β-酪蛋白A2和减轻或预防乳糖不耐受症状
阅读：861发布：2020-05-11
专利汇可以提供β-酪蛋白A2和减轻或预防乳糖不耐受症状专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且用于 预防 或减轻动物的乳糖不耐受症状的方法，包括使动物消耗包含β- 酪蛋白 的组合物或给动物提供用于消耗的该组合物，其中β-酪蛋白包含至少75％重量的β-酪蛋白A2。这种作用是急性的(暴露于组合物后)和进行性的(即将暴露于乳糖)。，下面是β-酪蛋白A2和减轻或预防乳糖不耐受症状专利的具体信息内容。
1.预防或使一个或多个基因的表观遗传改变最小化的方法，所述基因负责调节牵涉于动物消化过程和肠功能的酶的活性和水平，其中所述方法包括动物消耗组合物或包括向动物提供所述组合物用于消耗，其中所述组合物含有β-酪蛋白，且其中β-酪蛋白包含至少
75％重量的β-酪蛋白变体，所述变体在β-酪蛋白氨基酸序列的67位具有脯氨酸。
2.权利要求1所述的方法，其中所述β-酪蛋白包含至少75％重量的β-酪蛋白A2。
3.权利要求1所述的方法，其中所述β-酪蛋白包含少于75％重量的β-酪蛋白变体，所述变体能够通过在动物的肠道酶促消化而产生β-酪啡肽-7。
4.权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述预防或使一种或多种基因的表观遗传改变最小化减少了产生乳糖不耐受症状的风险。
5.权利要求4所述的方法，其中所述症状包括腹部气胀、腹部痉挛、肠胃气胀、腹泻、恶心、胃隆隆声和呕吐的一种或多种。
6.权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述一种或多种基因选自AKR1C1、AKR1C2、OOKBR、HTR3A、MLNR、SLC15A1、CTRB2、CTRB1、MEP1B、SULT2A1、OELA3A、AMY1C、CTSE、OOKAR、CAPN9、LCT、B4GALT2、LGALS12、B4GALT1、PGC、SCTR、OXTR、V1PR1、SST、PPARGC1A、GKN1、GALK2、GALR2、GALT、GALR1、CHST1、NPY和PYY。
7.权利要求1至6任一项所述的方法，其中所述β-酪蛋白包含至少90％重量的β-酪蛋白A2。
8.权利要求7所述的方法，其中所述β-酪蛋白包含至少99％的β-酪蛋白A2。
9.权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述β-酪蛋白包含少于75％重量的β-酪蛋白A1。
10.权利要求9所述的方法，其中所述β-酪蛋白包含少于10％重量的β-酪蛋白A1。
11.权利要求10所述的方法，其中所述β-酪蛋白包含少于1％重量的β-酪蛋白A1。
12.权利要求1至11任一项所述的方法，其中所述组合物是乳或乳制品。
13.权利要求12所述的方法，其中所述乳或乳制品得自已知具有β-酪蛋白A2A2基因型的母牛。
14.权利要求12或权利要求13所述的方法，其中所述乳是鲜乳、乳粉、由粉末重构的液体乳、脱脂乳、均化乳、炼乳、低倍浓缩乳、巴氏杀菌乳或非巴氏杀菌乳。
15.权利要求12或权利要求13所述的方法，其中所述乳制品是奶油、酸牛奶、夸克食品、干酪、黄油或冰淇淋。
16.权利要求1至15任一项所述的方法，其中所述动物是人、狗或猫。
17.用于预防或使一个或多个基因的表观遗传改变最小化的组合物，所述基因负责调节牵涉于动物消化过程和肠功能的酶的活性和水平，其中所述组合物含有β-酪蛋白，且其中β-酪蛋白包含至少75％重量的β-酪蛋白变体，所述变体在β-酪蛋白氨基酸序列的67位具有脯氨酸。
18.乳在制备用于预防或使一个或多个基因的表观遗传改变最小化的组合物中的用途，所述基因负责调节牵涉于动物消化过程和肠功能的酶的活性和水平，其中所述乳含有β-酪蛋白，且其中β-酪蛋白包含至少75％重量的β-酪蛋白变体，所述变体在β-酪蛋白氨基酸序列的67位具有脯氨酸。
β-酪蛋白A2和减轻或预防乳糖不耐受症状
技术领域
[0002] 本发明涉及乳蛋白β-酪蛋白A2用于减轻或预防乳糖不耐受症状的用途。具体地，本发明涉及乳或乳衍生的食品。申请人已经发现，消耗包含高水平的蛋白质β-酪蛋白A2的乳和乳制品和避免包含β-酪蛋白A1的乳和乳制品有益于减轻或预防乳糖不耐受症状。值得注意地，有益作用是即时的(急性的)且还诱导进行性的(暴露于β-酪蛋白A1之后)对将来暴露于乳糖的乳糖不耐受症状的预防或减轻的倾向性。
[0003] 发明背景
[0004] 乳糖不耐受一般是指消化乳糖的能力受损。乳糖是包含半乳糖和葡萄糖单糖类的二糖碳水化合物。在乳和乳衍生的乳制品中发现乳糖。人乳包含约9％乳糖，而未加工的牛乳包含约4.7％乳糖。来自山羊、水牛和绵羊的乳也包含4.5-5.0％的乳糖。乳糖的消化是通过乳糖酶将乳糖水解(或分解)成半乳糖和葡萄糖。
[0005] 为乳糖不耐受的个体在其消化系统中缺乏足够水平的乳糖酶。乳糖不能通过小肠壁被吸收入血流且由此如果未被乳糖酶分解，则完整地进入结肠。乳糖在结肠中的细菌发酵产生大量气体。此外，未吸收的碳水化合物和发酵产物升高了结肠的渗透压，导致流入肠的水增加。乳糖不耐受由此可以导致腹部气胀和痉挛、肠胃气胀、腹泻、恶心、胃隆隆声乃至呕吐。这些症状通常在消耗乳糖后约30分钟－2小时发生。
[0006] 婴儿早期的哺乳动物产生乳糖酶，但这种产生通常在断奶后停止。然而，一些人群发生乳糖酶持久保留，其中乳糖酶产生持续至成年期。认为不同人群中乳糖酶持久保留程度是天然选择的结果，有利于那些其中乳制品作为食品来源可得到的培养物。
[0007] 乳糖不耐受并非绝对的，因为可以耐受的乳糖的量因人而异。通常，根据试验和误差，乳糖不耐受个体必须检查他们可以耐受多少乳糖。这通常通过控制膳食乳糖水平或通过共同避免膳食乳糖来进行。在一些情况中，可以使用酶乳糖酶补充剂。可以使用基于植物的乳或乳衍生物，因为它们本身不含乳糖，例如大豆乳、稻米乳、杏仁乳、椰子乳、燕麦乳、大麻乳(hemp milk)和花生乳。还存在许多不含乳糖或乳糖减少的可得到的食品。尽管这类食品可以得到，但是避免膳食中的乳或乳制品通常比较困难。
[0008] 乳(和其它乳制品)消耗与乳糖不耐受症状之间的关联性是众所周知的。然而，在无特别地针对乳糖不耐受的医学诊断的存在下，许多个体错误地认为其自身是乳糖不耐受的，因为他们将他们所患有的症状与消耗乳或其它乳制品联系起来。实际上，这些症状可能归因于其它加剧另外可忽略不计或并不显著的效应的乳成分。蛋白质是可以导致或加剧这类症状的成分的实例。
[0009] 世界范围内人群消耗的乳、主要是牛乳是人膳食中蛋白质的主要来源。牛乳典型地包含约30克/升蛋白质。酪蛋白构成该蛋白质的最大成分(80％)，且β-酪蛋白构成酪蛋白的约37％。在过去二十年中，已经有不断增加的证据表示酪蛋白、尤其是β-酪蛋白牵涉众多健康障碍。
[0010] 可以将β-酪蛋白分类为β-酪蛋白A1和β-酪蛋白A2。这两种蛋白质是大部分人群中消耗的乳中的主要β-酪蛋白。β-酪蛋白A1不同于β-酪蛋白A2在于单一氨基酸。组氨酸氨基酸位于β-酪蛋白A1的209个氨基酸序列的67位上，而脯氨酸位于β-酪蛋白A2的同一位置上。然而，这种单一氨基酸差异对于肠中β-酪蛋白的酶消化是关键重要的。67位上存在组氨酸使得包含称作β-酪啡肽(casomorphine)-7(BCM-7)的7个氨基酸的蛋白质片段在酶消化时产生。因此，BCM-7是β-酪蛋白A1的消化产物。在β-酪蛋白A2的情况中，67位被脯氨酸占据，其阻碍该位置上的氨基酸键裂解。因此，BCM-7并非β-酪蛋白A2的消化产物。
[0011] 其它β-酪蛋白变体例如β-酪蛋白B和β-酪蛋白C也在67位上具有组氨酸，且其它变体例如A3、D和E在67位上具有脯氨酸。但这些变体仅在来自欧洲来源的母牛的乳中以极低水平上被发现或完全未被发现。因此，在本发明的上下文中，术语β-酪蛋白A1是指具有在67位上的组氨酸的任意β-酪蛋白，而术语β-酪蛋白A2是指在67位上具有脯氨酸的任意β-酪蛋白。
[0012] BCM-7是一种阿片样肽，且可以有效地活化遍在于体内的阿片样受体。BCM-7具有通过胃肠道壁和进入循环的能力，从而能够使其通过阿片样受体影响全身和细胞活动。申请人等之前已经确定了消耗乳和乳制品中β-酪蛋白A1的消耗与一些健康问题发生率之间的关联性，所述健康问题包括I型糖尿病(WO 1996/014577)、冠心病(WO 1996/036239)和神经性障碍(WO 2002/019832)。
[0013] 已经存在BCM-7也可以影响消化功能的推定。已经报道阿片样受体在控制胃肠道功能方面起作用，包括调节胃肠活动、黏液产生和激素产生(例如Mihatsch,W.A等人,Biol.Neonate,2005,87(3):160-3)。认为在乳中发现的酪蛋白与可能导致便秘的抑制肠能动性相关(Gunn T.R.和Stunzer D.,NZ Med.J.,1986,99(813):843-6)，且有关酪啡肽和合成酪啡肽衍生物的研究表明BCM-7促成阿片样受体介导的效应(Charlin V.等人,Rev.Med.Chil.,1992,120(6):666-9)。然而，尽管存在一些针对酪啡肽与肠中通过时间之间相关性的证据，但是显而易见，这种作用不一定可推断为在人体内的体内效应。例如，至少一种研究未能证实β-酪蛋白A1或β-酪蛋白A2消耗与便秘之间的相关性(Crowley,E.T.,Nutrients,2013,5,253-266)。另外，已经证实BCM-7通过u-阿片样受体介导的途经刺激黏液产生(Zoghbi,S.,Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.,2006,290(6):G1105-13)并且调节固有层淋巴细胞增殖(Elitsur,Y.和Luk,G.D.,Clin.Exp.Immunol.,1991,85(3):493-7)，它们是与免疫系统相关的细胞。更近来，已经报道β-酪蛋白A1导致胃肠道中组织炎症(Ul Haq,M.R.等人,Eur.J.Nutr.,2013；Barnett,M.P.G.等人,Int.J.Food Sci.Nutr.,2014)。经证实，β-酪蛋白A1衍生的BCM-7诱发的炎症对表观遗传(epigenetic)DNA修饰和随后的受侵害组织的基因表达具有下游作用(Trivedi,M.S.等人,J.Nut.Bio.,
2014)。
2014)。
[0014] 上述报道表明酪蛋白与酪啡肽(包括BCM-7)与胃肠道功能之间的关联性。这些报道基于使用乳蛋白或通常是酪蛋白的研究或使用BCM-7自身的研究。然而，迄今为止，尚未报道β-酪蛋白A1消耗与胃肠道功能且特别是乳糖不耐受症状的直接相关性。此外，已经存在来自具有未知或未证实的病症、涉及饮用高β-酪蛋白A2(和相反是低β-酪蛋白A1)的乳品后胃肠道功能改善的消费者的无对照报道(在线和媒体)，但这些报道是非科学性的报道，且它们在关于任何功能改善的原因方面是非特异性的。此外，还存在许多有关消耗这类乳无改善作用的无对照报道。这些报道存在不一致的方面，因为它们包括涵盖能动性和从便秘直到腹泻的粪便稠度的消化作用连续性的报道。结论不能从无对照报道而可靠地得出，特别是在食品和生理功能的情况中，其中可能潜在地影响结果的变量数量非常大。
[0015] 申请人目前已经发现了针对消耗β-酪蛋白A1与乳糖不耐受症状之间的直接相关性的结论性的科学证据。由于可能影响肠健康的人体膳食中的众多因素且乳和乳品包含大量蛋白质成分和其它成分，所以申请人在β-酪蛋白A1消耗与乳糖不耐受症状之间的明显的直接相关性的发现是令人惊奇的。重要地，申请人已经发现，不仅是对消耗β-酪蛋白A1的紧急和不期望的响应、而且是进行性的(暴露于β-酪蛋白A1或BCM-7之后)响应的证据，其中消耗β-酪蛋白A1和由此产生BCM-7可以诱导动物的遗传改变，导致乳糖酶水平较低和由此将来暴露于乳糖时导致乳糖不耐受症状的可能性增加。
[0016] 因此，本发明的一个目的在于提供用于减轻或预防乳糖不耐受症状的方法或至少提供有用的针对现存方法的可替代选择的方法。
[0017] 发明概述
[0018] 在本发明的第一个方面，提供组合物用于预防或减轻动物的乳糖不耐受症状的用途，其中该组合物包含β-酪蛋白，且其中β-酪蛋白包含至少75％重量的β-酪蛋白A2。
[0019] 在本发明的第二个方面，提供用于预防或减轻动物的乳糖不耐受症状的组合物，该组合物包含β-酪蛋白，且其中β-酪蛋白包含至少75％重量的β-酪蛋白A2。
[0020] 在本发明的另一个方面，提供乳在制备用于预防或减轻动物的乳糖不耐受症状的组合物中的用途，其中所述乳包含β-酪蛋白，且其中β-酪蛋白包含至少75％重量的β-酪蛋白A2。
[0021] 在另一个方面，提供β-酪蛋白A2在制备用于预防或减轻动物的乳糖不耐受症状的组合物中的用途，其中该组合物包含至少75％重量的β-酪蛋白A2。β-酪蛋白A2优选是乳的成分，所述乳优选是牛乳。
[0022] 在本发明的另一个方面，提供预防或减轻动物的乳糖不耐受症状的方法，包括由动物消耗包含β-酪蛋白的组合物，或给动物提供所述组合物用于消耗，其中β-酪蛋白包含至少75％重量的β-酪蛋白A2。
[0023] β-酪蛋白A2的量可以是β-酪蛋白重量的75％－100％范围的任意量，例如至少90％或甚至100％。
[0025] 乳糖不耐受症状可以是腹部气胀和痉挛、肠胃气胀、腹泻、恶心、胃隆隆声(rumbling stomach)和呕吐，但不限于此。
[0026] 动物对消耗所述组合物的响应可以是急性(acute)响应且还可以诱导动物在即将暴露于乳糖时预防或减轻乳糖不耐受症状的倾向性。
[0027] 在本发明的大部分实施方案中，所述动物是人。然而，在其它实施方案中，所述动物可以是狗、猫或任意其它家养动物，其中饲料中补充了乳。
[0029] 图1显示饲喂实施例1的膳食的大鼠的胃肠通过时间。
[0030] 图2显示饲喂实施例1的膳食的大鼠的十二指肠乳糖酶活性。
[0032] 图4显示神经元细胞和GI上皮细胞中半胱氨酸的吗啡和BCM-7浓度依赖性摄取。
[0033] 图5显示神经元细胞和GI上皮细胞中半胱氨酸的时间依赖性摄取。
[0034] 图6显示μ-阿片样受体牵涉介导BCM-7和吗啡对半胱氨酸摄取的作用。
[0035] 图7显示BCM-7和吗啡随时间对半胱氨酸水平、GSH/GSSG和SAM/SAH的作用。
[0036] 图8和9显示BCM-7对牵涉乳糖代谢和乳糖酶合成的基因中CpG甲基化的影响。
[0037] 图10显示编码乳糖酶的LCT基因在饲喂β-酪蛋白A1或β-酪蛋白A2膳食10和20周的NOD小鼠小肠中的水平。
[0038] 详细描述
[0039] 本发明涉及包含蛋白质β-酪蛋白的组合物及其在减轻或预防乳糖不耐受症状中的用途。重要地，β-酪蛋白是β-酪蛋白的A2变体或构成存在于组合物中的总β-酪蛋白变体的至少75％重量。组合物中A2变体占优势的重要性归因于如下事实：申请人已经证实在人体内A1变体与乳糖不耐受症状之间存在直接相关性。申请人还证实十二指肠中存在包含高水平A2变体的乳蛋白有益地刺激乳糖酶活性。因此，如果避免消耗A1变体而是消耗A2变体，则可以预期肠健康改善。
[0041] 除非另有指示，否则作为本说明书中使用的术语“急性”预期是指在从消耗β-酪蛋白A1到从肠中排出β-酪蛋白A1或BCM-7的时间期限(典型地是消耗后8-20小时)。
[0042] 由于大部分人群膳食中的β-酪蛋白主要(如果不只是)来源是乳或来源于乳的产品，且由于大部分消耗的乳仅包含β-酪蛋白的A1和A2变体的混合物，所以消耗具有高含量A2变体的乳(或由这类乳制成的产品)必然意味着A1变体的消耗低。从此以后，如果β-酪蛋白的膳食来源仅包含A2变体而不包含其它变体，则消除了A1变体的膳食摄取，且来源于β-酪蛋白A1消耗的不良乳糖不耐受症状由此也可以预期被消除。
[0043] 因此，本申请的发明基于减少或消除膳食中的β-酪蛋白A1并且促进β-酪蛋白A2，且这可以通过确保包含β-酪蛋白的食品组合物、尤其是乳和乳制品主要或甚至仅为β-酪蛋白A2来实现。
[0044] 理想地，组合物中的β-酪蛋白为100％β-酪蛋白A2。完全消除β-酪蛋白A1由此通过共同减少或消除乳糖不耐受症状而使相关的健康有益性最大化。然而，用任意的组合物可以减轻所述症状，在所述组合物中，β-酪蛋白主要是β-酪蛋白A2，例如75％重量－100％的任意量，包括但不限于80％、90％、95％、98％和99％重量。
[0045] 本发明的组合物典型地是乳，而且还有任意的乳衍生的产品，例如奶油、酸牛奶、夸克食品、干酪、黄油或冰淇淋。该组合物还可以是包含得自乳的β-酪蛋白的非乳品。该组合物可以是β-酪蛋白自身或可以由β-酪蛋白制备，所述β-酪蛋白可以是固体形式，例如粉末或颗粒；或固体饼状物形式。
[0046] 尽管乳可以得自任意哺乳动物，包括人、山羊、猪和水牛，但是在本发明的优选的实施方案中，所述乳是牛乳。
[0047] 所述乳可以是鲜乳、乳粉、由粉末重构的液体乳、脱脂乳、均化乳(homogenised milk)、炼乳、低倍浓缩乳、巴氏杀菌乳或非巴氏杀菌乳或任意其它形式的乳。
[0048] 本发明的组合物主要适用于人消耗，但应当理解，健康有益性还涉及一些另外的动物，例如猫、狗和其它家养动物。
[0049] 对于本发明的支持在如下实施例所述的实验中可见。
[0050] 实施例1列出了实施例2－4的大鼠研究的饲喂方法。膳食如表1中所示。A1乳品膳食基于其中膳食中的所有β-酪蛋白为β-酪蛋白A1的配方。A2乳品膳食基于其中膳食中的所有β-酪蛋白为β-酪蛋白A2的配方。对照品基于其中蛋白质内含物为蛋白(egg white)的配方。
[0051] 实施例2描述对在饲喂实施例1的不同膳食的大鼠中胃肠道通过时间(GITT)的调查研究。在饲喂12小时后将用作示踪物的二氧化钛(TiO2)通过口服施用于动物。TiO2的回收如图1中所示，为％回收与时间(小时)的关系。饲喂A1膳食的大鼠展示出相对于饲喂A2膳食的大鼠通过时间延迟，其中两个组均显示相对于饲喂对照膳食的大鼠的延迟。这一结果与β-酪蛋白A1具有高于β-酪蛋白A2的一般阿片样物质活性相一致，这归因于BCM-7释放。乳糖不耐受症状与肠中乳糖的细菌发酵相关。在发酵过程中的细菌计数随GITT呈指数增加。因此，如果能动性减少2倍，则发酵速率增加4倍，且由此表现出乳糖不耐受症状。实施例2由此是相对于包含β-酪蛋白A2的膳食，包含β-酪蛋白A1的膳食更可能促成GITT延迟并且产生乳糖不耐受症状。
[0052] 实施例3显示饲喂100％A2膳食而不是100％A1膳食的大鼠，在乳糖酶紧急饲喂后(12小时后)十二指肠中的活性明显地高于长期饲喂(60小时后)。这意味着β-酪蛋白A2和包含β-酪蛋白A2的乳或乳制品可以用于促进健康的胃肠道功能、消化膳食中的乳糖或缓解或消除消耗乳和乳制品时经历的乳糖不耐受症状。认为包含β-酪蛋白A2的膳食刺激乳糖酶分泌或活性，但包含β-酪蛋白A1的膳食不能。这最可能归因于β-酪蛋白A1和β-酪蛋白A2的消化产品对进入小肠的乳蛋白食团刺激酶分泌后的炎症和功能的差别作用。
[0053] 实施例4涉及β-酪蛋白A1和β-酪蛋白A2膳食对大鼠结肠中髓过氧化物酶(MPO)活性的作用。MPO活性是炎症标记(Krawisz等人,Gastroenterology,1984,87(6):1344-1350和Dommels,Y.E.M.等人,Genes Nutr.,2007,2(2):209-223)。发现结肠MPO活性在β-酪蛋白A1-饲喂的大鼠中比β-酪蛋白A2-饲喂的大鼠有所增加，表明β-酪蛋白A1-饲喂的大鼠中的嗜中性粒细胞水平增加，其又是炎症应答的指示剂。这种作用在使用纳洛酮(已知的阿片样受体拮抗剂)处理的大鼠中未观察到，表明这种作用通过BCM-7与u-阿片样受体的相互作用介导。结肠炎症导致对乳糖不耐受症状的易感性或敏感性增加。
[0054] 实施例5表明BCM-7可以以浓度依赖性方式抑制半胱氨酸摄取。吗啡显示效能高于BCM-7，在神经元细胞中的IC50值分别为0.16和1.31nM，且在GI上皮细胞中分别为6.38和15.95nM(图4)。30分钟后半胱氨酸摄取抑制完全发生且持续吗啡或BCM-7暴露的48小时自始至终(图5)。这表明单一暴露于BCM-7后对半胱氨酸摄取的长期慢性作用。在选择性μ-拮抗剂的存在下阻断和无δ阿片样受体，显示这些作用是μ-阿片样受体介导的。
[0055] 据报道食品衍生的肽类改变氧化还原代谢，包括可以调节细胞中S-腺苷甲硫氨酸(SAM)水平的谷胱甘肽水平。SAM是用于介导DNA甲基化改变的通用甲基供体。这些改变是表观遗传调节记忆的组成部分，并且可以调节基因表达水平以维持动态平衡。重要地，这些改变可以是高度稳定的且具有干扰基因表达/阻抑的潜能，且由此持久地改变基因水平。谷胱甘肽水平由此可以对其中基因起重要作用的途经产生影响，例如乳糖合成和代谢途经。因此，BCM-7通过基于氧化还原的信号传导途经诱导的表观遗传改变可以影响负责乳糖合成和代谢的调节基因且因此影响体内的乳糖水平。身体习惯于吸收、代谢、清除或储存一定总水平的乳糖。如果该水平在BCM-7影响下改变，则身体调节乳糖水平的能力可能饱和且由此诱导下游病理生理学亚临床或临床效应。
[0056] 实施例6显示BCM-7和吗啡导致半胱氨酸和谷胱甘肽(GSH)水平的时间依赖性减少。神经元细胞中半胱氨酸的胞内水平和细胞的氧化还原状态(由GSH与其氧化形式谷胱甘肽二硫化物(GSSG)之比反映)也减少(图6)，表明氧化性应激病症的可能性。此外，甲基化能力(由SAM/SAH之比表示)也在不同时间点受BCM-7处理影响(图7)。因此，BCM–7诱导主要胞内抗氧化剂水平、特别是GSH水平降低。已知降低的GSH水平通过氧化性应激信号传导途经、经调节SAM水平诱导染色质改变。
[0057] 实施例7研究由BCM-7诱导的DNA甲基化水平。图8显示MPO中的DNA甲基化改变，MPO为负责介导受BCM-7影响的炎症应答的基因之一。经证实氧化还原状态的改变导致炎症基因的表观遗传状态的长期改变。这等同于分子损伤的记忆，可能促成长期慢性改变和对乳糖不耐受的炎症应答。因此，BCM-7不仅改变MPO活性，正如从β-酪蛋白A1饲喂研究中显而易见的，而且改变MPO基因的表现遗传状态，且由此对乳糖合成和代谢具有进行性和长期的影响。改变的乳糖水平的下游效应可以包括胃功能障碍和消化问题。正如图9中所示，BCM-7改变酶如乳糖酶的表现遗传状态，其牵涉乳糖代谢和降解。这可以导致蓄积的乳糖水平和受调节的乳糖浓度，它们根据个体的不同可以是耐受性的或不耐受性的。如果不耐受，则可以预期消化功能的改变和肠炎症。
[0058] BCM-7还影响牵涉消化功能的酶，如表4中所示。B4GALT2、LGALS12和B4GALT1是编码牵涉半乳糖代谢的酶的基因。半乳糖是乳糖合成中的重要中间体。类似地，GKN1、GALK2、GALR2、GALT和GALR1编码牵涉调节半乳糖水平的酶，且由此间接地调节乳糖水平。这些酶的活性改变可以间接地导致乳糖水平改变。BCM-7通过调节这些基因的表现遗传状态而改变这些酶的酶活性。这通过氧化还原状态的机械性调节介导。这些改变最终使乳糖水平倾斜，不仅是在急性阶段，而且可能具有长期作用，因为表现遗传改变甚至可以传代至下一代。
[0059] BCM-7不仅介导乳糖合成和代谢的改变，而且可以调节牵涉消化过程和肠功能的酶活性和水平。经证实酶例如缩胆囊素、促胃动素、分泌酶和催产素的基因受BCM-7影响具有改变的表现遗传状态。这将直接影响个体的胃肠道功能和消化能力。因此，BCM-7将促成改变的肠能动性、消化异常、肠胃气胀和腹泻症状，它们均是乳糖不耐受症状。
[0060] 对qPCR中mRNA水平的研究进一步证实了表现遗传改变对乳糖酶水平的下游效应(实施例8)。给NOD小鼠在断奶后饲喂富含β-酪蛋白-A1或β-酪蛋白A2的膳食。在安乐死后，解剖并且采集肠样品。从这些样品中分离RNA，并且使用对小肠中乳糖酶水平具有特异性的引物进行PCR。正如图10中所示，饲喂β-酪蛋白A2膳食10和20周的小鼠小肠中的乳糖酶mRNA水平，高于饲喂β-酪蛋白A1膳食相同时间期限的小鼠小肠中的乳糖酶mRNA水平。由于具有高水平的乳糖酶，所以β-酪蛋白A2饲喂的小鼠可以从消化系统中清除乳糖，并且仅允许利用一定水平的乳糖。与乳糖不耐受相关的症状由此得以避免。相反，由于小肠中具有较低水平的乳糖酶mRNA，则饲喂β-酪蛋白A1膳食的小鼠允许累积更高水平的乳糖，且由此导致乳糖不耐受症状。
[0061] 这些研究提供了β-酪蛋白A1消耗与乳糖不耐受症状之间相关性的首次明确的科学证据；另外，β-酪蛋白A2消耗(相对于β-酪蛋白A1消耗)诱导在即将暴露于乳糖时预防或减轻乳糖不耐受症状的有益倾向性。此前，非结论性的和自相矛盾的无对照报道和涉及BCM-7(非β-酪蛋白A1自身)的研究导致本领域技术人员的混淆，其中许多人相信不存在这种关联性。通过申请人的发现，为许多认为自身是乳糖不耐受的人存在的问题提供了可选的潜在解决方式，即避免膳食中的β-酪蛋白A1。这可以通过如下方式实现：得到具有主要是β-酪蛋白A2的β-酪蛋白含量的乳并且生产来源于该乳的产品，且使得可利用该乳品和那些产品以用于减轻或预防乳糖不耐受症状的目的。
[0062] 可以测试奶牛乳的β-酪蛋白A1和β-酪蛋白A2相对比例。或者，可以以遗传方式测试奶牛产生包含β-酪蛋白A1或β-酪蛋白A2或它们两者的乳的能力。这些技术是众所周知的。
[0063] 本发明具有超过现存方法的显著优势以避免乳糖不耐受症状。大部分现存的方法依赖于膳食改变，其中许多通常具有有限的成功或实际上不成功。本发明提供了相对易于处置的解决方式，即避免包含β-酪蛋白A1的乳或乳制品，并且确保膳食中的乳和乳制品包含主要是β-酪蛋白A2的β-酪蛋白，优选100％β-酪蛋白A2。本发明避免了对大规模膳食改变的任何需求，例如避开了乳制品或其它常用食品。
[0064] 本说明书中任何涉及的现有技术文件不应被视为承认这类现有技术是广泛已知的或构成本领域一般公知常识的组成部分。
[0065] 作为本说明书中使用的措词“包含”、“包括”和类似措词不应当被解释为排他或穷尽的含义。换句话说，它们预以指“包括、但不限于”。
[0067] 实施例1：饲喂方法
[0068] 使用72只断奶的(4周龄)雄性Wistar大鼠。在用对照膳食7-天适应期后，给大鼠饲喂12或60小时的3种膳食之一：100％A1膳食、100％A2膳食、对照品膳食(n＝6/治疗)。膳食的蛋白质成分来源于脱脂乳(A1和A2膳食)和蛋白(非乳蛋白对照品膳食)，并且平衡能量和大量营养物组成(参见表1)。时间期限结束前15分钟，大鼠通过腹膜内注射接受纳洛酮或盐水(对照组)，且然后通过口腔管饲不能消化的示踪物二氧化钛。在接下来的24小时内的7个时间点采集粪便和尿样并且储存在-20℃(粪便)或-80℃(尿)，直至分析。
[0069] 表1：膳食组成
[0070]
[0071] 实施例2：胃肠道通过时间
[0072] 在根据实施例1饲喂的大鼠中测定胃肠道通过时间(GITT)。将二氧化钛(TiO2)用作示踪物，在对动物12小时饲喂100％A1膳食、100％A2膳食或对照品膳食后口服施用。结果如表2和图1中所示。将回收数据表示为％TiO2回收与时间(小时)的关系。饲喂A1膳食的大鼠显示出相对于饲喂A2膳食的大鼠的通过时间延迟，其中两个组均显示出相对于饲喂对照品膳食的延迟。
[0073] 表2：GI通过时间
[0074]
[0075] 实施例3：乳糖酶活性
[0076] 在冰冷的去离子水中匀化冷冻的粉状十二指肠组织样品(1:5wt/vol)，然后在4以2,200g离心30分钟。收集上清液并且进一步用去离子水稀释(1:25)。将样品与乳糖一起温育，并且使用葡萄糖氧化酶试剂盒(Sigma)测定释放的葡萄糖且用显微板读出器测定。表3和图2显示急性(12小时)和长期(60小时)大鼠饲喂组的十二指肠乳糖酶结果。在急性饲喂A2组中十二指肠乳糖酶活性相对于长期饲喂A2和急性和长期饲喂A1组均升高。
[0077] 表3：急性和长期饲喂组的乳糖酶活性
[0078]
[0079] 实施例4：MPO活性
[0080] 基于建立的方法对来自根据实施例1饲喂的大鼠的结肠组织的髓过氧化物酶(MPO)活性定量(Grisham,M.B.等人,Methods Enzymol.,1990,186:729-742)。匀化结肠组织(50mg)，通过离心分配、通过超声探头破碎并且进行冷冻-融化循环。内源性MPO催化3,3’,5,5’-四甲基-联苯胺的H2O2-依赖性氧化，在562nm以比色法测定。通过用于相同匀化物的双辛可宁酸(BCA)(Smith,P.K.等人,Anal.Biochem.,1985,150(1):76-85)蛋白质测定来校准活性。结果如图3中所示。相对于A1饲喂的动物，A2动物在急性饲喂后显示出明显较低水平的MPO活性。这是持续性的且随长期饲喂进一步增加，并且通过口服施用纳洛酮完全可逆转。
[0081] 实施例5：BCM-7对半胱氨酸摄取的作用
[0082] 在Caco-2-GI上皮细胞和神经元细胞中，在从β-酪蛋白A1中释放的BCM-7存在下，35
进行放射性标记的[ S]-半胱氨酸摄取测定，并且与未处理的对照组和与吗啡(典型的阿片样受体激动剂)进行比较。在如上所述的不同时间点对细胞进行预处理30min、4、24和48h(Trivedi M.等人；Mol.Pharm.,2014)。将SH-SY5Y人神经元细胞和Caco-2肠上皮细胞在6-孔平板中铺板并且用药物预处理，温育不同时间，然后测定摄取。抽吸培养基并且在37℃用
35
600μL HBSS洗涤细胞。抽吸非放射性HBSS，用包含[ S]-半胱氨酸(1μCi/1mL)、10μM未标记的半胱氨酸和100μM DTT的600μL37℃HBSS替代，并且将细胞温育5min。抽吸[35S]-半胱氨酸/HBSS混合物，且通过用冰冷HBSS洗涤2次终止处理。然后用600μL dH2O裂解细胞，刮取，采集入1.5mL微量离心管，超声处理10s。等分100μL各样品用于蛋白质测定。将200μL各样品(一式三份)等分入具有4mL闪烁液的闪烁小瓶，涡旋，并且计数放射性(对蛋白质含量校准)。另外，还在D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr(CTAP)即一种选择性μ-拮抗剂和δ阿片受体拮抗剂纳曲吲哚(naltrindole)(NTI)的存在下表征吗啡和BCM-7的半胱氨酸摄取效应。结果如图4、5和6中所示。这些图中使用的符号*表示与未处理的对照组相比具有统计学显著性差异(p<0.05)，且符号#表示与未处理的对照组细胞具有统计学显著性差异(p<
0.005)。
进行放射性标记的[ S]-半胱氨酸摄取测定，并且与未处理的对照组和与吗啡(典型的阿片样受体激动剂)进行比较。在如上所述的不同时间点对细胞进行预处理30min、4、24和48h(Trivedi M.等人；Mol.Pharm.,2014)。将SH-SY5Y人神经元细胞和Caco-2肠上皮细胞在6-孔平板中铺板并且用药物预处理，温育不同时间，然后测定摄取。抽吸培养基并且在37℃用
35
600μL HBSS洗涤细胞。抽吸非放射性HBSS，用包含[ S]-半胱氨酸(1μCi/1mL)、10μM未标记的半胱氨酸和100μM DTT的600μL37℃HBSS替代，并且将细胞温育5min。抽吸[35S]-半胱氨酸/HBSS混合物，且通过用冰冷HBSS洗涤2次终止处理。然后用600μL dH2O裂解细胞，刮取，采集入1.5mL微量离心管，超声处理10s。等分100μL各样品用于蛋白质测定。将200μL各样品(一式三份)等分入具有4mL闪烁液的闪烁小瓶，涡旋，并且计数放射性(对蛋白质含量校准)。另外，还在D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr(CTAP)即一种选择性μ-拮抗剂和δ阿片受体拮抗剂纳曲吲哚(naltrindole)(NTI)的存在下表征吗啡和BCM-7的半胱氨酸摄取效应。结果如图4、5和6中所示。这些图中使用的符号*表示与未处理的对照组相比具有统计学显著性差异(p<0.05)，且符号#表示与未处理的对照组细胞具有统计学显著性差异(p<
0.005)。
[0083] 实施例6：BCM-7对GSH和SAM水平的作用
[0084] 本实施例研究如实施例5中观察到的半胱氨酸摄取减少是否可以翻译为GSH改变并且影响抗氧化剂水平。使用BCM-7和吗啡在不同时间(30min、4h、24h)、应用HPLC和电化学梯度检测方法(Hodgson等人,J.Alzh.Dis.2013,Trivedi M.等人,Mol.Pharm.2014)测定GSH胞内水平。使SH-SY5Y神经元细胞在α-MEM中生长至汇合。抽吸培养基并且用1mL冰冷HBSS洗涤细胞两次。抽吸HBSS并且将0.6mL冰冷dH2O加入到细胞中。从烧瓶/平皿中刮取细胞并且混悬于dH2O。将细胞混悬液在冰上超声处理15s并且将100μL该混悬液用于测定蛋白质含量。将剩余的裂解液加入到微量离心管中并加入等体积的0.4N高氯酸，然后在冰上温育5min。以5,000×g离心样品并将上清液转入新的微量离心管。将100μL各样品加入到锥形微量自动采样器小瓶中并保持在4℃下在自动采样器的冷却托盘中。将10μL这些样品各自注入HPLC系统。
[0085] 使用Agilent Eclipse XDB-C8分析柱(3×150mm；3.5μm)和Agilent Eclipse XDB-C8(4.6×12.5mm；5μm)保护柱分离氧化还原和甲基化途经代谢物。使用两个流动相。流动相A：0％乙腈、25mM磷酸钠、1.4mM 1-辛磺酸，用磷酸调整至pH 2.65。流动相B：50％乙腈。最初将流速设定在0.6mL/min并且使用步阶梯度：0–9min 0％B，9–19min 50％B，19–
30min50％B。然后在下一次运行前用5％B平衡柱12min。将温度维持在27℃。所用的电化学检测器是带有BDD分析池Model 5040的ESA CoulArray，并且将工作电压设定在1500mV。使用标准校准曲线和ESA-提供的HPLC软件、根据代谢物的峰面积测定样品浓度。将样品浓度对蛋白质含量校准。在一些情况中，根据需要用流动相稀释样品或注射至多50μl样品，以确保硫醇水平在标准曲线范围内。结果如图7中所示。
30min50％B。然后在下一次运行前用5％B平衡柱12min。将温度维持在27℃。所用的电化学检测器是带有BDD分析池Model 5040的ESA CoulArray，并且将工作电压设定在1500mV。使用标准校准曲线和ESA-提供的HPLC软件、根据代谢物的峰面积测定样品浓度。将样品浓度对蛋白质含量校准。在一些情况中，根据需要用流动相稀释样品或注射至多50μl样品，以确保硫醇水平在标准曲线范围内。结果如图7中所示。
[0086] 实施例7：BCM-7对DNA甲基化水平的作用
[0087] 使用如上所述的甲基-CpG结合结构域(MBD)蛋白质-富集的基因组测序(MBD-seq)，研究由BCM-7诱导的整体DNA甲基化水平(Trivedi M.等人,Mol.Pharm.2014)，而使用Agilent V3微阵列芯片、从未处理对照组SH-SY5Y细胞和用1μM BCM-7处理4小时的细胞得到mRNA翻译微阵列数据。
[0088] 使用Easy DNA试剂盒(Invitrogen K1800-01)、应用适合的细胞系方案从样品中提取基因组DNA。使用Covaris S2与如下设置进行片段化：工作期10％，强度5，200秒过程中200个循环/触发。得到具有200bp平均长度的片段。功率模式为频率扫描，温度6-8℃，水位
12。将最大5μg载入带有AFA放大器的微管中的130μl Tris-EDTA。对于具有较少DNA输入的样品(降至500ng)，用TrisEDTA按照1:5稀释DNA。用Agilent 2100、应用DNA 1000芯片分析具有5-3μg输入的DNA。在旋转蒸发器中浓缩输入低于3μg的DNA至25μl，并用高灵敏度DNA芯片检查片段分布。使用MethylCap试剂盒(Diagenode,Belgium)俘获甲基化DNA。收率典型地为0.5－8ng总俘获的DNA。随后使用Illumina基因组分析仪II(Illumina Genome Analyzer II)对片段测序。用Fluostar Optima平板读出器与Quant-iT PicoGreen dsDNA测定试剂盒(Invitrogen P7589)在480/520nm测定片段化和俘获的DNA浓度。
12。将最大5μg载入带有AFA放大器的微管中的130μl Tris-EDTA。对于具有较少DNA输入的样品(降至500ng)，用TrisEDTA按照1:5稀释DNA。用Agilent 2100、应用DNA 1000芯片分析具有5-3μg输入的DNA。在旋转蒸发器中浓缩输入低于3μg的DNA至25μl，并用高灵敏度DNA芯片检查片段分布。使用MethylCap试剂盒(Diagenode,Belgium)俘获甲基化DNA。收率典型地为0.5－8ng总俘获的DNA。随后使用Illumina基因组分析仪II(Illumina Genome Analyzer II)对片段测序。用Fluostar Optima平板读出器与Quant-iT PicoGreen dsDNA测定试剂盒(Invitrogen P7589)在480/520nm测定片段化和俘获的DNA浓度。
[0089] 为了制备DNA文库，将DNA样品制备基本混合物组1(DNA Sample Prep Master Mix Set 1)(NEB E6040)与Multiplexing Sample Preparation Oligo试剂盒(96份样品，Illumina PE-400-1001)组合。使用完整片段化的DNA并且遵循NEB方案，使用Multiplexing Sample Preparation Oligo试剂盒中提供的多路测序连接物。用2％琼脂糖凝胶进行文库的大小筛选(Low Range Ultra Agarose Biorad 161-3107)。使用1Kb+ladder(Invitrogen10787-018)，并且在120V运行凝胶电泳2hrs。切下300bps+/-50bps片段并且用Qiagen凝胶提取试剂盒柱(Qiagen 28704)洗脱且用23μl EB洗脱。
[0090] 使用具有如下改变的Illumina文库扩增指数方案：使用22μl DNA并且进行21个循环运行。用Qiaquick PCR纯化柱(Qiagen 28101)纯化样品并且用1:5稀释的50μl EB洗脱，且在旋转蒸发器中浓缩至10μl。使1μl上Agilent2100HS DNA芯片，并通过用Agilent 2100进行涂片分析测定浓度。将样品稀释至10nM。用NaOH变性后，将样品稀释至16pM。根据Cluster Station User Guide制备配对-末端流动池。根据HiSeq用户指南进行测序(进行多路PE运行)，其中对于配对末端运行使用2x 51个循环。
[0091] 全部基因组DNA MBD-测序揭示出差别甲基化转录物(DMTs)，如错误发现率(FDR)<0.1和ANOVA、随后post-hoc student’s t-检验(p<0.05)所定义。转录物包括基因和非编码RNAs，它们是差别甲基化的/转录的。使用Ingenuity Pathway Analysis(IPA)工具评价特定生物学或功能相关途经中BCM-7诱导的表现遗传改变和转录改变，且鉴定了显示最高影响的途经。结果如表4中所示。还将负责乳糖代谢和乳糖合成的基因的表现遗传状态的改变报道为在BCM7下改变，如图8和9中所示。
[0092] 表4：在BCM-7影响下差别甲基化转录物的列表
[0093]
[0094] 实施例8：BCM-7对小肠中乳糖酶水平的作用
[0095] 从断奶开始对NOD小鼠(雄性和雌性)使用富含来自断奶的β-酪蛋白A1或A2乳蛋白的膳食。这些膳食由Specialty Feeds Pty.Ltd.(Australia)制备，以确保足够的组成和营养。在10周或20周对来自每一性别和膳食的小鼠组(n＝10)实施安乐死。在解剖时，采集组织样品并储存在-80℃在RNAlaterTM中。在本研究中跟踪40只NOD小鼠：10只/组(雄性/雌性：A1/A2)。
[0096] 使用来自Ambion(Austin,TX)的 -4PCR试剂盒分离来自细胞培养物的RNA用于RNA转录分析。方法与制造商的方案所述相同。用DNase处理分离的RNA以纯化RNA，然后使用ND-1000NanoDrop分光光度计进行RNA定量。如上所述、使用来自Roche(Indianapolis,IN)的第一链cDNA合成来合成cDNA。加入RNA(1mg)、dNTP混合物(1mM)、随机六聚体引物(60mM)与足够分子生物学等级的H2O，以达到13ml的最终样品体积。使每一样品在65℃变性5分钟，然后置于冰上。加入转录RT(20个单位/ml)(Roche)、Protector RNase抑制剂(40U/ml)(Roche)、5转录物逆录酶反应缓冲液(Roche)和分子生物学等级H2O，并将最终体积调整至20ml。随后在PTC热循环仪(MJ Research,St.Bruno,QC,Canada)中在25℃温育10分钟和在55℃温育30分钟。最终，通过在85℃温育5分钟抑制逆转录酶。
[0097] 使用一式三份样品、应用来自Roche的LightCycler 480qRT-PCR机器进行qRT-PCR测定(Trivedi等人,Mol.Pharmcol.,2014)。使用最终体积为20ml的5ml cDNA模板、10mM正义和反义引物、来自Roche的10ml SYBR Green I Master和dH2O进行qRT-PCR。用于该目的的引物是正向5’-GGAGTGTCACCCACAGACAG-3’和反向5’-GAACACAAGCTACAC GGGGA-3’。使样品通过如下方案：在95℃温育5分钟，然后是95℃10秒、60℃20秒和72℃30秒的45个循环，随后是95℃5秒、65℃1分钟和97℃的单一循环，用于解链曲线，然后是在40℃冷却90秒。在平板上运行无模板对照品(NTC)，生成解离曲线以测定非特异性产物，并且校准以避免任何非特异性扩增。使用Roche定量方法D(DCt)分析数据，并对β-肌动蛋白水平校准，结果如图10中所示。
[0098] 尽管通过实施例描述了本发明，但是应当理解，可以在不脱离如权利要求所定义的本发明范围的情况下进行改变和变型。此外，如果存在与具体特征的已知等效特征，则并入这类等效特征，如同本说明书中具体涉及的一样。
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