骨骼和软骨损害或疾病的预防和治疗
阅读：693发布：2020-05-14
专利汇可以提供骨骼和软骨损害或疾病的预防和治疗专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且公开了使用用抗整联蛋白α10 抗体 分离的间充质干细胞来 预防 和/或 治疗 涉及 哺乳动物 软骨和骨骼的 疾病 或损害的病症的组合物和方法。，下面是骨骼和软骨损害或疾病的预防和治疗专利的具体信息内容。
1.一种间充质干细胞(MSC)富集整联蛋白α10高群体，用于预防和/或治疗软骨下骨硬化、创伤性关节损伤和/或椎间盘退行性疾病，
其中所述MSC群体的至少60％的细胞表达整联蛋白α10亚基，并且
其中所述MSC选自间充质干细胞、间充质祖细胞和间充质基质细胞。
2.用于根据权利要求1使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述创伤性关节损伤包括运动损伤。
3.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述创伤性关节损伤选自骨软骨损害、肌腱损害、韧带损害和肌肉损害。
4.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述骨软骨损害包括关节软骨损害和/或骨骼损害。
5.一种用于促进或诱导骨折愈合的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC群体的至少60％的细胞表达整联蛋白α10亚基，并且其中所述MSC选自间充质干细胞、间充质祖细胞和间充质基质细胞。
6.用于根据权利要求1和2中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述群体中包含的总细胞的至少65％，诸如至少70％，诸如至少75％，诸如至少80％，诸如至少85％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少96％，诸如至少97％，诸如至少98％，诸如至少
99％，诸如100％，表达整联蛋白α10亚基。
7.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述细胞被诱导表达整联蛋白α10亚基。
8.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含哺乳动物血清和FGF-2的培养基中培养所述细胞。
9.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含血小板裂解物和/或血小板裂解物组分的培养基中培养所述细胞。
10.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含血小板裂解物和/或血小板裂解物组分的无血清培养基中培养所述细胞。
11.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含生长因子的无血清培养基中培养所述细胞。
12.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含生长因子FGF2和/或TGFβ的无血清培养基中培养所述细胞。
13.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含FGF-2和血小板裂解物和/或血小板裂解物组分的培养基中培养所述细胞。
14.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含哺乳动物血清和血小板裂解物和/或血小板裂解物组分的培养基中培养所述细胞。
15.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含TGFβ的培养基中培养所述细胞。
16.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述血清是胎牛血清。
17.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述群体是体外细胞培养物。
18.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述培养基还包含抗坏血酸。
19.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述整联蛋白α10与整联蛋白β1亚基组合表达为异源二聚体。
20.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中用抗整联蛋白α10抗体来分离表达整联蛋白α10的所述细胞。
21.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述抗整联蛋白α10抗体是单克隆抗体。
22.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述抗体是通过用人类整联蛋白α10多肽免疫小鼠产生的。
23.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC的特征还在于不存在MHCII和CD45。
24.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC的特征还在于存在CD44、CD90和CD105。
25.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述细胞源自脂肪组织、骨髓、滑膜、外周血、脐血、脐带血、华通氏胶或羊水。
26.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述细胞源自脂肪组织。
27.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述细胞源自骨髓。
28.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述群体用于用在预防软骨下骨病和/或骨软骨损害的方法中。
29.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述群体用于用在治疗软骨下骨病和/或骨软骨损害的方法中。
30.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述受试者患有或以前曾患有骨软骨损害或者关节或骨骼损害或损伤。
31.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是断裂、扭伤、挫伤、撕裂、骨折或破裂。
32.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是软骨裂缝。
33.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是软骨微骨折。
高
34.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10 群体，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是软骨缺损。
35.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是肌腱破裂或韧带破裂。
高
36.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10 群体，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是骨折。
37.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述损伤是运动损伤。
38.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述受试者患有骨排列不齐。
39.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是佩戴假体的结果。
40.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述骨软骨损害、软骨损害或关节损伤是在肌肉、肌腱、骨骼、韧带、软骨或半月板中。
高
41.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10 群体，其中所述方法预防由软骨下骨病或骨软骨损害引起的创伤后骨关节炎(PTOA)。
42.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC是同种异体的或自体的。
高
43.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10 群体，其中将所述MSC给予至关节腔中。
44.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC群体通过注射给予。
高
45.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10 群体，其中所述MSC群体与药学上可接受的赋形剂一起在细胞悬浮液中给予。
46.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中将所述MSC群体在给予之前配制成细胞聚集体。
47.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中将所述MSC储存在包含二甲基亚砜(DMSO)的培养基中。
48.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中将所述MSC群体在手术期间给予以修复受损的关节和/或骨骼。
49.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中将所述MSC群体在断裂后固定骨骼的同时给予。
50.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述受试者是人类、马、矮种马、公牛、驴、骡、骆驼科动物、猫、狗、猪或母牛。
51.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述受试者是人类。
52.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述受试者是马。
53.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述受试者是狗。
54.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC和受试者来自相同的物种或属。
55.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC和受试者来自不同的物种或属。
56.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述细胞源自胎儿、新生儿、青少年或成人MSC和/或祖细胞。
57.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述细胞不是源自胚胎细胞或胚胎。
58.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述给予导致给予部位的胶原产生、蛋白多糖产生和/或润滑素的增加。
59.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其还包含与所述MSC组合给予抗炎剂。
60.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC不表达MHCII和CD45。
61.用于根据前述权利要求中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC表达CD44、CD90和CD105。
62.MSC富集整联蛋白α10高群体用于制备预防或治疗软骨下骨硬化、创伤性关节损伤和/或椎间盘退行性疾病的药剂的用途，其中所述MSC群体的至少60％的细胞表达整联蛋白α10亚基，并且其中所述MSC选自间充质干细胞、间充质祖细胞和间充质基质细胞。
63.一种治疗和/或预防受试者的软骨下骨硬化、创伤性关节损伤和/或椎间盘退行性疾病的方法，其包括向有患软骨下骨硬化风险或患有软骨下骨硬化的受试者给予MSC富集高
整联蛋白α10 群体，从而治疗和/或预防软骨下骨硬化和/或骨软骨损害，其中所述MSC群体的至少60％的细胞表达整联蛋白α10亚基，并且其中所述MSC选自间充质干细胞、间充质祖细胞和间充质基质细胞。
64.根据权利要求62和63中任一项的用途或方法，其中所述创伤性关节损伤包括运动损伤。
65.根据权利要求62至64中任一项的用途或方法，其中所述创伤性关节损伤选自骨软骨损害、肌腱损害、韧带损害和肌肉损害。
66.根据权利要求62至65中任一项的用途或方法，其中所述骨软骨损害包括关节软骨损害和/或骨骼损害。
67.根据权利要求62至66中任一项的用途或方法，其中所述MSC富集整联蛋白α10高群体如权利要求1至61中任一项所述。
68.一种制造MSC富集整联蛋白α10高群体的方法，其中所述MSC群体的至少60％的细胞表达整联蛋白α10亚基，所述方法包括：
a.从脂肪组织、骨髓、滑膜、脐血、华通氏胶或羊水中分离干细胞群体；
b.在塑料培养容器中培养所分离的细胞；
c.丢弃非贴壁细胞；
d.通过添加培养基诱导整联蛋白α10表达，其中所述培养基为无血清培养基或包含哺乳动物血清的培养基，并且其中所述培养基包含血小板裂解物和/或血小板裂解物组分和/或生长因子；
e.选择表达整联蛋白α10的细胞，以及
f.扩增所选细胞，从而产生MSC富集整联蛋白α10高群体。
69.根据权利要求68的方法，其中步骤d.中的所述培养基包含生长因子FGF2和/或TGFβ。
70.根据权利要求68和69中任一项的方法，其中所述MSC富集整联蛋白α10高群体如权利要求1至61中任一项所述。
骨骼和软骨损害或疾病的预防和治疗
技术领域
背景技术
[0002] 关节软骨极易发生损伤和病理性退化。一旦受损，关节软骨通常不会愈合，或仅在某些生物条件下部分愈合。损害导致软骨进一步降解，软骨折断产物引发炎症，导致软骨进一步降解，反过来又使炎症发生，从而形成恶性循环1。众所周知，早期软骨损伤(例如运动损伤)与骨关节炎(OA)的后期发展之间有着某种联系2。
[0003] 细胞疗法是一种很有前景的组织再生方法。对动物和人类的一系列研究显示，使用多能间充质基质细胞(MSC)治疗包括软骨损害在内的各种疾病具有安全性和有效性6,7。MSC的治疗效果被认为是多方面的。MSC可以直接分化为待再生的组织的特异性细胞类型，也可以通过产生细胞外基质、细胞因子和生长因子来修饰微环境，募集和刺激内源性干细
8
胞，并且具有免疫抑制作用。因此，鉴于这些细胞分化为软骨细胞的潜能，MSC移植用于软骨修复和再生是一种有前途的策略6。典型地，干细胞制剂是具有不同分化能力的细胞类型或细胞的复杂混合物。由于它们具有可塑性和较大的分化潜能，因此对定义明确的细胞进行临床前和临床研究是重要的。通过质量受控的生物标志物对MSC进行表征，这对于作为治疗剂的细胞的良好有效性以及安全使用是至关重要的。国际细胞治疗协会提出，细胞表型塑料粘附性、三系分化潜能以及表面标志物CD73、CD90、CD105的表达或CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19、HLA-DR的缺失是人类细胞被定义为MSC的最低标准9。
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胞，并且具有免疫抑制作用。因此，鉴于这些细胞分化为软骨细胞的潜能，MSC移植用于软骨修复和再生是一种有前途的策略6。典型地，干细胞制剂是具有不同分化能力的细胞类型或细胞的复杂混合物。由于它们具有可塑性和较大的分化潜能，因此对定义明确的细胞进行临床前和临床研究是重要的。通过质量受控的生物标志物对MSC进行表征，这对于作为治疗剂的细胞的良好有效性以及安全使用是至关重要的。国际细胞治疗协会提出，细胞表型塑料粘附性、三系分化潜能以及表面标志物CD73、CD90、CD105的表达或CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19、HLA-DR的缺失是人类细胞被定义为MSC的最低标准9。
[0004] 在兽医患者中，基于MSC的三种手术入路目前用于治疗马或狗的肌腱、韧带或软骨/关节损伤10。所用的三种细胞类型是：源自骨髓(BM)抽取液的培养扩增细胞群体(大多数临床研究都使用了该细胞群体)、源自BM抽取液的浓缩混合细胞群体和源自脂肪组织(AT)的混合有核细胞群体。所有三种类型的细胞可以是自体(自身)或同种异体(供体)来源。它们都没有被明确定义。
[0005] 为了改善MSC的软骨修复能力，据信待注射的MSC的质量和数量以及给予方法这两个变量对于取得满意的效果是重要的。现在很明显的是，由国际细胞治疗协会标准选择的细胞仍然是异质群体。MSC质量问题的解决方案可以是使用被定义的表达特异性候选效力标志物的MSC群体11。
[0006] 整联蛋白阿尔法10贝塔1(α10β1)最初被鉴定为软骨细胞上的II型胶原结合受体，12
并已显示在骨骼发育中具有关键作用 。它在软骨细胞上大量表达，并存在于人类MSC亚群体中。靶向整联蛋白α10β1的抗体可用于从混合细胞群体中鉴定、分化和分离MSC(参见WO
03/106492)。软骨细胞的扩增培养或转化生长因子(TGF)β1治疗导致去分化，伴随着软骨细胞特异性整联蛋白α10水平的减少。相反，向培养基中给予骨形态发生蛋白(BMP)-2可稳定
13
软骨细胞表型并诱导整联蛋白α10的高水平表达 。在悬浮培养中，具有不同细胞周基质的软骨细胞聚集体的形成需要α10β1整联蛋白-II型胶原相互作用14。此外，已证明整联蛋白α
10β1表达与源自人类BM的MSC的软骨分化潜能的改善有关15。
并已显示在骨骼发育中具有关键作用 。它在软骨细胞上大量表达，并存在于人类MSC亚群体中。靶向整联蛋白α10β1的抗体可用于从混合细胞群体中鉴定、分化和分离MSC(参见WO
03/106492)。软骨细胞的扩增培养或转化生长因子(TGF)β1治疗导致去分化，伴随着软骨细胞特异性整联蛋白α10水平的减少。相反，向培养基中给予骨形态发生蛋白(BMP)-2可稳定
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软骨细胞表型并诱导整联蛋白α10的高水平表达 。在悬浮培养中，具有不同细胞周基质的软骨细胞聚集体的形成需要α10β1整联蛋白-II型胶原相互作用14。此外，已证明整联蛋白α
10β1表达与源自人类BM的MSC的软骨分化潜能的改善有关15。
[0007] 已知关节损伤大大增加了骨关节炎(OA)的风险，这种现象称为创伤后骨关节炎(PTOA)。然而，没有可用于治疗OA或PTOA的预防性治疗或疾病修饰治疗，并且目前的治疗缓解症状但不预防疾病的发作和/或疾病进展或恶化。因此，非常需要用于预防损伤或创伤后OA的发展的方法
发明内容
[0008] 本发明人首次在体内证明，将MSC整联蛋白α10富集群体给予患有骨骼或软骨损伤的哺乳动物可用以预防和治疗与其相关的或由其产生的病症。
[0009] 因此，在一个方面，本公开文本涉及一种用在用于预防或治疗软骨下骨硬化创伤性关节损伤和/或椎间盘退行性疾病的方法中的MSC富集整联合蛋白α10高群体，其中所述MSC群体的至少60％的细胞表达整联蛋白α10亚基，并且其中所述MSC选自间充质干细胞、间充质祖细胞和间充质基质细胞。
[0010] 本公开文本的另一个方面涉及一种用于促进或诱导骨折愈合的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC群体的至少60％的细胞表达整联蛋白α10亚基，并且其中所述MSC选自间充质干细胞、间充质祖细胞和间充质基质细胞。
[0011] 本公开文本的一个方面涉及MSC富集整联蛋白α10高群体用于制备预防或治疗软骨下骨硬化创伤性关节损伤和/或椎间盘退行性疾病的药剂的用途，其中所述MSC群体的至少60％的细胞表达整联蛋白α10亚基，并且其中所述MSC选自间充质干细胞、间充质祖细胞和间充质基质细胞。
[0012] 本公开文本的另一个方面涉及一种治疗和/或预防受试者的软骨下骨硬化创伤性关节损伤和/或椎间盘退行性疾病的方法，其包括向有患软骨下骨硬化风险或患有软骨下骨硬化的受试者给予MSC富集整联蛋白α10高群体，从而治疗和/或预防软骨下骨硬化和/或骨软骨损害，其中所述MSC群体的至少60％的细胞表达整联蛋白α10亚基，并且其中所述MSC选自间充质干细胞、间充质祖细胞和间充质基质细胞。
[0013] 本公开文本的一个方面涉及一种制造如本文所述的MSC富集整联蛋白α10高群体的方法，所述方法包括：
[0014] a.从脂肪组织、骨髓、滑膜、脐血、华通氏胶或羊水中分离干细胞群体；
[0015] b.在塑料培养容器中培养所分离的细胞；
[0016] c.丢弃非贴壁细胞；
[0017] d.通过添加培养基诱导整联蛋白α10表达，其中所述培养基为无血清培养基或包含哺乳动物血清的培养基，并且其中所述培养基包含血小板裂解物和/或血小板裂解物组分和/或生长因子；
[0018] e.选择表达整联蛋白α10的细胞，以及
[0020] 图1提供了源自骨髓(BM)和脂肪组织(AT)的间充质基质细胞(MSC)的典型FACS图。用识别细胞表面标志物CD44、CD45、CD90、CD105和II类MHC的抗体标记细胞。左图显示源自BM的MSC，右图显示源自AT的MSC。显示了抗体标记的细胞和阴性对照细胞(未用抗体标记)。
[0021] 图2A-B显示了整联蛋白α10β1在源自BM(A)和AT(B)的经培养的马MSC上的典型表达谱。相对于侧向散射绘制整联蛋白α10标记强度。两种类型的MSC都表达整联蛋白α10β1，但更大比例的源自BM的MSC呈整联蛋白α10表达阳性。
[0022] 图3A-B显示了通过使用特异性抗整联蛋白α10mAb的荧光活化细胞分选术(FACSAria)分选为两个不同的细胞群体的源自AT的MSC。相对于侧向散射绘制整联蛋白α10标记强度。用蓝色表示整联蛋白α10高门控MSC(右侧)，用黄色表示整联蛋白α10低门控MSC(左高侧)(A)。随后使整联蛋白α10 门控细胞粘附到塑料并用针对整联蛋白α10的抗体染色。用DAPI对细胞核复染色(B)。
[0023] 图4A-D显示了对未分选和分选的(整联蛋白α10高或整联蛋白α10低)AT-MSC的冷冻切片进行的沉淀团块培养物的免疫组织化学分析。用抗II型胶原抗体标记五个分化实验的冷冻切片，并使用ImageJ 1.50i软件定量免疫组织化学显色反应(A)。显示了使用未分选的细胞(B)、分选的整联蛋白α10高细胞(C)或分选的整联蛋白α10低细胞(D)的沉淀团块培养物中心区域的冷冻切片的典型II型胶原表达谱和水平。II型胶原标记显示未分选沉淀中II型胶原的中等标记、分选的整联蛋白α10高沉淀中II型胶原的强标记，而整联蛋白α10低沉淀中II型胶原较低，指示整联蛋白α10对软骨细胞分化的阳性效应。
[0024] 图5显示了用未分选和分选的(整联蛋白α10高或整联蛋白α10低)AT-MSC的RNA进行的沉淀团块培养物的基因表达分析。将GAPDH用作内源对照，未分选的细胞用作ΔΔCt计算的参考样品。结果显示，与整联蛋白α10低沉淀相比，整联蛋白α10高沉淀中I型胶原的表达较低且II型胶原和聚集蛋白聚糖的表达较高，指示来自整联蛋白α10高分选细胞的沉淀中的软骨细胞分化较好。条显示平均值±SD。
[0025] 图6A-D显示了未分选和整联蛋白α10分选的细胞对完整或受损软骨的归巢能力。表达更高水平的整联蛋白α10的细胞(α10高细胞)在归巢到软骨修复的目的区域时更好。条代表平均值±S.D.。
[0026] 图7显示6个月对照肢体的软骨下骨硬化成分得分显著高于6个月时的治疗肢体，并且显著高于6周时和研究开始(0天)时的治疗肢体或对照肢体。条代表平均值±S.E.。不共有共同字母的组彼此间具有显著性差异(p<0.05)。
[0027] 图8显示，治疗肢体中前列腺素E2(PGE-2)水平在9/11时间点与对照肢体相比更高，并且术后28天的治疗肢体中的前列腺素E2(PGE-2)水平与时间0、4、42、56、126和154天的对照肢体相比显著更高。用平均值±S.E.来表示数据。不共有共同字母的组具有显著性差异(p<0.05)。
[0028] 图9显示，在若干个时间点，前胶原II C-前肽(CPII)水平(指示II型胶原合成增加)在治疗肢体中与对照肢体相比更高，并且在7天和14天时，治疗肢体和对照肢体中的前胶原II C-前肽(CPII)水平与时间0和研究结束(第154天)相比显著更高。用平均值±S.E.来表示数据。不共有共同字母的组具有显著性差异(p<0.05)。
[0029] 图10显示了C2C ELISA的结果。C2C ELISA测量通过胶原酶切割II型胶原产生的3/4肽的C末端的新表位。在治疗组和对照组中，C2C从冲击手术到第14天显著增加，然后在整个研究中减少到与时间0没有差异的值。用平均值±S.E.来表示数据。不共有共同字母的组具有显著性差异(p<0.05)。
[0030] 图11A-B显示了骨软骨切片的组织学。制备距小腿关节(飞节)用于组织学，并用番红O/固绿对切片进行染色(A)。在治疗肢体和对照肢体中的软骨的未受冲击区域中，可以看到正常水平的蛋白多糖。在一些马中，在受冲击区域，可以看到蛋白多糖含量和软骨细胞组构的差异。相邻的切片用针对II型胶原的抗体标记(B)。在治疗治疗和对照肢体中的软骨的未受冲击区域中，可以看到正常水平的II型胶原。在一些马中，在受冲击区域，可以看到II型胶原含量和表达谱的差异。
[0032] 图13显示了印度墨汁染色。死后，将印度墨汁涂在关节面上，并获得数码照片。印度墨汁含有颗粒碳，粘附在软骨完整性受损的关节面区域。箭头指向印度墨汁粘附可在受损软骨上以黑斑的形式看到的受冲击区域。与治疗肢体软骨表面相比，更多的印度墨汁粘附到对照肢体软骨表面，指示治疗的有益作用。
[0033] 图14：免疫抑制测定显示从脂肪组织分离的马整联蛋白α10选择的MSC对T细胞具有免疫调节能力，证明淋巴细胞增殖随着MSC与PBMC比例增加而减少。在一MSC对一PBMC的比例下，免疫抑制作用最强。
具体实施方式
[0034] 定义
[0035] 如在此使用的，“抗整联蛋白α10抗体”或“抗整联蛋白α10亚基抗体”是指能够识别并至少结合到异源二聚体蛋白整联蛋白α10β1的α10亚基的抗体。这些抗体可以是识别异源二聚体蛋白整联蛋白α10β1的表位的抗体，其中所述表位包含整联蛋白α10和整联蛋白β1亚基两者的氨基酸残基。
[0036] 如在此使用的，与骨损伤或损害有关的术语“断裂”是指骨折，其是骨骼的连续性受损的医学病症。断裂可能是高冲击力或应力导致的结果，也可能是由于诸如骨质疏松症、骨癌或成骨不全等削弱骨骼的某些医学病症导致的最小创伤性损伤，这种原因导致的断裂或骨折也可以被称为病理性骨折。
[0037] 如在此使用的，与骨骼损伤或损害有关的术语“挫伤”是指骨纤维组织的创伤性损伤，其不如骨折严重。骨骼挫伤可由骨骼或关节的创伤性损伤以及关节炎引起。
[0038] 如在此使用的，术语“鉴定”是指将细胞识别为某种类型细胞(例如MSC或软骨细胞)的行为。鉴定的替代性术语是“检测”，其在此以相同含义使用。
[0039] 如在此使用的，“整联蛋白α10”或“整联蛋白α-10”是指异源二聚体蛋白整联蛋白α10β1的α10亚基。这指示不排除结合到整联蛋白α10亚基从而形成整联蛋白α10β1异源二聚体的四级结构的整联蛋白β1亚基的存在。人类整联蛋白α10链序列是已知的，并且在GenBankTM/EBI Data Bank登录号AF074015处可公开获得，并且已在Camper等人J.Bio.Chem.273:20383-20389(1998)中描述。
[0040] 如在此使用的，术语“骨排列不齐”是指骨骼相对于关节的不一致位移。
[0041] 如在此使用的，术语“分离”、“分选”和“选择”是指将细胞鉴定为某种细胞类型并且将其与不属于相同的细胞类型或另一种分化状态的细胞分开的行为。通常，分离是分开的第一步，而“选择”是更特异的，例如在抗体的帮助下进行。
[0042] 如在此使用的，“间充质干细胞”或“MSC”是指由国际细胞治疗协会间充质和组织干细胞委员会所定义的多能基质细胞(参见Dominici M等人,Cytotherapy.8(4):315-7(2006))。当维持在标准培养条件下时，MSC必须具有塑料粘附性，并且必须表达CD105、CD73和CD90，且不表达CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19和HLA-DR表面分子。MSC必须具有在体外分化为成骨细胞、脂肪细胞或成软骨细胞的能力。
[0043] 如在此使用的，“骨关节炎”或“OA”是指以关节软骨折断为特征的关节疾病。OA也可称为磨损性关节炎、退行性关节病和退行性关节炎。OA的症状包括关节肿胀、疼痛和活动度减少。常受OA影响的关节包括手、大脚趾、手腕、颈部、背部、膝盖和臀部。在OA中，软骨可能变硬并失去弹性，或软骨可能在一些区域磨损。在OA的晚期病例中，当关节表面软骨损失时，关节的骨骼可彼此相互摩擦。
[0044] 如在此使用的，“损伤后关节炎”、“创伤后关节炎”或“PTOA”是指由先前的损伤、损害或创伤引起的OA。这种情况可能在任何关节发生。损伤可能会损害关节的软骨和/或骨骼，这会导致软骨更快地磨损。持续损伤或体重过重等病症可能导致或加速PTOA的发展。
[0045] 如在此定义的，术语“运动损伤”是指在运动时发生的损伤。运动损伤既可以具有创伤性质并且还归因于过度使用和重复应力。
[0046] 如在此使用的，与骨骼损伤或损害有关的术语“扭伤”是指韧带的拉伸和/或撕裂。扭伤通常是由对关节施加应力并且过度拉伸或甚至使支撑韧带破裂的损伤(例如扭曲)引起的。
[0047] 如在此使用的，与骨骼损伤或损害有关的术语“撕裂”是指关节中一个或多个纤维软骨条的破裂。撕裂可能是由诸如扭曲等创伤性损伤导致的，也可能是由轻度和长期应力导致的，在这种情况下，它也可称为退行性撕裂。撕裂也被称为韧带破裂。
[0048] 如在此使用的，“治疗(Treating或Treatment)”包括关于所公开的受试者的疾病、障碍和病症的治疗的任何给予或施加，并且包括抑制疾病的进展，减缓疾病或其进展，阻止其发展，部分或完全缓解疾病，或部分或完全缓解疾病的一种或多种症状。
[0049] 如在此使用的，“预防(Preventing或Prevention)”包括延迟或阻止疾病、障碍或病症的发作。
[0050] 组成
[0051] 本发明包括用抗整联蛋白α10抗体从混合细胞群体分离的间充质干细胞(MSC)。可以给予治疗有效量的分离的MSC以治疗骨关节炎、软骨损害(包括裂缝)和软骨下骨硬化等疾病/障碍。
[0052] 本发明包括MSC富集整联蛋白α10高群体，其中这些细胞被诱导表达整联蛋白α10亚基，并且其中所述MSC富集整联蛋白α10高群体是其中表达整联蛋白α10亚基的MSC的百分比为所述群体的至少60％的细胞的一个群体。
[0053] 在一些实施方案中，所述MSC富集整联蛋白α10高群体中包含的总细胞的至少65％，诸如至少70％，诸如至少75％，诸如至少80％，诸如至少85％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少98％，诸如至少99％，诸如至少100％，表达整联蛋白α10亚基。
[0054] 在一些实施方案中，MSC群体中的细胞被诱导表达整联蛋白α10亚基。
[0055] 在一些实施方案中，整联蛋白α10与整联蛋白β1亚基组合表达为异源二聚体。
[0056] 在一些实施方案中，MSC群体源自脂肪组织、骨髓、滑膜、外周血、脐血、脐带血、华通氏胶或羊水。优选地，在一些实施方案中，MSC群体源自脂肪组织。优选地，在一些实施方案中，MSC群体源自骨髓。
[0057] 在一些情况下，将MSC富集整联蛋白α10高群体在塑料培养皿中培养并诱导表达整联蛋白α10。
[0058] 在一些实施方案中，在包含哺乳动物血清和FGF-2的培养基中培养细胞。在一些实施方案中，在包含血小板裂解物和/或血小板裂解物组分的培养基中培养细胞。术语“血小板裂解物组分”是指仅包含通常在血小板裂解物中发现的一些元素的组合物。例如，可以选择或取消选择特异性生长因子。在一些实施方案中，在包含FGF-2和血小板裂解物和/或血小板裂解物组分的培养基中培养细胞。在一些实施方案中，在包含哺乳动物血清和血小板裂解物和/或血小板裂解物组分的培养基中培养细胞。在一些实施方案中，在包含TGFβ的培养基中培养细胞。在一些实施方案中，在无血清培养基中培养细胞。在一些实施方案中，在包含血小板裂解物和/或血小板裂解物组分的无血清培养基中培养细胞。在一些实施方案中，在包含生长因子例如FGF-2和/或TGFβ的无血清培养基中培养细胞。在一些实施方案中，在包含哺乳动物血清的培养基中培养细胞，并且所述哺乳动物血清是胎牛血清。如上所述的培养基的例子均适用于诱导细胞表达整联蛋白α10。然而，仍存在适用于诱导细胞表达整联蛋白α10的其他培养基，并且是本领域技术人员已知的。
[0059] 在一些实施方案中，MSC富集整联蛋白α10高群体是体外细胞培养物。
[0060] 在一些实施方案中，在还包含抗坏血酸的培养基中培养细胞。
[0061] 在一些实施方案中，将细胞储存在还包含二甲基亚砜(DMSO)的培养基中。为了储存目的，DMSO可以按包括在总培养体积的0与12％之间的体积存在于培养基中，优选至少1％，诸如至少2％，例如至少3％，优选至少4％，诸如至少5％，例如至少6％，优选至少7％，诸如至少8％，例如至少9％，优选总培养体积的至少10％。由于DMSO便于细胞培养物的冷冻和解冻，使得可以在解冻后将细胞直接给予有需要的受试者，因此它有益于细胞的储存。也可以在解冻后通过洗涤细胞除去DMSO。
[0062] 在一些实施方案中，DMSO通过减少急性创伤继发的软组织肿胀、炎症和水肿，增加的血流量和促进血管扩张而便于MSC的预防或治疗作用
[0063] 在一些实施方案中，本发明包含表达整联蛋白α10、CD44、CD90和CD105并且不表达MHCII和CD45的MSC。
[0064] 在一些实施方案中，MSC群体源自胎儿、新生儿、青少年或成人MSC和/或祖细胞。
[0065] 在一些实施方案中，MSC群体不是源自胚胎细胞或胚胎。
[0066] 在一些实施方案中，本发明包括体外细胞培养物，其包括表达整联蛋白α10亚基的未分化MSC。
[0067] 在一些实施方案中，细胞源自脂肪或骨髓组织。在一些实施方案中，培养物中的细胞具有分化为软骨细胞的能力。在一些实施方案中，分化后，细胞培养物包含至少1％、至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少
20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的软骨细胞。在一些实施方案中，细胞在含有血清和至少一种增殖诱导生长因子的培养基中分裂。在一些实施方案中，在除去血清和增殖诱导生长因子后，培养物中的细胞分化为软骨细胞。在一些实施方案中，至少一种增殖诱导生长因子选自成纤维细胞生长因子(FGF)-2或血小板裂解物或其组合。
20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的软骨细胞。在一些实施方案中，细胞在含有血清和至少一种增殖诱导生长因子的培养基中分裂。在一些实施方案中，在除去血清和增殖诱导生长因子后，培养物中的细胞分化为软骨细胞。在一些实施方案中，至少一种增殖诱导生长因子选自成纤维细胞生长因子(FGF)-2或血小板裂解物或其组合。
[0068] 在一些实施方案中，本发明包括培养皿中的MSC群体，其中所述细胞与含有诱导整联蛋白α10表达的成分的培养基接触或以前曾与其接触，并且其中整联蛋白α10阳性细胞的百分比占总细胞的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％。优选地，富集整联蛋白α10高群体中包含的整联蛋白α
10阳性细胞的百分比占总细胞的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少
85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％。
10阳性细胞的百分比占总细胞的至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少
85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％。
[0069] 在一些实施方案中，本发明包括悬浮培养物中的MSC，其中所述细胞表达整联蛋白α10亚基或整联蛋白α10多肽。
[0070] 在一些实施方案中，悬浮细胞大量形成细胞聚集体。例如，细胞聚集体可以处于沉淀或球状体的形式。在一些实施方案中，在含有增殖诱导生长因子的培养基中维持细胞聚集体。
[0071] 在一些实施方案中，MSC富集整联蛋白α10高群体进一步表达CD44、CD90或CD105中的至少一种。在一些实施方案中，MSC富集整联蛋白α10高群体进一步表达CD44、CD90和/或CD105中的两种。在一些实施方案中，MSC富集整联蛋白α10高群体不表达MHCII或CD45。
[0072] 在一些实施方案中，培养物中的细胞来自人类、鼠、犬或马。在一些实施方案中，培养物中的细胞来自人类。在一些实施方案中，培养物中的细胞来自马。在一些实施方案中，培养物中的细胞来自犬。
[0073] 在一些实施方案中，富集整联蛋白α10高群体中的细胞选自间充质干细胞、间充质祖细胞和间充质基质细胞。
[0074] 在一些实施方案中，富集整联蛋白α10高群体中的细胞源自人类胎儿、新生儿、青少年或成人MSC。在一些实施方案中，培养物中的细胞不是源自人类胚胎细胞或人类胚胎。
[0075] 在一些实施方案中，培养MSC以数次扩增并诱导整联蛋白α10的表达。
[0076] 在一些实施方案中，MSC粘附于塑料培养皿。在一些实施方案中，丢弃非贴壁细胞。
[0077] 在一些实施方案中，通过添加成分确定的培养基诱导整联蛋白α10表达。在一些实施方案中，该成分确定的培养基是补充有胎牛血清和FGF-2的DMEM、补充有血小板裂解物的DMEM、或市售的在化学上定义的具有与FGF-2或血小板裂解物执行相同功能的因子的培养基。在一些实施方案中，MSC富集整联蛋白α10高群体在包含DMEM/F12、PRIME- MSC Expansion SFM或STEMMACS的培养基中培养。
[0078] 在一些实施方案中，用抗整联蛋白α10抗体分离表达整联蛋白α10的细胞。例如，抗整联蛋白α10抗体可以是单克隆抗体。在一些实施方案中，通过用人类整联蛋白α10多肽免疫小鼠产生抗体。在一些实施方案中，丢弃不表达整联蛋白α10的细胞。
[0079] 在一些实施方案中，将富集表达整联蛋白α10的MSC的体外细胞培养物或从体外细胞培养物中分离的表达整联蛋白α10的MSC冷冻并储存在由例如环烯烃共聚物(COC)或任何等同材料制成的封闭塑料小瓶中。在给予有此需要的受试者之前，将冷冻的细胞解冻并且可以在不进一步处理的情况下或在洗涤后给予。
[0080] 在一些实施方案中，在给予MSC群体之前，通常甚至在冷冻之前将其配制成细胞聚集体。细胞聚集体可以处于球状体或沉淀的形式。以细胞聚集体形式给予细胞是有利的，因为它们具有更好的归巢能力并且更好地模拟软骨。
[0081] 在一些实施方案中，将富集表达整联蛋白α10的MSC的体外细胞培养物或从体外细胞培养物中分离的表达整联蛋白α10的MSC用作体细胞治疗药物产品或组织工程产品。
[0082] 治疗方法
[0083] 本公开文本涉及用于预防和/或治疗软骨下骨硬化和/或骨软骨损害的方法，其包括向有需要的受试者给予MSC富集整联蛋白α10高群体。
[0084] 本公开文本涉及用于预防和/或治疗退行性关节病(DJD)、创伤性关节损伤和/或椎间盘退行性疾病的方法，其包括向有需要的受试者给予MSC富集整联蛋白α10高群体。
[0085] 在一些实施方案中，DJD选自软骨下骨硬化、软骨下骨病、软骨变性、创伤后骨关节炎、炎性关节炎和先天性畸形和/或肌肉骨骼系统变形。
[0086] 在一些实施方案中，创伤性关节损伤包括运动损伤。
[0087] 在一些实施方案中，创伤性关节损伤选自骨软骨损害、肌腱损害、韧带损害和肌肉损害。
[0088] 在一些实施方案中，骨软骨损害包括关节软骨损害和/或骨骼损害。
[0089] 在一些实施方案中，本公开文本的方法可用于治疗或预防关节炎。
[0090] 在上文“组成”的部分中详细描述了此处公开的方法中使用的MSC富集整联蛋白α高10 群体。
[0091] 此处公开的方法的一个优点是，由于整联蛋白α10的表达，MSC富集整联蛋白α10高群体可有效地呈高粘附性并且可以容易地附接于受损的骨骼或软骨。
[0092] 在一些实施方案中，此处所公开的预防软骨下骨硬化和/或骨软骨损害的方法包括在关节损伤后不久，例如同一天、在一周内、两周内、三周内、一个月内、两个月内、三个月内或损伤后不到一年内，给予诱导表达整联蛋白α10的MSC细胞。给予的MSC例如可以修复骨骼和软骨中的初始损害，从而预防软骨下骨硬化和进行性软骨退化，或使其的发展最小化，否则其可能发展成骨关节炎。事实上，作为进行性退行性关节障碍，骨关节炎的特征在于软骨损害、软骨下骨的变化、骨赘形成、肌肉无力以及滑膜组织和肌腱的炎症。尽管骨关节炎长期以来被认为是关节软骨的原发性障碍，但软骨下骨正引起越来越多的关注。据普遍报道，它在骨关节炎的发病机制中起着至关重要的作用。软骨下骨硬化与进行性软骨退化一起被广泛认为是骨关节炎的标志(Guangyi Li,Jimin Yin,Junjie Gao,Tak S Cheng,Nathan J Pavlos,Changqing Zhang,和Ming H Zheng；Subchondral bone in osteoarthritis:insight into risk factors and microstructural changes；Arthritis Res Ther.2013；15(6):223；和 S,Roman-Blas JA,Largo R,
Herrero-Beaumont G；Subchondral bone as a key target for osteoarthritis treatment；Biochem Pharmacol.2012年2月1日；83(3):315-23)。此外，骨软骨病变或剥脱性骨软骨炎可发生在任何关节，但在膝盖和踝关节最常见。这种病变是覆盖关节中的骨骼之一的软骨的撕裂或骨折。软骨可以被撕裂、压碎或损害，并且在极少数情况下，软骨中可以形成囊肿。本公开文本提供了治疗软骨下骨硬化的方法，因此可以使用相同的方法成功预防骨关节炎。
Herrero-Beaumont G；Subchondral bone as a key target for osteoarthritis treatment；Biochem Pharmacol.2012年2月1日；83(3):315-23)。此外，骨软骨病变或剥脱性骨软骨炎可发生在任何关节，但在膝盖和踝关节最常见。这种病变是覆盖关节中的骨骼之一的软骨的撕裂或骨折。软骨可以被撕裂、压碎或损害，并且在极少数情况下，软骨中可以形成囊肿。本公开文本提供了治疗软骨下骨硬化的方法，因此可以使用相同的方法成功预防骨关节炎。
[0093] 在一些实施方案中，此处公开的治疗软骨下骨硬化和/或骨软骨损害的方法包括将诱导表达整联蛋白α10的MSC细胞给予被诊断患有软骨下骨硬化和/或骨软骨损害的受试者。给予的诱导表达整联蛋白α10的MSC细胞可以减少关节软骨下层的增厚和/或减少关节中骨密度的增加，从而治疗软骨下骨硬化和/或骨软骨损害。
[0094] 如在此使用的，“骨软骨损害或损伤”是骨骼末端的光滑表面(称为关节软骨(软骨))以及其下方的骨骼(骨(osteo))的损害。损伤程度的范围为关节内部的小裂缝到断裂的骨块。这些碎片可以具有多种尺寸和深度，并且在关节内可以附接(稳定)到受伤的区域或变得松散(不稳定)。这种损伤在青少年和年轻人中更常见，典型地发生在膝盖、踝关节或肘部。具体地，公认的骨软骨缺损部位是：股骨髁(最常见)；肱骨头；距骨；和肱骨小头。该术语包括剥脱性骨软骨炎，并且与骨软骨损害或损伤是同义的。
[0095] 在一些实施方案中，所述方法包括治疗受试者的骨关节炎，其包括将MSC富集整联蛋白α10高群体或使用抗整联蛋白α10抗体从MSC群体中分离的MSC给予患有骨关节炎或有患骨关节炎风险的受试者，从而治疗骨关节炎。
[0096] 在一些实施方案中，所述方法包括延迟或预防受试者的骨关节炎的进展，其包括高将使用抗整联蛋白α10抗体从MSC群体中分离的MSC富集整联蛋白α10 群体给予患有骨关节炎的受试者，其中与未给予MSC的对照相比，骨关节炎的进展被延迟。
[0097] 在一些实施方案中，所述方法包括治疗软骨下骨硬化，其包括给予MSC富集整联蛋白α10高群体或使用抗整联蛋白α10抗体从MSC群体分离的MSC，从而治疗软骨下骨硬化。
[0098] 在一些实施方案中，治疗软骨下骨硬化包括预防或逆转关节周围骨骼形成的增加。在一些实施方案中，治疗软骨下骨硬化包括预防或减少关节的软骨下层增厚或者预防或减少关节骨密度的增加。
[0099] 在一些实施方案中，所述方法包括治疗退行性骨和关节病，其包括给予MSC富集整联蛋白α10高群体或使用抗整联蛋白α10抗体从MSC群体分离的MSC，从而治疗退行性骨关节病。
[0100] 在一些实施方案中，所述方法包括预防退行性骨和关节病，其包括给予MSC富集整联蛋白α10高群体或使用抗整联蛋白α10抗体从MSC群体分离的MSC，从而预防退行性骨关节病。
[0101] 在一些实施方案中，软骨下骨硬化或骨软骨损害是退行性关节病或先天性畸形和/或肌肉骨骼系统的变形。
[0102] 在一些实施方案中，软骨下骨硬化或骨软骨损害是选自骨关节、炎性关节炎、椎间盘退行性疾病、运动损伤、创伤性关节损伤的退行性关节病。
[0103] 在一些实施方案中，所述方法包括治疗运动损伤，其包括给予MSC富集整联蛋白α10高群体或使用抗整联蛋白α10抗体从MSC群体分离的MSC，从而治疗运动损伤。
[0104] 在一些实施方案中，所述方法包括治疗创伤后骨关节炎(PTOA)，其包括给予MSC富集整联蛋白α10高群体或使用抗整联蛋白α10抗体从MSC群体分离的MSC，从而治疗PTOA。
[0105] 在一些实施方案中，给予此处描述的MSC组合物导致给予部位的胶原产生增加。在一些实施方案中，给予所述组合物导致II型胶原合成的增加。在一些实施方案中，使用前胶原II C-前肽测定来测量II型胶原合成的增加，所述ProCollagen II C-前肽测定测量胶原形成中释放的羧基前肽，从而反映II型胶原合成速率的变化。与对照肢体相比，来自治疗肢体的滑液中的CPII倾向于更多。在一些实施方案中，给予所述组合物导致蛋白多糖的产生增加和/或润滑素的增加。
[0106] 在一些实施方案中，治疗受试者的软骨裂缝的方法包括给予MSC富集整联蛋白α10高群体或使用抗整联蛋白α10抗体从MSC群体分离的MSC，从而治疗软骨裂缝。在一些实施方案中，软骨裂缝包括软骨纤维性颤动。在一些实施方案中，软骨裂缝位于关节软骨或骨骼末端的软骨中。在一些实施方案中，当软骨层内的裂解导致层之间的分离时，软骨裂缝就会形成。软骨裂隙可以是骨软骨损害、软骨损害或损伤。
[0107] 在一些实施方案中，治疗软骨裂缝包括减少损伤区域中的结构性损害。在一些实施方案中，治疗软骨裂缝包括预防软骨损害。
[0108] 在一些实施方案中，MSC以细胞聚集体的形式给予。在一些实施方案中，MSC以沉淀形式给予。将MSC以沉淀的方法给予是本领域技术人员已知的(参见Bartz等人,J.Transl.Med.14:317(2016)，特此通过引用并入)。在一些实施方案中，MSC可以在分化为软骨细胞后作为球状体或作为基质相关的软骨细胞植入物给予。这些给予形式导致细胞更容易归巢到受损部位。
[0109] 在一些实施方案中，MSC富集整联蛋白α10高群体作为细胞悬浮液给予。给予药学有效量的MSC。MSC可以与药学上可接受的赋形剂一起给予。
[0110] 在一些实施方案中，将MSC富集整联蛋白α10高群体给予患有或以前曾患有骨软骨损害、软骨损害或者关节或骨骼损伤的受试者。在一些实施方案中，骨软骨损害、软骨损害或损伤是断裂、扭伤、挫伤或撕裂。例如，所述损害可以是软骨裂缝或韧带纤维性颤动。在一些实施方案中，骨软骨损害、软骨损害或损伤是软骨微骨折。在一些实施方案中，骨软骨损害、软骨损害或损伤是软骨缺损。在一些实施方案中，骨软骨损害、软骨损害或损伤是佩戴假体的结果。例如，骨软骨损害、软骨损害或关节损伤是在肌肉、肌腱、骨骼、韧带、软骨或半月板中。
[0111] 在一些实施方案中，将MSC富集整联蛋白α10高群体给予患有骨排列不齐的受试者。
[0112] 在损伤后，可给予MSC富集整联蛋白α10高群体以预防疾病的发作。在受伤关节和/或骨骼部位的外科修复期间，可在损伤后给予MSC富集整联蛋白α10高群体。在一些实施方案中，在断裂后固定骨骼的同时，例如在修复发生骨折的骨骼时，给予MSC富集整联蛋白α10高群体。
[0113] 在一些实施方案中，MSC富集整联蛋白α10高群体具有抗炎作用。然而，MSC富集整联蛋白α10高群体可以在给予诸如例如抗炎剂等的另一种疗法的同时、之前或之后给予。
[0114] 在一些实施方案中，可以将MSC富集整联蛋白α10高群体给予至关节腔。MSC富集整联蛋白α10高群体可以通过注射给予。
[0115] 在一些实施方案中，将MSC富集整联蛋白α10高群体给予受试者，其中受试者是人类、马、矮种马、公牛、驴、骡、骆驼科动物、猫、狗、猪或母牛。在优选的实施方案中，受试者是人类。在其他优选的实施方案中，受试者是马。在进一步优选的实施方案中，受试者是狗。
[0116] 在一些实施方案中，给予的MSC富集整联蛋白α10高群体是同种异体的或自体的。在一些实施方案中，MSC富集整联蛋白α10高群体和受试者来自相同的物种或属。在一些实施方案中，MSC富集整联蛋白α10高群体和受试者来自不同的物种或属。
[0117] 在一些实施方案中，将富集表达整联蛋白α10的MSC的体外细胞培养物或从体外细胞培养物中分离的表达整联蛋白α10的MSC作为体细胞治疗药物产品或组织工程产品给予。
[0118] 制造方法
[0119] 本公开文本的一个方面涉及一种制造如本文所公开的MSC富集整联蛋白α10高群体的方法，所述方法包括：
[0120] a.从脂肪组织、骨髓、滑膜、脐血、华通氏胶或羊水中分离干细胞群体；
[0121] b.在塑料培养容器中培养所分离的细胞；
[0122] c.丢弃非贴壁细胞；
[0123] d.通过添加培养基诱导整联蛋白α10表达，其中所述培养基为无血清培养基或包含哺乳动物血清的培养基，并且其中所述培养基包含血小板裂解物和/或血小板裂解物组分和/或生长因子
[0124] e.选择表达整联蛋白α10的细胞，以及
[0125] f.扩增所选细胞，从而产生MSC富集整联蛋白α10高群体。
[0126] 在一些实施方案中，在整联蛋白α10表达诱导过程中将细胞在上文“组成”的部分中详细描述的培养基中培养。
[0127] 在一些实施方案中，如上文所述，使用抗整联蛋白α10抗体在步骤e中选择表达整联蛋白α10的细胞。
[0128] 在一些实施方案中，在上文“组成”的部分中描述了获得的MSC富集整联蛋白α10高群体。
[0129] 在一些实施方案中，在不包含哺乳动物血清的培养基中培养细胞。例如，在一些实施方案中，在包含血小板裂解物或血小板裂解物组分或者由其组成的培养基中培养细胞。
[0130] 条款
[0131] 1.一种间充质干细胞(MSC)富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC群体的至少60％的细胞表达整联蛋白α10亚基。
[0132] 2.根据条款1的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述群体中包含的总细胞的至少65％，诸如至少70％，诸如至少75％，诸如至少80％，诸如至少85％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少96％，诸如至少97％，诸如至少98％，诸如至少99％，诸如至少100％，表达整联蛋白α10亚基。
[0133] 3.根据前述条款中任一项的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述细胞被诱导表达整联蛋白α10亚基。
[0134] 4.根据前述条款中任一项的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含哺乳动物血清和FGF-2的培养基中培养所述细胞。
[0135] 5.根据前述条款中任一项的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含血小板裂解物和/或血小板裂解物组分的培养基中培养所述细胞。
[0136] 6.根据前述条款中任一项的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含FGF-2和血小板裂解物和/或血小板裂解物组分的培养基中培养所述细胞。
[0137] 7.根据前述条款中任一项的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含哺乳动物血清和血小板裂解物和/或血小板裂解物组分的培养基中培养所述细胞。
[0138] 8.根据前述条款中任一项的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含TGFβ的培养基中培养所述细胞。
[0139] 9.根据前述条款中任一项的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含血小板裂解物和/或血小板裂解物组分的无血清培养基中培养所述细胞。
[0140] 10.根据前述条款中任一项的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含生长因子的无血清培养基中培养所述细胞。
[0141] 11.根据前述条款中任一项的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含生长因子FGF2和/或TGFβ的无血清培养基中培养所述细胞。
[0142] 12.根据前述条款中任一项的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述群体是体外细胞培养物。
[0143] 13.一种用抗整联蛋白α10抗体从前述条款中任一项的群体中分离的MSC。
[0144] 14.一种用在用于预防或治疗退行性关节病(DJD)、创伤性关节损伤和/或椎间盘高退行性疾病的方法中的MSC富集整联蛋白α10 群体，
[0145] 其中所述MSC群体的至少60％的细胞表达整联蛋白α10亚基，并且
[0146] 其中所述MSC选自间充质干细胞、间充质祖细胞和间充质基质细胞。
[0147] 15.一种用在用于预防或治疗退行性关节病(DJD)、创伤性关节损伤、椎间盘退行性疾病、软骨退变、软骨下骨硬化、创伤后骨关节炎、炎性关节炎、软骨下骨疾病、运动损伤、骨软骨损害、关节软骨损害、骨骼损害、肌腱损害、韧带损害和/或肌肉损害的方法中的MSC富集整联蛋白α10高群体，
[0148] 其中所述MSC群体的至少60％的细胞表达整联蛋白α10亚基，并且
[0149] 其中所述MSC选自间充质干细胞、间充质祖细胞和间充质基质细胞。
[0150] 16.用于根据条款14使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中DJD选自软骨下骨硬化、软骨下骨病、软骨变性、创伤后骨关节炎、炎性关节炎和先天性畸形和/或肌肉骨骼系统的变形。
[0151] 17.用于根据条款14和16中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述创伤性关节损伤包括运动损伤。
[0152] 18.用于根据条款14至17中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述创伤性关节损伤选自骨软骨损害、肌腱损害、韧带损害和肌肉损害。
[0153] 19.用于根据条款14和18中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述骨软骨损害包括关节软骨损害和/或骨骼损害。
[0154] 20.一种用于促进或诱导骨折愈合的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC群体的至少60％的细胞表达整联蛋白α10亚基，其中所述MSC选自间充质干细胞、间充质祖细胞和间充质基质细胞。
[0155] 21.用于根据条款14至20中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述群体中包含的总细胞的至少65％，诸如至少70％，诸如至少75％，诸如至少80％，诸如至少85％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少96％，诸如至少97％，诸如至少98％，诸如至少99％，诸如至少100％，表达整联蛋白α10亚基。
[0156] 22.根据条款14至21中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述细胞被诱导表达整联蛋白α10亚基。
[0157] 23.用于根据条款14-22中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含哺乳动物血清和FGF-2的培养基中培养所述细胞。
[0158] 24.用于根据条款14至23中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含血小板裂解物和/或血小板裂解物组分的培养基中培养所述细胞。
[0159] 25.用于根据条款14至24中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含血小板裂解物和/或血小板裂解物组分的无血清培养基中培养所述细胞。
[0160] 26.用于根据条款14至25中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含生长因子的无血清培养基中培养所述细胞，其中所述生长因子是FGF2和/或TGFβ。
[0161] 27.用于根据条款14至26中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含FGF-2和血小板裂解物和/或血小板裂解物组分的培养基中培养所述细胞。
[0162] 28.用于根据条款14至27中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含哺乳动物血清和血小板裂解物和/或血小板裂解物组分的培养基中培养所述细胞。
[0163] 29.用于根据条款14至28中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中在包含TGFβ的培养基中培养所述细胞。
[0164] 30.用于根据条款14至29中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述血清是胎牛血清。
[0165] 31.用于根据条款14至30中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述群体是体外细胞培养物。
[0166] 32.用于根据条款14至31中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述培养基还包含抗坏血酸。
[0167] 33.用于根据条款14至32中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC选自间充质干细胞、间充质祖细胞和间充质基质细胞。
[0168] 34.用于根据条款14至33中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述整联蛋白α10与整联蛋白β1亚基组合表达为异源二聚体。
[0169] 35.根据条款14至34中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中用抗整联蛋白α10抗体分离表达整联蛋白α10的所述细胞。
[0170] 36.根据条款14至35中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述抗整联蛋白α10抗体是单克隆抗体。
[0171] 37.用于根据条款14至36中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述抗体是通过用人类整联蛋白α10多肽免疫小鼠产生的。
[0172] 38.用于根据条款14至37中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC的特征还在于不存在MHCII和CD45。
[0173] 39.用于根据条款14至38中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC的特征还在于存在CD44、CD90和CD105。
[0174] 40.用于根据条款14至39中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述细胞源自脂肪组织、骨髓、滑膜、外周血、脐血、脐带血、华通氏胶或羊水。
[0175] 41.用于根据条款14至40中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述细胞源自脂肪组织。
[0176] 42.用于根据条款14至41中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述细胞源自骨髓。
[0177] 43.用于根据条款14至42中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述群体用于用在预防软骨下骨病和/或骨软骨损害的方法中。
[0178] 44.用于根据条款14至43中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述群体用于用在治疗软骨下骨病和/或骨软骨损害的方法中。
[0179] 45.用于根据条款14至44中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述受试者具有或以前曾患有骨软骨损害、软骨损害或者关节或骨骼损伤。
[0180] 46.用于根据条款14至45中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是断裂、扭伤、挫伤、撕裂、骨折或破裂。
[0181] 47.用于根据条款14至46中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是软骨裂缝。
[0182] 48.用于根据条款14至47中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是软骨微骨折。
[0183] 49.用于根据条款14至48中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是软骨缺损。
[0184] 50.用于根据条款14至49中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是肌腱破裂或韧带破裂。
[0185] 51.用于根据条款14至50中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是骨折。
[0186] 52.用于根据条款14至51中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述损伤是运动损伤。
[0187] 53.用于根据条款14至52中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述受试者患有骨排列不齐。
[0188] 54.用于根据条款14至53中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是佩戴假体的结果。
[0189] 55.用于根据条款14至54中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述骨软骨损害、软骨损害或关节损伤在肌肉、肌腱、骨骼、韧带、软骨或半月板中。
[0190] 56.用于根据条款14至55中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述方法预防由软骨下骨病或骨软骨损害引起的创伤后骨关节炎(PTOA)。
[0191] 57.用于根据条款14至56中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC是同种异体的或自体的。
[0192] 58.用于根据条款14至57中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中将所述MSC给予至关节腔中。
[0193] 59.用于根据条款14至58中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC群体通过注射给予。
[0194] 60.用于根据条款14至59中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC群体与药学上可接受的赋形剂一起在细胞悬浮液中给予。
[0195] 61.用于根据条款14至60中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中将所述MSC群体在给予之前配制成细胞聚集体。
[0196] 62.用于根据条款14至61中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中将所述MSC群体在手术期间给予以修复受损的关节和/或骨骼。
[0197] 63.用于根据条款14至62中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中将所述MSC群体在断裂后固定骨骼的同时给予。
[0198] 64.用于根据条款14至63中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述受试者是人类、马、矮种马、公牛、驴、骡、骆驼科动物、猫、狗、猪或母牛。
[0199] 65.用于根据条款14至64中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述受试者是人类。
[0200] 66.用于根据条款14至65中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述受试者是马。
[0201] 67.用于根据条款14至66中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述受试者是狗。
[0202] 68.用于根据条款14至67中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC和受试者来自相同的物种或属。
[0203] 69.用于根据条款14至68中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC和受试者来自不同的物种或属。
[0204] 70.用于根据条款14至69中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述细胞源自胎儿、新生儿、青少年或成人MSC和/或祖细胞。
[0205] 71.用于根据条款14至70中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述细胞不是源自胚胎细胞或胚胎。
[0206] 72.用于根据条款14至71中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述给予导致给予部位的胶原产生、蛋白多糖产生和/或润滑素的增加。
[0207] 73.用于根据条款14至72中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其还包括与所述MSC组合给予抗炎剂。
[0208] 74.用于根据条款14至73中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC不表达MHCII和CD45。
[0209] 75.用于根据条款14至74中任一项使用的MSC富集整联蛋白α10高群体，其中所述MSC表达CD44、CD90和CD105。
[0210] 76.MSC富集整联蛋白α10高群体用于制备预防或治疗退行性关节病(DJD)、创伤性关节损伤和/或椎间盘退行性疾病的药剂的用途，其中所述群体中包含的总细胞的至少60％表达整联蛋白α10亚基，并且其中所述MSC选自间充质干细胞、间充质祖细胞和间充质基质细胞。
[0211] 77.一种治疗和/或预防受试者的退行性关节病(DJD)、创伤性关节损伤和/或椎间盘退行性疾病的方法，其包括向有患软骨下骨硬化风险或患有软骨下骨硬化的受试者给予MSC富集整联蛋白α10高群体，从而治疗和/或预防退行性关节病(DJD)、创伤性关节损伤和/或椎间盘退行性疾病，其中所述MSC群体的至少60％的细胞表达整联蛋白α10亚基，并且其中所述MSC选自间充质干细胞、间充质祖细胞和间充质基质细胞。
[0212] 78.根据条款76和77中任一项的用途或方法，其中所述DJD选自软骨下骨硬化、软骨下骨病、软骨变性、创伤后骨关节炎、炎性关节炎和先天性畸形和/或肌肉骨骼系统的变形。
[0213] 79.根据条款76至78中任一项的用途或方法，其中所述创伤性关节损伤包括运动损伤。
[0214] 80.根据条款76至79中任一项的用途或方法，其中所述创伤性关节损伤选自骨软骨损害、肌腱损害、韧带损害和肌肉损害。
[0215] 81.根据条款76至80中任一项的用途或方法，其中所述骨软骨损害包括关节软骨损害和/或骨骼损害。
[0216] 82.根据条款76至81中任一项的用途或方法，其中所述群体中包含的总细胞的至少65％，诸如至少70％，诸如至少75％，诸如至少80％，诸如至少85％，诸如至少90％，诸如至少95％，诸如至少96％，诸如至少97％，诸如至少98％，诸如至少99％，诸如至少100％，表达整联蛋白α10亚基。
[0217] 83.根据条款76至82中任一项的用途或方法，其中所述细胞被诱导表达整联蛋白α10亚基。
[0218] 84.根据条款76至83中任一项的用途或方法，其中所述干细胞源自脂肪组织、骨髓、滑膜、外周血、脐血、脐带血、华通氏胶或羊水。
[0219] 85.根据条款76至84中任一项的用途或方法，其中所述MSC源自脂肪组织。
[0220] 86.根据条款76至85中任一项的用途或方法，其中所述MSC源自骨髓。
[0221] 87.根据条款76至86中任一项的用途或方法，其中所述受试者患有或以前曾患有骨软骨损害、关节或骨的损害或损伤。
[0222] 88.根据条款76至87中任一项的用途或方法，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是断裂、扭伤、挫伤、撕裂、骨折或破裂。
[0223] 89.根据条款76至88中任一项的用途或方法，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是软骨微骨折。
[0224] 90.根据条款76至89中任一项的用途或方法，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是软骨缺损。
[0225] 91.根据条款76至90中任一项的用途或方法，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是肌腱破裂或韧带破裂。
[0226] 92.根据条款76至91中任一项的用途或方法，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是骨折。
[0227] 93.根据条款76至92中任一项的用途或方法，其中所述损伤是运动损伤。
[0228] 94.根据条款76至93中任一项的用途或方法，其中所述受试者患有骨排列不齐。
[0229] 95.根据条款76至94中任一项的用途或方法，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是佩戴假体的结果。
[0230] 96.根据条款76至95中任一项的用途或方法，其中所述骨软骨损害、软骨损害或关节损伤在肌肉、肌腱、骨骼、韧带、软骨或半月板中。
[0231] 97.根据条款76至96中任一项的用途或方法，其中所述骨软骨损害、软骨损害或损伤是软骨裂缝。
[0232] 98.根据条款76至97中任一项的用途或方法，其中所述用途或方法预防由软骨下骨病或骨软骨损害引起的创伤后骨关节炎(PTOA)。
[0233] 99.根据条款76至98中任一项的用途或方法，其中所述MSC是同种异体的或自体的。
[0234] 100.根据条款76至99中任一项的用途或方法，其中将所述MSC给予至关节腔中。
[0235] 101.根据条款76至100中任一项的用途或方法，其中所述MSC通过注射给予。
[0236] 102.根据条款76至101中任一项的用途或方法，其中所述MSC与药学上可接受的赋形剂一起在细胞悬浮液中给予。
[0237] 103.根据条款76至102中任一项的用途或方法，其中将所述MSC在给予之前配制成细胞聚集体。
[0238] 104.根据条款76至103中任一项的用途或方法，其中将所述MSC储存在包含二甲基亚砜(DMSO)的培养基中。
[0239] 105.根据条款76至104中任一项的用途或方法，其中将所述MSC在手术期间给予以修复受损的关节或骨骼。
[0240] 106.根据条款76至105中任一项的用途或方法，其中将所述MSC在断裂后固定骨骼的同时给予。
[0241] 107.根据条款76至106中任一项的用途或方法，其中所述受试者是人类、马、矮种马、公牛、驴、骡、骆驼科动物、猫、狗、猪或母牛。
[0242] 108.根据条款76至107中任一项的用途或方法，其中所述受试者是人类。
[0243] 109.根据条款76至108中任一项的用途或方法，其中所述受试者是马。
[0244] 110.根据条款76至109中任一项的用途或方法，其中所述受试者是狗。
[0245] 111.根据条款76至110中任一项的用途或方法，其中所述MSC和受试者来自相同物种或属。
[0246] 112.根据条款76至111中任一项的用途或方法，其中所述MSC和受试者来自不同的物种或属。
[0247] 113.根据条款76至112中任一项的用途或方法，其中所述细胞源自胎儿、新生儿、青少年或成人MSC和/或祖细胞。
[0248] 114.根据条款75至113中任一项的用途或方法，其中所述细胞不是源自胚胎细胞或胚胎。
[0249] 115.根据条款76至114中任一项的用途或方法，其中所述给予导致给予部位的胶原产生、蛋白多糖产生和/或润滑素的增加。
[0250] 116.根据条款76至115中任一项的用途或方法，其还包括与所述MSC组合给予抗炎剂。
[0251] 117.根据条款76至116中任一项的用途或方法，其中所述MSC不表达MHCII和CD45。
[0252] 118.根据条款76至117中任一项的用途或方法，其中所述MSC表达CD44、CD90和CD105。
[0253] 119.一种制造根据条款1至13中任一项的MSC富集整联蛋白α10高群体的方法，所述方法包括：
[0254] a.从脂肪组织、骨髓、滑膜、脐血、华通氏胶或羊水中分离干细胞群体；
[0255] b.在塑料培养容器中培养所分离的细胞；
[0256] c.丢弃非贴壁细胞；
[0257] d.通过添加培养基诱导整联蛋白α10表达，其中所述培养基为无血清培养基或包含哺乳动物血清的培养基，并且其中所述培养基包含血小板裂解物和/或血小板裂解物组分和/或生长因子；
[0258] e.选择表达整联蛋白α10的细胞，以及
[0259] f.扩增所选细胞，从而产生MSC富集整联蛋白α10高群体。
[0260] 120.根据条款119的方法，其中步骤d.中的所述培养基包含生长因子FGF2和/或TGFβ。
[0261] 实施例
[0262] 实施例1.马MSC的表征
[0263] 从骨髓(BM)和脂肪组织(AT)分离马MSC。在瑞典农业委员会的许可下，从健康的马尸体获得BM抽取液和颈部脂肪组织。
[0264] 将BM抽取液在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤并铺板到细胞培养瓶中以在补充有10％胎牛血清(FBS)(Biological Industries)、50μg/L成纤维细胞生长因子(FGF)-2(Miltenyi)和100U/mL抗生素-抗真菌剂(Gibco)的DMEM-F12培养基(Gibco)中粘附到塑料，并在37℃于含4％O2和5％CO2的加湿孵育器中孵育。24小时后，弃去非贴壁细胞并添加新鲜培养基。在大约80％汇合时，使用Accutase(Gibco)传代细胞，并在含有来自Cook Regentec的5％人类血小板裂解物(PL)、50μg/L FGF-2和抗生素-抗真菌剂的DMEM F-12培养基中以
104个细胞/cm2的密度重新铺板进行扩增。
104个细胞/cm2的密度重新铺板进行扩增。
[0265] 将来自马颈部的AT无菌切碎成小块，洗涤，之后用0.1％的1型胶原酶(Sigma-Aldrich)在37℃下伴随温和搅拌消化1.5小时。将样品以300xg离心5分钟，之后吸出脂肪细胞层和胶原酶上清液。用DMEM F-12培养基洗涤剩余的基质血管部分，通过100μm细胞过滤器过滤，并接种到含有补充10％FBS和抗生素-抗真菌剂的DMEM F-12的细胞培养瓶中，铺板密度为约35mL脂肪组织/200cm2。将细胞在37℃于含4％O2和5％CO2的加湿孵育器中孵育，24小时后，丢弃非贴壁细胞，添加含有DMEM F-12、5％PL和抗生素-抗真菌剂的培养基。每2-3天更换培养基，并在80％汇合时使用Accutase收获细胞，并在含有5％PL、50μg/L的FGF-2和抗生素-抗真菌剂的DMEM F-12培养基中以5000个细胞/cm2的细胞密度重新接种以进行扩增。
[0266] 在每次传代时，使用如下的一组细胞表面标志物通过流式细胞术分析对MSC进行免疫表型分型：整联蛋白α10β1(Xintela)、CD90(BD Pharmingen)、CD44、CD105、CD45和II类MHC(AdB Serotec)。简而言之，在补充有1％FBS和0.1％叠氮化钠的PBS中洗涤100,000个细胞，随后与选择性抗体一起孵育。孵育结束后，将细胞在缓冲液中洗涤两次，并使用BD Accuri C6流式细胞仪采集细胞。采集并分析至少20,000个细胞。结果表示为阳性细胞的百分比。
[0267] 用PL和FGF-2在缺氧条件下培养细胞。MSC通常在含有FGF-2的培养基中常规增殖，以保持干细胞样表型。然而，FGF-2在培养物中上调MSC上的MHC II的表达21。因此，最初仅用PL补充培养物。从BM或AT分离并在含有血小板裂解物的培养基中培养的MSC展现出良好的生长特征，倍增时间分别为1.9天(46小时)和1.6天(38小时)。源自AT和BM的细胞均显示出MSC的典型形态。
[0268] 通过流式细胞术连续监测细胞的整联蛋白α10、CD44、CD45、CD90和CD105的表达。MSC表达高水平的标志物CD44、CD90和CD105并且不表达造血细胞标志物CD45和II类MHC(HLA-DR)(图1)。
[0269] 对于人类MSC，细胞表型塑料粘附性和表面标志物CD73、CD90和CD105的表达以及CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19和HLA-DR表面分子的缺失符合MSC定义的最小表面抗原标准9。由于缺乏与马细胞表面标志物反应的经验证的抗体，未评价CD73、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19的表达。然而，源自AT和BM的细胞粘附到塑料，表达测试的MSC标志物，不表达CD45或II类MHC，并分化为软骨细胞。
[0270] 结论：表达整联蛋白α10的源自AT和BM的细胞粘附到塑料，表达测试的MSC标志物(CD44、CD90和CD105)，不表达CD45或II类MHC，并分化为软骨细胞。
[0271] 实施例2.MSC分化为软骨细胞
[0272] 根据文献，马MSC难以分化为软骨细胞16-18。然而，对人类AT-MSC的研究显示，这可能是由于缺乏TGFβ受体，因此对软骨形成诱导信号TGFβ1无反应9。这种缺陷可以通过添加20
BMP-6来克服，BMP-6将刺激源自人类AT的MSC中的TGFβ-受体表达 。经人类FGF-2处理的MSC上的整联蛋白α10表达上调，随后软骨形成分化潜能得到改善15。在含有胎牛血清的培养基和含有FGF-2的培养基中，在正常细胞培养中引发源自马AT的MSC的软骨形成分化。在不含添加的生长因子、仅含有TGFβ3或含有两种不同浓度的TGFβ3和BMP-6的培养基中孵育28天后，还是通过沉淀团块培养物中II型胶原表达来比较软骨形成分化。对源自马BM的MSC的软骨形成分化进行比较。
BMP-6来克服，BMP-6将刺激源自人类AT的MSC中的TGFβ-受体表达 。经人类FGF-2处理的MSC上的整联蛋白α10表达上调，随后软骨形成分化潜能得到改善15。在含有胎牛血清的培养基和含有FGF-2的培养基中，在正常细胞培养中引发源自马AT的MSC的软骨形成分化。在不含添加的生长因子、仅含有TGFβ3或含有两种不同浓度的TGFβ3和BMP-6的培养基中孵育28天后，还是通过沉淀团块培养物中II型胶原表达来比较软骨形成分化。对源自马BM的MSC的软骨形成分化进行比较。
[0273] 培养源自马AT的MSC并扩增至第3代，之后通过FACSAria(BD)进行整联蛋白α10荧光活化细胞分选术。使用单克隆抗整联蛋白α10(Xintela)对细胞进行染色，并将活细胞分成两个群体：整联蛋白α10阳性细胞和整联蛋白α10阴性细胞。对活/死细胞的鉴别伴有7-AAD染色(BioLegend)。将分选的细胞在培养基中洗涤，并在进行软骨形成分化实验之前重新接种以恢复和扩增一代。
[0274] 为了确定未分选和整联蛋白α10分选细胞的软骨形成分化能力，将第4代的200,000个MSC在含有软骨形成培养基的15mL聚丙烯管中沉淀，其中所述软骨形成培养基由补充有20μg/L TGFβ3、20μg/L BMP-6、50mg/L L-抗坏血酸-2-磷酸酯、1％胰岛素-转铁蛋白-硒(ITS)和100nM地塞米松(Sigma Aldrich)的含有4.5g葡萄糖/L(Gibco)的DMEM组成。测试各种生长因子浓度和这些的组合以优化源自马AT的MSC软骨形成分化条件。每周更换三次培养基，并通常维持28天或如软骨形成时间研究中所指示。将沉淀包埋在最佳切片温度复合物(HistoLab)中进行冷冻切片或快速冷冻，并在-80℃下储存用于RNA提取。在随后的免疫组织学染色和PCR实验中，将未诱导的软骨形成沉淀团块培养物用作阴性对照。
[0275] 将沉淀冷冻切片并用阿尔新蓝染色以检测蛋白多糖，或使用针对软骨特异性蛋白质II型胶原(Ab3092，Abcam)和整联蛋白α10(Xintela)的抗体进行免疫组织化学分析。
[0276] 结论：源自AT和BM的马MSC分化为软骨细胞。
[0277] 实施例3.整联蛋白α10表达水平与软骨形成分化潜能相关
[0278] 检查整联蛋白α10β1在源自马AT和BM的MSC上的表达。培养源自马AT的MSC并扩增至第3代，之后通过FACSAria(BD)进行整联蛋白α10荧光活化细胞分选术。使用单克隆抗整联蛋白α10β1抗体(Xintela)对细胞进行染色，并将活细胞分成两个群体：整联蛋白α10阳性细胞和整联蛋白α10阴性细胞。对活/死细胞的鉴别伴有7-AAD染色(BioLegend)。将分选的细胞在培养基中洗涤，并在进行软骨形成分化实验之前重新接种以恢复和扩增一代。
[0279] 整联蛋白α10表达的流式细胞术分析显示，与源自AT的MSC相比，源自BM的MSC中的整联蛋白α10的表达显著增加。几乎100％的源自BM的MSC是整联蛋白α10阳性，相比大约30％的源自AT的MSC(图2A-B)。
[0280] 为了检查整联蛋白α10对软骨形成分化的重要性，使用特异性单克隆抗体(mAb)通过荧光活化细胞分选术(FACSAria)将源自AT的MSC分选成两个不同的细胞群体(图3A)。如免疫荧光染色所示，所有整联蛋白α10高MSC表达整联蛋白α10β1，并且表达被定位于细胞表面(图3B)。然后扩增整联蛋白α10富集(α10高)和α10耗尽的(α10低)两个细胞群，并将它们用于沉淀团块培养中，并在此将它们与未分选的细胞进行比较。使用来自四个马供体的细胞。将分选的细胞转移至沉淀团块培养中，分化28天，切片并通过免疫组织化学进行分析。沉淀冷冻切片的免疫组织化学分析显示用整联蛋白α10高细胞得到的沉淀中II型胶原的强标记，而整联蛋白α10低沉淀中II型胶原较低(图4A-D)。
[0281] 用未分选和分选的((α10高)或(α10低))的源自AT的MSC的RNA进行沉淀团块培养物的基因表达分析。将GAPDH用作内源对照，未分选的细胞用作ΔΔCt计算的参考样品。
[0282] 通过使用Precellys裂解试剂盒珠和“均质器”在QIAzol中均质化沉淀来提取总RNA，随后根据RNeasy Lipid Tissue Mini试剂盒(QIAGEN)分离RNA。使用SuperScript VILO试剂盒(Invitrogen)将RNA逆转录成cDNA。根据StepOne Plus实时PCR系统装置(Applied Biosystems)中的方案，使用TaqMan测定对以下马基因转录物连同TaqMan通用主混合物II进行实时PCR：ACAN、COL1A1、COL2A1、GAPDH、RUNX2和SOX9。使用2-ΔΔCt方法计算相对mRNA表达，其中GAPDH是内源对照(ΔCt)并且针对未分选细胞标准化(ΔΔCt)[0283] 结论：基因表达结果显示，与整联蛋白α10低沉淀相比，整联蛋白α10高沉淀中II型胶原和聚集蛋白聚糖的表达较高，指示整联蛋白α10高分选细胞的沉淀中的软骨细胞分化较好(图5)。
[0284] 实施例4.整联蛋白α10表达水平与归巢潜能相关
[0285] 为了确定未分选和整联蛋白α10分选的细胞对完整或受损软骨的归巢能力，将MSC在具有牛骨软骨外植体的旋转塑料管中孵育1小时。这些外植体在两个位置处受伤。一个暴露了软骨下骨，一个具有仅暴露软骨的较浅伤口。1小时后，对未受损区域、软骨缺损和软骨下缺损的贴壁细胞分别计数(使用Image J细胞计数插件)。两次独立实验的结果如图6所示。整联蛋白α10高细胞整体上结合得更好(图6A)，并且比未分选细胞或整联蛋白α10低细胞更好地结合完整软骨(图6B)、软骨缺损(图6C)和软骨下缺损(图6D)。
[0286] 结论：这显示表达更高水平的整联蛋白α10的细胞(α10高细胞)在归巢到软骨修复的目的区域时更好。
[0287] 实施例5.患有创伤后骨关节炎(PTOA)的马中整联蛋白α10β1阳性MSC的调查研究[0288] 本研究评价了整联蛋白α10β1阳性MSC在马PTOA模型中的安全性和有效性。
[0289] A.动物和手术
[0290] 根据年龄(范围，2-5岁)选择纳入本研究的马。在招募前，对每匹马都进行了常规的全身体检和跛行评价，以排除可能会影响研究的身体系统异常，特别是肌肉骨骼和神经系统异常。只有确定马后肢健全且全身健康状况良好才招募到本研究中。
[0291] 抵达后，马被限制在马厩内。参数一次术前评价临床，术后3天内每天评价两次，然后术后10天内每天评价一次。每日体检包括重要参数、粘膜颜色、毛细血管再充盈时间、胃肠动力、数字脉冲、粪便和尿排出量、食欲和饮水量。体检值记录在每匹马各自的医疗记录中。委员会认证的兽医麻醉师诱导、维持和监测麻醉。对马进行镇静，然后根据麻醉师的判断并与本研究和IACUC方案一致，诱导和维持全身麻醉。必要时，按主治麻醉师的判断给予额外的药物或液体治疗。完成外科手术后，将马置于带衬垫的恢复盒中，采用侧卧位。为了恢复，对马匹给出额外的镇静处理。一旦马自发呼吸，就去除气管内导管。在麻醉恢复期间，连续监测马，一旦它们可以稳定站立并完全负载所有肢体，就让它们返回马厩。在诱导、全身麻醉或麻醉恢复期间没有遇到明显的并发症。麻醉的马被定位在背卧位，左右两个飞节被夹住。然后进行皮肤的无菌准备和常规的无菌覆盖。对飞节(距小腿关节)进行了标准的背侧入路。将18规格针置于关节中，收集滑液用于如下所述的分析。用盐水使所述关节扩张。在伸肌腱的侧面做5mm的刺切创口，插入关节镜。探查关节，并使用针来确定引入冲击器的入口位置。将冲击器定位在关节内，使得其尖端垂直于距骨的内侧滑车脊的轴向表面。在所述距骨的内侧滑车脊的轴向方向上施加三次间隔约1cm的冲击。在冲击过程中，由冲击器内的称重传感器记录冲击力。获得滑膜活检，用于组织学分析。在相对的肢体上重复该过程。获得所有外科手术的关节镜视频。使用不可吸收的缝合材料以简单的间断模式闭合皮肤切口，将关节包扎起来，并将马运送到恢复区。
[0292] B.制备和注射马整联蛋白α10选择的MSC
[0293] 在这些研究中利用根据实施例1-3制备的称为马整联蛋白α10选择的MSC的细胞，即下文中的“Eq12a10+.1细胞”。
[0294] 将Eq12a10+.1细胞储存在液氮中直至使用(冲击手术后4天)。将小瓶解冻，进行细6
胞计数，并使用台盼蓝评估活力。然后将细胞离心并以约6x 10 个细胞/ml的浓度重悬于PBS中。立即将细胞转移到治疗区域进行注射。
胞计数，并使用台盼蓝评估活力。然后将细胞离心并以约6x 10 个细胞/ml的浓度重悬于PBS中。立即将细胞转移到治疗区域进行注射。
[0295] 将3ml等份的细胞悬浮液和对照PBS通过3英寸、18规格针无菌地吸入6ml注射器中。经20-30秒缓慢抽吸细胞。为了准备注射，必要时对马进行化学和物理限制，并在双侧无菌备好距小腿关节的背内侧袋。首先注射接受测试物品的随机肢体，将19规格针插入距小腿关节的背内侧隔室，将滑液吸入3-ml注射器中，然后附接载药的注射器，以缓慢而稳定的速度清空溶液(经3-5秒)，以将超过100万个细胞递送到关节腔内。按照相同的程序将对照PBS注射到相对的肢体中。
[0296] 如上所述进行术前准备和麻醉以进行首次手术。麻醉的马被定位在背卧位，左右两个飞节被夹住、备好并且常规覆盖。对飞节进行标准的背外侧入路。将18规格针置于距小腿关节中，收集滑液用于如下所述的分析。用盐水使所述关节扩张。在伸肌腱的侧面为关节镜套管做5mm的刺切创口。使用ICRS评分方法对所述关节进行探查和评分。获得滑膜活检，用于组织学分析。在相对的肢体上重复该过程。使用不可吸收的缝合材料以简单的间断模式闭合皮肤切口，将飞节包扎起来，并将马运送到恢复区。术后恢复如上所述。
[0297] 在冲击手术之前即刻和术后第4天、第7天、第14天、第28天、第42天、第70天、第98天、第126天、第154天以及在安乐死的时候，从所有马吸出来自各距小腿的滑液样品。在除了冲击手术、测试物品注射和6周复查手术之外的时间点，根据需要对马进行化学和物理限制，并且在双侧无菌地备好距小腿关节的背内侧袋。将19规格针插入到距小腿关节的背内侧隔室中，并将滑液吸入3-mL注射器中。将大约1mL的抽吸物提交给康奈尔大学临床病理学实验室进行完整的滑液评价(涂片和差异计数)。将剩余的滑液样品离心以除去细胞沉淀，转移到微量离心管中并储存在-80℃冰柜中。
[0298] 在6个月时，根据AVMA指南静脉注射过量巴比妥酸盐(戊巴比妥)，对马进行镇静并对其人道地实施安乐死。通过无菌方法收集关节液，并由经委员会认证的兽医病理学家进行标准尸检。收集主要器官的组织样品用于组织学检查。收获距小腿关节，加标签用于鉴定，并包装以在冷却器中运输。关节始终伴随着监管链形式。
[0299] C.分析
[0300] 在MRI检查后，解剖并检查距小腿关节。收获滑膜的样品并将其固定用于组织学处理。将印度墨汁涂在关节面上，并获得数码照片。印度墨汁含有颗粒碳，粘附在软骨完整性受损的关节面区域。收集含有冲击部位以及未受冲击对照软骨的骨软骨块并固定用于组织学处理。
[0301] 对于具有超过一次采样的每个关节健康结果度量(跛行、滑液分析、滑液ELISA、关节镜得分、滑膜组织学)，将混合效应模型拟合到如下的数据，即以马匹作为随机效应且处理(对照或治疗)和时间作为固定效应，以及关于治疗*时间的相互作用项。适当时，使用Tukey事后检验和线性反差来测试特定目的组之间的差异。对软骨组织学和MRI得分进行配对t检验。使用JMP12(美国北卡罗来纳州凯瑞市SAS研究所)进行统计学分析。显著性设定为p<0.05。
[0302] 大多数分析的模型拟合是公允的(调整后的R2＝0.25-0.50)或良好的(R2＝0.50-0.75)，这被认为是动物体内研究可接受的。在一些情况下，模型拟合很差(调整后的R2＝<
0.25)。
0.25)。
[0303] D.射线照相结果
[0304] 汇总射线照相数据呈现于表5中。
[0305] 基线(术前)发现：在术前射线照相上，除了一匹马之外，其他所有马都有在射线照相上正常的飞节，没有硬化、关节周围骨赘、关节间隙变窄或关节肿大。一匹马在近中央跗骨的背内侧表面有轻度关节周围骨赘。这被记录并确定对于研究纳入标准是无关紧要的。
[0306] 软骨下骨硬化：在6个月的研究结束时，对照组具有比治疗组显著更多的硬化(图7；p＝0.004；调整后的R2＝0.03)。硬化指的是骨密度增加，使得骨更硬并且更不能吸收和传递远离关节软骨的力。硬化是骨关节炎的标志，可能是软骨退化的原因或结果。由于本研究是创伤后骨关节炎的模型系统，因此它遵循软骨下骨硬化的增加是关节创伤的结果，证实该模型诱导了骨关节炎。在研究结束时，对照组中硬化的增加表明，由于在负重期间传递的力的吸收增加，对照组中的软骨将随着时间继续恶化。
[0307] 结论：在6个月的研究终点，与对照相比，治疗肢体中基于射线照相发现的软骨下骨硬化较少。软骨下骨硬化可能导致持续的软骨恶化和关节炎的进展，并且这种效果预期会在运动时被放大。
[0308] E.滑液ELISA结果
[0309] 在手术后0、4、7、14、28、42、70、98、126、154和169天的时间点从左和右距小腿关节获得的滑液样品上进行六次ELISA。离心样品以除去细胞碎片并储存在-80℃直至分析。汇总数据呈现在下表9中。
[0310] 前列腺素E2(PGE-2)：MSC被认为是具有免疫调节性，部分被认为是PGE-2的上调。治疗组和对照组的PGE-2从时间0到28天增加。然后它急剧下降并在整个研究中保持低水平但高于基线值。在11个时间点中的9个，治疗组中PGE-2浓度与对照肢体相比更高。第28天时治疗肢体中的PGE-2与时间0、4、42、56、126和154天时对照相相比显著增加(图8)，表明与对照肢体相比，治疗肢体术后关节环境的调节增强。
[0311] 胶原CPII：该测定也称为前胶原II C-前肽测定。所述CPII测定测量胶原形成中释放的羧基前肽，因此反映了II型胶原合成速率的变化。与对照肢体相比，CPII在来自治疗肢体的滑液中倾向于更多(图9)，表明治疗肢体中II型胶原合成增加。与时间零和研究结束时相比，术后第7天和第14天，治疗肢体和对照肢体的CPII都增加了。
[0312] 胶原C2C：该测定测量通过胶原酶切割II型胶原产生的新表位(在3/4肽的C末端)。在术后第4-14天，治疗和对照关节中的C2C浓度显著增加(图10)，然后在整个研究中减少至与时间0无显著差异的值。与TNF-α一样，这支持将所述模型作为轻度创伤后骨关节炎模型之一。
[0313] F.软骨组织学结果
[0314] 所有H&E和番红O快绿染色的骨软骨切片通过研究者的共识进行评分，这些研究者在评分时对治疗组是不知情的。数据呈现在图11中，汇总数据见表11。对于所有马，在每个关节中检查两个未受冲击软骨区域：距骨的外侧滑车脊和胫骨的远端中间脊，其为与内侧滑车脊上的受冲击区域用关节连接的相对的关节表面。检查两个样品，然后为未受冲击软骨分配单个得分。对于所有马，检查包含三次冲击中每个的内侧滑车脊的病灶性区域，然后为每个关节的受冲击软骨分配单个得分。
[0315] 一般性观察-受冲击软骨：正如预期的那样，所有受冲击软骨区域都有中度到严重的异常软骨得分。
[0316] 总关节得分：结果显示MSC治疗导致裂缝/纤维性颤动的得分显著更好。与对照相比，治疗组中的所有其他成分得分以及总得分也更好(表11)。
[0317] 软骨裂缝/纤维性颤动：治疗关节的颤动/裂缝(图12，p＝0.039，单侧t检验)和三角纤维性颤动/裂缝(p＝0.030，单侧t检验)得分显著较低(更好)。这一发现证明，治疗关节在损伤区域的结构性损害小于对照。
[0318] 附加观察：在若干张载玻片中注意到软骨裂隙的愈合，这主观地说更常见于治疗肢体。先前未在创伤后骨关节炎的动物模型中注意到这种愈合型反应。在许多载玻片中也可以观察到软骨下骨硬化。
[0319] 表11.骨软骨组织学成分和总得分。数据代表平均值±S.E.
[0320]
[0321] F.骨软骨免疫组织化学(I型和II型胶原)结果
[0322] 在骨软骨切片上进行I型和II型胶原的免疫组织化学(图11)。还进行了印度墨汁染色(图13)。由于测定中固有的高变异性，未对免疫组织化学切片进行定量评估。
[0323] I型胶原-未受冲击(远距离)软骨：对于没有I型胶原染色的关节软骨的治疗肢体和未治疗对照肢体中的远距离对照样品，I型胶原的免疫组织化学在很大程度上不显著。
[0324] I型胶原-未受冲击软骨：I型胶原的染色被限制在受冲击区域，并且通常延伸到关节软骨表面的1/4-1/2。治疗肢体与对照肢体之间几乎没有变化，并且没有观察到差异。在修复组织的区域中(如“附加主观观察”中所述，仅在修复组织的更深的1/2中注意到染色)。
[0325] II型胶原-未受冲击(远端)软骨：对于II型胶原在整个软骨中均匀分布的对照样品，II型胶原的免疫组织化学特别不显著。
[0326] II型胶原-受冲击软骨：对照关节或治疗关节中II型胶原损失的区域很少。在冲击的紧邻区域，II型胶原的染色略微减少。与I型胶原相似，纤维修复区域仅在修复组织的较深层中有II型胶原染色。
[0327] 免疫调节趋化因子：本研究中最有MSC特异性的发现是与对照相比，Eq12a10+.1MSC治疗的关节中PGE-2浓度增加。PGE-2调节促炎细胞的趋化因子和趋化性，因此是免疫病理学的关键介质。所有细胞都能够产生PGE-2，并且已知MSC通过骨髓和基质细胞增加PGE-2的表达。在本研究中，滑液中的PGE-2浓度在第28天达到峰值，然后在研究的剩余时间内减少。
[0328] 结论：这项临床前研究支持使用Eq12a10+.1MSC治疗创伤后骨关节炎。治疗是安全的，有强有力的证据表明它可有效减轻关节创伤的影响。例如，在若干张载玻片中注意到软骨裂隙愈合，这主观地说更常见于治疗肢体。先前未在创伤后骨关节炎的动物模型中注意到这种愈合型反应
[0329] 实施例6.免疫抑制
[0330] 还测试了从脂肪组织分离的马整联蛋白α10选择的MSC的免疫抑制能力。通过在不同比例的同种异体MSC的共培养物中用伴刀豆球蛋白A刺激外周血单核细胞(PBMC)72小时来进行免疫抑制测定。通过在掺入溴脱氧尿苷(BrdU)的流式细胞术分析之前24小时添加BrdU来测量淋巴细胞增殖。图14中显示了BrdU阳性CD4表达T细胞的频率。
[0331] 结论：从脂肪组织分离的马整联蛋白α10选择的MSC对T细胞具有免疫调节能力，证明淋巴细胞增殖随着MSC与PBMC比例增加而减少。在一MSC对一PBMC的比例下，免疫抑制作用最强。
[0332] 等同物
[0333] 上述书面说明书被认为足以使本领域技术人员能够实施这些实施方案。上述描述和实施例详述了某些实施方案并描述了本发明人设想的最佳模式。然而应理解的是，不管文本中显现以上所述如何详细，仍可以以许多方式来实现实施方案，并且应该根据所附权利要求书及其任何等同物来解释。
[0334] 如在此使用的，无论是否明确指示，术语“约”是指数值，包括例如整数、分数和百分比。术语约通常是指本领域普通技术人员认为等同于所述值(例如，具有相同的功能或结果)的一系列数值(例如，所述范围的+/-5％-10％)。当诸如至少和约等的术语在数值或范围列表之前时，所述术语修改列表中提供的所有值或范围。在一些情况下，术语约可以包括化整到最接近的有效数字的数值。
[0335] 参考文献
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