防(prevent/preventing/prevention)」或「治疗(treat/treating/treatment)」是指在个体中引发所需生物反应，亦即，预防及治疗作用。根据本发明，治疗作用包含在投与本发明的多肽、核酸或递送系统(本发明的药剂/组合物)后微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状的严重程度、强度及/或持续时间相较于在治疗之前其在个体中的严重程度、强度及/或持续时间或相较于具有该感染或其任何症状的未经
处理的对照个体中的严重程度、强度及/或持续时间降低/减少中的一或多种。根据本发明，预防作用可以包含当与未经处理的对照个体(亦即，有经历微生物(例如细菌)感染(例如葡
萄球菌感染) 或其任何症状的风险的无症状个体)中的发作时间或其严重程度、强度及/或
持续时间相比较时，在将来时间有经历微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状的风
险的无症状个体中该微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状的发作延迟；或在本发
明的药剂/组合物投与后发生的微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状的严重程
度、强度及/或持续时间降低/减少；及/或当与具有此类预先存在的微生物感染(例如葡萄
球菌感染)或其任何症状的未经处理的对照个体中微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任
何症状的进展相比较时，在投与本发明的药剂/组合物后个体中任何预先存在的微生物感
染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状的进展减少/减轻。如本文所使用，在治疗性治疗中，本发明的药剂/ 组合物是在微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状发作之后投与。
如本文所使用，在预防性治疗中，本发明的药剂/组合物是在微生物感染(例如葡萄球菌感
染)或其任何症状发作之前或在其发作之后但在其进展之前投与。
处理的对照个体中的严重程度、强度及/或持续时间降低/减少中的一或多种。根据本发明，预防作用可以包含当与未经处理的对照个体(亦即，有经历微生物(例如细菌)感染(例如葡
萄球菌感染) 或其任何症状的风险的无症状个体)中的发作时间或其严重程度、强度及/或
持续时间相比较时，在将来时间有经历微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状的风
险的无症状个体中该微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状的发作延迟；或在本发
明的药剂/组合物投与后发生的微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状的严重程
度、强度及/或持续时间降低/减少；及/或当与具有此类预先存在的微生物感染(例如葡萄
球菌感染)或其任何症状的未经处理的对照个体中微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任
何症状的进展相比较时，在投与本发明的药剂/组合物后个体中任何预先存在的微生物感
染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状的进展减少/减轻。如本文所使用，在治疗性治疗中，本发明的药剂/ 组合物是在微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状发作之后投与。
如本文所使用，在预防性治疗中，本发明的药剂/组合物是在微生物感染(例如葡萄球菌感
染)或其任何症状发作之前或在其发作之后但在其进展之前投与。
[0193] 如本文所使用，「减少」或「减轻」微生物感染(例如葡萄球菌感染)或其任何症状是指症状相较于对照个体(未用本发明的药剂/组合物治疗的个体)减轻至少10％，在一个实施例中减轻至少20％，在另一实施例中减轻至少30％，在另一实施例中减轻至少40％，在另一实施例中减轻至少50％，在另一实施例中减轻至少60％，在另一实施例中减轻至少
70％，在另一实施例中减轻至少80％，在另一实施例中减轻至少90％，在另一实施例中减轻
100％(完全抑制)。
70％，在另一实施例中减轻至少80％，在另一实施例中减轻至少90％，在另一实施例中减轻
100％(完全抑制)。
[0194] 如本文关于葡萄球菌感染使用的术语「症状」是指任何葡萄球菌感染症状，诸如疼痛、炎症、发热、呕吐、腹泻、疲劳、肌肉疼痛、食欲不振、脱水、低血压、蜂窝组织炎、脓疱、疖子及烫伤样皮肤症候群。更确切地说，就葡萄球菌IMI而言，葡萄球菌IMI症状是指例如目测乳汁异常(例如水样外观、片状、结块、异味、存在血液)、乳房发红、乳房肿胀、乳房压痛、直肠温度升高(>39.0℃)、食欲不振、瘤胃活动性降低及疲劳。乳汁体细胞计数(SCC)增加是另一种葡萄球菌IMI。乳汁体细胞包括白血球，诸如白细胞或嗜中性球，以及上皮细胞。一般认为 SCC>200,000个/mL可表示葡萄球菌IMI症状或指示葡萄球菌IMI。
[0195] 剂量
[0196] 疫苗组分引起免疫反应的毒性或功效可以藉由细胞培养或实验动物的标准程序测定。可量测有毒作用与免疫刺激作用的间的剂量比率。展现较大比率的组分较佳。尽管可以使用展现有毒副作用的组分，但应当小心地设计递送系统以便使可能的细胞损伤减到最
少并由此减小副作用。
少并由此减小副作用。
[0197] 自细胞培养分析法及实验室动物研究获得的资料可用于调配用于大型动物及人类的剂量范围。此类组分的剂量较佳处于包括具有很小毒性或无毒性的投与浓度的范围
内。剂量可取决于所用剂型及所用投药途径而在此范围内变化。
内。剂量可取决于所用剂型及所用投药途径而在此范围内变化。
[0198] 可以向个体投与任何适合量的医药组合物。剂量将取决于许多因素。通常，在单次剂量内所包含的活性成分的量将为有效地预防或治疗 IMI，且不诱导显著毒性的量。熟练技术人员应了解，某些因素可能影响在个体中有效地产生免疫反应所需的剂量。另外，本发明的抗原(例如融合构建体)的治疗有效量可能需要一是列剂量。一般而言，可考虑每剂约
0.01mg至500mg量的包括融合构建体的抗原。在一具体实施例中，可考虑每剂约0.1mg至1mg量的包括融合构建体的抗原。一般而言，一剂、两剂或三剂疫苗可以促进最佳免疫的发展。
两次剂量的间的时间可以短至三或四周，但使初始剂量(第一剂)与加强剂量(第二剂)间隔
五、六、七、八、九或十周，随后用加强注射刺激免疫系统可能为较佳的。后续加强注射(强化注射(recall shot))亦可最佳提供可持续的免疫。该强化注射可以例如每半年(6个月)、每年、每两年、每三年或每五年进行。
0.01mg至500mg量的包括融合构建体的抗原。在一具体实施例中，可考虑每剂约0.1mg至1mg量的包括融合构建体的抗原。一般而言，一剂、两剂或三剂疫苗可以促进最佳免疫的发展。
两次剂量的间的时间可以短至三或四周，但使初始剂量(第一剂)与加强剂量(第二剂)间隔
五、六、七、八、九或十周，随后用加强注射刺激免疫系统可能为较佳的。后续加强注射(强化注射(recall shot))亦可最佳提供可持续的免疫。该强化注射可以例如每半年(6个月)、每年、每两年、每三年或每五年进行。
[0199] 「样品」或「生物样品」是指自活体分离的任何固体或液体样品。在一个特定实施例中，其是指自哺乳动物分离的任何固体(例如组织样品)或液体样品，诸如乳汁、活检材料(例如固体组织样品)、血液(例如血浆、血清或全血)、唾液、滑液、尿液、羊膜液及脑脊髓液。
此类样品在分析感染原的表达量之前可以例如为新鲜的、经固定(例如福尔马林、醇或丙酮固定)、经石蜡包埋或经冷冻。
此类样品在分析感染原的表达量之前可以例如为新鲜的、经固定(例如福尔马林、醇或丙酮固定)、经石蜡包埋或经冷冻。
[0200] 患者
[0201] 如本文所使用，术语「个体」或「患者」是指作为治疗、观察或实验的对象的动物，较佳为哺乳动物，诸如(但不限于)人类、母牛(例如雌牛犊、经产母牛、初产母牛、小牛)、山羊、绵羊、母羊、驴、马、猪、鸡、猫、狗等。在一具体实施例中，其是母牛(例如有经历葡萄球菌(例如IMI)感染的风险)。
[0202] 如本文所使用，术语「在将来时间有经历葡萄球菌感染(例如葡萄球菌感染(例如IMI)或其任何症状的风险的个体」是指用于产奶或产肉的哺乳动物(例如母牛(例如雌牛
犊、经产母牛、初产母牛、小牛)、山羊、绵羊)。
犊、经产母牛、初产母牛、小牛)、山羊、绵羊)。
[0203] 在一个实施例中，以上提及的哺乳动物是母牛。
[0204] 检测方法
[0205] 量测所选蛋白质/多肽的量/含量的方法的实施例包括(但不限于)：西方墨点法(Western blot)、免疫墨点法、酶联结免疫吸附分析法 (ELISA)、放射免疫分析法(RIA)、免疫沈淀法、表面电浆子共振法、化学发光、荧光偏光、磷光、免疫组织化学分析、基质辅助雷射脱附/ 电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱法、显微细胞测量术 (microcytometry)、微数组、显微镜检查、流式细胞测量术，及基于蛋白质的特性，包括(但不限于)DNA结合、配体结合、与其他蛋白质搭配物的相互作用或酶活性的分析法。
[0206] 在一个实施例中，使用特异性针对多肽/蛋白质的抗体在本发明的方法内检测多肽/蛋白质的量。如本文所使用，术语「抗体」涵盖单株抗体、多株抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)及抗体片段，只要其展现所需生物活性或特异性即可。「抗体片段」包含全长抗体的一部分，一般为其抗原结合区或可变区。抗体与靶多肽的间的相互作用是藉由辐射
量测、色度或荧光方式检测。可以藉由添加偶合至可检测标签，诸如酶、荧光团或发色团的二次抗体检测抗原-抗体复合物。
量测、色度或荧光方式检测。可以藉由添加偶合至可检测标签，诸如酶、荧光团或发色团的二次抗体检测抗原-抗体复合物。
[0207] 用于制备抗体的方法是此项技术中熟知的。可以藉由用所关注多肽 /蛋白质或其片段作为免疫原对适合个体(例如兔、山羊、小鼠或其他哺乳动物)免疫接种来制备多株抗
体。多肽/蛋白质「片段」、「部分」或「区段」是具有上述多肽中的至少约5、7、10、14、15、20、21个或更多个氨基酸的氨基酸残基链段。可以藉由标准技术，诸如使用固定的外吐小体标记
物多肽或其片段的酶联结免疫吸附剂分析(ELISA)，随时间监测经免疫接种的个体中的抗
体效价。在免疫接种之后的适当时间，例如当抗体效价最高时，可以自动物，通常小鼠获得产抗体细胞，且可以使用产抗体细胞，藉由标准技术，诸如最初由Kohler及 Milstein
(1975)Nature 256:495-497描述的融合瘤技术、人类B细胞融合瘤技术(Kozbor等人(1983)
Immunol.Today 4:72)、EBV-融合瘤技术 (Cole等人(1985)Monoclonal Antibodies and
Cancer Therapy,Reisfeld 及Sell编(Alan R.Liss,Inc.,New York,NY),第77-96页)或三
源融合瘤技术制备单株抗体。用于产生融合瘤的技术是熟知的(一般参见Coligan等人编
(1994)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,Inc., New York,NY)。
体。多肽/蛋白质「片段」、「部分」或「区段」是具有上述多肽中的至少约5、7、10、14、15、20、21个或更多个氨基酸的氨基酸残基链段。可以藉由标准技术，诸如使用固定的外吐小体标记
物多肽或其片段的酶联结免疫吸附剂分析(ELISA)，随时间监测经免疫接种的个体中的抗
体效价。在免疫接种之后的适当时间，例如当抗体效价最高时，可以自动物，通常小鼠获得产抗体细胞，且可以使用产抗体细胞，藉由标准技术，诸如最初由Kohler及 Milstein
(1975)Nature 256:495-497描述的融合瘤技术、人类B细胞融合瘤技术(Kozbor等人(1983)
Immunol.Today 4:72)、EBV-融合瘤技术 (Cole等人(1985)Monoclonal Antibodies and
Cancer Therapy,Reisfeld 及Sell编(Alan R.Liss,Inc.,New York,NY),第77-96页)或三
源融合瘤技术制备单株抗体。用于产生融合瘤的技术是熟知的(一般参见Coligan等人编
(1994)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons,Inc., New York,NY)。
[0208] 或者，为了制备单株抗体分泌性融合瘤，可以藉由用多肽或其片段筛选重组组合免疫球蛋白文库(例如抗体噬菌体展示文库)，由此分离出结合该多肽的免疫球蛋白文库成
员来鉴别并分离单株抗体。用于产生及筛选噬菌体展示文库的试剂盒是可商购的(例如
TM
Pharmacia Recombinant Phage Antibody System ，目录号27-9400-01；及Stratagene
SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。
员来鉴别并分离单株抗体。用于产生及筛选噬菌体展示文库的试剂盒是可商购的(例如
TM
Pharmacia Recombinant Phage Antibody System ，目录号27-9400-01；及Stratagene
SurfZAPTM噬菌体展示试剂盒，目录号240612)。
[0209] 另外，针对一或多种本文所描述的多肽/蛋白质的抗体亦可自商业来源获得。
[0210] 本发明亦涵盖使用对多肽/蛋白质具有特异性的固定抗体且其是一般熟习此项技术者熟知的。抗体可固定至多种固体支撑物上，诸如磁性或层析基质粒子、分析位置(诸如微量滴定孔)的表面、固体基质材料(诸如塑料、耐纶、纸)片及类似物。可以藉由在固体支撑物上以数组方式涂布该抗体或复数种抗体来制备分析条带。此条带接着可浸渍于测试样品
中，且接着藉由洗涤及检测步骤快速处理，产生可量测信号，诸如彩色点。
中，且接着藉由洗涤及检测步骤快速处理，产生可量测信号，诸如彩色点。
[0211] 复数种(2种或2种以上)多肽/蛋白质的分析可以用一份测试样品分别或同时进行。若干多肽/蛋白质可以组合于一项测试中以高效处理多份样品。
[0212] 多肽/蛋白质的分析亦可以多种物理形式进行。举例而言，可使用微量滴定板或自动化以便利大量测试样品的处理。或者，可以开发单一样品形式以便利以及时方式实时治
疗及诊断。特别有用的物理形式包含具有复数个不连续、可寻址位置用于检测复数种不同
分析物的表面。此类形式包括蛋白质微数组或「蛋白质芯片」(参见例如，Ng及Ilag, J.Cell Mol.Med.6:329-340,2002)及毛细管装置。
疗及诊断。特别有用的物理形式包含具有复数个不连续、可寻址位置用于检测复数种不同
分析物的表面。此类形式包括蛋白质微数组或「蛋白质芯片」(参见例如，Ng及Ilag, J.Cell Mol.Med.6:329-340,2002)及毛细管装置。
[0213] 在一个实施例中，以上提及的表达量是藉由量测自该一或多个基因转录的mRNA的表达量测定。
[0214] 测定核酸(mRNA)含量的方法是此项技术中已知的，且包括例如聚合酶链反应(PCR)、逆转录酶-PCR(RT-PCR)、SAGE、定量PCR(q- PCR)、南方墨点法(Southern blot)、北方墨点法(Northern blot)、序列分析、微数组分析、报导基因检测或其他DNA/RNA杂交平
台。对于 RNA表达，较佳方法包括(但不限于)：提取细胞mRNA及使用与编码一或多种本发明的蛋白质/多肽的编码核酸的全部或一部分的转录物杂交的经标记探针进行北方墨点法；
使用特异性引子、聚合酶链反应 (PCR)、定量PCR(q-PCR)及逆转录酶-聚合酶链反应(RT-
PCR)扩增由一或多种编码本发明的蛋白质/多肽的核酸表达的mRNA，随后藉由多种方式中
的任一种定量检测产物；自生物样品提取总RNA，接着标记并用于探测排列在多种表面中的任一种上的编码本发明的蛋白质/多肽编码核酸的全部或一部分的cDNA或寡核苷酸。
台。对于 RNA表达，较佳方法包括(但不限于)：提取细胞mRNA及使用与编码一或多种本发明的蛋白质/多肽的编码核酸的全部或一部分的转录物杂交的经标记探针进行北方墨点法；
使用特异性引子、聚合酶链反应 (PCR)、定量PCR(q-PCR)及逆转录酶-聚合酶链反应(RT-
PCR)扩增由一或多种编码本发明的蛋白质/多肽的核酸表达的mRNA，随后藉由多种方式中
的任一种定量检测产物；自生物样品提取总RNA，接着标记并用于探测排列在多种表面中的任一种上的编码本发明的蛋白质/多肽编码核酸的全部或一部分的cDNA或寡核苷酸。
[0215] 试剂盒
[0217] 本发明亦提供一种用于治疗及/或预防葡萄球菌IMI的试剂盒或包装，其包含可用于向有需要的个体投与一或多种本发明的构建体、多肽、核酸、载体、宿主、组合物或其中至少两种的组合的试剂。此类试剂盒可以进一步包含例如有关预防及/或治疗葡萄球菌IMI的
说明书、容器、可用于执行这些方法的试剂。必要时，该试剂盒进一步包括用于降低测试中的背景干扰的试剂、用于增加信号的试剂、用于组合及内插标记物值以产生对所关注临床
结果的预测的软件及算法、用于进行测试的设备、校准曲线及图表、标准化曲线及图表，及类似物。
说明书、容器、可用于执行这些方法的试剂。必要时，该试剂盒进一步包括用于降低测试中的背景干扰的试剂、用于增加信号的试剂、用于组合及内插标记物值以产生对所关注临床
结果的预测的软件及算法、用于进行测试的设备、校准曲线及图表、标准化曲线及图表，及类似物。
[0218] 用于进行本发明的模式
[0219] 本发明藉由以下非限制性实施例进一步详细说明。
[0220] 实施例1：有关包括SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720、 SACOL1867、SACOL1912及SACOL2385的疫苗(疫苗#1)的材料及方法
[0221] 制备抗原.选择在金黄色葡萄球菌牛乳房内感染期间大量表达的六种抗原纳入第一种牛疫苗(疫苗#1)中。这些抗原是： SACOL0029(GenBank登录编号:YP_184940.1)(SEQ
ID NO:5)、 SACOL0442(YP_185332.1)(SEQ ID NO:29)、 SACOL0720(YP_185601.1)(SEQ ID NO:11)、SACOL1867(GenBank登录编号：YP_186695.1)(SEQ ID NO:38)、SACOL1912(GenBank登录编号：YP_186737.1)(SEQ ID NO:43)及SACOL2385(GenBank登录编号： YP_187189.1)
(SEQ ID NO:50)。由GenScript,Inc.(Piscataway,NJ)对 His标记的SACOL0029、
SACOL1867、SACOL1912及SACOL2385的重组蛋白质进行工程改造及制造。根据制造商的推
荐，使用来自Qiagen Inc.(Mississauga,ON,Canada)的QIA表达技术(pQE30质粒)工程改造
及制造His标记的SACOL0442及SACOL0720的重组蛋白质。有关his标记的抗原序列，参见图
21I至VI。实施例2至5及图1至4是关于该疫苗#1。
ID NO:5)、 SACOL0442(YP_185332.1)(SEQ ID NO:29)、 SACOL0720(YP_185601.1)(SEQ ID NO:11)、SACOL1867(GenBank登录编号：YP_186695.1)(SEQ ID NO:38)、SACOL1912(GenBank登录编号：YP_186737.1)(SEQ ID NO:43)及SACOL2385(GenBank登录编号： YP_187189.1)
(SEQ ID NO:50)。由GenScript,Inc.(Piscataway,NJ)对 His标记的SACOL0029、
SACOL1867、SACOL1912及SACOL2385的重组蛋白质进行工程改造及制造。根据制造商的推
荐，使用来自Qiagen Inc.(Mississauga,ON,Canada)的QIA表达技术(pQE30质粒)工程改造
及制造His标记的SACOL0442及SACOL0720的重组蛋白质。有关his标记的抗原序列，参见图
21I至VI。实施例2至5及图1至4是关于该疫苗#1。
[0222] 对奶牛免疫接种.将十九头处于泌乳中期的健康经产荷斯坦母牛 (Holstein cow)圈养于加拿大农业与农产品部奶牛及猪研究与开发中心 (Dairy and Swine
Research and Development Centre of Agriculture and Agri-Food Canada；
Sherbrooke,QC)的II级生物安全畜棚中。将母牛随机分成2组：一组(10头母牛)接受生理食盐水(安慰剂组)；另一组(9头母牛)接受疫苗#1(疫苗接种组)。该疫苗是由六种抗原
(SACOL0029、 SACOL0720、SACOL1867、SACOL1912及SACOL2385)各300μg组合EmulsigenTM-D(MVP Technologies,Omaha,NE)、CpG ODN 2007(TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:
194)，一种病原体相关分子模式(PAMP)，VIDO,Saskatoon,SW)及阳离子肽吲哚力西丁
(ILPWKWPWWPWRR(SEQ ID NO:195)，用于诱导母牛的免疫反应(Chemprep Inc.,Miami,FL)
构成。间隔10周在颈部中经皮下进行两次免疫接种。未观察到不良副作用。在第一次免疫接种之前(免疫前血清)并且接着每两周取得尾静脉血液及牛奶样品以检测总IgG、IgG1及
IgG2。在第一次免疫接种之前及第一次免疫接种之后14周(亦即，在第二次免疫接种之后4
周)自颈静脉取得较大体积的血液(150mL)进行外周血液单核细胞(PBMC)分离并分析细胞
免疫反应。
Research and Development Centre of Agriculture and Agri-Food Canada；
Sherbrooke,QC)的II级生物安全畜棚中。将母牛随机分成2组：一组(10头母牛)接受生理食盐水(安慰剂组)；另一组(9头母牛)接受疫苗#1(疫苗接种组)。该疫苗是由六种抗原
(SACOL0029、 SACOL0720、SACOL1867、SACOL1912及SACOL2385)各300μg组合EmulsigenTM-D(MVP Technologies,Omaha,NE)、CpG ODN 2007(TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:
194)，一种病原体相关分子模式(PAMP)，VIDO,Saskatoon,SW)及阳离子肽吲哚力西丁
(ILPWKWPWWPWRR(SEQ ID NO:195)，用于诱导母牛的免疫反应(Chemprep Inc.,Miami,FL)
构成。间隔10周在颈部中经皮下进行两次免疫接种。未观察到不良副作用。在第一次免疫接种之前(免疫前血清)并且接着每两周取得尾静脉血液及牛奶样品以检测总IgG、IgG1及
IgG2。在第一次免疫接种之前及第一次免疫接种之后14周(亦即，在第二次免疫接种之后4
周)自颈静脉取得较大体积的血液(150mL)进行外周血液单核细胞(PBMC)分离并分析细胞
免疫反应。
[0223] 藉由ELISA检测总IgG、IgG1及IgG2.如先前所描述且稍加修改(Ster等人,Vet.Immunol.Immunopathol.(2010),136:311-318)，检测针对血清及牛奶中的每一抗原的
总IgG、IgG1及IgG2。用测试抗原(5 μg/mL在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中稀释，Sigma
Aldrich,Oakville,ON) 涂布Nunc MaxiSorpTM 96孔盘(Thermo Fisher Scientific Inc., Rochester,NY)并在37℃下培育隔夜。接着，在37℃下，用含有0.5％明胶的PBS(BD，
Franklin Lakes,NJ)使这些盘饱和，保持1小时。将一百微升在含有0.5％明胶及0.1％
TweenTM 20的PBS中的血清的两倍连续稀释液装载至盘中并在37℃下培育1小时。用含有
0.1％TweenTM 20的PBS 洗涤这些盘三次。将一百微升辣根过氧化酶(HRP)偶联的二次抗体
添加至该盘中。使用的二次抗体是分别在含有0.5％明胶及0.1％TweenTM 20 的PBS中以1/
50,000、1/20,000及1/20,000稀释的山羊抗牛IgG(Jackson ImmunoResearch
Laboratories Inc.,West Grove,PA)、绵羊抗牛 IgG1(AbD Serotec,Raleigh,NC)或绵羊
抗牛IgG2(AbD Serotec)。在 37℃下培育1小时随后洗涤3次之后，根据制造商的推荐，用3,
3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)试剂(KPL Inc.,Gaithersburg,MD)检测过氧化酶活性。
总IgG、IgG1及IgG2。用测试抗原(5 μg/mL在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中稀释，Sigma
Aldrich,Oakville,ON) 涂布Nunc MaxiSorpTM 96孔盘(Thermo Fisher Scientific Inc., Rochester,NY)并在37℃下培育隔夜。接着，在37℃下，用含有0.5％明胶的PBS(BD，
Franklin Lakes,NJ)使这些盘饱和，保持1小时。将一百微升在含有0.5％明胶及0.1％
TweenTM 20的PBS中的血清的两倍连续稀释液装载至盘中并在37℃下培育1小时。用含有
0.1％TweenTM 20的PBS 洗涤这些盘三次。将一百微升辣根过氧化酶(HRP)偶联的二次抗体
添加至该盘中。使用的二次抗体是分别在含有0.5％明胶及0.1％TweenTM 20 的PBS中以1/
50,000、1/20,000及1/20,000稀释的山羊抗牛IgG(Jackson ImmunoResearch
Laboratories Inc.,West Grove,PA)、绵羊抗牛 IgG1(AbD Serotec,Raleigh,NC)或绵羊
抗牛IgG2(AbD Serotec)。在 37℃下培育1小时随后洗涤3次之后，根据制造商的推荐，用3,
3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)试剂(KPL Inc.,Gaithersburg,MD)检测过氧化酶活性。
[0224] 使用相同程序且略加修改，检测牛奶中的总IgG、IgG1及IgG2。将牛奶样品稀释于含有0.5％明胶的PBS中。将绵羊抗牛IgG2是以1/10,000 稀释于含有0.5％明胶及0.1％
TweenTM 20的PBS中。
TweenTM 20的PBS中。
[0225] 评价细胞免疫反应.如先前所描述(Loiselle等人,J.Dairy.Sci.(2009), 92:1900-1912)，自颈静脉血液分离出PBMC并用二乙酸羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFDA-SE；
Molecular Probes Inc.,Eugene,OR)标记。在 CFDA-SE标记程序结束时，使这些PBMC悬浮
于含有5％FBS及1X抗生素/抗霉菌素(A5955,Sigma Chemical Aldrich)的RPMI培养基中。
用最终浓度为1μg/mL的有丝分裂原伴刀豆球蛋白A(ConA；阳性对照； Sigma Aldrich)，或各抗原(每孔5μg)刺激这些PBMC(5×106个细胞/孔) 并在37℃下培育7天。在无任何有丝分
裂原下培育这些PBMC作为阴性对照。刺激是一式两份进行(Ster等人,2010)。
Molecular Probes Inc.,Eugene,OR)标记。在 CFDA-SE标记程序结束时，使这些PBMC悬浮
于含有5％FBS及1X抗生素/抗霉菌素(A5955,Sigma Chemical Aldrich)的RPMI培养基中。
用最终浓度为1μg/mL的有丝分裂原伴刀豆球蛋白A(ConA；阳性对照； Sigma Aldrich)，或各抗原(每孔5μg)刺激这些PBMC(5×106个细胞/孔) 并在37℃下培育7天。在无任何有丝分
裂原下培育这些PBMC作为阴性对照。刺激是一式两份进行(Ster等人,2010)。
[0226] 在与不同有丝分裂原一起培育后，评价CD4+及CD8+细胞的增殖情况。以300×g离心细胞5分钟，使其悬浮于含有0.5％BSA的PBS中。接着添加与Alexa FluorTM 647偶合的小鼠抗牛CD8(以1/20稀释，AbD serotec)及与rPE偶合的小鼠抗牛CD4(以1/20稀释，AbD
serotec)。在冰上培育20分钟之后，用含有0.5％BSA的PBS洗涤细胞三次。接着使细胞悬浮于含0.5％甲醛的PBS中。在BD FACS Canto II流式细胞仪上，使用BD FACS Diva软件藉由
流式细胞测量术测定增殖群的百分比。
serotec)。在冰上培育20分钟之后，用含有0.5％BSA的PBS洗涤细胞三次。接着使细胞悬浮于含0.5％甲醛的PBS中。在BD FACS Canto II流式细胞仪上，使用BD FACS Diva软件藉由
流式细胞测量术测定增殖群的百分比。
[0227] 奶牛中的实验性金黄色葡萄球菌IMI.在使用细菌培养物进行实验性IMI之前，确定细菌培养物的吸光度(A600nm)与CFU的间的关系。在激发当天，将含一定体积金黄色葡萄球菌隔夜培养物的米勒辛顿培养液(Mueller Hinton broth，MHB；BD)转移至200mL新鲜MHB中以获得0.1的A600nm，且随后使其在35℃下生长，直至A600nm在指数生长期达到对应于
108CFU/mL的值。用于该实验性感染的菌株(CLJ08-3)已预先在共同发明者的实验室中表征
(Allard等人,Vet.Microbiol.(2013) 162:761-770)。对于乳房内输注，常规地在无菌PBS
(Sigma Aldrich)中稀释细菌以在3mL中达到约50CFU。在本实验中，将接种物涂铺于 TSA上并发现其在3mL中含有63cfu。
108CFU/mL的值。用于该实验性感染的菌株(CLJ08-3)已预先在共同发明者的实验室中表征
(Allard等人,Vet.Microbiol.(2013) 162:761-770)。对于乳房内输注，常规地在无菌PBS
(Sigma Aldrich)中稀释细菌以在3mL中达到约50CFU。在本实验中，将接种物涂铺于 TSA上并发现其在3mL中含有63cfu。
[0228] 在实验性IMI之前，进行体细胞计数(SCC)测定及无菌乳区牛奶样品的细菌分析以确保所有母牛均无IMI。根据先前所描述的程序 (Petitclerc等人,J.Dairy.Sci.(2007),
90:2778-2787)且略加修改，在晚间挤奶之后，在每头母牛四个乳区中的三个(随机选择)中进行乳区的实验性细菌输注。简言之，在接种之前，用浸泡于70％乙醇中的纱布擦洗乳头。
使乳头空气干燥，随后将3mL细菌悬浮液(含有63CFU)经乳房内输注至四个乳区中的三个
中。在输注之后，立即充分按摩所有乳区并将乳头浸入基于碘伏的乳头消毒剂中。在整个程序中穿戴抛弃式分指手套并在进行至下一动物之前消毒。输注金黄色葡萄球菌的所有乳区
变得感染且所有母牛在输注金黄色葡萄球菌之后前几天期间的某一时间显示乳腺炎的临
床症状(炎症及/或较差牛奶外观)。
90:2778-2787)且略加修改，在晚间挤奶之后，在每头母牛四个乳区中的三个(随机选择)中进行乳区的实验性细菌输注。简言之，在接种之前，用浸泡于70％乙醇中的纱布擦洗乳头。
使乳头空气干燥，随后将3mL细菌悬浮液(含有63CFU)经乳房内输注至四个乳区中的三个
中。在输注之后，立即充分按摩所有乳区并将乳头浸入基于碘伏的乳头消毒剂中。在整个程序中穿戴抛弃式分指手套并在进行至下一动物之前消毒。输注金黄色葡萄球菌的所有乳区
变得感染且所有母牛在输注金黄色葡萄球菌之后前几天期间的某一时间显示乳腺炎的临
床症状(炎症及/或较差牛奶外观)。
[0229] 评价在实验性感染之后金黄色葡萄球菌活菌计数.实验性感染之后的前3周期间一周三次并且接着在其余2周一周两次在早晨挤奶之前取得无菌牛奶样品。在丢弃前奶且
用70％乙醇对乳头消毒之后，对于每一个别乳区，将10 mL牛奶样品无菌收集于50 mL无菌
小瓶中。连续稀释牛奶样品且将100μL各稀释液涂铺于胰蛋白酶大豆琼脂(Becton
Dickinson)及甘露糖醇盐琼脂盘(Becton Dickinson)上以测定CFU并鉴别金黄色葡萄球
菌。接着在35℃下培育盘24小时，随后对菌落计数。使用显示菌落数在30个与300个的间的稀释液计算细菌浓度。每一稀释液是一式两份涂铺。
用70％乙醇对乳头消毒之后，对于每一个别乳区，将10 mL牛奶样品无菌收集于50 mL无菌
小瓶中。连续稀释牛奶样品且将100μL各稀释液涂铺于胰蛋白酶大豆琼脂(Becton
Dickinson)及甘露糖醇盐琼脂盘(Becton Dickinson)上以测定CFU并鉴别金黄色葡萄球
菌。接着在35℃下培育盘24小时，随后对菌落计数。使用显示菌落数在30个与300个的间的稀释液计算细菌浓度。每一稀释液是一式两份涂铺。
[0230] 评价体细胞计数.以与无菌牛奶样品相同的频率，在早晨挤奶时使用个别乳区挤奶单元收集牛奶并称重以测定乳区牛奶产量。亦自各乳区挤奶单元获得非无菌50 mL样品
以藉由商业实验室(Valacta Inc.,Ste- Anne-de-Bellevue,QC,Canada)测定SCC。每头母
牛上的挤奶单元在其使用的间用基于碘的杀菌剂清洁剂(K.O. GEA Farm
Technologies,Westmoreland,NY)充分洗涤并消毒。接触牛奶的所有其他材料均用70％乙
醇消毒。
以藉由商业实验室(Valacta Inc.,Ste- Anne-de-Bellevue,QC,Canada)测定SCC。每头母
牛上的挤奶单元在其使用的间用基于碘的杀菌剂清洁剂(K.O. GEA Farm
Technologies,Westmoreland,NY)充分洗涤并消毒。接触牛奶的所有其他材料均用70％乙
醇消毒。
[0231] 统计分析.使用SAS(SAS Institute Inc.,Cary,NC)的MIXED程序作为重复量测方式进行实验性感染数据的统计分析。为分析SCC及CFU，在分析之前对数据进行log10转换。
使用GraphPad PrismTM v6.05进行抗体效价及CFU与SCC之间相关性的统计分析。
使用GraphPad PrismTM v6.05进行抗体效价及CFU与SCC之间相关性的统计分析。
[0232] 伦理学声明.所有动物实验均得到加拿大农业与农产品部地方机构动物护理委员会(Agriculture and Agri-Food Canada local institutional animal care
committee)的批准并根据加拿大动物护理委员会(Canadian Council on Animal Care)的
指导原则进行。
committee)的批准并根据加拿大动物护理委员会(Canadian Council on Animal Care)的
指导原则进行。
[0233] 实施例2：在疫苗接种之后的血清总IgG1效价-疫苗#1
[0234] 如实施例1(制备抗原及对奶牛免疫接种)中所描述，制备有关SACOL0029(Genbank登录编号：YP_184940.1)(SEQ ID NO:5)、 SACOL0442(SEQ ID NO:29)、SACOL0720(SEQ ID NO:11)、 SACOL1867(Genbank登录编号：YP_186695.1)(SEQ ID NO:38)、 SACOL1912
(Genbank登录编号：YP_186737.1)(SEQ ID NO:43)及 SACOL2385(Genbank登录编号：YP_
187189.1)(SEQ ID NO:50)的重组 His标记的抗原并投与健康母牛。有九头奶牛接受疫苗
且10头母牛接受生理食盐水(安慰剂)。如实施例1(藉由ELISA检测总IgG、IgG1及IgG2) 中
所描述，检测总血清IgG、IgG1及IgG2效价。
(Genbank登录编号：YP_186737.1)(SEQ ID NO:43)及 SACOL2385(Genbank登录编号：YP_
187189.1)(SEQ ID NO:50)的重组 His标记的抗原并投与健康母牛。有九头奶牛接受疫苗
且10头母牛接受生理食盐水(安慰剂)。如实施例1(藉由ELISA检测总IgG、IgG1及IgG2) 中
所描述，检测总血清IgG、IgG1及IgG2效价。
[0235] 正如预期，且如图1B-C中所示，相较于安慰剂组，在疫苗接种组中免疫接种诱导抗原特异性血清IgG1及IgG2的产生增加。有趣的是，对于SACOL0442，IgG2/IgG1比率是1(参见图1D)，指示针对该抗原的平衡Th1/Th2免疫反应。对于抗原SACOL0029、SACOL0720、 SACOL1912及SACOL2385，IgG2/IgG1比率明显低于SACOL0442的比率，指示这些抗原主要经
由Th2路径诱导IgG1抗体反应。
由Th2路径诱导IgG1抗体反应。
[0236] 实施例3：在疫苗接种之后的抗原依赖性血液CD4+及CD8+细胞增殖-疫苗#1
[0237] 对于各抗原，在第二次免疫接种(即将实验性感染之前)之后四周，如实施例1(评价细胞免疫反应)中所描述，评价来自经疫苗接种的母牛 (9)及安慰剂母牛(10)的血液CD4
+及CD8+细胞的抗原依赖性增殖情况。有关CD4+细胞的结果显示于图2中，其中每个符号表
示在与阳性对照 (ConA)或各抗原一起培育一周之后每头母牛中增殖的CD4+细胞的百分含
量。空心圆(○)表示经疫苗接种的母牛的资料，黑色正方形(■)表示安慰剂母牛的资料。水平线表示中值：虚线表示经疫苗接种的母牛的中值，而连续线表示安慰剂母牛的中值。
+及CD8+细胞的抗原依赖性增殖情况。有关CD4+细胞的结果显示于图2中，其中每个符号表
示在与阳性对照 (ConA)或各抗原一起培育一周之后每头母牛中增殖的CD4+细胞的百分含
量。空心圆(○)表示经疫苗接种的母牛的资料，黑色正方形(■)表示安慰剂母牛的资料。水平线表示中值：虚线表示经疫苗接种的母牛的中值，而连续线表示安慰剂母牛的中值。
[0238] 符号＊显示针对抗原SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720及 SACOL1912，疫苗接种组与安慰剂组的间的统计差异(＊，P<0.05)。
[0239] 此外，对于除抗原SACOL0720的外的所有抗原，经疫苗接种的母牛及安慰剂母牛的CD8+细胞增殖类似，对于抗原SACOL0720，在经疫苗接种的母牛中观察到较高CD8+细胞增殖(数据未显示)。CD8+细胞的诱导看来对于感染的消退亦很重要(Riollet等人,2001；Burton及 Erskine,2003)。疫苗能够刺激细胞(CD8+)及体液(CD4+)两种免疫反应。利用不同抗原
的疫苗#1引起平衡的免疫反应。
的疫苗#1引起平衡的免疫反应。
[0240] 实施例4：如藉由跟踪体细胞计数(SCC)的变化评价的疫苗的保护作用-疫苗#1
[0241] 如实施例1(奶牛中的实验性金黄色葡萄球菌IMI、在实验性感染之后评价金黄色葡萄球菌活菌计数、评价体细胞计数及统计分析)中所描述，对奶牛进行实验性金黄色葡萄球菌感染并加以评价。在第二次免疫接种之后四周及4天，在晚间挤奶时，将63CFU的金黄色葡萄球菌输注至经疫苗接种母牛(9)及安慰剂母牛(10)的4个乳区中的3个中(第1天，图 3
中的箭头)。在早晨挤奶时取得无菌牛奶样品并由Valacta(Ste-Anne-de- Bellevue,QC)测
定SCC。结果显示于图3中，其中空心圆(○)及虚线表示经疫苗接种母牛的资料，而黑色正方形(■)及连续线表示安慰剂母牛的资料。每个空心圆表示经疫苗接种母牛的所有经感染乳
区(27个)的平均 SCC，而每个正方形表示安慰剂母牛所有经感染乳区(30个乳区)的平均
SCC。
中的箭头)。在早晨挤奶时取得无菌牛奶样品并由Valacta(Ste-Anne-de- Bellevue,QC)测
定SCC。结果显示于图3中，其中空心圆(○)及虚线表示经疫苗接种母牛的资料，而黑色正方形(■)及连续线表示安慰剂母牛的资料。每个空心圆表示经疫苗接种母牛的所有经感染乳
区(27个)的平均 SCC，而每个正方形表示安慰剂母牛所有经感染乳区(30个乳区)的平均
SCC。
[0242] 在激发期间，发现经疫苗接种母牛的牛奶中的SCC明显低于安慰剂母牛(＊＊＊；P<0.001)，指示在经疫苗接种母牛中炎症较少及对感染的较佳控制。
[0243] 实施例5：金黄色葡萄球菌(CFU)的SCC或活菌计数相对于针对特异性抗原的血清或牛奶IgG效价的间的相关性-疫苗#1
[0244] 如图4A-B中所示，SCC与激发期的金黄色葡萄球菌CFU呈正相关 (图4A，r＝0.82，P<0.0001)且与在感染之前测量的针对SACOL0442的血清IgG1效价呈负相关(图4B，r＝-0.49，P<0.05)。因此，疫苗接种使此由激发诱导的炎症标准减小。利用在第10天收集的样品进行类似分析。观察到与先前所获得相同的相关性，但在此特定时间点，SCC及金黄色葡萄球菌CFU亦与针对SACOL0029的牛奶IgG2效价相关(图4C，分别为r＝-0.48，P<0.05及r＝-
0.58，P<0.05)。这些结果显示，在针对感染的免疫反应中涉及超过一种抗原。
0.58，P<0.05)。这些结果显示，在针对感染的免疫反应中涉及超过一种抗原。
[0245] 实施例6：有关包括SACOL0442、SACOL0720以及SACOL1867与 SACOL0029的融合物的疫苗的材料及方法-疫苗#2
[0246] 制备抗原.选择在金黄色葡萄球菌牛乳房内感染期间大量表达的四种抗原纳入疫苗#2中。这些抗原是由以下编码的多肽：
[0247] SACOL0029(Genbank登录编号：YP_184940.1)(SEQ ID NO:5)、 SACOL1867(Genbank登录编号：YP_186695.1)(SEQ ID NO:38)、 SACOL0442(SEQ ID NO:29)及
SACOL0720(SEQ ID NO:11)。包括呈融合物形式的SACOL0029及SACOL1867抗原。由
GenScript, Inc.(Piscataway,NJ)对His标记的SACOL0720及SACOL0029-1867的重组蛋白
质进行工程改造及制造。根据制造商的推荐，使用来自Qiagen Inc.(Mississauga,ON,
Canada)的QIA表达技术(pQE30质粒)工程改造及制造His标记的SACOL0442的重组蛋白质。
(有关SACOL0720、 SACOL0442及SACOL0029-1867his标记序列，参见图21D-E及I，以及第II、III及VII项)。另外，亦藉由使用该QIA表达载体，藉由自金黄色葡萄球菌ATCC 25904选殖
clfA基因制造表面蛋白质ClfA(SEQ ID NO:184)。该后一重组蛋白并非疫苗组合物的一部
分，但用于ELISA分析中以测定针对其他金黄色葡萄球菌蛋白质，诸如ClfA的血清IgG效价。
SACOL0720(SEQ ID NO:11)。包括呈融合物形式的SACOL0029及SACOL1867抗原。由
GenScript, Inc.(Piscataway,NJ)对His标记的SACOL0720及SACOL0029-1867的重组蛋白
质进行工程改造及制造。根据制造商的推荐，使用来自Qiagen Inc.(Mississauga,ON,
Canada)的QIA表达技术(pQE30质粒)工程改造及制造His标记的SACOL0442的重组蛋白质。
(有关SACOL0720、 SACOL0442及SACOL0029-1867his标记序列，参见图21D-E及I，以及第II、III及VII项)。另外，亦藉由使用该QIA表达载体，藉由自金黄色葡萄球菌ATCC 25904选殖
clfA基因制造表面蛋白质ClfA(SEQ ID NO:184)。该后一重组蛋白并非疫苗组合物的一部
分，但用于ELISA分析中以测定针对其他金黄色葡萄球菌蛋白质，诸如ClfA的血清IgG效价。
[0248] 该疫苗是由3种抗原(如实施例1中所定义的SACOL0442及 SACOL0720，及融合物SACOL0029-1867)各300μg及EmulsigenTM- D(MVP Technologies,Omaha,NE)、CpG ODN 2007(亦即， TCGTCGTTGTCGTTTTGTCGTT(SEQ ID NO:194)(IDT,Coralville, IA))及吲哚力西丁
(ILPWKWPWWPWRR(SEQ ID NO:195,GenScript, Piscataway,NJ,Chemprep Inc.,Miami,FL)
构成(疫苗#2)。
(ILPWKWPWWPWRR(SEQ ID NO:195,GenScript, Piscataway,NJ,Chemprep Inc.,Miami,FL)
构成(疫苗#2)。
[0249] 对奶牛免疫接种.将十一头处于泌乳中期的健康经产荷斯坦母牛圈养于加拿大农业与农产品部奶牛及猪研究与开发中心(Sherbrooke,QC) 的II级生物安全畜棚中。母牛接
受疫苗#2(经疫苗接种组)。间隔10周在颈部中经皮下进行两次免疫接种。未观察到不良副
作用。在第一次免疫接种之前(免疫前血清)，并且接着每周取得尾静脉血液及牛奶样品以
检测总IgG。
受疫苗#2(经疫苗接种组)。间隔10周在颈部中经皮下进行两次免疫接种。未观察到不良副
作用。在第一次免疫接种之前(免疫前血清)，并且接着每周取得尾静脉血液及牛奶样品以
检测总IgG。
[0250] 藉由ELISA检测总IgG.如先前所描述且稍加修改(Ster等人,Vet. Immunol.Immunopathol.(2010),136:311-318)，检测针对血清中的每一抗原的总IgG。用测试抗原(5μg/mL在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中稀释， Sigma Aldrich,Oakville,ON)涂布
Nunc MaxiSorpTM 96孔盘(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rochester,NY)并在37℃下培
育隔夜。接着，在37℃下，用含有0.5％明胶的PBS(BD，Franklin Lakes,NJ)使这些盘饱和，保持1小时。将一百微升在含有0.5％明胶及0.1％TweenTM 20的 PBS中的血清的两倍连续稀释液装载至盘中并在37℃下培育1小时。用含有0.1％TweenTM 20的PBS洗涤这些盘三次。将一百微升辣根过氧化酶(HRP)偶联的二次抗体添加至该盘中。使用的二次抗体是在含有
0.5％明胶及0.1％TweenTM 20的PBS中1/1000,000稀释的山羊抗牛 IgG(Jackson
ImmunoResearch Laboratories Inc.,West Grove,PA)。在 37℃下培育1小时随后洗涤3次
之后，根据制造商的推荐，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)试剂(KPL Inc.,
Gaithersburg,MD)检测过氧化酶活性。
Nunc MaxiSorpTM 96孔盘(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rochester,NY)并在37℃下培
育隔夜。接着，在37℃下，用含有0.5％明胶的PBS(BD，Franklin Lakes,NJ)使这些盘饱和，保持1小时。将一百微升在含有0.5％明胶及0.1％TweenTM 20的 PBS中的血清的两倍连续稀释液装载至盘中并在37℃下培育1小时。用含有0.1％TweenTM 20的PBS洗涤这些盘三次。将一百微升辣根过氧化酶(HRP)偶联的二次抗体添加至该盘中。使用的二次抗体是在含有
0.5％明胶及0.1％TweenTM 20的PBS中1/1000,000稀释的山羊抗牛 IgG(Jackson
ImmunoResearch Laboratories Inc.,West Grove,PA)。在 37℃下培育1小时随后洗涤3次
之后，根据制造商的推荐，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)试剂(KPL Inc.,
Gaithersburg,MD)检测过氧化酶活性。
[0251] 实施例7：抗原融合物诱导高抗体效价-疫苗#2
[0252] 图5显示经疫苗接种的母牛针对该疫苗(包括融合抗原SACOL0029 及SACOL1867(在图5上标为SACOL0029-1867)各抗原的血清总IgG效价。每个空心圆表示在第二次免疫接
种之后四周每头母牛的效价(在即将实验性感染之前)，而每个黑色菱形表示免疫前效价。
水平线表示中值：实线表示免疫前血清，点线表示在免疫接种之后四周取得的样品。经疫苗接种的母牛的效价高于免疫前血清的效价(＊＊，P<0.01；对于测试的其他抗原，＊＊＊，P<
0.001)。
种之后四周每头母牛的效价(在即将实验性感染之前)，而每个黑色菱形表示免疫前效价。
水平线表示中值：实线表示免疫前血清，点线表示在免疫接种之后四周取得的样品。经疫苗接种的母牛的效价高于免疫前血清的效价(＊＊，P<0.01；对于测试的其他抗原，＊＊＊，P<
0.001)。
[0253] 因此，图5显示，由包括融合肽在内的三种独立抗原构成的疫苗在母牛中诱导较强免疫反应。另外，图5意外地显示，融合抗原 SACOL0029及SACOL1867(融合物SACOL0029-
SACOL1867)引起的抗体效价高于由各单独抗原引起的抗体效价(比较图1A与图5)且这些融
合抗原使疫苗具有另外的益处。
SACOL1867)引起的抗体效价高于由各单独抗原引起的抗体效价(比较图1A与图5)且这些融
合抗原使疫苗具有另外的益处。
[0254] 更确切地说，当在疫苗中个别地投与时，免疫母牛针对 SACOL0029及SACOL1867的效价分别达到3200及51200(图1A)，而当这些抗原是以融合物形式投与时，免疫母牛的效价分别达到12800及 409600(图5)，显示该融合物在免疫反应中产生出人意料的协同作用。
[0255] 实施例8：有关包含SACOL0029、SACOL1867以及SACOL1867与 SACOL0029的融合物的疫苗的材料及方法-疫苗#3
[0256] 制备抗原.选择由在金黄色葡萄球菌牛乳房内感染期间大量表达的两个基因得到的三种抗原纳入疫苗中。这些抗原是：SACOL0029(Genbank登录编号：YP_184940.1)(SEQ ID NO:5)、 SACOL1867Genbank登录编号：YP_186695.1)(SEQ ID NO:38)及 SACOL1867与
SACOL0029的间的融合物(Genbank登录编号： YP_184940.1)(SEQ ID NO:5)。由GenScript,Inc.(Piscataway,NJ)对 His标记的SACOL0029、SACOL1867及SACOL0029-1867的重组蛋白
质进行工程改造及制造。(有关SACOL0029、SACOL1867及 SACOL0029-1867的his标记序列，参见图21A、F及I，第I、IV及VII 项)。
SACOL0029的间的融合物(Genbank登录编号： YP_184940.1)(SEQ ID NO:5)。由GenScript,Inc.(Piscataway,NJ)对 His标记的SACOL0029、SACOL1867及SACOL0029-1867的重组蛋白
质进行工程改造及制造。(有关SACOL0029、SACOL1867及 SACOL0029-1867的his标记序列，参见图21A、F及I，第I、IV及VII 项)。
[0257] 对小鼠免疫接种.在小鼠中评价由SACOL0029、SACOL1867基因及SACOL0029与SACOL1867的融合物编码的重组金黄色葡萄球菌蛋白质的免疫原性特性。四组小鼠接受呈
单价形式(SACOL0029或 SACOL1867)或呈多价形式(融合物SACOL0029-1867或SACOL0029与
SACOL1867的组合)的精确等摩尔量的蛋白质，并比较。
单价形式(SACOL0029或 SACOL1867)或呈多价形式(融合物SACOL0029-1867或SACOL0029与
SACOL1867的组合)的精确等摩尔量的蛋白质，并比较。
[0258] 简言之，使用ExPASyTM生物信息学资源门户 (http://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)计算对应于整个融合物或该融合物的SACOL0029或SACOL1867部分的
各氨基酸序列的理论分子量。
各氨基酸序列的理论分子量。
[0259] 向一组小鼠投与五微克融合物。根据理论分子量，测定5μg的 SACOL0029-1867融合物的相应摩尔量是168.55pmol。向其他两组小鼠分别投与1.15μg及3.69μg量的
SACOL0029及SACOL1867以便分别提供168.55pmol各抗原。最后一组小鼠接受两种个别抗原
(各168.55 pmol)的组合。
SACOL0029及SACOL1867以便分别提供168.55pmol各抗原。最后一组小鼠接受两种个别抗原
(各168.55 pmol)的组合。
[0260] 为制备免疫接种剂量，个别地混合SACOL0029、SACOL1867及 SACOL0029-1867融合多肽并使其悬浮于PBS中以在100μl体积中获得最终等摩尔量的各抗原。将二十只CD-1雌性小鼠随机分成4组：A组(5 只小鼠)接受5μg SACOL0029-1867融合蛋白(融合物)；B组(5只小鼠)接受1.15μg SACOL0029及3.69μg SACOL1867(组合)；C组(5只小鼠)接受1.15μg
SACOL0029(0029)；且D组接受3.69μg SACOL1867(1867)。在颈部以间隔两周方式两次皮下注射对CD-1小鼠进行免疫接种。在整个实验性免疫接种期间未观察到不良副作用。在即将
第一次初始注射之前(免疫前血清)及增强免疫接种之后十天(免疫血清)取得血液样品。使
血液等分试样在室温下凝结，保持一小时，在4℃下以10,000g离心10分钟。收集血清并保持在-20℃，以待后续分析。
SACOL0029(0029)；且D组接受3.69μg SACOL1867(1867)。在颈部以间隔两周方式两次皮下注射对CD-1小鼠进行免疫接种。在整个实验性免疫接种期间未观察到不良副作用。在即将
第一次初始注射之前(免疫前血清)及增强免疫接种之后十天(免疫血清)取得血液样品。使
血液等分试样在室温下凝结，保持一小时，在4℃下以10,000g离心10分钟。收集血清并保持在-20℃，以待后续分析。
[0261] 藉由ELISA检测总IgG.如先前所描述且稍加修改(Ster等人,Vet. Immunol.Immunopathol.(2010),136:311-318)，检测针对SACOL0029 及SACOL1867重组蛋
白质的血清总IgG。用75μl各测试抗原(6.67 μg/mL在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中稀释，
Sigma Aldrich,Oakville,ON) 涂布Nunc MaxiSorpTM 96孔盘(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rochester, NY)并在室温下培育隔夜。接着在37℃下，用含有5％脱脂奶粉的PBS 使
这些盘饱和，保持1小时。将一百微升在含有3％牛奶及0.025％ TweenTM 20的PBS中的血清的四倍连续稀释液装载至盘中并在37℃下培育1小时。用含有0.05％TweenTM 20的PBS洗涤
这些盘三次。接着将一百微升辣根过氧化酶(HRP)偶联的二次抗体添加至该盘中。所用二次抗体是在含有3％牛奶及0.025％TweenTM 20的PBS中1/5000稀释的商购山羊抗小鼠IgG
(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.,West Grove, PA)。在37℃下培育1小时随
后洗涤3次之后，根据制造商的推荐，藉由添加一百微升3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)试
剂(KPL Inc., Gaithersburg,MD)检测过氧化酶活性。
白质的血清总IgG。用75μl各测试抗原(6.67 μg/mL在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中稀释，
Sigma Aldrich,Oakville,ON) 涂布Nunc MaxiSorpTM 96孔盘(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rochester, NY)并在室温下培育隔夜。接着在37℃下，用含有5％脱脂奶粉的PBS 使
这些盘饱和，保持1小时。将一百微升在含有3％牛奶及0.025％ TweenTM 20的PBS中的血清的四倍连续稀释液装载至盘中并在37℃下培育1小时。用含有0.05％TweenTM 20的PBS洗涤
这些盘三次。接着将一百微升辣根过氧化酶(HRP)偶联的二次抗体添加至该盘中。所用二次抗体是在含有3％牛奶及0.025％TweenTM 20的PBS中1/5000稀释的商购山羊抗小鼠IgG
(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.,West Grove, PA)。在37℃下培育1小时随
后洗涤3次之后，根据制造商的推荐，藉由添加一百微升3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)试
剂(KPL Inc., Gaithersburg,MD)检测过氧化酶活性。
[0262] 统计分析抗体效价及相关性的统计分析是使用GraphPad PrismTM v6.05进行。
[0263] 实施例9：相较于单价抗原或抗原组合，抗原融合物诱导明显较高的抗体效价-疫苗#3
[0264] 图6显示融合多肽(亦即，SACOL0029-1867融合蛋白)中所包括的抗原(SACOL1867)可以诱导针对特异性抗原(SACOL1867)的较强特异性抗体免疫反应，且更重要的是，该反应可以显著高于利用该抗原的单价形式(单独投与的SACOL1867)或作为融合物的一部分的个
别多肽的多价组合(SACOL1867加SACOL0029的组合)获得的反应。因此，除产生针对多个多
肽靶的免疫反应的优势外，此类融合抗原亦提供大幅提高针对这些靶的抗体效价的额外益
处。
别多肽的多价组合(SACOL1867加SACOL0029的组合)获得的反应。因此，除产生针对多个多
肽靶的免疫反应的优势外，此类融合抗原亦提供大幅提高针对这些靶的抗体效价的额外益
处。
[0265] 实施例10：有关包括SACOL0720片段及/或SACOL442片段的疫苗的材料及方法-疫苗#4至6
[0266] 制备抗原.基于B细胞表位的存在，选择长度为15至50个氨基酸且源自于序列SACOL0442及/或SACOL0720的肽及氨基酸片段。亦设计出肽表位的融合物，其中用氨基酸接头(例如EAAAKEAAAK(SEQ ID NO:62)，或ERKYK(SEQ ID NO:61)，或KDYERKYKKHIVS(SEQ ID NO:196))接合各种表位。肽及氨基酸片段是由Biomatik, Inc.(Cambridge,ON)合成。在收
到后，将冻干的肽及氨基酸片段以5 mg/mL浓度悬浮于无菌水中并在-80℃储存待用。
到后，将冻干的肽及氨基酸片段以5 mg/mL浓度悬浮于无菌水中并在-80℃储存待用。
[0267] 对小鼠免疫接种.使用肽及氨基酸片段作为抗原对小鼠免疫接种。对于制备免疫接种剂量，除非另外说明，否则将各肽及氨基酸片段或其组合混合并悬浮于含有20％
-D水包油乳液佐剂的PBS 中，以获得每剂100μg多肽的最终剂量。将CD-
1雌性小鼠随机分成具有3至4只动物的不同组别。以间隔两周方式两次皮下注射小鼠颈部
进行免疫接种。在整个实验期间未观察到不良副作用。在即将第一次初始注射之前(免疫前血清)及增强免疫接种之后十天(免疫血清)取得血液样品。使血液等分试样在室温下凝结，保持1小时，并且接着在4℃下以 10,000g离心10分钟。收集血清并保持在-20℃，以待后续分析。
-D水包油乳液佐剂的PBS 中，以获得每剂100μg多肽的最终剂量。将CD-
1雌性小鼠随机分成具有3至4只动物的不同组别。以间隔两周方式两次皮下注射小鼠颈部
进行免疫接种。在整个实验期间未观察到不良副作用。在即将第一次初始注射之前(免疫前血清)及增强免疫接种之后十天(免疫血清)取得血液样品。使血液等分试样在室温下凝结，保持1小时，并且接着在4℃下以 10,000g离心10分钟。收集血清并保持在-20℃，以待后续分析。
[0268] 藉由ELISA检测总IgG.如先前所描述及稍加修改(Ster等人,Vet. Immunol.Immunopathol.(2010),136:311-318)，检测针对用于免疫接种小鼠的抗原中所发
现的特定氨基酸序列的血清总IgG。用100μl在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma Aldrich,
Oakville,ON)中稀释的最终浓度为5 μg/mL的各靶氨基酸序列涂布Nunc MaxiSorpTM 96孔
盘(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rochester,NY)并在室温下培育隔夜。接着在37℃
下，用含有5％脱脂奶粉的PBS使这些盘饱和，保持1小时。将一百微升在含有 1％牛奶及
0.025％TweenTM 20的PBS中的血清的四倍或两倍连续稀释液装载至盘中并在37℃下培育1
小时。接着用含有0.05％TweenTM 20的 PBS洗涤这些盘三次。接着将一百微升辣根过氧化酶(horseradish peroxidase；HRP)偶联的二次抗体添加至该盘中。所用二次抗体是在含有
1％牛奶及0.025％TweenTM 20的PBS中1/5000稀释的山羊抗小鼠 IgG(Jackson
ImmunoResearch Laboratories Inc.,West Grove,PA)。在 37℃下培育1小时随后用PBS
TweenTM 20洗涤3次且最后用PBS洗涤一次之后，根据制造商的推荐，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)试剂(KPL Inc.,Gaithersburg,MD)检测过氧化酶活性。
现的特定氨基酸序列的血清总IgG。用100μl在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液(Sigma Aldrich,
Oakville,ON)中稀释的最终浓度为5 μg/mL的各靶氨基酸序列涂布Nunc MaxiSorpTM 96孔
盘(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rochester,NY)并在室温下培育隔夜。接着在37℃
下，用含有5％脱脂奶粉的PBS使这些盘饱和，保持1小时。将一百微升在含有 1％牛奶及
0.025％TweenTM 20的PBS中的血清的四倍或两倍连续稀释液装载至盘中并在37℃下培育1
小时。接着用含有0.05％TweenTM 20的 PBS洗涤这些盘三次。接着将一百微升辣根过氧化酶(horseradish peroxidase；HRP)偶联的二次抗体添加至该盘中。所用二次抗体是在含有
1％牛奶及0.025％TweenTM 20的PBS中1/5000稀释的山羊抗小鼠 IgG(Jackson
ImmunoResearch Laboratories Inc.,West Grove,PA)。在 37℃下培育1小时随后用PBS
TweenTM 20洗涤3次且最后用PBS洗涤一次之后，根据制造商的推荐，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)试剂(KPL Inc.,Gaithersburg,MD)检测过氧化酶活性。
[0269] 统计分析.抗体效价及光学密度的统计分析是使用GraphPad PrismTM v6.05进行。
[0270] 实施例11：针对包括由序列SACOL0442及SACOL0720编码的表位的肽的融合物的免疫反应-疫苗#4
[0271] 使用由SACOL0442及SACOL0720编码的肽表位的融合物对小鼠接种疫苗(n＝4)。肽融合物的序列是KDGGKYTLESHKELQ EAAAKEAAAKKDINKIYFMTDVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:3)
(疫苗#4)，其中接头呈斜体且不同表位是以粗体字符标识。表位是由 SACOL0442编码的
KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)、由 SACOL0720编码的KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO:23)及
亦由 SACOL0720编码的DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24)。在ELISA分析中，自动物收集的血
清中的IgG抗体能够结合包含来自 SACOL0442(亦即KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1))及/
或 SACOL0720(亦即，QFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:21)； KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO:23)、DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24))的B细胞表位的氨基酸片段且抗体效价为1/6400或更高。
用于免疫接种的肽的融合物及在ELISA分析中用作抗体靶的氨基酸片段或多肽显示于下表
III中。在该表中，表位是呈粗体且接头序列是呈斜体。
(疫苗#4)，其中接头呈斜体且不同表位是以粗体字符标识。表位是由 SACOL0442编码的
KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)、由 SACOL0720编码的KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO:23)及
亦由 SACOL0720编码的DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24)。在ELISA分析中，自动物收集的血
清中的IgG抗体能够结合包含来自 SACOL0442(亦即KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1))及/
或 SACOL0720(亦即，QFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:21)； KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO:23)、DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24))的B细胞表位的氨基酸片段且抗体效价为1/6400或更高。
用于免疫接种的肽的融合物及在ELISA分析中用作抗体靶的氨基酸片段或多肽显示于下表
III中。在该表中，表位是呈粗体且接头序列是呈斜体。
[0272] 表III-多肽疫苗及抗体反应靶
[0273] 用于疫苗接种的肽的融合物
[0274]
[0275]
[0276] 在ELISA分析中，由来自疫苗接种以上融合抗原的小鼠的IgG结合以上显示的所有抗体靶。
[0277] 由此证实，可以使用由SACOL0442及SACOL0720编码的肽表位的融合物免疫接种哺乳动物并引起免疫反应。获得的免疫反应包括产生识别SACOL0442或SACOL0720、由
SACOL0442或SACOL0720编码的氨基酸片段或变体的抗体。
SACOL0442或SACOL0720编码的氨基酸片段或变体的抗体。
[0278] 实施例12：在免疫接种中用作抗原的多个表位的融合物显著增强针对单一表位的免疫反应-疫苗#4
[0279] 使用由SACOL0442及SACOL0720编码的肽表位的融合物对小鼠接种疫苗(n＝4)。肽融合物的序列是KDGGKYTLESHK ELQEAAAKEAAAKKDINKIYFMTDVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:
3)，其中接头呈斜体且不同表位以粗体字符标识。表位是由 SACOL0442编码的
KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)、由 SACOL0720编码的KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO:23)及
亦由 SACOL0720编码的DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24)。用由 SACOL0442编码的单一肽表
位KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO: 1)对另一组小鼠(n＝4)免疫接种。
3)，其中接头呈斜体且不同表位以粗体字符标识。表位是由 SACOL0442编码的
KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)、由 SACOL0720编码的KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO:23)及
亦由 SACOL0720编码的DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24)。用由 SACOL0442编码的单一肽表
位KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO: 1)对另一组小鼠(n＝4)免疫接种。
[0280] 自动物收集血清并测试针对由SACOL0442编码的氨基酸片段 (GEHLPKGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTAD)(SEQ ID NO:2)的IgG抗体的存在，该氨基酸片段含有肽表位 KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)。
[0281] 如图7上所示，相较于当仅使用肽表位KDGGKYTLESHK ELQ(SEQ ID NO:1)作为抗原进行免疫接种时获得的抗体含量，用三个肽表位(一个由SACOL0442编码及两个由
SACOL0720编码)的融合物免疫接种显著增加针对由SACOL0442编码的氨基酸片段 (GEHLP
KGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTAD)(SEQ ID NO:2)的抗体产生，该氨基酸片段含有
肽表位KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)。
SACOL0720编码)的融合物免疫接种显著增加针对由SACOL0442编码的氨基酸片段 (GEHLP
KGNIVINTKDGGKYTLESHKELQKDRENVKINTAD)(SEQ ID NO:2)的抗体产生，该氨基酸片段含有
肽表位KDGGKYTLESHKELQ(SEQ ID NO:1)。
[0282] 实施例13：针对SACOL0720变体编码的50个氨基酸的多肽片段的免疫反应-疫苗#5
[0283] 用由序列SACOL0720编码的含有B细胞表位(粗体字符)，更具体言的，含有表位KDINKIYFMTDVDL(SEQ ID NO:23)、 DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24)及QFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:21)的50个氨基酸的肽片段(KDINKIYFMTDVDLGGP TFVLNDKDYERKYKKHIVSQFGFDLKHK
KDALA(SEQ ID NO: 27))(疫苗#5)对一组小鼠(n＝3)进行疫苗接种。KDINKIYFMTDVDL GGP
TFVLNDKDYERKYKKHIVSQFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:27)的总体序列与SACOL0720的天然序
列在连接表位 DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24)与QFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:21)的区域
中有四个氨基酸的差异。因此，可以认为疫苗#5是 SACOL0720的变体片段或藉由接头ERKYK(SEQ ID NO:61)隔开的来自SACOL0720的表位的融合物。
KDALA(SEQ ID NO: 27))(疫苗#5)对一组小鼠(n＝3)进行疫苗接种。KDINKIYFMTDVDL GGP
TFVLNDKDYERKYKKHIVSQFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:27)的总体序列与SACOL0720的天然序
列在连接表位 DVDLGGPTFVLND(SEQ ID NO:24)与QFGFDLKHKKDALA(SEQ ID NO:21)的区域
中有四个氨基酸的差异。因此，可以认为疫苗#5是 SACOL0720的变体片段或藉由接头ERKYK(SEQ ID NO:61)隔开的来自SACOL0720的表位的融合物。
[0284] 测试血清中针对由SACOL0720(SEQ ID NO:25)(亦即，图21D中第 II项显示的聚组氨酸形式)编码的天然蛋白质的片段的IgG抗体的存在。在ELISA分析中，用对应于氨基酸的变异序列(或融合物SACOL0720- 720)的肽片段疫苗接种的小鼠均产生识别原始氨基酸序
列中的表位的抗体，且效价为1/6400或更高。
列中的表位的抗体，且效价为1/6400或更高。
[0285] 由此证实，包含由序列SACOL0720编码的表位的氨基酸片段可以在哺乳动物中引起免疫反应。此亦进一步证实，天然序列变体能够刺激针对含有B细胞表位的原始片段序列的免疫系统。
[0286] 实施例14：针对融合物组合(肽融合物0442-0720及多肽融合物0029- 1867)的免疫反应-疫苗#6
[0287] 将由SACOL0442及SACOL0720编码的肽表位的融合物(参见图21I 中第VII项的序列-融合物)与含有SACOL0029及SACOL1867序列的多肽融合物(参见图21I中第VII项融合物
的序列)组合并用于对小鼠进行疫苗接种(疫苗#6)。
的序列)组合并用于对小鼠进行疫苗接种(疫苗#6)。
[0288] 为制备免疫接种剂量，将肽融合物0442-0720及多肽融合物1867- 0029混合并悬浮于含有20％ -D水包油乳液佐剂的PBS 中，分别获得每剂100μg及5μg
最终剂量的肽融合物(0442-0720)及多肽融合物(0029-1867)。藉由在颈部中三次皮下注射
对CD-1雌性小鼠(n＝3) 进行免疫接种。前两次注射是间隔一周进行且第三次注射是在第
二次注射之后3周进行。在整个实验期间未观察到不良副作用。在即将第一次初始注射之前(免疫前血清)及增强免疫接种之后十四天(免疫血清)取得血液样品。使血液等分试样在室
温下凝结，保持一小时，并且接着在 4℃下以10,000g离心10分钟。收集血清并保持在-20
℃，以待后续分析。
最终剂量的肽融合物(0442-0720)及多肽融合物(0029-1867)。藉由在颈部中三次皮下注射
对CD-1雌性小鼠(n＝3) 进行免疫接种。前两次注射是间隔一周进行且第三次注射是在第
二次注射之后3周进行。在整个实验期间未观察到不良副作用。在即将第一次初始注射之前(免疫前血清)及增强免疫接种之后十四天(免疫血清)取得血液样品。使血液等分试样在室
温下凝结，保持一小时，并且接着在 4℃下以10,000g离心10分钟。收集血清并保持在-20
℃，以待后续分析。
[0289] 在ELISA分析中，自动物收集的血清中的IgG抗体能够结合包含来自SACOL0442或SACOL0720的表位的氨基酸片段或多肽SACOL0029 或SACOL1867，且抗体效价为1/6400或更
高。用于免疫接种的肽及多肽的融合物以及在ELISA分析中用作抗体靶的多肽或氨基酸片
段显示于下表IV中。
高。用于免疫接种的肽及多肽的融合物以及在ELISA分析中用作抗体靶的多肽或氨基酸片
段显示于下表IV中。
[0290] 表IV-混合多肽融合物疫苗及抗体反应靶
[0291] 使用肽0442-0720的融合物与多肽融合物0029-1867的混合物进行疫苗接种(疫苗 #6)
[0292] 表位是呈粗体且接头序列是呈斜体
[0293]
[0294] 由此证实，可以使用融合物组合(例如肽融合物0442-0720与多肽融合物0029-1867的混合物)对哺乳动物免疫接种并引起免疫反应。获得的免疫反应包括产生识别由
SACOL0442或SACOL0720或SACOL0029或 SACOL1867编码的氨基酸序列的抗体。
SACOL0442或SACOL0720或SACOL0029或 SACOL1867编码的氨基酸序列的抗体。
[0295] 实施例15：有关减毒活突变株的材料及方法
[0296] 细菌菌株及生长条件.实施例15至25中使用的菌株列于表V中。金黄色葡萄球菌ATCC 29213及其同基因突变株Δ720如先前所描述(Allard 等人,2013)。除非另外规定，否则金黄色葡萄球菌菌株是在胰酶大豆培养液(TSB)及琼脂(TSA)(BD,ON,Canada)中生长，且
大肠杆菌DH5α是在LB及LBA培养基(BD)中生长。必要时，将安比西林(ampicillin) (100μg/ml)(Sigma,Oakville,Ontario,Canada)、氯霉素 (chloramphenicol)(20μg/ml)(ICN
Biomedicals,Irvine,CA)及红霉素 (erythromycin)(10μg/ml)(Sigma)添加至琼脂盘中。
对于免疫测试，选择对应于在加拿大奶牛群及世界其他地方所发现的主要金黄色葡萄球菌 spa类型中的一部分的四种不同的牛乳腺炎分离株(Veh等人,2015； Mitra等人,2013)。菌
株SHY97-3906(spa t529)是自在泌乳期间发生的临床牛乳腺炎病例分离，且CLJ08-3(spa
t359)最初是在干奶期自患有持久乳腺炎的母牛分离(Allard等人,2013)。菌株Sa3151(spa t13401)及 Sa3181(spa t267)是自加拿大牛乳腺炎及牛奶质量研究网(Canadian Bovine
Mastitis and Milk Quality Research Network，CBMMQRN)乳腺炎病原体培养物保藏中心
(Mastitis Pathogen Culture Collection)(Universitéde Montréal,Facultéde mé
decine vétérinaire,St- Hyacinthe,QC,Canada)获得，且自亚临床乳房内感染病例分离。
大肠杆菌DH5α是在LB及LBA培养基(BD)中生长。必要时，将安比西林(ampicillin) (100μg/ml)(Sigma,Oakville,Ontario,Canada)、氯霉素 (chloramphenicol)(20μg/ml)(ICN
Biomedicals,Irvine,CA)及红霉素 (erythromycin)(10μg/ml)(Sigma)添加至琼脂盘中。
对于免疫测试，选择对应于在加拿大奶牛群及世界其他地方所发现的主要金黄色葡萄球菌 spa类型中的一部分的四种不同的牛乳腺炎分离株(Veh等人,2015； Mitra等人,2013)。菌
株SHY97-3906(spa t529)是自在泌乳期间发生的临床牛乳腺炎病例分离，且CLJ08-3(spa
t359)最初是在干奶期自患有持久乳腺炎的母牛分离(Allard等人,2013)。菌株Sa3151(spa t13401)及 Sa3181(spa t267)是自加拿大牛乳腺炎及牛奶质量研究网(Canadian Bovine
Mastitis and Milk Quality Research Network，CBMMQRN)乳腺炎病原体培养物保藏中心
(Mastitis Pathogen Culture Collection)(Universitéde Montréal,Facultéde mé
decine vétérinaire,St- Hyacinthe,QC,Canada)获得，且自亚临床乳房内感染病例分离。
[0297] 表V-实施例15至25中使用的菌株及质粒
[0298]
[0299]
[0300] 细胞培养条件.使用确定的牛乳房上皮细胞(BMEC)株MAC- T(Huynh等人,1991)作为感染的细胞培养模型。在含有10％热灭活胎牛血清(FBS)且补充有5μg/ml胰岛素(Roche Diagnostics Inc.,Laval, Canada)及1μg/ml羟皮质酮(hydrocortisone)(Sigma)的达尔
伯克改良型伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)中常规地培养并
维持MAC-T细胞，且在37℃及5％CO2下于含湿气培育箱中培育。细胞培养试剂是购自Wisent(St-Bruno,QC,Canada)。
伯克改良型伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)中常规地培养并
维持MAC-T细胞，且在37℃及5％CO2下于含湿气培育箱中培育。细胞培养试剂是购自Wisent(St-Bruno,QC,Canada)。
[0301] DNA操作.遵循制造商推荐的试剂盒进行基因组DNA分离 (Sigma)、质粒DNA分离(Qiagen,ON,Canada)、自琼脂糖凝胶提取 DNA片段(Qiagen)以及PCR产物及消化的DNA片段
的纯化(Qiagen)。在分离基因组及质粒DNA时，再使用200μg/ml溶葡球菌酶(Sigma)处理1 小时以实现金黄色葡萄球菌细胞的有效溶解。引子( Integrated DNA
Technologies；Coraville,Iowa,USA)经设计以在扩增产物的上游及下游添加限制性位点。
对于常规PCR，使用Taq DNA聚合酶(NEB, Pickering,ON,Canada)进行PCR，或对于选殖，使用Q5高保真度DNA 聚合酶(NEB)，且循环时间及温度针对各引物对进行优化。使用大肠杆菌DH5α(Invitrogen,Burlington,ON,Canada)、限制酶(NEB)及T4 DNA连接酶(NEB)产生质粒
构建体。在电穿孔放入金黄色葡萄球菌 RN4220中(Kreiswirth等人,1983)及最终宿主菌株
中之前，藉由限制性消化模式及DNA测序验证质粒构建体。实施例15至25中使用的质粒列于上表V中。
的纯化(Qiagen)。在分离基因组及质粒DNA时，再使用200μg/ml溶葡球菌酶(Sigma)处理1 小时以实现金黄色葡萄球菌细胞的有效溶解。引子( Integrated DNA
Technologies；Coraville,Iowa,USA)经设计以在扩增产物的上游及下游添加限制性位点。
对于常规PCR，使用Taq DNA聚合酶(NEB, Pickering,ON,Canada)进行PCR，或对于选殖，使用Q5高保真度DNA 聚合酶(NEB)，且循环时间及温度针对各引物对进行优化。使用大肠杆菌DH5α(Invitrogen,Burlington,ON,Canada)、限制酶(NEB)及T4 DNA连接酶(NEB)产生质粒
构建体。在电穿孔放入金黄色葡萄球菌 RN4220中(Kreiswirth等人,1983)及最终宿主菌株
中之前，藉由限制性消化模式及DNA测序验证质粒构建体。实施例15至25中使用的质粒列于上表V中。
[0302] 产生减毒活金黄色葡萄球菌菌株Δ720及ΔhemB.构筑ATCC 29213 菌株的同基因hemB突变株，其中hemB基因缺失且藉由同源重组插入 emrA卡匣替代。使用TargeTronTM基因敲除系统(Gene Knockout System)(利用TargeTronTM载体pNL9164(Sigma-Aldrich Canada Ltd.)(Chen等人,2007)破坏细菌基因，藉由在金黄色葡萄球菌 ATCC29213中的核苷酸803
与804的间插入第II组内含子(如先前所描述 (Allard等人,2013)，片段大小为约2Kb)来产
生针对基因 SACOL0720(Δ720)的金黄色葡萄球菌ATCC 29213突变株。遵循制造商的方案
及推荐。
与804的间插入第II组内含子(如先前所描述 (Allard等人,2013)，片段大小为约2Kb)来产
生针对基因 SACOL0720(Δ720)的金黄色葡萄球菌ATCC 29213突变株。遵循制造商的方案
及推荐。
[0303] 产生ΔhemBΔ720.为了在基因hemB中实现第二突变以便在Δ720突变基因背景下获得SCV表型，使用另一策略：在先前所描述的策略 (Mitchell等人,2008)中，稍加修改，使用温度敏感性pBT2- hemB:emrA(pBT-E:hemB)。简言之，藉由在温度敏感性穿梭载体pBT2
的XbaI与SalI位点的间插入ermA卡匣来构筑pBT-E质粒(Brückner, 1997)。自金黄色葡萄
球菌ATCC 29213扩增基因hemB(SACOL1715)DNA片段的侧接区且选殖于质粒pBT-E中的ermA
卡匣的两侧上。接着将质粒转移至金黄色葡萄球菌RN4220(res-)中进行繁殖。在用溶葡球
菌酶(200μg/ml，在室温下保持1小时)细菌溶解之后，分离质粒DNA并藉由电穿孔而用于转型ATCC 29213及Δ720。对于质粒整合及突变株产生，先使细菌在30℃下在10μg/ml红霉素及1μg/ml氯化血红素补充物(Sigma-Aldrich,ON,Canada)存在下生长隔夜。接着以 1:1000稀释细菌并使其在42℃下在2.5μg/ml红霉素及1μg/ml氯化血红素存在下生长隔夜。该步骤重复两次。最后，以1:1000稀释细菌并在无抗生素存在下，使其在42℃下生长隔夜。选择的带有失活的hemB基因的突变株对红霉素具有抗性且对氯霉素敏感，且带有可以藉由在琼脂
盘上补充5μg/ml氯化血红素补充的SCV表型(亦即，反突变成正常生长表型)。藉由PCR确定ATCC 29213(亦即ΔhemB)及Δ720(亦即ΔhemBΔ720) 菌株中hemB的缺失(参见图8A及B)。
的XbaI与SalI位点的间插入ermA卡匣来构筑pBT-E质粒(Brückner, 1997)。自金黄色葡萄
球菌ATCC 29213扩增基因hemB(SACOL1715)DNA片段的侧接区且选殖于质粒pBT-E中的ermA
卡匣的两侧上。接着将质粒转移至金黄色葡萄球菌RN4220(res-)中进行繁殖。在用溶葡球
菌酶(200μg/ml，在室温下保持1小时)细菌溶解之后，分离质粒DNA并藉由电穿孔而用于转型ATCC 29213及Δ720。对于质粒整合及突变株产生，先使细菌在30℃下在10μg/ml红霉素及1μg/ml氯化血红素补充物(Sigma-Aldrich,ON,Canada)存在下生长隔夜。接着以 1:1000稀释细菌并使其在42℃下在2.5μg/ml红霉素及1μg/ml氯化血红素存在下生长隔夜。该步骤重复两次。最后，以1:1000稀释细菌并在无抗生素存在下，使其在42℃下生长隔夜。选择的带有失活的hemB基因的突变株对红霉素具有抗性且对氯霉素敏感，且带有可以藉由在琼脂
盘上补充5μg/ml氯化血红素补充的SCV表型(亦即，反突变成正常生长表型)。藉由PCR确定ATCC 29213(亦即ΔhemB)及Δ720(亦即ΔhemBΔ720) 菌株中hemB的缺失(参见图8A及B)。
[0304] 在培养液培养中的氯化血红素补充.为了评价氯化血红素使金黄色葡萄球菌ΔhemB及双重突变株Δ720ΔhemB恢复最佳生长动力学的能力，在包含补充有各种浓度氯化
血红素(Sigma)的新鲜BHI的培养管中，将隔夜细菌培养物稀释至A600nm为约0.1。在35℃
(225rpm)下培育期间的不同时间点监测培养物的A600nm。
血红素(Sigma)的新鲜BHI的培养管中，将隔夜细菌培养物稀释至A600nm为约0.1。在35℃
(225rpm)下培育期间的不同时间点监测培养物的A600nm。
[0305] 金黄色葡萄球菌感染牛乳房上皮细胞(BMEC).使用MAC-T BMEC 表征ATCC 29213(WT)及其同基因突变株的细胞内感染性及存留性。在感染之前四十八小时，将1×105个/毫
升MAC-T细胞接种于经处理的24孔盘(Corning)上以获得30％汇合。在37℃及10％CO2下，使单细胞层生长至汇合。在感染之前六小时，用DMEM洗涤单细胞层并与侵袭性培养基
(invasion medium，IM)(不含抗生素且含有1％热灭活FBS的生长培养基)一起培育。将隔夜细菌培养物以1:20稀释于新鲜TSB中并使其生长至对数生长中期，接着用PBS洗涤并稀释于
IM中达到感染倍率10。藉由将单细胞层与细菌一起培育3小时来实现侵袭。接着用DMEM洗涤单细胞层并用含有20μg/ml溶葡球菌酶的IM培育以杀灭细胞外细菌。先前在细胞侵袭分析
中已验证溶葡球菌酶在杀灭细胞外正常及SCV金黄色葡萄球菌方面的用途(Moisan等人,
2006及Tuchscherr等人,2011)。处理30 分钟以测定感染3小时的CFU，或再处理12或24小
时。接着，在用达尔伯克氏磷酸盐缓冲生理食盐水(Dulbecco's Phosphate-Buffered
Saline， DPBS)充分洗涤之后，藉由胰蛋白酶消化剥离单细胞层并用0.05％ TritonX-100
溶解，且添加PBS以获得最终1×浓度。连续稀释溶解产物并将其涂铺于TSA上进行CFU测定。
升MAC-T细胞接种于经处理的24孔盘(Corning)上以获得30％汇合。在37℃及10％CO2下，使单细胞层生长至汇合。在感染之前六小时，用DMEM洗涤单细胞层并与侵袭性培养基
(invasion medium，IM)(不含抗生素且含有1％热灭活FBS的生长培养基)一起培育。将隔夜细菌培养物以1:20稀释于新鲜TSB中并使其生长至对数生长中期，接着用PBS洗涤并稀释于
IM中达到感染倍率10。藉由将单细胞层与细菌一起培育3小时来实现侵袭。接着用DMEM洗涤单细胞层并用含有20μg/ml溶葡球菌酶的IM培育以杀灭细胞外细菌。先前在细胞侵袭分析
中已验证溶葡球菌酶在杀灭细胞外正常及SCV金黄色葡萄球菌方面的用途(Moisan等人,
2006及Tuchscherr等人,2011)。处理30 分钟以测定感染3小时的CFU，或再处理12或24小
时。接着，在用达尔伯克氏磷酸盐缓冲生理食盐水(Dulbecco's Phosphate-Buffered
Saline， DPBS)充分洗涤之后，藉由胰蛋白酶消化剥离单细胞层并用0.05％ TritonX-100
溶解，且添加PBS以获得最终1×浓度。连续稀释溶解产物并将其涂铺于TSA上进行CFU测定。
[0306] BMEC活力及代谢活性分析.为了测定MAC-T细胞上由金黄色葡萄球菌ATCC 29213(WT)及其同基因突变株造成的细胞毒性损伤，进行 MTT细胞代谢活性分析，该分析量测活
细胞中3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]- 2,5二苯基四唑鎓溴化物(MTT)还原成不溶性甲 产物
的情况。该分析遵循Kubica等人(Kubica等人,2008)的方法且稍加修改。简言之，如存留性分析中所描述实现细胞的金黄色葡萄球菌感染，但在12小时或24小时之后不溶解，而是在
37℃下，用含100μl MTT试剂(5mg/ml)(Sigma) 的DPBS培育细胞2小时。在此之后，添加具有
16％SDS及40％PMF的 pH 4.7酸性溶剂溶液以溶解细胞并溶解甲 晶体隔夜。在570nm波长
下，使用Epoch微量盘读取器(Biotek Instruments Inc.)读取样品。所有分析均一式三份
进行，且在每个盘中均包括含未感染细胞(高活力对照) 或溶解的WT感染的细胞(细菌背景
对照；在添加MTT之前，用0.05％ tritonX-100处理10分钟)的对照孔。使用下式计算代谢活性水平：
细胞中3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]- 2,5二苯基四唑鎓溴化物(MTT)还原成不溶性甲 产物
的情况。该分析遵循Kubica等人(Kubica等人,2008)的方法且稍加修改。简言之，如存留性分析中所描述实现细胞的金黄色葡萄球菌感染，但在12小时或24小时之后不溶解，而是在
37℃下，用含100μl MTT试剂(5mg/ml)(Sigma) 的DPBS培育细胞2小时。在此之后，添加具有
16％SDS及40％PMF的 pH 4.7酸性溶剂溶液以溶解细胞并溶解甲 晶体隔夜。在570nm波长
下，使用Epoch微量盘读取器(Biotek Instruments Inc.)读取样品。所有分析均一式三份
进行，且在每个盘中均包括含未感染细胞(高活力对照) 或溶解的WT感染的细胞(细菌背景
对照；在添加MTT之前，用0.05％ tritonX-100处理10分钟)的对照孔。使用下式计算代谢活性水平：
[0307] (样品吸光度-背景对照)/高对照)×100.
[0308] 小鼠乳腺炎模型中的毒力.感染的小鼠乳腺炎模型是基于先前的描述(Brouillette,2005；Brouillette,2004)。用小鼠进行的所有实验均得到伦理学委员会有
关舍布鲁克大学科学是(Facultédes sciences of theUniversitéde Sherbrooke)动物实
验的批准且根据加拿大动物护理委员会(Canadian Council on Animal Care)的指导原则
进行。简言之，在取出12至14天大的后代之后一小时，分别每用公斤体重87mg及13mg 的氯胺酮及甲苯噻嗪使哺乳期CD-1小鼠(Charles River Laboratories)麻醉并在双眼显微镜
下对乳腺接种。藉由在乳头近端的小切口暴露出乳管并使用32号钝针经乳头导管注射在无
内毒素的磷酸盐缓冲生理食盐水 (PBS，Sigma)中含有102CFU的100μl细菌悬浮液。对于每只动物，接种两个腺体(自头至尾，右侧第四个[R4]及左侧第四个[L4])。在指定时间时以无菌方式收集乳腺，称重并目测评价炎症。在PBS中进行机械组织均质化，连续稀释并涂铺于琼脂上测定CFU之后，评价细菌负荷。在第二实验中，保留均质化腺体进行蛋白质提取用于髓过氧化酶(MPO)活性酶分析。
关舍布鲁克大学科学是(Facultédes sciences of theUniversitéde Sherbrooke)动物实
验的批准且根据加拿大动物护理委员会(Canadian Council on Animal Care)的指导原则
进行。简言之，在取出12至14天大的后代之后一小时，分别每用公斤体重87mg及13mg 的氯胺酮及甲苯噻嗪使哺乳期CD-1小鼠(Charles River Laboratories)麻醉并在双眼显微镜
下对乳腺接种。藉由在乳头近端的小切口暴露出乳管并使用32号钝针经乳头导管注射在无
内毒素的磷酸盐缓冲生理食盐水 (PBS，Sigma)中含有102CFU的100μl细菌悬浮液。对于每只动物，接种两个腺体(自头至尾，右侧第四个[R4]及左侧第四个[L4])。在指定时间时以无菌方式收集乳腺，称重并目测评价炎症。在PBS中进行机械组织均质化，连续稀释并涂铺于琼脂上测定CFU之后，评价细菌负荷。在第二实验中，保留均质化腺体进行蛋白质提取用于髓过氧化酶(MPO)活性酶分析。
[0309] 乳腺蛋白质提取.利用先前所描述的优化方法(Pulli等人,2013)且稍加修改，自乳腺提取总蛋白质。在含有最终浓度50mM磷酸钾(pH 6.0) 及50mM溴化十六烷基三甲基铵
(CTAB)(Sigma)的缓冲液中将乳房组织均质化。接着超音处理样品，在液氮中冷冻-解冻，并在4℃下以2000g 离心15分钟。最后，藉由抽吸移除脂肪层，并保留上清液，以15000g 最终离心15分钟，以丢弃每个细胞残渣。将上清液分配成数等分并保持在-80℃，直至用于酶分析或如藉由双金鸡纳酸法(BCA)蛋白质分析试剂盒(Thermo-Scientific)所量测的蛋白质
浓度测定。
(CTAB)(Sigma)的缓冲液中将乳房组织均质化。接着超音处理样品，在液氮中冷冻-解冻，并在4℃下以2000g 离心15分钟。最后，藉由抽吸移除脂肪层，并保留上清液，以15000g 最终离心15分钟，以丢弃每个细胞残渣。将上清液分配成数等分并保持在-80℃，直至用于酶分析或如藉由双金鸡纳酸法(BCA)蛋白质分析试剂盒(Thermo-Scientific)所量测的蛋白质
浓度测定。
[0310] MPO活性分析.藉由改良用于微孔盘的邻二甲氧苯胺-H2O2方法 (Bradley,RD.及Rothstein,GPPC.,1982)定量MPO酶活性来量测乳房组织中的嗜中性球募集。在96孔微量盘
中，将10μl组织提取上清液与邻二甲氧苯胺盐酸盐(0.167mg/mL)(Sigma)及0.0005％H2O2
(Sigma)于50 mM CTAB磷酸盐缓冲液50mM(pH 6.0)中的溶液一起培育。在Epoch微量盘读取
器中，在460nm下，经5分钟的时间，间隔15秒动力学量测 MPO活性。MPO单位视为在25℃下每分钟降解1μmol H2O2的酶量，假设在460nm下邻二甲氧苯胺的吸收是数为11.3mM-1cm-1
(Zhang等人, 2004)。结果表示为每公克腺体的MPO单位数。
中，将10μl组织提取上清液与邻二甲氧苯胺盐酸盐(0.167mg/mL)(Sigma)及0.0005％H2O2
(Sigma)于50 mM CTAB磷酸盐缓冲液50mM(pH 6.0)中的溶液一起培育。在Epoch微量盘读取
器中，在460nm下，经5分钟的时间，间隔15秒动力学量测 MPO活性。MPO单位视为在25℃下每分钟降解1μmol H2O2的酶量，假设在460nm下邻二甲氧苯胺的吸收是数为11.3mM-1cm-1
(Zhang等人, 2004)。结果表示为每公克腺体的MPO单位数。
[0311] 用减毒活突变株Δ720ΔhemB免疫接种小鼠.在小鼠中评价以活毒疫苗形式投与的减毒菌株Δ720ΔhemB的免疫原性特性。在初步研究中，小鼠对肌肉内及皮下(SC)注射减毒菌株具有良好耐受性。选择106、107及108CFU剂量及SC途径用于后续实验。对于制备细菌接种物，在冰冷的PBS中洗涤预先在BHIA盘上生长的金黄色葡萄球菌Δ720ΔhemB菌落两次
并将其悬浮于含有15％甘油的PBS中，接着等分并保持在-80℃待用。藉由在BHIA涂铺连续
6
稀释液来验证接种物制剂中活细菌计数。将 CD-1随机分成3组：第1组(n＝3)接受10CFU剂
量；第2组(n＝3)，107 CFU；及第3组(n＝3)，108CFU。在颈部以间隔两周方式两次皮下注射于PBS(100μl)中的细菌来对小鼠免疫接种。在即将初始注射之前(免疫前血清)及增强免疫接种之后十天(免疫血清)取得血液样品。使血液等分试样在室温下凝结，保持一小时，并且接着在4℃下以10,000g离心10分钟。收集血清并保持在-20℃以待后续分析。
并将其悬浮于含有15％甘油的PBS中，接着等分并保持在-80℃待用。藉由在BHIA涂铺连续
6
稀释液来验证接种物制剂中活细菌计数。将 CD-1随机分成3组：第1组(n＝3)接受10CFU剂
量；第2组(n＝3)，107 CFU；及第3组(n＝3)，108CFU。在颈部以间隔两周方式两次皮下注射于PBS(100μl)中的细菌来对小鼠免疫接种。在即将初始注射之前(免疫前血清)及增强免疫接种之后十天(免疫血清)取得血液样品。使血液等分试样在室温下凝结，保持一小时，并且接着在4℃下以10,000g离心10分钟。收集血清并保持在-20℃以待后续分析。
[0312] 制备金黄色葡萄球菌细胞提取物.如先前所描述且稍加修改(Asli等人,2016)，制备金黄色葡萄球菌全细胞提取物。简言之，将隔夜细菌培养物以1/1000稀释于新鲜BHI培养液中，并且接着在35℃(225rpm)下培育，直至A600nm达到约0.8。对细菌细胞离心并在冰冷的PBS中洗涤细胞集结粒两次并藉由添加每毫升集结粒5ml PBS使其悬浮。首先在37℃下用溶
葡球菌酶(Sigma)(100μg/ml集结粒)处理细菌悬浮液1小时，并且接着将每毫升集结粒3μg蛋白酶抑制剂混合液(Sigma)、8μgRNA酶 A(Sigma)及8μgDNA酶(Qiagen)添加至该悬浮液
中。在室温下30分钟之后，藉由3至4次通过SLMAmincoTM French加压细胞破碎仪(Pressure cell disrupter)以机械方式破坏细胞，并且接着在4℃下以12,000g离心 10分钟以移除未
破坏的细胞。收集上清液并如先前所描述，利用BCA 蛋白质分析试剂盒测定总蛋白质浓度。
葡球菌酶(Sigma)(100μg/ml集结粒)处理细菌悬浮液1小时，并且接着将每毫升集结粒3μg蛋白酶抑制剂混合液(Sigma)、8μgRNA酶 A(Sigma)及8μgDNA酶(Qiagen)添加至该悬浮液
中。在室温下30分钟之后，藉由3至4次通过SLMAmincoTM French加压细胞破碎仪(Pressure cell disrupter)以机械方式破坏细胞，并且接着在4℃下以12,000g离心 10分钟以移除未
破坏的细胞。收集上清液并如先前所描述，利用BCA 蛋白质分析试剂盒测定总蛋白质浓度。
[0313] 藉由ELISA检测小鼠总IgG.检测针对Δ720ΔhemB疫苗接种菌株及各牛IMI分离株的血清总IgG以展示并量测由小鼠免疫接种产生的全身体液反应。对于靶抗原，用100μl各完整金黄色葡萄球菌细胞提取物(10 μg/ml于碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中稀释，Sigma)涂布TM
NuncMaxiSorp 96孔盘(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rochester,NY)，并在室温下培
育隔夜。接着，在37℃下用含有5％脱脂奶粉的PBS使这些盘饱和，保持1 小时，随后藉由添加5％猪血清以防止非特异性金黄色葡萄球菌蛋白质 A相互作用进行第二个阻断步骤。将
一百微升于稀释缓冲液(含2％牛奶、5％猪血清及0.025％TweenTM 20的PBS)中的血清的两
TM
倍连续稀释液装载至这些盘中并在37℃下培育1小时。接着用含有0.05％ Tween 20的PBS
洗涤盘三次，且装载在稀释缓冲液中以1/5000稀释的 100μl辣根过氧化酶(HRP)偶联山羊
抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.,West Grove,PA)。在37℃下培
育1 小时随后洗涤3次之后，根据制造商的推荐，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺 (TMB)试剂
(KPL Inc.,Gaithersburg,MD)检测过氧化酶活性。
NuncMaxiSorp 96孔盘(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rochester,NY)，并在室温下培
育隔夜。接着，在37℃下用含有5％脱脂奶粉的PBS使这些盘饱和，保持1 小时，随后藉由添加5％猪血清以防止非特异性金黄色葡萄球菌蛋白质 A相互作用进行第二个阻断步骤。将
一百微升于稀释缓冲液(含2％牛奶、5％猪血清及0.025％TweenTM 20的PBS)中的血清的两
TM
倍连续稀释液装载至这些盘中并在37℃下培育1小时。接着用含有0.05％ Tween 20的PBS
洗涤盘三次，且装载在稀释缓冲液中以1/5000稀释的 100μl辣根过氧化酶(HRP)偶联山羊
抗小鼠IgG(Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.,West Grove,PA)。在37℃下培
育1 小时随后洗涤3次之后，根据制造商的推荐，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺 (TMB)试剂
(KPL Inc.,Gaithersburg,MD)检测过氧化酶活性。
[0314] 统计分析.用GraphPadPrismTM软件(6.02版)进行统计分析。在用于统计分析之前，将细胞内细菌CFU及细菌CFU/g腺体(小鼠中的IMI)转换成以10为底的对数值。用于分析各实验的统计检定及显著性在图例中说明。
[0315] 实施例16：构筑金黄色葡萄球菌ATCC 29213Δ720、ΔhemB及Δ720ΔhemB菌株
[0316] 仿真天然感染的减毒活生物体以一种有效的方式刺激免疫系统，引起广泛且稳定的免疫反应，由此产生血清及黏膜抗体，以及协同作用以防止疾病的效应及记忆T细胞
(Detmer,2006；Kollaritsch,2000； Pasetti,2011)。
(Detmer,2006；Kollaritsch,2000； Pasetti,2011)。
[0317] 在母牛实验性IMI感染中，经显示基因SACOL0720的突变可改变金黄色葡萄球菌的毒力(Allard等人,2013)。
[0318] 基于金黄色葡萄球菌SCV的表型特征，制备其他减毒活菌株用于疫苗目的。SCV一般不产生侵袭性感染(亦即，额外减毒)且可以内化于宿主细胞中并因此除体液免疫反应
外，还将刺激细胞介导的免疫反应。
外，还将刺激细胞介导的免疫反应。
[0319] 先经由hemB基因缺失(ΔhemB)产生稳定金黄色葡萄球菌SCV(参见实施例15，产生减毒活金黄色葡萄球菌菌株Δ720及ΔhemB)。接着藉由使基因SACOL0720失活(Δ720)达成
该SCV的进一步减毒(参见实施例 15，产生ΔhemBΔ720)。
该SCV的进一步减毒(参见实施例 15，产生ΔhemBΔ720)。
[0320] 在感染MAC-T牛乳房上皮细胞之后，相较于分别用ΔhemB及Δ720 所观察到的情形，双重突变株(Δ720ΔhemB)明显地显示较少的内化及细胞破坏。
[0321] 实施例17：金黄色葡萄球菌ΔhemBΔ720菌株在MAC-T细胞中减毒
[0322] 接着，在细胞内存留分析中使用MAC-T细胞比较ATCC 29213(WT)、Δ720、ΔhemB及ΔhemBΔ720菌株的感染性。藉由将该三个突变菌株与其同基因WT亲株相比较，观察基因hemB及SACOL0720 突变的不同影响。基于活细胞内细菌的回收率(CFU)，将细菌与细胞单层培育3小时的较短时间，随后添加溶葡球菌酶除去细胞外细菌WT及ΔhemB菌株在MAC-T细胞
中的较高内化程度(图9A及B)。然而，相较于其亲本WT菌株，单Δ720突变株显示明显较低(P≤0.01)的内化(图9A)。当比较双重突变株ΔhemBΔ720与ΔhemB时，在Δ720中见到甚至更明显的内化减少，且在该3小时内化分析中接种物回收率减小10倍 (P≤0.001，图9B)。如在侵袭(PI)后12及24小时相较于关于ΔhemB所观察的结果CFU/ml有1-log10减小所说明，对于双重突变株ΔhemBΔ720(图9C)，该内化细菌负载的初始降低在该两个时间点仍显而易见
(P≤0.001)。单Δ720突变株与WT菌株的间的初始细胞内细菌负载量差异 (图9A)随着培育
时间延长而逐渐消失(图9C)，因为该两种菌株无法良好地存留于MAC-T细胞中(图10)。相
反，在24小时PI时，所回收的单ΔhemB菌株的细胞内CFU显著高于所回收的该三种其他菌株的细胞内 CFU(图9C，针对全部，P≤0.001)。总体而言且正如关于SCV表型所预期的，相较于任何其他菌株，ΔhemB菌株随时间显示较高的细胞内存留量(图10)。这些结果表明，Δ720突变主要降低MAC-T细胞中的内化过程。结果进一步证实，ΔhemBΔ720突变株仍能够内化
且存留于BMEC 中，但程度要比用单ΔhemB突变株所观察到的程度低得多。
中的较高内化程度(图9A及B)。然而，相较于其亲本WT菌株，单Δ720突变株显示明显较低(P≤0.01)的内化(图9A)。当比较双重突变株ΔhemBΔ720与ΔhemB时，在Δ720中见到甚至更明显的内化减少，且在该3小时内化分析中接种物回收率减小10倍 (P≤0.001，图9B)。如在侵袭(PI)后12及24小时相较于关于ΔhemB所观察的结果CFU/ml有1-log10减小所说明，对于双重突变株ΔhemBΔ720(图9C)，该内化细菌负载的初始降低在该两个时间点仍显而易见
(P≤0.001)。单Δ720突变株与WT菌株的间的初始细胞内细菌负载量差异 (图9A)随着培育
时间延长而逐渐消失(图9C)，因为该两种菌株无法良好地存留于MAC-T细胞中(图10)。相
反，在24小时PI时，所回收的单ΔhemB菌株的细胞内CFU显著高于所回收的该三种其他菌株的细胞内 CFU(图9C，针对全部，P≤0.001)。总体而言且正如关于SCV表型所预期的，相较于任何其他菌株，ΔhemB菌株随时间显示较高的细胞内存留量(图10)。这些结果表明，Δ720突变主要降低MAC-T细胞中的内化过程。结果进一步证实，ΔhemBΔ720突变株仍能够内化
且存留于BMEC 中，但程度要比用单ΔhemB突变株所观察到的程度低得多。
[0323] ΔhemBΔ720及ΔhemB SCV引起较少BMEC破坏。如以上所报导，如由ΔhemB及ΔhemBΔ720SCV菌株在12及24小时PI时具有持久活力所说明，这些菌株在MAC-T细胞中随时
间显示比WT及Δ720菌株高的存留量(图9C及10)。对于双重突变株及单hemB突变株，在溶葡球菌酶添加之后0至24小时，自细胞回收的接种物的百分含量保持大致相同，其中在12小时略有增加，指示细胞内生长(图10)。在该感染时间后，两种菌株开始以较慢速率减少。然而，在WT及Δ720菌株的细胞内CFU的明显降低的同时，目测观察到细胞单层随时间而损伤的增
加，与利用具有 SCV表型的菌株所观察到的情形形成比较。
间显示比WT及Δ720菌株高的存留量(图9C及10)。对于双重突变株及单hemB突变株，在溶葡球菌酶添加之后0至24小时，自细胞回收的接种物的百分含量保持大致相同，其中在12小时略有增加，指示细胞内生长(图10)。在该感染时间后，两种菌株开始以较慢速率减少。然而，在WT及Δ720菌株的细胞内CFU的明显降低的同时，目测观察到细胞单层随时间而损伤的增
加，与利用具有 SCV表型的菌株所观察到的情形形成比较。
[0324] 在感染之后亦藉由该四种研究菌株中的每一种评价MAC-T细胞活力。藉由MTT方法(Kubica等人,2008)评价MAC-T细胞活力。结果显示，两种SCV菌株(ΔhemB及ΔhemBΔ720)
在该分析中引起明显不如WT 及Δ720菌株的MAC-T杀灭作用。当与ΔhemB相比较时，在12小时， WT菌株使细胞活力降低接近一半(图11A：WT：25.4％；ΔhemB： 48.4％)。该差异在24小时仍显而易见(图11B：分别为16.3％相对于 34.5％)，即使ΔhemB突变株的细菌负载量高
出10倍(图9C)。ΔhemB对 MAC-T细胞的破坏明显超过双重突变株Δ720ΔhemB，但仅在24小时存在显著差异(P≤0.01)。当直接与WT菌株相比较时，双重突变株Δ720ΔhemB在12小时
保持的上皮细胞活力高出2.3倍(图11A)且在24小时要高出2.7倍(图11B)(12小时与24小
时：P≤0.0001)。因此，两种SCV菌株随时间的细胞内存留量高于WT及Δ720菌株(图10)可能归于SCV对MAC-T细胞的毒性较低(图11)。综合而言，自BMEC感染分析得到的结果证实Δ
hemB及Δ720两种突变对于WT菌株减毒呈现相加效应。
在该分析中引起明显不如WT 及Δ720菌株的MAC-T杀灭作用。当与ΔhemB相比较时，在12小时， WT菌株使细胞活力降低接近一半(图11A：WT：25.4％；ΔhemB： 48.4％)。该差异在24小时仍显而易见(图11B：分别为16.3％相对于 34.5％)，即使ΔhemB突变株的细菌负载量高
出10倍(图9C)。ΔhemB对 MAC-T细胞的破坏明显超过双重突变株Δ720ΔhemB，但仅在24小时存在显著差异(P≤0.01)。当直接与WT菌株相比较时，双重突变株Δ720ΔhemB在12小时
保持的上皮细胞活力高出2.3倍(图11A)且在24小时要高出2.7倍(图11B)(12小时与24小
时：P≤0.0001)。因此，两种SCV菌株随时间的细胞内存留量高于WT及Δ720菌株(图10)可能归于SCV对MAC-T细胞的毒性较低(图11)。综合而言，自BMEC感染分析得到的结果证实Δ
hemB及Δ720两种突变对于WT菌株减毒呈现相加效应。
[0325] 实施例18：金黄色葡萄球菌ΔhemBΔ720菌株在小鼠IMI模型中减毒
[0326] 为了证明在活体内感染模型中ΔhemBΔ720减毒，在鼠类IMI模型中评价双重突变株的毒力且与WT菌株相比较(Brouillette及Malouin, 2005)。用于两种菌株，感染的指数
期主要在感染后前12小时内发生，而最大细菌负荷对于双重突变株是在24小时且对于WT菌
株是在48小时 (第2天[D2])达到(图12)。在24小时的时候，双重突变株显示平均CFU/g 腺
体相较于WT有1.9log10的减小(P≤0.05)。另外，在24小时之后，该突变株细菌负荷显示持续减小直至在第12天细菌完全清除(在图12上以星号显示)。相比的下，相较于该突变株，亲本WT菌株引起严重侵袭性感染，在第2天杀灭剩余9只小鼠中的3只且在第7天杀灭3只小鼠中
的2只 (图12；箭头)，随后可以收集这些组的腺体。在WT感染中存活的小鼠在第7天维持较高的活菌计数(9log10CFU/g腺体)，细菌负荷相较于双重突变株有近似5log10的差异。这些结果清楚地展示菌株ΔhemBΔ720在乳腺中倍增及存活的能力明显降低。因此，ΔhemBΔ
720双重突变株在小鼠乳房内感染(IMI)模型中明显减毒且自乳腺高效地清除。
期主要在感染后前12小时内发生，而最大细菌负荷对于双重突变株是在24小时且对于WT菌
株是在48小时 (第2天[D2])达到(图12)。在24小时的时候，双重突变株显示平均CFU/g 腺
体相较于WT有1.9log10的减小(P≤0.05)。另外，在24小时之后，该突变株细菌负荷显示持续减小直至在第12天细菌完全清除(在图12上以星号显示)。相比的下，相较于该突变株，亲本WT菌株引起严重侵袭性感染，在第2天杀灭剩余9只小鼠中的3只且在第7天杀灭3只小鼠中
的2只 (图12；箭头)，随后可以收集这些组的腺体。在WT感染中存活的小鼠在第7天维持较高的活菌计数(9log10CFU/g腺体)，细菌负荷相较于双重突变株有近似5log10的差异。这些结果清楚地展示菌株ΔhemBΔ720在乳腺中倍增及存活的能力明显降低。因此，ΔhemBΔ
720双重突变株在小鼠乳房内感染(IMI)模型中明显减毒且自乳腺高效地清除。
[0327] 减毒菌株ΔhemBΔ720看来理想地用于疫苗接种目的及细胞内抗原递送。实际上，ΔhemBΔ720较少且暂时性内化应有助于刺激细胞介导的免疫，该免疫是对于防御金黄色
葡萄球菌极为重要的免疫反应的组成部分(Fowler及Proctor,2014)。
葡萄球菌极为重要的免疫反应的组成部分(Fowler及Proctor,2014)。
[0328] 实施例19：在IMI之后针对Δ720ΔhemB及WT菌株的炎症反应
[0329] 为了监测小鼠对WT及突变菌株感染的炎症反应(免疫反应)，藉由腺体匀浆总蛋白质提取物的MPO酶活性评价腺体中的嗜中性球浸润。如先前所述，生物样品的MPO活性与嗜
中性球绝对数存在较强相关性 (Xia,1997)，且因此为适当标记物。在感染之后前几小时期间，双重突变株及WT感染的腺体中嗜中性球募集遵循类似型态(图13)，且在感染后12小时
至24小时，明显嗜中性球浸润呈指数加强，与细菌生长一致，尽管存在一定延迟。先前已显示与乳腺中细菌负载量有关的多形核细胞的绝对数目未必总是在相同时间达到峰值
(Brouillette,2005)。在6小时、12小时及24小时，在感染突变株与感染WT菌株的腺体的间未观察到MPO活性的显著差异(图13)。不过，该同等的明显嗜中性球浸润与在 24小时目测
观察到的炎症不相关，在24小时的时候，相较于双重突变株，WT感染引起经感染腺体的大面积发红(图14的照片)。相反地，相较于PBS对照组，感染突变株的腺体在宏观层面上目测无变化。目测炎症评估与嗜中性球浸润结果的间的不一致可以归于细菌负载量的差异 (图
9A-C)及WT菌株的细胞毒性活性(图11)，且可经由毒素及酶表达与该菌株的高侵袭性及传
播能力相关联。因此，这些结果指示，感染突变株的腺体中的嗜中性球募集与用WT菌株所见到的情形相当且此足以引起突变株负载量的后续降低及清除。
中性球绝对数存在较强相关性 (Xia,1997)，且因此为适当标记物。在感染之后前几小时期间，双重突变株及WT感染的腺体中嗜中性球募集遵循类似型态(图13)，且在感染后12小时
至24小时，明显嗜中性球浸润呈指数加强，与细菌生长一致，尽管存在一定延迟。先前已显示与乳腺中细菌负载量有关的多形核细胞的绝对数目未必总是在相同时间达到峰值
(Brouillette,2005)。在6小时、12小时及24小时，在感染突变株与感染WT菌株的腺体的间未观察到MPO活性的显著差异(图13)。不过，该同等的明显嗜中性球浸润与在 24小时目测
观察到的炎症不相关，在24小时的时候，相较于双重突变株，WT感染引起经感染腺体的大面积发红(图14的照片)。相反地，相较于PBS对照组，感染突变株的腺体在宏观层面上目测无变化。目测炎症评估与嗜中性球浸润结果的间的不一致可以归于细菌负载量的差异 (图
9A-C)及WT菌株的细胞毒性活性(图11)，且可经由毒素及酶表达与该菌株的高侵袭性及传
播能力相关联。因此，这些结果指示，感染突变株的腺体中的嗜中性球募集与用WT菌株所见到的情形相当且此足以引起突变株负载量的后续降低及清除。
[0330] 最后，为了证明菌株的安全性，及评估该炎症反应并非不可接受的反应原性菌株所致，监测在感染之后4天及12天感染Δ720ΔhemB的腺体的MPO活性。接着，将活性水平与用注射PBS的小鼠获得的水平相比较。如图15中所示，感染突变株的腺体中的明显存在的嗜中性球在感染之后4天仍大量存在，且活性范围为8至21个单位/公克腺体。此外，腺体退化(使哺乳期腺体恢复成接近孕前状态的形态的过程)通常与嗜中性球募集以允许在组织重
塑期间吞噬凋亡细胞有关(Stein,2007)。在此模型中感染后数天，如由小鼠腺体迅速收缩
所指示，这些腺体已经处于改良的正常状态。然而，感染突变株的腺体中的MPO含量在第4天与第12 天的间大幅降低(P≤0.01)。接着，认为MPO含量在第12天恢复到正常水平，显示与用注射PBS的小鼠所达到的含量无显著差异。感染Δ720ΔhemB的腺体的炎症反应随着细菌
清除而恢复正常水平(图15。
塑期间吞噬凋亡细胞有关(Stein,2007)。在此模型中感染后数天，如由小鼠腺体迅速收缩
所指示，这些腺体已经处于改良的正常状态。然而，感染突变株的腺体中的MPO含量在第4天与第12 天的间大幅降低(P≤0.01)。接着，认为MPO含量在第12天恢复到正常水平，显示与用注射PBS的小鼠所达到的含量无显著差异。感染Δ720ΔhemB的腺体的炎症反应随着细菌
清除而恢复正常水平(图15。
[0331] 实施例20：免疫接种Δ720GΔhemB产生针对若干金黄色葡萄球菌牛乳房内感染分离株的较强体液反应.
[0332] 为了证实免疫接种活Δ720ΔhemB实际上可以产生使其适合用作针对金黄色葡萄球菌乳房内感染的推定的活毒疫苗的较强免疫反应，用不同剂量的活毒疫苗对小鼠免疫接
种并分析结合至多种金黄色葡萄球菌牛分离株的全细胞提取物的血清总IgG。首先，在颈部中皮下投与106、 107及108CFU剂量，未在整个免疫接种时间段内引起不良作用，诸如小鼠行为改变或在免疫接种部位的炎症或坏死迹象。另外，使用递增量的活双重突变株ATCC
29213Δ720ΔhemB免疫接种使针对其自身抗原的全细胞提取物的全身IgG抗体的效价增加
(图15B)。免疫血清效价明显高于免疫前血清的效价，展示产生针对活毒疫苗中存在的金黄色葡萄球菌抗原的特异性抗体。最重要的是，使用递增量的Δ720ΔhemB免疫接种亦引起针对自牛乳腺炎分离的变种金黄色葡萄球菌菌株，包括在加拿大及世界其他地方发现的主要
spa类型菌株的抗体效价随的升高(图15C)。这些结果清楚地显示，免疫接种双重突变株可
以产生免疫反应，及(ii)菌株背景(ATCC 29213)与牛乳腺炎菌株共有足够的共同特征，使
得该抗体反应亦很大程度上识别主要spa类型的菌株。
种并分析结合至多种金黄色葡萄球菌牛分离株的全细胞提取物的血清总IgG。首先，在颈部中皮下投与106、 107及108CFU剂量，未在整个免疫接种时间段内引起不良作用，诸如小鼠行为改变或在免疫接种部位的炎症或坏死迹象。另外，使用递增量的活双重突变株ATCC
29213Δ720ΔhemB免疫接种使针对其自身抗原的全细胞提取物的全身IgG抗体的效价增加
(图15B)。免疫血清效价明显高于免疫前血清的效价，展示产生针对活毒疫苗中存在的金黄色葡萄球菌抗原的特异性抗体。最重要的是，使用递增量的Δ720ΔhemB免疫接种亦引起针对自牛乳腺炎分离的变种金黄色葡萄球菌菌株，包括在加拿大及世界其他地方发现的主要
spa类型菌株的抗体效价随的升高(图15C)。这些结果清楚地显示，免疫接种双重突变株可
以产生免疫反应，及(ii)菌株背景(ATCC 29213)与牛乳腺炎菌株共有足够的共同特征，使
得该抗体反应亦很大程度上识别主要spa类型的菌株。
[0333] 如根据所量测的针对完整细菌细胞提取物的总IgG效价较高判断，使用皮下注射存活Δ720ΔhemB免疫接种小鼠引起较强体液反应。另外，疫苗菌株Δ720ΔhemB与牛乳腺
炎菌株具有足够的共同特征，使得该抗体反应亦很大程度上识别来自多种常见乳腺炎相关
spa类型的菌株。
炎菌株具有足够的共同特征，使得该抗体反应亦很大程度上识别来自多种常见乳腺炎相关
spa类型的菌株。
[0334] 尽管此证实双重突变株背景(ATCC 29213)与牛乳腺炎菌株共有许多共同的特征，但若希望，则此类双重突变株可以在任何所希望的遗传背景下产生，特别是自牛乳腺炎分
离的任何菌株，诸如(但不限于)金黄色葡萄球菌菌株RF122。
离的任何菌株，诸如(但不限于)金黄色葡萄球菌菌株RF122。
[0335] 这些结果显示，具有某些残留细胞内能力的SCV菌株可以允许免疫细胞募集，但不产生严重感染。此类SCV菌株可以用作减毒活疫苗，充分地刺激免疫反应以对抗有细胞内能力的病原体。
[0336] 实施例21：材料及方法-SACOL0442、SACOL0720、SACOL0029 以及SACOL1867与SACOL0029的间的融合物+减毒活细菌(疫苗#7)
[0337] 制备抗原.如实施例6制备抗原一节中所描述来制备抗原，不过另外存在抗原SACOL0029。由GenScript,Inc.(Piscataway,NJ)对His标记的 SACOL0029的重组蛋白质进
行工程改造及制造。(参见图21A第I项， his标记的序列)。
行工程改造及制造。(参见图21A第I项， his标记的序列)。
[0338] 产生减毒活金黄色葡萄球菌菌株Δ720ΔhemB.如实施例15(产生ΔhemBΔ720)中所描述来产生减毒活金黄色葡萄球菌菌株。
[0339] 对小鼠免疫接种.在小鼠中评价由SACOL0442、SACOL0720、 SACOL0029基因以及SACOL0029及SACOL1867基因的融合物编码的重组金黄色葡萄球菌蛋白质与或不与减毒活
细菌菌株金黄色葡萄球菌Δ720ΔhemB组合的免疫原性特性。在小鼠颈部皮下注射及大腿
3 5 6 7 8 5
肌肉内注射的10、10 、10、10及10CFU剂量具有良好耐受性。选择10剂量及皮下途径用于
后续实验。
细菌菌株金黄色葡萄球菌Δ720ΔhemB组合的免疫原性特性。在小鼠颈部皮下注射及大腿
3 5 6 7 8 5
肌肉内注射的10、10 、10、10及10CFU剂量具有良好耐受性。选择10剂量及皮下途径用于
后续实验。
[0340] 对于制备细菌接种物，在冰冷的PBS中洗涤预先在BHIA盘上生长的金黄色葡萄球菌Δ720ΔhemB菌落两次并将其再悬浮于含有15％甘油的PBS中，接着等分并保持在-80℃
5
待用。为了获得对应于10CFU减毒细菌的最终小鼠免疫接种剂量，藉由将连续稀释液涂铺
于BHIA上来评价冷冻接种物细菌浓度，并且接着在免疫接种当天，在PBS中将其稀释至
105CFU/ml的最终浓度。
5
待用。为了获得对应于10CFU减毒细菌的最终小鼠免疫接种剂量，藉由将连续稀释液涂铺
于BHIA上来评价冷冻接种物细菌浓度，并且接着在免疫接种当天，在PBS中将其稀释至
105CFU/ml的最终浓度。
[0341] 对于制备蛋白质剂量，将SACOL0029、SACOL0442、 SACOL0720及SACOL0029-1867融合多肽混合并悬浮于PBS中，各自获得5μg最终剂量。将CD-1雌性小鼠随机分成3组：第1组(5只小鼠)接受混合蛋白质剂量(蛋白质混合物)；第2组(5只小鼠)接受减毒细菌 (Δ720ΔhemB)剂量(Δ720ΔhemB)；第3组(6只小鼠)接受混合蛋白质与减毒细菌的组合(组合)。在
颈部以间隔两周方式两次皮下注射对CD-1雌性小鼠进行免疫接种。如先前所描述，在PBS中稀释蛋白质及细菌菌株剂量并以100μl最终体积投与每组小鼠。在整个实验性免疫接种期
间未观察到不良副作用。在即将第一次初始注射之前(免疫前血清)及增强免疫接种之后十
天(免疫血清)取得血液样品。使血液等分试样在室温下凝结，保持一小时，在4℃下以10,
000g离心10分钟。收集血清并保持在- 20℃，以待后续分析。
颈部以间隔两周方式两次皮下注射对CD-1雌性小鼠进行免疫接种。如先前所描述，在PBS中稀释蛋白质及细菌菌株剂量并以100μl最终体积投与每组小鼠。在整个实验性免疫接种期
间未观察到不良副作用。在即将第一次初始注射之前(免疫前血清)及增强免疫接种之后十
天(免疫血清)取得血液样品。使血液等分试样在室温下凝结，保持一小时，在4℃下以10,
000g离心10分钟。收集血清并保持在- 20℃，以待后续分析。
[0342] 藉由ELISA检测总IgG、IgG1及IgG2.如先前所描述且稍加修改 (Ster等人,Vet.Immunol.Immunopathol.(2010),136:311-318)，检测针对先前用于免疫接种的各抗原
的血清总IgG、IgG1及IgG2。此外，亦检测针对葡萄球菌表面蛋白质ClfA的IgG以展示使用活菌株增强及平衡针对金黄色葡萄球菌的免疫反应的补充优势。用75μl各测试抗原(6.67 μg/mL在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中稀释，Sigma Aldrich,Oakville,ON) 涂布Nunc
TM
MaxiSorp 96孔盘(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rochester, NY)并在室温下培育隔
夜。接着在37℃下，用含有5％脱脂奶粉的PBS 使这些盘饱和，保持1小时。将一百微升在含有3％牛奶及0.025％ TweenTM 20的PBS中的血清的四倍连续稀释液装载至盘中并在37℃下
培育1小时。用含有0.05％TweenTM 20的PBS洗涤这些盘三次。接着将一百微升辣根过氧化酶TM
(HRP)偶联的二次抗体添加至该盘中。使用的二次抗体是在含有3％牛奶及0.025％Tween
20的PBS分别以1/5000稀释的山羊抗小鼠IgG、IgG2a及IgG1(Jackson ImmunoResearch
Laboratories Inc.,West Grove,PA)。在37℃下培育1小时随后洗涤3次之后，根据制造商
的推荐，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)试剂(KPL Inc.,Gaithersburg,MD)检测过氧化
酶活性。
的血清总IgG、IgG1及IgG2。此外，亦检测针对葡萄球菌表面蛋白质ClfA的IgG以展示使用活菌株增强及平衡针对金黄色葡萄球菌的免疫反应的补充优势。用75μl各测试抗原(6.67 μg/mL在碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液中稀释，Sigma Aldrich,Oakville,ON) 涂布Nunc
TM
MaxiSorp 96孔盘(Thermo Fisher Scientific Inc.,Rochester, NY)并在室温下培育隔
夜。接着在37℃下，用含有5％脱脂奶粉的PBS 使这些盘饱和，保持1小时。将一百微升在含有3％牛奶及0.025％ TweenTM 20的PBS中的血清的四倍连续稀释液装载至盘中并在37℃下
培育1小时。用含有0.05％TweenTM 20的PBS洗涤这些盘三次。接着将一百微升辣根过氧化酶TM
(HRP)偶联的二次抗体添加至该盘中。使用的二次抗体是在含有3％牛奶及0.025％Tween
20的PBS分别以1/5000稀释的山羊抗小鼠IgG、IgG2a及IgG1(Jackson ImmunoResearch
Laboratories Inc.,West Grove,PA)。在37℃下培育1小时随后洗涤3次之后，根据制造商
的推荐，用3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)试剂(KPL Inc.,Gaithersburg,MD)检测过氧化
酶活性。
[0343] 统计分析.抗体效价及相关性的统计分析是使用GraphPad PrismTM v6.05进行。
[0344] 实施例22：抗原融合物及与减毒活金黄色葡萄球菌菌株的组合在小鼠中诱导高抗体效价-疫苗#7
[0345] 如实施例21中所描述，制备抗原及减毒活金黄色葡萄球菌菌株Δ720ΔhemB。如实施例21中所描述，对小鼠免疫接种并检测IgG。
[0346] 图16中的结果显示，用SACOL0029-1867融合物免疫接种(当与其他抗原或与减毒活菌株共投与时)在小鼠中诱导较高特异性抗体反应。
[0347] 实施例23：减毒活金黄色葡萄球菌菌株明显改善针对一些特异性抗原的抗体免疫反应-疫苗#7
[0348] 如实施例21中所描述，制备抗原及减毒活金黄色葡萄球菌菌株Δ720ΔhemB。如实施例21中所描述，对小鼠免疫接种并检测IgG。
[0349] 图17中的结果显示，相较于自仅用蛋白质混合物免疫接种的小鼠获得的IgG抗体，用减毒活菌株Δ720ΔhemB免疫接种使针对 SACOL0029抗原的特异性IgG抗体的产生明显
增加。
增加。
[0350] 实施例24：减毒活金黄色葡萄球菌菌株明显诱导另外针对金黄色葡萄球菌表面蛋白质的抗体效价-疫苗#7
[0351] 如实施例21中所描述，制备抗原及减毒活金黄色葡萄球菌菌株Δ720ΔhemB。如实施例21中所描述，对小鼠免疫接种并检测IgG。
[0352] 图18中的结果显示，相较于用仅由SACOL0029、SACOL0442、 SACOL0720及SACOL0029-1867构成的蛋白质混合物所实现的抗体产生，用减毒活菌株Δ720ΔhemB免疫
接种(单独或当与多肽抗原共投与时) 使针对葡萄球菌表面蛋白质ClfA的特异性抗体的产
生显著增加。
接种(单独或当与多肽抗原共投与时) 使针对葡萄球菌表面蛋白质ClfA的特异性抗体的产
生显著增加。
[0353] 实施例25：减毒活金黄色葡萄球菌菌株明显平衡Th1Th2免疫反应- 疫苗#7
[0354] 如实施例21中所描述，制备抗原及减毒活金黄色葡萄球菌菌株Δ720ΔhemB。
[0355] 如先前所描述，在经疫苗接种小鼠的血清中检测针对SACOL0029- 1867融合蛋白的血清IgG2a及IgG1同型，并测定各小鼠的IgG2a比IgG1 效价比率。IgG2a同型与小鼠体内
的Th1免疫反应相关，而IgG1是Th2 反应的标记物。如实施例5中所描述，如根据母牛的牛奶中相应体细胞 (SCC)含量或细菌计数(CFU)判断(图4C)，在母牛中诱导产生IgG2及牛奶中
IgG2效价的程度与保护母牛免受金黄色葡萄球菌激发影响明显相关。
的Th1免疫反应相关，而IgG1是Th2 反应的标记物。如实施例5中所描述，如根据母牛的牛奶中相应体细胞 (SCC)含量或细菌计数(CFU)判断(图4C)，在母牛中诱导产生IgG2及牛奶中
IgG2效价的程度与保护母牛免受金黄色葡萄球菌激发影响明显相关。
[0356] 图19及20中所示的结果证实，在组合免疫接种疫苗(Δ720ΔhemB金黄色葡萄球菌与SACOL0029、SACOL0442、SACOL0720及 SACOL0029-1867一起投与)中包括减毒活菌株Δ
720ΔhemB诱导的针对 SACOL0029-1867融合物及SACOL0029蛋白质的IgG2a/IgG1抗体比率
明显高于用蛋白质混合物免疫接种(SACOL0029、SACOL0442、 SACOL0720及SACOL0029-
1867)所见到的比率，引起明显更平衡的 Th1/Th2反应。
720ΔhemB诱导的针对 SACOL0029-1867融合物及SACOL0029蛋白质的IgG2a/IgG1抗体比率
明显高于用蛋白质混合物免疫接种(SACOL0029、SACOL0442、 SACOL0720及SACOL0029-
1867)所见到的比率，引起明显更平衡的 Th1/Th2反应。
[0357] 以上实施例21至25显示，即使藉由免疫接种呈蛋白质混合物组合物形式的不同抗原(包括例如SACOL0029-1867融合物)获得较强抗体反应，对小鼠免疫接种这些抗原与减毒
活菌株的组合藉由诱导针对某些特定抗原(例如SACOL0029)的较高抗体效价、藉由产生针
对其他葡萄球菌蛋白质(例如ClfA)的抗体及藉由达到针对与活菌株共投与的抗原更平衡
的IgG2a/IgG1比率(较强Th1型反应的较佳标记物)，仍显著提高针对金黄色葡萄球菌的免
疫反应。
活菌株的组合藉由诱导针对某些特定抗原(例如SACOL0029)的较高抗体效价、藉由产生针
对其他葡萄球菌蛋白质(例如ClfA)的抗体及藉由达到针对与活菌株共投与的抗原更平衡
的IgG2a/IgG1比率(较强Th1型反应的较佳标记物)，仍显著提高针对金黄色葡萄球菌的免
疫反应。
[0358] 实施例26：在金黄色葡萄球菌ΔhemBΔ720菌株中重组蛋白质的表达-疫苗#8、9、10等
[0359] 将基因SACOL0442、SACOL0720、SACOL0029及/或 SACOL1867以及基因SACOL0029及SACOL1867(或其片段)的融合物 (例如大小为50AA或更多AA)(SACOL0029-SACOL1867)、
SACOL720 及/或SACOL0442的片段(例如表位)的融合物(融合物720-720)(融合物 442-
720)或基因或其片段的任何其他融合物，例如SACOL0029- SACOL0442、SACOL0029-
SACOL0720、SACOL0029-SACOL0720- SACOL0442、SACOL0029-SACOL0720-SACOL1867、
SACOL0029- SACOL1867-SACOL0442、SACOL0442-SACOL0029-SACOL0720、 SACOL0442-
SACOL0029-SACOL0720、SACOL0442-SACOL1867- SACOL0720、SACOL0720-SACOL0442-
SACOL1867、SACOL04029- SACOL1867-SACOL0720-SACOL0442，选殖至质粒 pCN36
(Charpentier等人,2004)中，处于组成性启动子(来自质粒pCN40 的PblaZ)(Charpentier
等人,2004)控制下并在金黄色葡萄球菌ΔhemBΔ720菌株中表达。预测本文中提出的某些
蛋白质抗原是外毒素、肠毒素或超抗原(例如SACOL0442)或可用于针对宿主防御进行保护
的蛋白质(例如SACOL0720)且可能干扰哺乳动物免疫系统及抗体产生，及/或在宿主体内显
示一定毒性。尽管用本文所描述的疫苗组合物及调配物未观察到此类干扰，但对金黄色葡
萄球菌ΔhemBΔ720菌株中表达的蛋白质或多肽进行修饰以使选殖的基因不补充其毒力可
能是有用的。出于此类目的，可使用分子生物学技术使此类蛋白质活性所涉及的推定区域
缺失或突变，同时不丧失免疫原性(Chang等人,2008)。该是申请人用于制备本发明的疫苗
组合物的抗原的方法。
SACOL720 及/或SACOL0442的片段(例如表位)的融合物(融合物720-720)(融合物 442-
720)或基因或其片段的任何其他融合物，例如SACOL0029- SACOL0442、SACOL0029-
SACOL0720、SACOL0029-SACOL0720- SACOL0442、SACOL0029-SACOL0720-SACOL1867、
SACOL0029- SACOL1867-SACOL0442、SACOL0442-SACOL0029-SACOL0720、 SACOL0442-
SACOL0029-SACOL0720、SACOL0442-SACOL1867- SACOL0720、SACOL0720-SACOL0442-
SACOL1867、SACOL04029- SACOL1867-SACOL0720-SACOL0442，选殖至质粒 pCN36
(Charpentier等人,2004)中，处于组成性启动子(来自质粒pCN40 的PblaZ)(Charpentier
等人,2004)控制下并在金黄色葡萄球菌ΔhemBΔ720菌株中表达。预测本文中提出的某些
蛋白质抗原是外毒素、肠毒素或超抗原(例如SACOL0442)或可用于针对宿主防御进行保护
的蛋白质(例如SACOL0720)且可能干扰哺乳动物免疫系统及抗体产生，及/或在宿主体内显
示一定毒性。尽管用本文所描述的疫苗组合物及调配物未观察到此类干扰，但对金黄色葡
萄球菌ΔhemBΔ720菌株中表达的蛋白质或多肽进行修饰以使选殖的基因不补充其毒力可
能是有用的。出于此类目的，可使用分子生物学技术使此类蛋白质活性所涉及的推定区域
缺失或突变，同时不丧失免疫原性(Chang等人,2008)。该是申请人用于制备本发明的疫苗
组合物的抗原的方法。
[0360] 藉由LC-MS/MS分析验证带有这些构筑表达载体的一的金黄色葡萄球菌ΔhemBΔ720菌株中每一种的个别重组蛋白产物的表达。简言之，对在含15μg/ml四环素的BHI中生长至对数中期的菌株离心且用乙醇使集结粒失活。样品保持在-20℃，直至进行细胞溶解及胰蛋白酶消化程序。在37℃下，将样品与溶葡球菌酶及胰蛋白酶一起培育，随后藉由使用玻璃珠及珠磨器以机械方式均质化来破坏细胞。接着在4℃下以13 000rpm将溶解产物离心25分
钟以便移除细胞碎片，随后用胰蛋白酶消化蛋白质，藉由标准程序进行还原及烷基化，接着注射样品以使用LC- MS/MS的MRM方法检测蛋白质。
钟以便移除细胞碎片，随后用胰蛋白酶消化蛋白质，藉由标准程序进行还原及烷基化，接着注射样品以使用LC- MS/MS的MRM方法检测蛋白质。
[0361] 或者，亦藉由细菌溶解产物西方墨点确定重组蛋白的表达。
[0362] 实施例27：用表达抗原的减毒菌株免疫接种小鼠-疫苗#8等
[0363] 以间隔两周方式两次皮下注射对CD-1雌性小鼠疫苗进行接种。在生理食盐水中稀释带有或未带有这些构筑表达载体的一的金黄色葡萄球菌ΔhemBΔ720菌株中的每一种并
以每剂100μl最终体积投与。第1组仅接受双重突变株；第2组接受表达融合物SACOL0029-
1867的双重突变株；第3组接受表达融合物SACOL0029-0442的双重突变株；第4组接受表达
融合物SACOL0029-0720的双重突变株；第5组接受双重突变株的混合物，一种表达融合物
SACOL0029-1867且另一种表达融合物 SACOL0029-0442；第6组接受双重突变株的混合物，
一种表达融合物 SACOL0029-1867且另一种表达融合物SACOL0029-0720；及第7组接受双重
突变株的混合物。在即将第一次注射之前及在第二次注射之后十二天取得血液样品。使样
品在室温下凝结一小时，接着在4℃下以2000 g离心10分钟。收集上清液(血清)并保持在-
20℃，以待后续分析。在第 27天对小鼠实施安乐死并藉由心脏穿刺收集血液。回收免疫血清，等分并储存作为免疫前血清。
以每剂100μl最终体积投与。第1组仅接受双重突变株；第2组接受表达融合物SACOL0029-
1867的双重突变株；第3组接受表达融合物SACOL0029-0442的双重突变株；第4组接受表达
融合物SACOL0029-0720的双重突变株；第5组接受双重突变株的混合物，一种表达融合物
SACOL0029-1867且另一种表达融合物 SACOL0029-0442；第6组接受双重突变株的混合物，
一种表达融合物 SACOL0029-1867且另一种表达融合物SACOL0029-0720；及第7组接受双重
突变株的混合物。在即将第一次注射之前及在第二次注射之后十二天取得血液样品。使样
品在室温下凝结一小时，接着在4℃下以2000 g离心10分钟。收集上清液(血清)并保持在-
20℃，以待后续分析。在第 27天对小鼠实施安乐死并藉由心脏穿刺收集血液。回收免疫血清，等分并储存作为免疫前血清。
[0364] 藉由酶联结免疫吸附分析法(ELISA)关于针对金黄色葡萄球菌完整细胞(Wood株)或特定重组蛋白质的血清多株IgG抗体的存在评价针对疫苗接种的免疫反应。使用抗小鼠
IgG-HRP(HRP：辣根过氧化酶)作为二次抗体，使用分光亮度计检测由过氧化酶活性氧化3,
3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)受质产生的色度。
IgG-HRP(HRP：辣根过氧化酶)作为二次抗体，使用分光亮度计检测由过氧化酶活性氧化3,
3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)受质产生的色度。
[0365] 参考文献
[0366] Allard M,Ster C.,Jacob CL,Scholl D,Diarra MS,Lacasse P,and Malouin F,2013.The expression of a putative exotoxin and an ABC transporter during
bovine intramammary infection contributes to the virulence of Staphylococcus
aureus.Vet.Microbiol.162:761-70.
bovine intramammary infection contributes to the virulence of Staphylococcus
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[0367] Allard,M.,C.Ster,L.St-James,P.Lacasse,M.S.Diarra,C.L. Jacob,and F.Malouin.2008.Transcriptional Analysis of In Vivo- Expressed Genes in
Staphylococcus aureus During Bovine Mastitis. American Society for
Microbiology General Meeting.Boston,USA. June 1-5,2008(Poster)
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Microbiology General Meeting.Boston,USA. June 1-5,2008(Poster)
[0368] Allard,M.,H.Moisan,E.Brouillette,A.L.Gervais,M.Jacques,P. Lacasse,M.S.Diarra,and F.Malouin.2006.Transcriptional modulation of some
Staphylococcus aureus iron-regulated genes during growth in vitro and in a
tissue cage model in vivo.Microbes Infect. 7:1679-1690.
Staphylococcus aureus iron-regulated genes during growth in vitro and in a
tissue cage model in vivo.Microbes Infect. 7:1679-1690.
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Protein Is Not Solely Dependent on Transmembrane Pot 64.
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