[0001] 本发明涉及用于妊娠和非妊娠测试的方法，并涉及允许适当授精时间的确定以建立妊娠的方法。

[0002] 奶牛场的利润取决于成功的繁殖。只有在母牛分娩牛犊时才会生产乳汁，因此让母牛怀孕是必不可少的。理论上，这个过程是简单的——观察母牛并在静立发情时授精——但在大的畜群、高产奶量、人工授精和忙碌的员工的这些日子里，现实是让母牛怀孕可能是很大的挑战。因此，已经开发了许多方法来增加母牛成功繁殖的可能性和机会。牛的动情周期通常被称为发情。考虑到母牛的排卵通常间隔21天发生，动情周期或发情通常在性成熟、空怀（非妊娠）的雌性牛中每18至24天发生一次。在发情期间，母牛可以接受公牛或其它母牛的爬胯活动，通常会在第21天左右展现出静立发情，预知最佳的动情周期、具有最高的受精准备和受孕成功的最高机会。由于未受精卵到达时应对牛进行授精以使活精子处于受精部位，因此估计每只待授精的母牛的排卵时间非常重要。排卵一般发生在静立发情开始后的25至32小时。静立行为是生产者必须确定排卵时间的可靠指标。

[0003] 在精子能够使精子卵子受精前，精子必须在雌性生殖道中大约6个小时。这个过程被称为精子获能。尽管直到授精后48小时在雌性生殖道中发现活精子，但通常将精子存活率估计为18至24小时。

[0004] 卵子从排卵部位非常迅速地行进至输卵管中的受精部位。卵子的能育寿命比精子的能育寿命短。排卵的卵子保持可受精的时间（10-20小时）比它们保持能够受精并发育成正常胚胎的时间（8-10小时）长。因此，随着超过该间隔的时间增加，胚胎死亡的可能性增加。因此活精子应该在受精部位等待新排卵的卵子到来。过早或过晚授精允许老化的精子或老化的卵子在受精部位相互作用并且将导致不良的受孕。

[0005] 发情检测对于同期发情和授精计划至关重要，尤其对于确定用于人工授精（AI）或胚胎移植（ET）的适当的时间段至关重要。

[0006] 有效的发情检测通常是繁殖的最大限制因素。目视观察是常用的发情检测方法。该方法涉及训练有素的观察者识别并记录发情的迹象。可观察到的发情迹象包括爬胯或试图爬胯其它牛、静立以被其它牛爬胯、嗅闻其它雌性、尾随其它雌性、吼叫、食欲不振、紧张和易激动行为、弄脏牛的后肢和侧面、粗暴挥动尾毛、外阴肿胀并发红、明显的阴道粘液排出以及涂抹在臀部上的粘液。最确信的发情迹象是，当母牛或小母牛允许其它牛爬胯它时而它保持静立。这称为静立发情。牛可能愿意爬胯其它牛，但当不在静立发情时，可能不会静立以被爬胯。这通常表明它正在进入静立发情或正在结束静立发情。

[0007] 检测发情的目视观察需要每天至少两次观察牛，通常是清晨和深夜。对牛的发情进行更频繁的观察提高了检测准确性并增加了识别繁殖牛的最佳时间的可能性，特别是发情不那么强烈或持续时间较短的牛的品种。当每天检查四次时，将观察到比每天检查两次高出将近20%的牛在发情。为了有效，发情观察需要在24小时内均匀定时。每个观察期必须足够长，通常至少30分钟才有效，这表明如果没有其它技术的帮助，农民或受过培训的农场工人每天可能在适当的发情检测上花费至少2小时。静立发情能够在24小时期间内的任何时间发生。然而，让母牛或小母牛展现出发情迹象的最可能的时间是在晚上。一年中的季节能够影响这一点，在天气热时更多的母牛在晚上展现出发情，在寒冷的天气冷时里更多的母牛在白天展现出发情。居住条件也可能在24小时内对发情的分布产生影响。天气热、高产量、拥挤的条件和高压力环境可能会减少发情活动。观察者必须区分进入发情的牛、在静立发情的牛以及结束发情的牛。在静立发情的雌性、昨天静立发情的雌性或明天将静立发情的雌性，最有可能是爬胯在发情的其它母牛或小母牛的畜群同伴。

[0008] 每个奶农的繁殖管理的主要目标是确保母牛以最佳的间隔产犊，将哺乳重置为最高效率水平。因此，农民为高的受孕率而努力。受孕率（CR）是母牛在服务时的繁殖力的衡量指标。通过将怀孕母牛的数量除以授精的总数来计算受孕率。可观的比率为50-55%，并在第一次授精期（第一次服务）后是最高的。第一次服务时的CR也是整体CR的最佳指标，因为所有母牛都在此计算中，包括在重复服务后缺乏受孕的问题母牛以及可能由于繁殖力差而被淘汰的问题母牛。受孕率受到诸如母牛的生理繁殖力、整体发情检测、精液质量及精液处理和授精技术等因素的影响。这不是易于改进的可变因素，除了确保良好的精液在适当的时间被适当地插入健康的子宫以实现受孕之外。发情检测和确定适当的授精时间通常被认为是实现高CR的最昂贵的组成部分，并且毫无疑问，是AI项目在许多奶牛场取得成功的主要限制因素。动情周期的错误检测和错失及时授精的机会与由于产犊间隔延长、乳汁减少、兽医和小母牛饲养成本增加以及遗传进展缓慢而导致的收入损失有关。特别是当母牛已经早期受精（即在第一次服务之后）时，如果没有实现受孕并且母牛在所述第一次服务之后结果是非妊娠的话，则很难及时检测出再次授精的需要。请注意，当第一次服务后第21天的静立发情未被检测到时，适当地授精以实现成功的受孕并因此妊娠的的下一次机会发生在第一次服务后的第42天左右，增加了整整三周的低生产率滞后阶段至理想的产犊间隔。

[0009] 虽然发情检测可能是某些手术的主要问题，但在一或两次服务中让雌性怀孕是同样重要的。由于以下原因，在美国的大学乳品研究将延长的产犊间隔的成本保守估计为每头空怀超过100天的母牛每天3.19美元至5.41美元：产奶量损失、牛犊产量减少、兽医成本增加、非妊娠母牛的非自愿淘汰以及对替代母牛的需求增加。据估计，由于错误诊断和未能预测最佳的动情周期，美国乳品业损失了3亿美元。同样，由于繁殖问题，每年在加拿大西部从奶牛畜群中移出的母牛超过30%被淘汰。此外，人工授精的平均第一次服务受孕率仅为40％左右。基于1次估计，加拿大奶农每年损失高达2.3亿美元的潜在收入，因为目前国家的平均产犊间隔为14个月。

[0010] 当使用AI时，实现最佳的产犊间隔的挑战首先取决于对动情周期的有效预测。发情检测辅助工具是可用的。发情检测辅助工具通常用于补充但不能代替目视观察。这些包括尾部涂料、尾根标志器或检测器、颌下钢球发情标志器和记录爬胯或活动行为的检测系统。发情检测辅助工具的应用方法、检测方法、每种动物的成本和检测精确度各不相同。检测器（试情）动物也能够协助发情检测。试情动物包括几种类型的已切除输精管的公牛（gomer bull）、这些公牛通过外科手术改变以防止成功授精。

[0011] 多年来，科学已经提供了旨在帮助乳品生产者变得更有效率和生产力的各种繁殖管理技术。例如，自动化或电子的发情检测系统在一些畜群中显示出一些益处。利用无线技术，包含压力开关的无线电发射器例如可以粘在牛的尾根上，以监测所述牛的爬胯活动并将爬胯数据传输至计算机，在该计算机中软件检查每只动物的爬胯图谱。然而，与其它繁殖计划非常相似，自动化的发情检测的有用性取决于个别的乳品的管理系统、发情检测能力和育种目标，并且当尾根或颌下钢球发情检测器或者爬胯或活动发射器例如在挤奶笔中用力移动时，或者当母牛试图被另一头母牛爬胯时，自动化的发情检测的有用性也可能是简单的但严重地失败。

[0012] 已经尝试调整通常检测妊娠的方法以允许预测发情，推断积极测试妊娠的母牛将通常仅在产犊后发情，其中非妊娠的母牛通常可能很快进入发情，至少在妊娠试验后不到3周内。目前，在授精后10至13周通过人工经直肠妊娠检查对母牛进行测试是确定妊娠最可靠的方法。然而，在第一次服务后、妊娠能够被清楚地检测前，这段很长的时间排除使用手动经直肠技术来预测服务后第3周的非妊娠和动情周期。类似地，通常由兽医进行以检测萌芽胚胎的经直肠超声检查（TRUS）可以允许在授精后28-35天检测妊娠、在授精后42天更可靠地检测妊娠，但无法在服务后的第21天再次预测非妊娠和动情周期。妊娠相关糖蛋白（PAG）构成一大类糖蛋白，其根据空间和时间表达模式在反刍动物胎盘的肉阜的浅层中合成。当PAG在母体血液中释放时，它们可用于妊娠诊断、妊娠随访和监测滋养层的功能。然而，反刍动物的胚胎植入在第3周后开始，是非侵入性的并且相当慢。在5周时，在牛的胚胎膜与覆盖在肉阜上的子宫内膜之间仅存在紧密附着，并且此后胎盘才完全长成。因此，血液中的PAG测量只能从第35天开始以及在由农民授精或服务来进行繁殖管理后可靠地使用。然而，特别是在第5周及以后表明妊娠，PAG的早期（即第19天）测量被认为无法从还没有将PAG释放至血液中的妊娠3周的动物中及时识别需要在第3周再次授精的呈PAG阴性的非妊娠动物。类似地，对早期受孕因子（ECF）侧流测试准确测定奶牛的非妊娠状态的能力进行评估。涉及191头母牛和832个测试的2个田间试验的结果表明，通过使用ECF测试，母牛可以被正确诊断为非妊娠的可能性仅为约50%。从同一头母牛获得的乳汁和血清之间的测试结果一致性为57.5%。当相同的母牛在4周的时间内反复测试时，ECF测试在识别非妊娠方面并不一致。结论是ECF测试不能准确识别奶牛的非妊娠。

[0013] 在血液或乳汁中的孕酮（P4）测量最接近早期检测妊娠，在授精后第21天左右乳汁P4水平下降至5 ng/ml以下的母牛一般都没有妊娠。然而，这种早期P4测量根本不是特异性的，许多非妊娠动物测试P4的稳定阳性以及超过第21天很多天，因为即使在非妊娠动物中，黄体的高残留的产孕酮活性通常延伸到第21天以后。因此，在母牛中，P4测试通常需要从第19天到第28天重复进行测试，因此对于第21天的再次授精测试也是不可靠的，而且在乳汁中比在血液中更不可预测。

[0014] Balhara等人（Early pregnancy diagnosis in Bovines：Current status and future directions, The Scientific World Journal 78, 1-2, (2013)）对牛的早期妊娠诊断提供综述并指出，虽然繁殖后18-24天的低孕酮浓度可准确预测非妊娠，但此期间高孕酮浓度不是早期妊娠的期望的特异度指标，其中是由于母牛之间在动情周期循环的持续时间以及早期或晚期胚胎死亡率的发生率方面的变化。硫酸雌酮的检测仅从妊娠期第100天开始才有用且可靠。也称为早期妊娠因子（EPF）的早期受孕因子（ECF）的检测通常被认为是（Balhara等人）错误的妊娠检测方法。检测胎儿干扰素τ 样蛋白质或者通过由胎儿早期产生的胎儿干扰素τ 样蛋白质引发或刺激的胎儿或子宫表达产物以检测妊娠在很大程度上被排除，因为在子宫外组织和外周循环中的水平极低。由在胎儿或子宫中的干扰素τ样蛋白质刺激的基因表达产物的差异检测也被发现取决于所涉及的动物的胎次，再次排除其在整个畜群的可靠妊娠检测中的用途。妊娠相关糖蛋白（PAG）的检测可用于30-80天的妊娠检测，但不能更早。Balhara等人得出结论，有必要在畜牧物种中对新的早期妊娠诊断进行进一步研究。

[0015] Lee等人（Proteomic analysis of Bovine-specific serum proteins by 2D fluorescence difference gel electrophoresis, Asian Austral. J. Anim. Sci. 28, 6, (2015)）仅通过牛血清中妊娠蛋白质组学研究检测，并在2D荧光差异凝胶电泳（DIGE）中对人工授精后第21天采集的2头妊娠母牛的血清与21天前未进行授精的2头非妊娠母牛的血清进行比较。乳样（无需手术步骤即可容易获得）尚未经过测试，Lee等人也未测试21天前已进行人工授精的非妊娠母牛的血清。Lee等人得出结论，早孕的牛血清可能有几种妊娠特异性的蛋白质（见表2那里）、根据他们，这些妊娠特异性的蛋白质对于开发早期妊娠诊断标志物来说可能是有价值的信息。然而，他们未能鉴定需要进一步测试的蛋白质，没有提供早于或晚于第21天采集的血清蛋白的信息，也没有提供21天前授精、可能或可能没有经历过早期失去胚胎的非妊娠母牛中存在的血清蛋白的信息。此外，在第21天预测静立发情时，在第21天在繁重的DIGE测试中测试血清肯定是不可行的。在血清第一经历第一向等电聚焦、第二经历第二向凝胶电泳、第三经历染色至少24小时后，然后需要进行图像分析，在这之后完全不同的蛋白质必须通过MALDI-TOF质谱仪、分析和指纹法来鉴定，当测试的结果从实验室返回时，在第21天可能需要再次授精的大多数母牛的发情很可能已经消失，使在第42天对那些母牛进行再次授精再次成为必需，并没有给农民带来任何益处。

[0016] WO2004059282基于以下发现：在牛中，在受孕后不久，胎体所释放其中一种主要蛋白质（在妊娠大约第13至20天）是干扰素τ（IFN-τ）、最初称为滋养层素或滋养层蛋白-1。在从第18天妊娠的母牛中处理子宫内膜外植体后，响应于重组IFN-τ和重组IFN-α，将17 kDa子宫蛋白释放至培养基中。该17 kDa蛋白被发现尺寸与人IFN刺激的基因产物-15（也称为huUCRP）相似，并且与抗泛素的抗血清发生免疫反应。因此，该蛋白被称为牛泛素交叉反应蛋白（bUCRP）。该牛泛素交叉反应蛋白（也称为牛IFN刺激的基因产物-17，ISG17）由子宫内膜响应于从妊娠第13天至第20天牛胎体分泌的干扰素τ产生。WO2004059282讨论了结合血清ISG17水平来测试血清孕酮，并且还讨论了乳汁孕酮水平的分析。然而，WO2004059282没有公开对乳汁中ISG17水平的技术上可行的分析，与本领域的发现一致的是，如上文Balhara等人讨论过的，检测胎儿干扰素τ 样蛋白质或者通过由胎儿早期产生的干扰素τ样蛋白质引发或刺激的胎儿表达产物以检测妊娠在很大程度上被排除，因为在子宫外组织和外周循环中的水平极低。

[0017] WO03043524讨论了血清中孕酮的分析以及妊娠相关糖蛋白（PAG）的分析。WO03043524提供了具有来自79头母牛的数据的研究，该研究显示血清中PAG值高于或等于
10 ng/ml以及血清中孕酮值高于或等于2 ng/ml的组合，将预测从AI后25天母牛的妊娠状态，灵敏度为97%，特异度为97%。WO03043524还提供了具有来自270头母牛的数据的研究，该研究显示其能够在第25天识别96%的妊娠母牛（即4%假阴性）和91.2%的空怀母牛（8.8%假阳性）、血清中含10 ng/ml PAG，P4的血清界限范围为2 ng/ml。数据还显示，将PAG界限范围增加至26 ng/ml并且P4界限在2 ng/ml持续地提高了测试的特异度（减少了假阳性诊断）。有效地，在第25天之前用WO03043524中讨论的方法进行测试不会导致可靠的妊娠检测，使得研究人员需要开发一种在PAG/孕酮妊娠诊断后使乳牛和小母牛再同步的方法。通常，在WO03043524中，牛在繁殖后28至30天进行PAG/孕酮测试，并被诊断为妊娠或非妊娠。在PAG /孕酮测试后0至2天，在非妊娠母牛上实施再同步方法。以下列顺序处理动物：（i）注射前列腺素F2"（PGF2XX；引起黄体消退的激素）；（ii）等待两天，注射促性腺激素释放激素（GnRH；
引起排卵的激素）；（iii）等待0到8小时；（iv）人工授精。

[0018] 简而言之，奶牛的繁殖效率低下是乳品生产者面临的主要经济问题。如果母牛进行了授精，但在第一次服务后没有受孕，母牛应该在大约21天恢复发情（动情周期）。然而，由于发情检测在现代乳畜群中并不是最佳的，因此许多未能受孕的母牛直到兽医在繁殖后约40天、在母牛进行所述服务后进入第二次发情之前不久进行妊娠诊断时才被识别。第21天之后的再同步仅部分解决了繁殖时间的这种损失。因此，需要这样的技术，该技术允许在授精后不到21天的时刻足够准确地确定妊娠或非妊娠，从而允许非妊娠母牛及时再次授精，以有助于通过减少那些母牛的产犊间隔来提高奶牛的繁殖效率。优选地，这种所需技术允许乳样的测试。

[0019] 本发明提供在之前授精的雌性哺乳动物将预期排卵的时间点之前、优选在所述哺乳动物如果非妊娠的话呈现静立发情的时间点之前确定所述哺乳动物是否妊娠的方法，所述方法包括在所述时间点之前从所述哺乳动物中采取生物样品以及对所述样品是否存在多胎妊娠标志物模式（MPMP）进行测试。本发明还提供在所述时间点之前从所述哺乳动物中采取生物样品以及对所述样品是否存在多胎妊娠标志物模式（MPMP）进行测试。发明人在本文利用这样的事实：受精的复杂生理过程需要以不同模式有序表达许多蛋白质和其他生物标志物，该复杂生理过程导致在子宫中植入早期胚胎、随后胎盘发育并且胚胎进一步发育。这些模式随着时间和妊娠的建立或妊娠的建立失败而改变。单个蛋白质或激素在正确的位置和正确的时刻表达失败以及因此这种模式的破坏，可能会中断妊娠并导致排卵。发明人着手开发这样的测试并开发出非常准确并及时的方法，该测试测量涉及正确胚胎发育或其失败的妊娠生物标志物（例如激素或蛋白质）的多种模式，该方法能够在雌性哺乳动物预期继续其妊娠或者当妊娠失败时预期为另一次排卵做准备的时间点附近测量多种生物模式过程的状态。这种多胎妊娠标志物模式（MPMP）测试原则上能够应用于所有物种的哺乳动物，其中妊娠的哺乳动物与非妊娠的哺乳动物相比，在所述哺乳动物将预期继续其妊娠或者如果非妊娠的话为排卵做准备的时间附近存在不同模式的差异。优选使用质谱法的现代蛋白质组学分析非常适合检测标志物模式。原则上，甚至没有必要确定所涉及的标志物的绝对量，足以记录研究中的标志物的相对不同量，以提供与妊娠或非妊娠有关的标志物的峰的图谱或图案。当已知一组标志物时，可以考虑利用例如开发用于检测所述标志物的免疫测定法、使用特异性针对所涉及的MPMP的个别标志物的抗体来进行替代测试。为了匹配质谱法所允许的多种测试格式，可以使用多重免疫测定法格式。利用检测标志物模式的这种一般原则，发明人开发了各种测试以确定母牛的MPMP，其结果可由农民理解用于奶牛管理。在本发明的优选实施例中，提供了在之前授精的雌性哺乳动物如果非妊娠的话将预期排卵的时间点之前确定所述哺乳动物是否妊娠的方法，所述方法包括在所述时间点之前从所述哺乳动物采取生物样品以及对所述样品是否存在多胎妊娠标志物模式（MPMP）进行测试，其中测试所述样品的孕酮和至少一种标志物的相对表达，所述标志物选自标志物蛋白的组，所述标志物蛋白各自有助于与妊娠状态相关的显着差异标志物表达模式。优选的是，测试所述样品以确定所述哺乳动物是否非妊娠并为了建立妊娠可以再次授精。

[0020] 由此，本发明提供在授精的雌性哺乳动物如果非妊娠的话根据其物种的一般排卵周期预期或将预期排卵的时间点之前确定所述哺乳动物是否妊娠的方法。所述方法包括在所述第一时间点从所述哺乳动物中采取生物样品以及测试所述样品的孕酮和至少一种标志物的相对表达，所述标志物选自标志物蛋白的组，所述标志物蛋白各自具有与妊娠状态相关的显着差异标志物表达水平。本发明还提供了一种在授精后21天或不到21天的时间测试母牛的妊娠或非妊娠的方法，包括对所述母牛的样品的一种或多种蛋白质的相对存在进行测试，所述蛋白质选自蛋白质的组，该蛋白质的组由κ-酪蛋白（CSN3；本文还称为MS147）、Rho相关的GTP结合蛋白（RhoB；MFGM661）、蛋白质二硫化物异构酶（P4HB；MS9）、花生四烯酸12-脂加氧酶（ALOX12；MFGM197）、组织蛋白酶Z（CTSZ；MS92）、破骨细胞刺激因子1（OSTF1；
MFGM713）和UBX结构域蛋白4（UBXN4；MFGM660）组成。该组由7种蛋白质组成，与来自一组30头非妊娠母牛、在授精后第19天采取的乳样相比，来自一组30头妊娠母牛、在授精后第19天采取的乳样中的这7种蛋白质被发现显着上调或显着下调（通过T检测分析来研究，P <0.05显着性水平）。目前的发明人理解，在服务后第21天之前的早期阶段对母牛进行准确的妊娠预测对于奶农来说非常重要，这样他们就可以受益于在21天左右即将发生的排卵时立即对所述母牛进行授精，不必等待完整的排卵周期而只能在42天进行授精。目前最早的可靠妊娠测试可在授精后35天进行测试。排卵以21天的间隔发生。因此，开发在21天排卵前进行的妊娠/非妊娠测试，例如在授精后约19天的测试。知道在下一次发情之前母牛是非妊娠的将使农民意识到即将发生的发情，这样他们就可以更好地关注母牛并采取相应行动，以当母牛进入发情时及时对其进行授精。这减少了一些母牛21天的产犊间隔。此外，知道母牛是妊娠的将防止不必要的再次授精。这将节省授精成本，但更重要的是将防止受精卵受损，受精卵受损可能导致早期胚胎死亡。本发明提供了测试母牛妊娠或非妊娠的方法。发明人已着手检测涉及正确的胚胎发育或失败的蛋白质，其在建立妊娠期间起作用，以发现测量涉及在母牛中建立妊娠的生物过程的状态的生物标志物。然后，发明人开发了对测试结果的解释，该测试结果可用于由农民进行的繁殖奶牛管理。由于母牛在发育中的妊娠和不成功妊娠的恢复期间的主要生理变化，发明人理解血液含有提供这些过程的详细且特异性指示的成分，因此反映了妊娠的哺乳动物妊娠期的状态。涉及妊娠相关过程的循环蛋白质可能是实时检测这些过程的潜在生物标志物。乳汁还含有许多在血液中循环的蛋白质，使得乳汁因其易于获得而成为检测妊娠的理想来源。通过质谱法的蛋白质组学方法能够快速且广泛地筛选生物样品中的所有蛋白质，以检测具有与生理状态（例如妊娠）相关的可变表达的标志物蛋白。能够对反映血液的蛋白质图谱的大多数生物样品进行测试，例如血清或血浆或某些情况下的尿液，然而为了便于获得，优选的是所述样品是乳汁。

[0021] 在优选的实施例中，本发明提供在授精的雌性哺乳动物如果非妊娠的话将预期排卵的时间点之前确认所述哺乳动物是否妊娠的方法，所述方法包括在所述时间点之前从所述哺乳动物采取生物样品以及测试所述样品的孕酮和至少一种标志物的相对表达，所述标志物选自标志物蛋白的组，所述标志物蛋白各自具有与妊娠状态相关的显着差异标志物表达水平。优选的是，选自所述组的所述标志物的错误发现率小于1%。进一步优选的是，通常在所测试物种的雌性哺乳动物的生物样品中可检测到所述至少一种标志物的所述表达。此外，优选这样的方法，其中测试选自所述生物标志物蛋白的组的至少一种标志物的相对表达通过测试所述样品的孕酮的相对表达来增加确定妊娠的预测价值。为了确定哺乳动物是否妊娠，对蛋白质和孕酮的相对表达的图谱或图案进行计算。为了开发算法或公式以评估结果的效果，优选使用所有可能回归方法并计算利用通常可用的统计软件正确分类的特异度、灵敏度和百分比的交叉验证估计，其有利于这样的优点，该优点即利用来自所测试的所述不同种类的哺乳动物的增加的数据集的重复计算改进了所研究的特定物种的公式。

[0022] 在本发明的一些实施例中，提供通过质谱法完成测试所述样品的方法。这是一种分析化学技术，其中能够确定蛋白质的质荷比。使用质谱法，蛋白质被电离以获得带电荷的蛋白质和/或带电荷的蛋白质片段。然后，这些带电荷的蛋白质和/或片段通常被加速并经受电场或磁场。带电荷的蛋白质和片段的偏转量表示它们的质荷比。在优选的实施例中，所述质谱法包括液相色谱-质谱法（LC-MS）或多反应监测（MRM）。在最优选的实施例中，LC-MS/MS技术被用于测试所述样品。如在本申请中的示例中进一步详细的描述的LC-MS/MS技术提供了本发明在本文所提供的所需的多胎妊娠标志物模式识别和预测适当授精时间。

[0023] 在本发明的一些其他实施例中，提供通过免疫测定法完成测试所述样品的方法。在优选的实施例中，所述免疫测定法包括酶联免疫吸附测定（ELISA）（例如用于孕酮（P4）测试）或放射免疫测定法（RIA）和/或蛋白质印迹试验，设有用于在免疫测定法中有用的结合化合物，例如特异性抗体。在一些实施例中，进行试纸ELISA。优选地，试纸设有在免疫测定法中有用的结合化合物。在更优选的实施例中，所述免疫测定法包括多重免疫测定法，以同时测量单个样品中的多个特定蛋白质靶标，例如基于Luminex® xMAP®技术。由本发明提供的这样的多重试验也可以提供多胎妊娠标志物模式识别并预测适当授精时间。在这样的免疫测定法中有用的抗体是可利用的（参见表7）或能够在本领域中制备。可以对反映血液蛋白质图谱的大多数生物样品进行测试，例如血清或血浆、尿液或某些情况下的乳汁。优选地，生物样品的种类易于且非侵入性地收集（例如乳牛的乳汁、人类的尿液）。本发明可以应用于各种动物物种或甚至应用于人类。需要注意将测试的时间点调整至所研究物种的相应排卵周期。人类的排卵周期为28天，通常不会像其他动物那样出现静立发情。在一个实施例中，在授精的女性如果非妊娠的话根据其物种的28天一般排卵周期预期或将预期排卵的时间点之前确定所述哺乳动物是否妊娠的方法，所述方法包括在所述第一时间点从所述女性中采取生物样品以及测试所述样品的孕酮和至少一种标志物的相对表达，所述标志物选自标志物蛋白的组，所述标志物蛋白各自具有与人类的妊娠状态相关的显着差异标志物表达水平，尤其以提供多胎妊娠标志物模式识别，以预测人类的适当授精时间。

[0024] 在排卵之前呈现静立发情的动物通常在奇蹄目中（尤其是马或驴）以及在偶蹄目（尤其是母牛、山羊和绵羊以及猪）中发现。山羊的排卵周期为19天，在一个其他实施例中，在授精的雌性山羊如果非妊娠的话根据其物种的19天一般排卵周期预期或将预期排卵的时间点之前确定所述山羊是否妊娠的方法，所述方法包括在所述第一时间点从所述雌性山羊中采取生物样品以及测试所述样品的孕酮和至少一种标志物的相对表达，所述标志物选自标志物蛋白的组，所述标志物蛋白各自具有与山羊的妊娠状态相关的显着差异标志物表达水平，尤其以提供多胎妊娠标志物模式识别，以预测山羊的适当授精时间。

[0025] 绵羊的排卵周期为19天，在一个其他实施例中，在授精的雌性绵羊或母羊如果非妊娠的话根据其物种的19天一般排卵周期预期或将预期排卵的时间点之前确定所述绵羊是否妊娠的方法，所述方法包括在所述第一时间点从所述母羊中采取生物样品以及测试所述样品的孕酮和至少一种标志物的相对表达，所述标志物选自标志物蛋白的组，所述标志物蛋白各自具有与绵羊的妊娠状态相关的显着差异标志物表达水平，尤其以提供多胎妊娠标志物模式识别，以预测母羊的适当授精时间。

[0026] 猪的排卵周期为21天，在一个其他实施例中，在授精的雌性猪或母猪如果非妊娠的话根据其物种的21天一般排卵周期预期或将预期排卵的时间点之前确定所述母猪是否妊娠的方法，所述方法包括在所述第一时间点从所述母猪中采取生物样品以及测试所述样品的孕酮和至少一种标志物的相对表达，所述标志物选自标志物蛋白的组，所述标志物蛋白各自具有与母猪的妊娠状态相关的显着差异标志物表达水平，尤其以提供多胎妊娠标志物模式识别，以预测母猪的适当授精时间。

[0027] 马的排卵周期为21天，在一个其他实施例中，在授精的雌性马或母马如果非妊娠的话根据其物种的21天一般排卵周期预期或将预期排卵的时间点之前确定所述母马是否妊娠的方法，所述方法包括在所述第一时间点从所述母马中采取生物样品以及测试所述样品的孕酮和至少一种标志物的相对表达，所述标志物选自标志物蛋白的组，所述标志物蛋白各自具有与母马的妊娠状态相关的显着差异标志物表达水平，尤其以提供多胎妊娠标志物模式识别，以预测母马的适当授精时间。

[0028] 母牛的排卵周期为21天，在一个其他实施例中，在授精的母牛如果非妊娠的话根据其物种的21天一般排卵周期预期或将预期排卵的时间点之前确定所述母牛是否妊娠的方法，所述方法包括在所述第一时间点从所述母牛中采取生物样品以及测试所述样品的孕酮和至少一种标志物的相对表达，所述标志物选自标志物蛋白的组，所述标志物蛋白各自具有与母牛的妊娠状态相关的显着差异标志物表达水平，尤其以提供多胎妊娠标志物模式识别，以预测母牛的适当授精时间。个别的母牛有时具有稍短（即短至19-20天）或稍长（即长至22-23天）的排卵周期，优选的是，所述样品在所述母牛授精之后的17-21天、优选18-20天、更优选在19天采取，以最好地预测适当的再次授精时间。特别地，提供在母牛中进行测试的方法，其中标志物蛋白的所述组包括κ-酪蛋白（CSN3）、Rho相关的GTP结合蛋白（RhoB）、蛋白质二硫化物异构酶（P4HB）、花生四烯酸12-脂加氧酶（ALOX12）、组织蛋白酶Z（CTSZ）、破骨细胞刺激因子1（OSTF1）和UBX结构域蛋白4（UBXN4）。当在母牛中进行测试时，优选的是，至少一种标志物的所述组包括UBXN4。如本文详细的描述中所示，当母牛的乳汁样品中的孕酮浓度高于5ng/ml且乳汁样品中的UBXN4浓度被确定的时，应用公式Y = (-17.8933+(2.4546×UBXN4)+( 0.1472×孕酮)，在Y>0的情况下，动物被认为妊娠。如果Y<0，则动物被认为非妊娠。基于如本文说明书中所描述的测试60头母牛，该测定的平均灵敏度为82%，平均特异度为80%，正确分类率为81%。

[0029] 当在母牛中进行测试时，甚至更优选的是，至少一种标志物的所述组包括CSN3和P4HB两种标志物。如本文详细的描述中所示，当所述乳汁样品中的孕酮浓度高于5ng/ml且所述乳汁样品中的κ-酪蛋白浓度和蛋白质二硫键异构酶浓度被确定时，应用公式Y = (75.5618+(-2.7697×CSN3)+(-9.7142×P4HB)+(0.1707×孕酮)，在Y>0的情况下，动物被认为妊娠。如果Y<0，则动物被认为非妊娠。基于如本文说明书中所描述的测试60头母牛，该测定的平均灵敏度为 86%，平均特异度为85%，正确分类率为85%。

[0030] 当在母牛中进行测试时，甚至更优选的是，至少一种标志物的所述组包括CSN3、P4HB和OSTF1三种标志物。如本文详细的描述中所示，当所述乳汁样品中的孕酮浓度高于5ng/ml且所述乳汁样品中的κ-酪蛋白浓度、蛋白质二硫键异构酶浓度和破骨细胞刺激因子
1浓度被确定时，应用公式Y = (86.6024+(-3.3000×CSN3)+(-14.9385×P4HB)+(3.3527×OSTF1)+(0.2242×孕酮)，在Y>0的情况下，动物被认为妊娠。如果Y<0，则动物被认为非妊娠。基于如本文说明书中所描述的测试60头母牛，该测定的平均灵敏度为 92%，平均特异度为93%，正确分类率为92%。

[0031] 当在母牛中进行测试时，甚至更优选的是，至少一种标志物的所述组包括CSN3、P4HB、RhoB和ALOX12四种标志物。如本文详细的描述中所示，当所述乳汁样品中的孕酮浓度高于5ng/ml且所述乳汁样品中的κ-酪蛋白浓度、Rho相关的GTP结合蛋白浓度、蛋白质二硫键异构酶浓度和花生四烯酸12-脂加氧酶浓度被确定时，应用公式Y = (8954.89+(-365.97×CSN3)+(1517.26×P4HB)+(217.79×RhoB)+(166.7×ALOX12)+(18.81×孕酮)，在Y>0的情况下，动物被认为妊娠。如果Y<0，则动物被认为非妊娠。基于如本文说明书中所描述的测试60头母牛，该测定的平均灵敏度为 96%，平均特异度为93%，正确分类率为94%。

[0032] 当在母牛中进行测试时，甚至更优选的是，至少一种标志物的所述组包括CSN3、P4HB、RhoB、ALOX12和CTSZ五种标志物。如本文详细的描述中所示，当所述乳汁样品中的孕酮浓度高于5ng/ml且所述乳汁样品中的κ-酪蛋白浓度、Rho相关的GTP结合蛋白浓度、蛋白质二硫键异构酶浓度、花生四烯酸12-脂加氧酶浓度和组织蛋白酶Z浓度被确定时，应用公式Y =(6163.87 +(-247.94×CSN3)+(-969.05×P4HB)+(100.93×RhoB)+(100.38×ALOX12)+(-17.25×CTSZ)+(15.49×孕酮)，在Y>0的情况下，动物被认为妊娠。如果Y<0，则动物被认为非妊娠。基于如本文说明书中所描述的测试60头母牛，该测定的平均灵敏度为96%，平均特异度为96%，正确分类率为96%。

[0033] 包括用于根据本发明的一种或多种标志物的检测装置的试剂盒也在此提供。这样的试剂盒尤其适用于对乳样进行分型。因此，还提供的是包括一种或多种标志物的检测装置的试剂盒，所述标志物选自κ-酪蛋白（CSN3）、Rho相关的GTP结合蛋白（RhoB）、蛋白质二硫化物异构酶（P4HB）、花生四烯酸12-脂加氧酶、（ALOX12）、组织蛋白酶Z（CTSZ）、破骨细胞刺激因子1（OSTF1）和UBX结构域蛋白4（UBXN4）。在一些实施例中，根据本发明的试剂盒还包括孕酮的检测装置。然而，这不是必需的，因为市售的孕酮测试试剂盒也能够与根据本发明的一个或多个试剂盒结合使用。如前所述，所述检测装置优选包括能够特异性结合根据本发明的一种或多种标志物蛋白的一种或多种结合化合物（优选一种或多种抗体或者其功能性等价物或功能性部分）。这些试剂盒尤其适用于检测和/或定量乳样中存在的标志物蛋白。

[0034] 在一个优选的实施例中，提供了试剂盒，该试剂盒包括能够特异性结合UBX结构域蛋白4的结合化合物，优选为抗体或者其功能性等价物或功能性部分。这样的试剂盒尤其适用于对牛乳样进行分型，以便测试妊娠。如前所解释，当与用于孕酮的检测装置结合时，能够以0.82的平均灵敏度和0.80的平均特异度确定妊娠，该平均灵敏度和平均特异度分别比目前所使用的乳汁孕酮测试的平均灵敏度和平均特异度高。在一个优选的实施例中，包括用于UBX结构域蛋白4的检测装置、根据本发明的试剂盒还包括用于孕酮的检测装置。然而，这是不必要的，因为市售的孕酮测试试剂盒也能够与包括用于UBX结构域蛋白4的检测装置、根据本发明的试剂盒结合使用。

[0035] 在一个优选的实施例中，提供了试剂盒，该试剂盒包括：能够特异性结合κ-酪蛋白的结合化合物，优选为抗体或者其功能性等价物或功能性部分，以及
能够特异性结合蛋白质二硫键异构酶的结合化合物，优选为抗体或者其功能性等价物或功能性部分。

[0036] 这样的试剂盒尤其适用于对牛乳样进行分型，以便测试妊娠。如前所解释，当与用于孕酮的检测装置结合时，能够以0.86的平均灵敏度和0.85的平均特异度确定妊娠，该平均灵敏度和平均特异度分别比目前所使用的乳汁孕酮测试的平均灵敏度和平均特异度高。在一个优选的实施例中，包括κ-酪蛋白和蛋白质二硫键异构酶的检测装置、根据本发明的试剂盒还包括用于孕酮的检测装置。然而，这是不必要的，因为市售的孕酮测试试剂盒也能够与包括用于κ-酪蛋白和蛋白质二硫键异构酶的检测装置、根据本发明的试剂盒结合使用。

[0037] 在一个优选的实施例中，提供了试剂盒，该试剂盒包括：能够特异性结合κ-酪蛋白的结合化合物，优选为抗体或者其功能性等价物或功能性部分，和
能够特异性结合蛋白质二硫键异构酶的结合化合物，优选为抗体或者其功能性等价物或功能性部分，以及
能够特异性结合破骨细胞刺激因子1的结合化合物，优选为抗体或者其功能性等价物或功能性部分。

[0038] 这样的试剂盒尤其适用于对牛乳样进行分型，以便测试妊娠。如前所解释，当与用于孕酮的检测装置结合时，能够以0.92的平均灵敏度和0.93的平均特异度确定妊娠，该平均灵敏度和平均特异度分别比目前所使用的乳汁孕酮测试的平均灵敏度和平均特异度高。在一个优选的实施例中，包括用于κ-酪蛋白、蛋白质二硫键异构酶和破骨细胞刺激因子1的检测装置、根据本发明的试剂盒还包括用于孕酮的检测装置。然而，这是不必要的，因为市售的孕酮测试试剂盒也能够与包括用于κ-酪蛋白、蛋白质二硫键异构酶和破骨细胞刺激因子1的检测装置、根据本发明的试剂盒结合使用。

[0039] 在一个优选的实施例中，提供了试剂盒，该试剂盒包括：能够特异性结合κ-酪蛋白的结合化合物，优选为抗体或者其功能性等价物或功能性部分，和
能够特异性结合Rho相关的GTP结合蛋白的结合化合物，优选为抗体或者其功能性等价物或功能性部分，和
能够特异性结合蛋白质二硫键异构酶的结合化合物，优选为抗体或者其功能性等价物或功能性部分，以及
能够特异性结合花生四烯酸12-脂加氧酶的结合化合物，优选为抗体或者其功能性等价物或功能性部分。

[0040] 这样的试剂盒尤其适用于对牛乳样进行分型，以便测试妊娠。如前所解释，当与用于孕酮的检测装置结合时，能够以0.96的平均灵敏度和0.93的平均特异度确定妊娠，该平均灵敏度和平均特异度分别比目前所使用的乳汁孕酮测试的平均灵敏度和平均特异度高。在一个优选的实施例中，包括用于κ-酪蛋白、Rho相关的GTP结合蛋白、蛋白质二硫键异构酶和花生四烯酸12-脂加氧酶的检测装置、根据本发明的试剂盒还包括用于孕酮的检测装置。
然而，这是不必要的，因为市售的孕酮测试试剂盒也能够与包括用于κ-酪蛋白、Rho相关的GTP结合蛋白、蛋白质二硫键异构酶和花生四烯酸12-脂加氧酶的检测装置、根据本发明的试剂盒结合使用。

[0041] 在一个优选的实施例中，提供了试剂盒，该试剂盒包括：能够特异性结合κ-酪蛋白的结合化合物，优选为抗体或者其功能性等价物或功能性部分，和
能够特异性结合Rho相关的GTP结合蛋白的结合化合物，优选为抗体或者其功能性等价物或功能性部分，和
能够特异性结合蛋白质二硫键异构酶的结合化合物，优选为抗体或者其功能性等价物或功能性部分，和
能够特异性结合花生四烯酸12-脂加氧酶的结合化合物，优选为抗体或者其功能性等价物或功能性部分，以及
能够特异性结合组织蛋白酶Z的结合化合物，优选为抗体或者其功能性等价物或功能性部分。

[0042] 这样的试剂盒尤其适用于对牛乳样进行分型，以便测试妊娠。如前所解释，当与用于孕酮的检测装置结合时，能够以0.96的平均灵敏度和0.96的平均特异度确定妊娠，该平均灵敏度和平均特异度分别比目前所使用的乳汁孕酮测试的平均灵敏度和平均特异度高。在一个优选的实施例中，包括用于κ-酪蛋白、Rho相关的GTP结合蛋白、蛋白质二硫键异构酶、花生四烯酸12-脂加氧酶和组织蛋白酶Z的检测装置、根据本发明的试剂盒还包括用于孕酮的检测装置。然而，这是不必要的，因为市售的孕酮测试试剂盒也能够与用于κ-酪蛋白、Rho相关的GTP结合蛋白、蛋白质二硫键异构酶、花生四烯酸12-脂加氧酶和组织蛋白酶Z的检测装置、根据本发明的试剂盒结合使用。在这样的试剂盒中有用的抗体是可利用的（参见表7）或能够在本领域中制备。

[0043] 根据本发明的试剂盒的检测装置优选存在于固体载体上。优选的固体载体包括蛋白质微阵列、试纸、条带、芯片和/或生物传感器。这些固体载体允许乳样的简单测试。

[0044] 一种或多种标志物的检测装置用于确定在生物样品中、优选在母牛乳汁中一种或多种所述标志物的存在和/或（相对）含量的应用，所述标志物选自κ-酪蛋白（CSN3）、Rho相关的GTP结合蛋白（RhoB）、蛋白质二硫化物异构酶（P4HB）、花生四烯酸12-脂加氧酶、（ALOX12）、组织蛋白酶Z（CTSZ）、破骨细胞刺激因子1（OSTF1）和UBX结构域蛋白4（UBXN4）。附图说明

[0045] 图1在授精后第19天和第35天，妊娠母牛和非妊娠母牛的乳汁中乳汁孕酮水平（P4）和妊娠相关糖蛋白（PAG）浓度的比较。A和B：妊娠（A）母牛和非妊娠（B）母牛在第19天的P4和PAG；C和D：妊娠（C）母牛和非妊娠（D）母牛在第35天的P4和PAG；E：妊娠母牛在第19天的P4和在第
35天的PAG；F和G：妊娠（F）母牛和非妊娠（G）母牛在第19天和在第35天的P4。

[0046] 图2与母牛的静立发情和授精相关的事件和时间间隔。

[0047] 繁殖管理是奶牛的重要经济因素。在过去几十年中，人工授精成功率已经降低。因此，奶牛越来越多地进入泌乳后期生产率较低的阶段。另一方面，农民需要避免昂贵、不必要的再次授精。因此，需要进行使正确的再次授精决定成为可能的测试。再次授精的第一选择是在授精后第21天。截至目前，在授精后第21天之前母牛中妊娠的高效检测方法是缺乏的——在妊娠期第35天之前不可能可靠地检测妊娠。这项研究的目的是在母牛的乳汁中研制生物标志物，该生物标志物表明授精后19天母牛的妊娠期状态。泌乳奶牛被授精，并在第19天用乳汁孕酮测试以及在第35天用经直肠超声检查法确定妊娠。研究了授精后19天30头妊娠母牛和30头非妊娠母牛的乳汁蛋白质组表达谱。用“所有可能回归”方法分析结果，并用“留一交叉验证”方法验证生物标志物。最佳的生物标志物是最多五种不同的蛋白质加上孕酮的组合，显示出96%的预测能力。对三种最佳的生物标志物组合中十种蛋白质的功能注释分析表明，其中八种蛋白质在胚胎或胎盘中表达；另外两种蛋白质在乳腺中表达。得出结论，这里的生物标志物组有可能在第19天表明非妊娠母牛的再次授精。乳汁-妊娠测试能够作为‘牛侧’测试在第19天的乳样上进行，或者能够被并入挤乳机器人环境中。

[0048] 繁殖管理是奶牛的重要经济因素。短的产犊间隔对于保持高生产率非常重要。在过去的几十年里，产犊间隔增加了（Lucy，2001）。早期妊娠检测是繁殖管理的重要工具。由于在授精后恢复周期性的母牛的动情周期表达不佳，农民可能无法检测动情周期（Yoshida和Nakao，2005）。因此，奶牛越来越多地进入泌乳后期生产率较低的阶段。另一方面，农民需要避免不必要的再次授精，而再次授精是昂贵的并且危及流产。特别是在早期妊娠期间，妊娠、未能妊娠或失去非常小的早期胚胎的识别是难以检测的。目前，在妊娠的第35天之前不可能进行可靠的妊娠检测。为了在尽可能早的时刻（即在授精后21天）有效再次授精，有必要在第21天之前区分妊娠母牛和非妊娠母牛。因此，需要进行使正确的再次授精决定成为可能的测试。如果测试的成本低于由太晚识别妊娠失败的利益失去所带来的损失，则改进的测试方法可能对奶农具有经济价值。

[0049] 目前，在授精后第35天的乳汁或血液孕酮测量、经直肠超声（TRUS）或手感和PAG（妊娠相关糖蛋白，Szenci等人，1998）测量被奶农用于繁殖管理。然而，孕酮测试需要从第19至28天重复测试，并且在乳汁中的预测性低于血液（Gillis等人，2006），因此对于第21天再次授精不可靠。PAG测试还在授精后第35天检测到蛋白质，并且在第19天不可靠。类似地，使用单因子（如早期受孕因子）检测早期妊娠的其他方法由于高假阳性或假阴性预测率而失败（Cordoba等人，2001；Ambrose等人，2007）。受精的复杂生理过程需要许多蛋白质的有序表达，该复杂生理过程导致在子宫中植入早期胚胎、随后胎盘发育并且胚胎进一步发育（Memili和First，1999）。在正确的位置和正确的时刻单个蛋白质的表达失败可能中断妊娠。如果测试测量涉及正确的胚胎发育或其失败的蛋白质，将是非常准确且及时的生物标志物来测量生物过程的状态。这样的测试可以解释为奶农的奶牛管理。

[0050] 由于母牛在发育中的妊娠和不成功妊娠的恢复期间的主要生理变化，可以预期血液循环将含有提供这些过程以及因此的母牛的妊娠期状态的详细且特异性指示的成分。涉及妊娠相关过程的循环蛋白质可能是实时检测这些过程的潜在生物标志物。乳汁还含有使乳汁成为测量妊娠的理想来源的许多循环蛋白质（Petit，2003）。

[0051] 蛋白质组学方法能够对生物样品中的所有蛋白质进行广泛筛选，并检测具有与生理状态（如妊娠）相关的可变表达的蛋白质。本研究的目的是鉴定授精的母牛的乳汁中的蛋白质，该蛋白质能够在母牛的乳汁中研制表明母牛授精后19天的妊娠状态的生物标志物。最终的生物标志物能够是包括蛋白质的分子的组合。

[0052] 动物、实验设计以及乳汁收集和分析在2012年7月中旬至9月中旬期间在九个荷兰农场授精后第19、28和35天收集来自泌乳母牛的乳样。乳样中的孕酮浓度如下所述地确定。在授精后的几周内对母牛恢复发情进行监测。直到第35天未恢复发情的母牛在第35-38天通过经直肠超声（TRUS）测试妊娠。为了研究蛋白质组学数据与妊娠/非妊娠的关联，在第35天由TRUS诊断为妊娠的母牛（在第19、28和35天都全部具有高于9.5 ng/ml的乳汁孕酮值）被定义为妊娠。恢复发情（除了一个再次受精的之外）并在第19天或第28天具有低于5 ng/ml的乳汁孕酮值的母牛被定义为非妊娠。
来自30头妊娠母牛和30头非妊娠母牛的第19天乳样用于蛋白质组学分析。研究中使用的母牛的数量因农场而异，但每个农场妊娠母牛和非妊娠母牛是均衡的（表1）。为了比较，还使用第19天乳样和第35天乳样进行基于妊娠相关糖蛋白（PAG）的商业牛乳汁妊娠测试（Szenci等人，1998）（用于第35天乳样）。

[0053] 蛋白质组学和生物信息学乳清（乳汁）和乳霜（含有乳脂球膜（MFGM））级分通过在4℃以1500×g离心20分钟分离并分别收集。通过以100,000×g离心90分钟来清除乳清级分。将级分储存在-80℃直至使用。将乳霜级分用水洗涤四次并以1500×g离心。最后一次洗涤后，将乳霜级分用等体积的
4% SDS在100 mM TRIS/HCl（pH 7.6）中稀释，并在水浴超声仪中超声处理4分钟。在以1500×g离心10分钟后，收集上清液（即含有脂球蛋白质的MFGM级分）并储存在-80℃直至使用（Lu等人，2011）。

[0054] 进行纳米LC傅里叶变换MSMS（FTMS）无标记分析（LC-MS/MS；Lu等人，2011；Smaczniak等人，2012）以鉴定差异或可变表达的蛋白质。使用LTQ-Orbitrap XL质谱仪（美国加利福尼亚州圣何塞热电公司）以高分辨率（60000）在380和1400的质荷比之间测量全扫描正模式FTMS光谱。在线性阱中以数据依赖模式记录FTMS扫描中四个最丰富的多电荷峰的CMS MSMS扫描（MSMS阈值= 5.000）。

[0055] 使用默认设置为Andromeda搜索引擎（Cox等人，2011），利用MaxQuant 1.3.0.5（Cox和Mann 2008，Smaczniak等人，2012）分析LCMS趋向和所获得的所有MSMS谱，除了为N和Q的去酰胺化进行额外的变量修饰。从Uniprot（http://www.uniprot.org）下载的欧洲普通牛数据库与污染物数据库一起使用，该污染物数据库包含常见污染物的60种序列，例如：胰蛋白酶（P00760，牛）、胰蛋白酶（P00761，猪）、角蛋白K22E（P35908，人类）、角蛋白K1C9（P35527，人类）、角蛋白K2C1（P04264，人类）和角蛋白K1CI（P35527，人类）。对于蛋白质鉴定，具有小于1%的错误发现率（FDR）的肽和蛋白质以及具有至少2种所鉴定的肽的蛋白质是被接受的，其中一种或多种肽是独特的并且至少一种未修饰。使用Perseus 1.3模块（可在MaxQuant套件中获得）对MaxQuant/Andromeda工作流输出进行过滤和进一步生物信息学分析并对所鉴定的蛋白质的比率进行分析。从MaxQuant结果表中删除反转的采样数。使用UNIPROT（http://www.uniprot.org/）网站、Gene  Ontology（http://www.geneontology.org/）网站和KEGG（http://www.genome.jp/kegg/）网站更详细地研究上调的蛋白质和下调的蛋白质，以获得蛋白质的生物学功能来评估它们与妊娠的存在与否有关的生物学活性。使用Expression Atlas（http://www.ebi.ac.uk/gxa/home）研究胚胎或胎盘中的表达。

[0056] 与生物信息学有关的统计分析只有在所有动物中具有可检测的表达水平并因此在所有测试的动物中通常可检测的蛋白质用于统计学分析。这消除了具有非常低的表达水平的蛋白质。进行统计学筛选以评估因变量妊娠结果与独立变量蛋白质丰度和乳汁孕酮（P4）水平之间的关系。通过两种不同的统计、平均偏差和皮尔森卡方统计来评估拟合优度。卡方检验的P值小于0.05被认为是统计学上显着的。在妊娠母牛与非妊娠母牛中表达水平显着不同的蛋白质被用于进一步分析。

[0057] 为了从更大的集合中选择最佳的预测变量子集，使用最多有六个独立变量的“所有可能回归”方法。该方法逐个测试所有可能的子集，其具有潜在独立变量的集合的一至六个独立变量。使用R（R核心团队，2014）中的GLM函数，利用二项式数据的逻辑回归模型（广义线性模型，GLM，族=二项式，链=逻辑）进行分析。为了评估每个模型的性能，使用R软件包“R330”的cross.val函数执行留一交叉验证（LOOCV）（Lee等人，2012）。LOOCV涉及使用来自整个数据集的单个观察作为验证集，并且将剩余的观察作为训练集；重复该过程，使得数据集中的每个观察曾经被用作验证集。对于逻辑模型，函数cross.val计算特异度、灵敏度和正确分类百分比的交叉验证估计。

[0058] 授精后第19天乳汁中的孕酮水平表2示出乳汁中的孕酮水平。正如预期的，妊娠母牛中的孕酮与非妊娠母牛相比更高。
由于孕酮水平的变化，乳汁孕酮水平不能区分妊娠母牛和非妊娠母牛。

[0059] 授精后第19天的孕酮（P4）和妊娠相关糖蛋白（PAG）图1示出授精后第19天和第35天母牛的乳汁中乳汁孕酮和PAG水平的比较。在第19天的乳汁中，除了一头外所有妊娠母牛的PAG水平都很低，这确认了PAG在第19天不能用于诊断妊娠。在第35天的乳汁中，PAG水平与大多数母牛的d35 TRUS结果一致，除了2头妊娠母牛（灵敏度为93%）外，均示出高水平，并且所有非妊娠母牛是低水平（图1B）特异度100%）。在非妊娠母牛中，PAG浓度总是低的，而孕酮水平是变化的。

[0060] 蛋白质组学测量分别确定乳清的乳汁蛋白质组和MFGM级分。蛋白质组学测量鉴定出81种乳清蛋白质和
253种MFGM蛋白质，在所有样品中共检测到334种蛋白质（在两种级分中检测到一些蛋白质）。在一些母牛的乳汁中可检测到大约相同数量的蛋白质，而在其他母牛的乳汁中表达水平低于检测阈值。通过利用数据库的比较分析，所有蛋白质被至少2种肽鉴定并量化。这些鉴定用于统计分析后的生物信息学分析。

[0061] 统计分析第19天的所有乳汁蛋白质数据和乳汁孕酮水平被研究用于与第35天确定的妊娠或非妊娠关联。统计学关联分析揭露出示出与母牛的妊娠期状态的关联的27种蛋白质。蛋白质的表达水平在高丰度到低丰度之间变化。结果的示例能够在表6中找到。表3总结了统计分析的结果。孕酮是正确分类母牛百分比方面最具预测性的单生物标志物（表3）。添加蛋白质提高了生物标志物的组合的预测能力（表3）。对于孕酮和五种蛋白质的组合，正确分类母牛的数量达到96%。该生物标志物的灵敏度和特异度均为96%。表3分别示出与1-6种生物标志物的最佳生物标志物组合。所有都包含孕酮。MFGM660蛋白质是生物标志物中所包含的第一蛋白质（由两种组分组成），但未被保留作为由三至六种组分组成的生物标志物的组分。其他蛋白质（如MS147、MS9和MFGM661）是后续生物标志物组合的重复组分。由五种和六种组分组成的生物标志物显示出高度相似性，表明发生了生物标志物组合物的稳定化。

[0062] 蛋白质的生物学分析利用数据库，对蛋白质的鉴定用于研究生物标志物组合中蛋白质的功能生物学注释。
表4示出五种蛋白质在胚胎或胎盘中表达，表明涉及妊娠。更具体地说，已知ALOX12在产前/产后表达，这证明它涉及妊娠。然而，在数据库中未发现与早期妊娠的关系。两种蛋白质被注释，显示在乳腺中的表达。

[0063] 这项研究的目的是鉴定与妊娠相关的母牛乳汁蛋白质，该蛋白质能够为泌乳的授精母牛研制生物标志物，以在授精后第19天检测妊娠。农民能够使用这种妊娠测试来改善他们的母牛的繁殖管理。由于妊娠影响母牛生理机能，因此预计循环的蛋白质组以及因此乳汁的蛋白质组将显示出妊娠的状态。以前，发现能够使用蛋白质组学技术研制生物标志物以监测并预测几种特征（te Pas等人，2013a，b）。在此，表明蛋白质组学技术能够用于研制生物标志物以监测在授精后第19天母牛的妊娠状态。

[0064] 授精后第19天乳汁中的孕酮水平和妊娠相关糖蛋白（PAG）水平乳汁孕酮水平低于5 ng/ml被认为是非妊娠的指征（Bulman和Lamming，1978；Osman等人，2012）。然而，在第19天高于5 ng/ml的乳汁孕酮水平能够与妊娠和非妊娠有关，因为第
19天的非妊娠母牛可能仍然处于黄体期，因此具有高的孕酮水平。在授精后第35天通过TRUS进行妊娠测试。第35天的妊娠母牛在第19天也是妊娠的。但是母牛在第35天之前恢复发情以及在第35天被TRUS看作非妊娠的母牛在第19天可能已经妊娠，但在第19天后胚胎死亡。因此，只有恢复发情并且在第19天或第28天具有低于5 ng/ml的乳汁孕酮值的母牛才被定义为非妊娠。即便如此，有可能在第28天具有低孕酮水平但在第19天不是的母牛在第19天已经妊娠，但在第19-28天之间流产。然而，通过测量孕酮（或通过任何其他手段）来从具有长黄体期的母牛中区分具有早期胚胎死亡（在第28天之前）的妊娠母牛是不可能的。尽管比第19天之前的期间少，但在第19天和第28天之间可能发生一些胚胎死亡（Vasconcelos等人，1997；Lucy，2001；Silke等人，2002）。在我们的“非妊娠”组中存在这样的母牛只能导致特异度的低估而不是高估，因为在第19天根据乳汁蛋白质被正确地鉴定为妊娠、但在第28天基于低孕酮水平被定义为‘非妊娠’的动物将被错误地计为‘假阳性’。

[0065] 本申请的结果还清楚地表明，被开发以在授精后第35天检测妊娠的PAG测试不能在授精后第19天检测妊娠。PAG是妊娠第25天之前未表达的胎盘蛋白质（Green等人，2000）。因此，在本申请的实验中，不能将PAG测试用作妊娠的“黄金标准”。因为现有的生物标志物或牛妊娠的测试都不能在第一次下一次可能的发情之前预测妊娠，所以泌乳乳牛的早期妊娠诊断和最佳繁殖管理需要早期的生理标志物。

[0066] 蛋白质组学生物标志物研制统计学关联分析揭露出示出与母牛的妊娠期状态的关联的27种蛋白质。尽管与其他非缔合蛋白相比，几种蛋白质显示出相对低的表达，但是在所有样品中都可以检测到所有蛋白质。显示出在检测限以下的表达水平的蛋白质不用于关联分析。因此，预计表达水平不会影响统计学关联分析的结果。

[0067] 虽然显示出与母牛的妊娠期状态关联的27种蛋白质中的每一个具有有限的预测能力，但是孕酮加五种蛋白质的组合示出非常高的预测能力。例如，MFGM660蛋白质（含有蛋白4的UBX结构域（UBXN4）——促进ER相关的蛋白质降解的整合内质网膜蛋白质——具有较低的预测能力，因为它仅正确分类52%的样品。然而，值得注意的是，该蛋白质在由2种组分连同孕酮组成的生物标志物组合中具有最高的预测能力。这意味着MFGM660的功能和孕酮的功能是高度互补的。它们共同涵盖了更广泛的妊娠-非妊娠多样性，而不是两种组分的任何其他组合。添加更多组分会从最佳生物标志物组合中移除MFGM660。这意味着这些蛋白质共同涵盖了比MFGM660更广泛的妊娠-非妊娠多样性。之前已经显示出，添加更多蛋白质至生物标志物常常提高预测性和可靠性（te Pas等人，2013b）。然而，应该注意的是，该生物标志物等待独立验证——即利用来自另一个畜群或至少其他母牛的独立研究和数据集——以验证一般适用性的高预测能力。

[0068] 在本文中获得如何基于MPMP结果在测量母牛中生物标志物后确定妊娠。表5示出每个单独因子的界限值可能不是非常有用的，并且包括用公式计算的因子的组合基本上改善了测试。

[0069] 当MPMP生物标志物由5种蛋白质和孕酮组成时。定量测量这6个因子后，应使用如下公式确定妊娠或非妊娠：6个变量
Y = (6163.87 +(-247.94×CSN3)+(-969.05×P4HB)+(100.93×RhoB)+(100.38×
ALOX12)+(-17.25×CTSZ)+(15.49×孕酮)
如果Y>0，则母牛妊娠。

[0070] 5个变量Y = (8954.89+(-365.97×CSN3)+(1517.26×P4HB)+(217.79×RhoB)+
(166.7×ALOX12)+(18.81×孕酮)
如果Y>0，则母牛妊娠。

[0071] 4个变量Y = (86.6024+(-3.3000×CSN3)+(-14.9385×P4HB)+( 3.3527×OSTF1)+
(0.2242×孕酮)
如果Y>0，则母牛妊娠。

[0072] 3个变量Y = (75.5618+(-2.7697×CSN3)+(-9.7142×P4HB)+(0.1707×孕酮)
如果Y>0，则母牛妊娠。

[0073] 2个变量Y = (-17.8933+( 2.4546×UBX)+( 0.1472×孕酮)
如果Y>0，则母牛妊娠。

[0074] 1个变量Y = (-2.3280+(0.1389×孕酮)
如果Y>0，则母牛妊娠。

[0075] 将关联蛋白质的生物信息添加至统计结果中使得能够开发出许多蛋白质的相关生物学机制。这通常会增强结果的再保证（te Pas等人，2013a、b）。不幸的是，许多基因/蛋白质的注释仍然缺乏，或者最多未完成（Stelzl等人，2005）。因此，可以预期通过该方法将丢失相关的蛋白质。最佳生物标志物组合包含可能与妊娠有关的蛋白质（已知在胚胎或胎盘中的表达（http://www.ebi.ac..uk/gxa/home））。因此，生物学分析强化了这种生物标志物检测早期妊娠的结论（Balhara等人，2013）。

[0076] 乳品业的相关性本文所提供的本MPMP生物标志物测试提供了早在授精后17-19天的泌乳母牛妊娠的可靠检测。农民可以使用本文所提供的这种测试来改善繁殖管理、减少进入泌乳后期生产率较低的阶段的母牛的数量并降低不必要的再次授精的成本。检测生物标志物、乳汁的来源能够在没有兽医服务的成本的情况下进行取样。准确的早期妊娠预测对于奶农来说具有经济重要性。目前最早的妊娠测试是在授精后35天。排卵以21天的间隔发生。因此，在21天之前（例如在第一次授精后19天）进行妊娠测试。在下一次发情之前知道母牛是非妊娠的将让农民意识到这一点，这样他们就可以关注母牛并采取相应的行动。这能够减少一些母牛21天的产犊间隔。知道母牛是妊娠的将防止不必要的再次授精。这将节省授精成本，但更重要的是防止受精卵受损，受精卵受损可能导致早期胚胎死亡。

[0077] 如果母牛是非妊娠的并且农民不知道，则农民可能会错过第一次再次授精的可能性并不必要地使21天的产犊间隔增加。下文提供的经济分析考虑到一头牛的21天产犊间隔减少。

[0078] 成本和收益表。

[0079] 将非妊娠母牛的产犊间隔从全国平均值416减少至395，每年每头母牛增加€10的收益。在荷兰农场平均拥有90头母牛并在56天不返情率为 66%，有30.6头母牛可能不是妊娠。没有错过它们的下一次发情以及因此减少它们21天的产犊间隔将导致每年€306的利润。

[0080] 此外，农民不需要进行他们常规的妊娠测试。由于母牛不需要在一天的大部分时间内被限制，该测试比直肠触诊或超声要容易得多，而且该测试不是劳动密集型。

[0081] 表表1. 每个农场妊娠母牛和非妊娠母牛的数量
*如上所定义。

[0082] 表2. 在第19天每个妊娠组乳汁孕酮测量值，P值用T测试确定。

[0083] 表3. 由一至六种组分组成的生物标志物组合物。

[0084] 表4. 生物标志物中所包含的蛋白质的生物信息+：用特征注释的蛋白质，-：未用特征注释的蛋白质；+/-：用特征弱注释的蛋白质。

[0085] 表5本文测试的60头母牛的结果，测量值的平均值和标准差：。

[0086] 表6. 结果示例。

[0087] 表7 市售的ELISA试剂盒。

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