本发明涉及一种含有抗体和微生物的医药制剂。

据世界卫生组织调查，全世界每年至少有100万婴幼儿死于人类轮状病毒 引起的腹泻，发展中国家约占死亡人数的90％，我国的发病情况也十分严重， 据上海、西安等市卫生防疫站调查、夏秋季幼儿患急性胃肠炎的40％以上都与 轮状病毒感染有关，特别是对使用抗生素治疗无效的病例，绝大多数都是由轮 状病毒感染造成的。人类轮状病毒(Human Rotavirus，简称HRV)是呼吸病 毒科的一个属，是引起人和动物腹泻的重要病源。HRV颗粒在电镜下呈典型 轮状而得名。HRV侵入人体后，在小肠粘膜内复制繁殖，破坏绒毛细胞和新 生细胞，使水及电解质的吸收发生障碍，肠功能失调、紊乱。外表症状为发热、 严重的水样腹泻、呕吐和脱水。此外，有20-40％HRV患儿伴有呼吸道症 状，轮状病毒感染后，肠道大量有害菌乘机大量繁殖，夺取营养，产生毒素， 导致机体衰竭，中毒，病情进一步加重。欧、美等发达国家对此病已进行了30 余年的研究，我国也进行了20余年的研究，但至今尚无十分有效的治疗药物和 治疗方法。其中研究最多的有代表性的治疗药物是HRV疫苗的研究，美国于 1996年，我国于1997年相继报道开发出了预防HRV的疫苗，但至今尚未批准。 主要原因是HRV的感染在肠道，而所谓疫苗，也只能是口服疫苗，有效率仅 为50-60％，且不能获得终身免疫。而且效果也不稳定，口服接种一次的有 效期约为一年。这样的疫苗无法满足临床上治疗的需求。也不能根除HRV的 感染，只能作为一种尚不园满的预防措施。

本发明的目的是提供一种幼儿胃肠安制剂及其生产工艺。本制剂既含有对 四种不同血清型HRV具有中和作用的蛋黄抗体或泌育抗体、或二者的混合物， 同时又含有改善肠道生态、抑制肠道有害菌生长、繁殖的双歧杆菌等肠道有益 菌。本制剂对HRV感染有良好疗效，而且对普通的胃肠炎、胃肠功能紊乱的 患者有良好的预防、治疗效果。该生产工艺方法简单、易于实施。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：这种幼儿胃肠安制剂是用弱 化的轮状病毒抗原，给动物连续免疫，使其产生HRV抗体，并通过分离纯化 得到的HRV抗体，并配合一种或一种以上的双歧杆菌所制成的制剂。

本发明中，所述轮状病毒抗原是将轮状病毒用常规的物理或化学的方法进 行弱毒化，并不破坏其抗原决定簇而制成的抗原。

本发明中，所述用于制备HRV抗体的动物包括有母鸡，孕妊中的牛、马、 羊及猪，所述HRV抗体是从产生HRV抗体的鸡蛋、或牛、马、羊、猪的泌乳 中分离纯化得到的，该HRV抗体在该制剂中的的配合量为10mg-2000mg/一次 服用量。

本发明中，所述的双歧杆菌包括有婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌、长双歧杆 菌、两歧双歧杆菌，其在该制剂中的配合量为0.1亿个-4亿个活菌/一次服用量。

本发明中，该幼儿胃肠安制剂还包括有一种或一种以上的其它肠道有益 菌，该肠道有益菌包括有酪酸梭菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌，其在该制剂中 的配合量为0.1亿个-4亿个活菌/一次服用量。

本发明中，该幼儿胃肠安制剂还配合有双歧因子、维生素和微量元素。其 中，所述双歧因子是指对双歧杆菌的生长、增殖具有明显促进作用的低聚糖类 物质，一般由2-10个单糖通过糖苷键结合而成；或是天然植物提取的物质； 或是多糖类物质，可根据人身的需要适量的加入。所述低聚糖类物质包括大豆 低聚糖、低聚果糖、低聚木糖、低聚半乳糖、低聚乳果糖、低聚异麦芽糖、低 聚异麦芽酮糖、低聚葡萄糖、棉子糖、水苏糖、壳聚糖中的一种或几种，其配 合量为0.5g-30g/一次服用量，所述天然植物提取的物质包括柑桔皮提取物、人 参提取物、茶叶提取物、枸杞子提取物、五味子提取物中的一种或几种，其配 合量为0.5g-30g/一次服用量。双歧因子能特异性地促进双歧杆菌、肠道有益菌 的迅速增殖，抑制有害菌的繁殖。维生素和微量元素起到维持营养平衡的作用。 可根据人身的需要适量加入。

从免疫的蛋黄中纯化HRV抗体制备幼儿胃肠安制剂是通过下述步骤制成 的：

一、从免疫的蛋黄中纯化HRV抗体

(1)给半年鸡龄的母鸡连续免疫3次，所用的抗原是经过常规方法弱毒 化处理的HRV血清型1、血清型2、血清型3和血清型4组成，每次注射量为 0.2ml，每毫升含4×107个病毒，每隔3周注射一次，

(2)将上述经免疫处理的鸡所产出的蛋中的蛋黄，用生理盐水等倍(体 积比)稀释后，与2倍(体积比)的浓度为0.15％的卡拉胶溶液充分混和，并 在室温下静置30分钟，

(3)将上述液体用10000g，离心15分钟，然后去除沉淀，取上清液， 用硅藻土过滤，再用3NHCL调PH值为8.0，

(4)将上述液体上DEAE-Sephacel离子交换柱，再用20mM、PH为 8.0的磷酸缓冲液洗净，然后用200mM、PH为8.0的磷酸缓冲液洗脱，经280nm 检测，收集蛋白峰，向收集液中加入终浓度为15％的硫酸钠，充分混匀后，在 室温条件下静置30分钟，

(5)将上述液体用10000g，离心15分钟，取沉淀物再溶于100mM、 PH为8.0磷酸溶液中，再对10mM磷酸缓冲液透析，将透析液冷冻干燥得HRV 抗体，

二、制备双歧杆菌

(1)用蒸馏水配制发酵培养基，该发酵培养基含有胰蛋白胨、酵母抽取 物、牛肉浸膏中的一种或几种，以及低聚果糖、葡萄糖，该发酵培养基的组成 为(其含量为重量百分数)：胰蛋白胨0.5％-4％，酵母抽提物0.5％-4％，牛肉 浸膏0.5％-4％，低聚果糖0.5％-4％，葡萄糖0.5％-4％，

(2)将培养基在121℃条件下，灭菌30分钟，冷却至37℃时，接种一 种或一种以上的双歧杆菌，在37℃条件下培养18小时，控制含菌量达2.2× 109个/ml时，用连续离心机回收得到湿菌体，

(3)将上述湿菌体悬于PH为5.6、浓度为20％的脱脂奶粉液中，充分 混匀，冻结干燥得菌粉，控制含活菌数为4.0×1010个/g。

三、将上述的蛋黄抗体冻干粉和冻干菌粉按下述配合量混合配制，其配合 量为：蛋黄抗体冻干粉10mg-2000mg/一次服用量，一种或一种以上的双歧杆菌 的活菌数为0.1亿个-4亿个/一次服用量。

从免疫的动物乳中纯化HRV抗体所制备幼儿胃肠安制剂是通过下述步骤 制成的：

从免疫的动物乳中纯化HRV抗体。

(1)给怀孕的母牛或母羊或母猪，每隔一个月一次，分3次肌肉注射免 疫，所用的抗原是经过常规方法弱毒化处理的HRV血清型1、血清型2、血 清型3和血清型4组成，每毫升含4×107个病毒，每隔一个月注射一次，并 在产后再追加免疫一次。

(2)将上述经免疫处理的母牛或羊或母猪所产出的泌乳用消过毒的连续 离心机以16500r/min速度离心去除脂肪，将无菌的脱脂乳清冻结干燥，得到抗 体奶粉。

二、制备冻干菌粉

(1)用蒸馏水配制发酵培养基，该发酵培养基含有胰蛋白胨、酵母抽取 物、牛肉浸膏中的一种或几种，以及低聚果糖、葡萄糖，该发酵培养基的组成 为(其含量为重量百分数)：胰蛋白胨0.5％-4％，酵母抽提物0.5％-4％，牛肉 浸膏0.5％-4％，低聚果糖0.5％-4％，葡萄糖0.5％-4％，

(2)将培养基在121℃条件下，灭菌30分钟，冷却至37℃时，接种一 种或一种以上的双歧杆菌，在37℃条件下培养18小时，控制含菌量达2.2× 109个/ml时，用连续离心机回收得到湿菌体，

(3)将上述湿菌体悬于PH为5.6、浓度为20％的脱脂奶粉液中，充分 混匀，冻结干燥得菌粉，控制含活菌数为4.0×1010个/g。

三、将上述的冻干抗体奶粉和冻干菌粉，按下述配合量混合配制，其配合 量为：冻干抗体奶粉10mg-2000mg/一次服用量，一种或一种以上的双歧杆菌的 活菌数为0.1亿个-4亿个/一次服用量。

在上述两种制做幼儿胃肠安制剂过程中，在发酵培养基中接种双歧杆菌过 程中，可同时接种其它肠道有益菌种子液，可制成含有双歧杆菌和肠道有益菌 的冻干菌粉，该冻干菌粉与蛋黄抗体冻于粉或冻干抗体奶粉混合后可制成含有 HRV抗体、双歧杆菌、肠道有益菌的的幼儿胃肠安制剂。在该幼儿胃肠安制剂 中，一种或一种以上的肠道有益菌的配合量：活菌数为0.1亿个-4亿个/一次 服用量。

本发明的优点及独到之处在于，将轮状病毒按常规方法弱化，给鸡或孕妊 中的牛、马、羊、猪连续免疫1-数次，使其产生抗体、然后从蛋黄或泌乳的 奶中分离纯化得到抗体，再配合双歧杆菌等肠道有益菌，给HRV感染患儿口 服。HRV抗体、能迅速中和HRV病毒。因抗体来源于蛋黄或动物泌乳所以无 毒、无害、且能大量生产。

之所以要配合双歧杆菌等肠道有益菌进行治疗，是因为感染轮状病毒后， 肠道功能紊乱、免疫功能下降，大肠杆菌等致病菌乘机大量繁殖，夺取营养， 使病情进一步恶化。因此，需配合上双歧杆菌等肠道有益菌。迅速抑制大肠菌 等有害菌的繁殖，使肠道菌群生态恢复平衡，在轮状病毒抗体起效控制HRV 的同时，发挥作用控制有害菌的繁殖，双歧因子能特异性地促进双歧杆菌等肠 道有益菌的迅速增殖，抑制有害菌的繁殖。维生素和微量元素起到维持营养平 衡的作用。

本发明的最大特点和创新之处在于既含有对四种不同血清型HRV具有中 和作用的蛋黄抗体或泌育抗体、或二者的混合物，同时又含有改善肠道生态、 抑制肠道有害菌生长、繁殖的双歧杆菌等肠道有益菌。

用动物和人体做的初步实验结果表明，本制剂不仅对HRV感染有良效， 对普通的胃肠炎、胃肠功能紊乱也有良好的预防、治疗效果。

实施例1

母鸡的免疫及从蛋黄中纯化HRV抗体。

给半年鸡龄的母鸡，连续免疫3次，抗原由经过常规方法弱毒化处理的HRV 血清型1、血清型2、血清型3及血清型4组成，每次注射量为0.2ml，每毫 升含4×107个病毒。注射部位为皮下多点注射。每隔3周注射一次。经如此 处理免疫的鸡，在产蛋期内均能持续产生抗体。其效价均高达6000以上，且对 四种血清型的HRV病毒均具有较高的中和抗体效价，见表1，结果表明，1 型和3型，2型和4型的中和抗体效价相似。

表1、蛋黄HRV对四种HRV抗原中和抗体效价

  HRV血清型           中和抗体效价

  血清型1                 7180

  血清型2                 6730

  血清型3                 7180

  血清型4                 6730

从蛋黄中纯化得到的抗体，若不经过特殊处理，直接做成胃溶制剂，服用， 就存在一个被胃液破坏的问题。因胃液既是酸性的，又含各种消化酶，为此， 进行了蛋黄抗体与胃液进行反应的实验。结果见表2。

表2    胃液对抗体活性的影响

    项目                       中和抗体效价②

    蛋黄抗体+正常人胃液             1782

    蛋黄抗体+人工胃液①             1782

    卵黄抗体                        6730

①人工胃液按药典1995年版配制。

②反应条件，抗体+胃液，37℃，30min后，测定效价。

结果表明，胃液对抗体的活性有一定的影响，但仍有相当一部分抗体，没 有被破坏可进入肠道，中和HRV病毒，起到治疗作用。

为了提高效果，减少胃液对抗体活性的影响，可将剂型做成肠溶剂型。在 胃液(酸性条件)下不溶解，进入肠道后溶解，而发挥作用。

一、从免疫的蛋黄中纯化HRV抗体方法如下：

(1)用生理盐水等倍(体积比)稀释蛋黄，取稀释的蛋黄液1000ml， 与2000ml的浓度为0.15％的卡拉胶溶液充分混和，并在室温下静置30分钟。

(2)将上述液体放入重力加速度为10000g离心机中离心15分钟，然后 去除沉淀，取上清液，用硅藻土过滤，再用3NHCl调PH值为8.0。

(3)将上述液体上DEAE-Sephacel离子交换柱，再用20mM、PH为 8.0的磷酸缓冲液洗净，然后用200mM、PH为8.0的磷酸缓冲液洗脱，经280nm 检测，收集蛋白峰，向收集液中加终浓度为15％的硫酸钠，充分混匀后，在室 温条件下静置30分钟。

(4)将上述液体用10000g，离心15分钟，取沉淀物再溶于500ml的 100mM、PH为8.0磷酸溶液中，再对10mM磷酸缓冲液透析，将透析液冷冻 干燥得HRV抗体3.02g。

表3、从蛋黄纯化抗HRV抗体的各步得率

                     全蛋白质量   HRV量      HRV纯      HRV得率

      纯化步骤

                       (g)        (g)          度        (％)

                                              (％)

  蛋黄稀释液           85          4.1         4.8       100

  加卡拉胶后上清       18.7        3.55        18        85

  从DEAE-Sephacel      6.9         3,24        47        75

  柱洗下部分

  硫酸钠沉淀部分       3.11        3.02        97        72

所得HRV抗体冻干粉，贮于4℃备用。

该冻干粉，10mg用于治疗轮状病毒感染造成的腹泻，即有良好的治疗效 果。既可与一定的辅料配合制成幼儿胃肠安制剂。

也可将冻干的抗体粉先按常规方法做成微囊，该微囊为肠溶性，用于配制 冲剂，微囊中有效成份HRV抗体的含量为10％。

二、双歧杆菌及肠道有益菌的生产

用100L蒸馏水配制发酵培养蒸基。

发醇培养基的组成如下(其组成含量均为重量百分数)：胰蛋白胨1％， 酵母提取物0.5％，牛肉浸膏0.5％，葡萄糖1％，低聚果糖1％，乙酸钠0.5 ％，碳酸钙0.05％，在121℃条件下，灭菌30分钟，冷却至37℃时，接种婴 儿双歧杆菌种子液2L，在37℃条件下培养18小时，含菌量达2.2×109个/ml 时，用连续离心机以15000r/min速度，离心回收得湿菌体0.6kg，悬于14L的 PH为5.6、浓度20％的脱脂奶粉液中，充分混匀，冻结干燥得菌粉3Kg，含活 菌数4.0×1010个/g。该菌粉和上述的蛋黄抗体冻干粉配合制成幼儿胃肠安制 剂。配方举例如下：

配方组成1：以10000粒肠溶胶囊为例

    蛋黄抗体冻干粉      100g

    冻干菌粉            50g

    VC                  100g

    低聚果糖            2250g

准确称取上述四种组分，用混匀机充分混匀，分装于10000粒肠溶胶囊中。 即制成幼儿胃肠安胶囊。

配方举例2：以10000粒肠溶胶囊为例。

    蛋黄抗体冻干粉      100g

    冻干菌粉            50g

    VC                  100g

    VB1                 15g

    VB6                 15g

    Zn                  13g

    Fe                  120g

    低聚果糖            2100g

准确称取上述8种组份，用混匀机充分混匀，每粒250mg，分装于10000粒 肠溶胶囊中。即制得幼儿胃肠安肠溶胶囊。

配方举例3：以1000袋为例

    蛋黄抗体冻干粉微囊  60g

    冻干菌粉            5g

    VC                  10g

    VB1                 1.5g

    VB6                 1.5g

    Fe                   12g

    低聚果糖             1000g

准确称取上述7种组份，用混匀机充分混匀，分装于1000袋中，即成每袋 1g的幼儿胃肠安冲剂。

实施例2

一、从免疫的动物泌乳中纯化HRV抗体。

以牛为例，给怀孕6个月的健康母牛，在分娩前，每隔一个月一次，分3 次肌肉注射弱毒化的HRV抗原。抗原由等量的HRV血清型1、血清型2、血 清型3及血清型4组成。经常规方法弱毒化的抗原每毫升含HRV病毒量4× 107个。产后再追加免疫一次，即可获得对HRV的高抗泌乳。收集初奶和常奶。 分离纯化抗体，分离纯化方法如下：取新鲜的高抗泌乳20L，用消过毒的连续 离心机，以16500r/min速度，离心去除脂肪，将无菌的脱脂乳清冻结干燥，得 抗体奶粉1.2Kg，含HRV抗体12g，可用于幼儿胃肠安制剂的配制。试验结果 证明，初奶的抗体的效价高于常奶，但经过连续免疫后的常奶，在2个月内可 维持较高抗体效价，见表4。由此方法，可简单快速获取大量高价值抗体奶， 该抗体奶不经过任何处理，鲜用1-20ml对婴幼儿HRV感染也有良好的治疗 作用，冻干抗体奶粉0.1-2g直接冲入水中或与冻干菌粉配合使用，均对HRV 感染有良好治疗作用。

表4、免疫初奶、常奶抗体效价变化

                        采奶日        中和抗体效价

      免疫初奶            2              5230倍

      免疫常奶            26             2720倍

      免疫常奶            60             2312倍

二、双歧杆菌及肠道有益菌的发酵、制备

用100L蒸馏水配制发酵培养基。

培养共组成如下(其组成含量均为重量百分数)：胰蛋白胨1％，酵母抽 提物1％，肉胨0.5％，葡萄糖1％，低聚果糖1％，乙酸钠0.5％，碳酸钙 0.05％，在121℃条件下，灭菌30分钟，冷却至37℃时，接种婴儿双歧杆菌 和酪酸梭菌种子液各1L，在37℃条件下，培养18小时，用连续离心机，以 15000r/min速度，离心回收湿菌体0.6kg，悬于14L的PH为5.6、浓度20％ 的脱脂奶粉中，充分混匀，冻结干燥得菌粉3Kg，含活菌数4×1010个/g，该菌 粉可与上述牛奶中提取的抗体冻干粉配合制成幼儿胃肠安制剂。

配方举例如下：以1000袋为例

1、

    牛奶提取抗体冻干粉  1000g

    冻干菌粉            5g

    VC                  10g

    VB1                1500mg

    VB6                1500mg

准确称取上述5种组份，充分混匀，分装于1000袋中。即制成幼儿胃肠安 冲剂。

2、

    牛奶提取抗体冻干粉   1000g

    冻干菌粉             5g

    VC                   10g

    Zn                   1300mg

    VB6                 1500mg

    低聚果糖             1000g

准确称取上述6种组份，充分混匀，分装于1000袋中。即制成幼儿胃肠安 冲剂。

3、

    蛋黄抗体冻干粉微囊     30g

    牛奶提取抗体冻干粉     400g

    VC                     10g

    Zn                     1300mg

    VB6                   1500mg

    低聚果糖               570g

准确称取上述6种组份，充分混匀，分装于1000袋中。每袋1g。即制成 幼儿胃肠安冲剂。

本发明的幼儿胃肠安制剂中的双歧杆菌和肠道有益菌的配合量是按一次 服用量所含活菌数进行配比的，而HRV抗体的配合量是按一次服用量所含的 重量进行配比的，凡按本发明提出的配合量配比任何重量的幼儿胃肠安制剂都 在本发明的权利要求范围内。

本发明所使用的微生物菌种已于97年7月28日放到中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心(北京、中关村，邮编100080)保藏，共七个下述 微生物菌种。

(1)分类命名：Clostridium butyricum酪酸梭菌，保存编号0313-1。

(2)分类命名：Bifidobacterium infantis婴儿双歧杆菌，保存编号0313 -2。

(3)分类命名：Streptococcus thermophilus嗜热链球菌，保存编号0313 -3。

(4)分类命名：Lactobacillus acidophilus嗜酸乳杆菌，保存编号0313 -4。

(5)分类命名：Bifidobacterium longum长双歧杆菌，保存编号0313 -5。

(6)分类命名：Bifidobacterium breve短双歧杆菌，保存编号0313-6。

(7)分类命名：Bifidobacterium bifidum两歧双歧杆菌，保存编号0313 -7。

上述七个微生物菌种经该微生物中心检测，检测结果均为存活。