副溶血性弧菌夹心DNA杂交快速检测用探针、试剂盒和检测
方法
技术领域
[0001] 本
发明具体涉及一种VP夹心DNA杂交技术快速检测用探针、试剂及其检测方法。
背景技术
[0002] 副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus，VP)广泛分布于近海岸的
海水、海底泥沙、浮游
生物和鱼、虾、贝类等海产品中。我国华东地区沿岸的
海水的VP检出率为47.5％～66.5％，海产鱼虾的平均带菌率为45.6％～48.7％，夏季可高达90％以上。除了海产品以外，畜禽肉、咸菜、咸蛋、
淡水鱼等都发现有VP的存在，已成为世界性公共卫生问题。生食或者食用未充分烹饪的被VP污染的海产品4～96h后可能会引起腹泻、肠痉挛、恶心、呕吐、发烧等典型胃肠炎反应。极少情况下，副溶血性弧菌感染还会引起伤口感染、中
耳炎及败血症等。健康人群感染副溶血性弧菌后症状较轻可自愈，但免疫功能受损的人群如
肝炎、癌症及糖尿病患者，恢复期的肠道手术患者易感。据统计，1998年以来，在我国由副溶血性弧菌引发的食物中毒事件，发生规模及人群暴露规模呈明显上升的趋势，已位居沙
门氏菌之上，成为我国细菌性食物中毒事故的首要病原。特别是沿海省份，副溶血性弧菌引起的食物中毒，已经高居
微生物性食物中毒首位。所以亟需对食品中VP进行检测的方法，特别是在食品出入境的快速检测中。
[0003] VP为多形态革兰氏阴性细菌，无荚膜，无芽孢，形态呈球杆状、杆状、弧状、丝状，分散排列，大小不一，一般长度为0.7～1.0μm。VP的多形态性与盐的浓度不适宜有关，时有端生单毛，固体培养则常呈周身鞭毛。
[0004] VP营养要求不高，普通培养基、蛋白胨水中均可生长。在含盐3.5％的培养基上生长良好。发育
温度为30～37℃，以37℃最佳，最适pH范围是7.0～9.5。该菌在普通平板上不溶血或只产生α-溶血，但在特定条件下，某些菌株在含高盐(7％)的人O型血或兔血及以D-甘露醇为
碳源的我妻氏琼脂(Wagatsuma)平板上可产生β-溶血，称为神奈川现象(Kanagawa phenomenon，KP)阳性。神奈川现象阳性菌株与多数对人的致病性有密切关系切关系。
[0005] 传统的副溶血性弧菌检测方法需要经过前增菌、增菌、选择性平板分离、生物化学试验和血清学分型鉴定4个步骤，整个过程通常需要5～7天，检测周期长，工作量大，不能满足水产品
质量安全快速反应体系的需求，给水产品养殖、出入境检验检疫、食品卫生监督等部门的检测工作带来很大的困难。酶联
免疫吸附(ELISA)试验检测副溶血弧菌具有特异性强、灵敏度高、易于观察等优点，但是ELISA对试剂的选择性要求过高、对结构类似的化合物存在一定程度的交叉反应，且出现新的血清型时，以现有的血清检测就会造成漏检。根据副溶血弧菌特异基因序列，设计引物进行PCR检测，是现阶段检测副溶血弧菌的最快速准确的方法之一。早期的副溶血弧菌的PCR法主要是检测编码毒
力蛋白的致病基因tdh、trh。但是，这两种基因的携带率很低，随后被tlh基因取代。PCR技术操作简便，用时短，但是在操作过程中容易被DNA污染，且在灵敏度、多基因检测等方面有一定的局限性，不适合于用于副溶血弧菌的大规模筛选和培养检测。
[0006] 目前国内外尚无利用夹心DNA杂交技术检测VP的试剂盒。
发明内容
[0007] 为克服
现有技术的不足，本发明的第一个目的是提供一种副溶血性弧菌夹心DNA杂交快速检测用探针，第二个目的是提供使用该探针的试剂盒，第三个目的是提供上述检测用探针的试剂盒的使用方法。
[0008] 为了实现上述第一目的本发明中包括VP捕获探针和VP检测探针，所述VP捕获探针的DNA序列为SEQ ID NO.1，所述VP检测探针的DNA序列为SEQ ID NO.2。
[0009] 一种VP夹心DNA杂交快速检测用试剂盒，包括一
块包被了poly dT的96孔板、两瓶浓的菌液裂解液、一瓶裂解缓冲液、一瓶杂交液、一瓶探针液、一瓶洗涤液、一瓶显色液、一瓶终止液、一瓶阳性对照液和一瓶阴性对照液，其中：
[0010] 所述探针液由以下成分组成：
[0011] DNA序列为SEQ ID NO.1的10μmol/L的VP捕获探针12.5μL；
[0012] DNA序列为SEQ ID NO.2的1 0μmol/L的VP检测探针12.5μL；
[0013] 合计25μL；
[0014] 裂解液，体积为30μL(所述两瓶浓的菌液裂解液，为干粉状，每瓶需用6mL裂解缓冲液裂解；所述裂解缓冲液，体积为12mL)；
[0015] 所述杂交液，体积为100μL；
[0016] 所述洗涤液，需10倍稀释后使用，体积为750μL；
[0017] 所述显色液，体积为150μL；
[0018] 所述终止液，体积为100μL；
[0019] 以上为一个微孔反应的用量。
[0020] 所述阳性对照液，管内为VP菌液，体积为5mL；
[0021] 所述阴性对照液，管内为非VP菌液，体积为5mL。
[0022] 为了实现本发明的第三目的，提供一种VP夹心DNA杂交快速检测方法：包括如下步骤：
[0023] (1)增菌3％
氯化钠碱性蛋白胨
水培养待测菌48h，获得待测菌液。
[0024] (2)菌液裂解反应将待测菌液和裂解液按体积比4﹕1的比例在玻璃管中混合，放入65℃水浴锅中培养5分钟。
[0025] (3)杂交反应吸取150μL步骤(2)裂解后的菌液加到包被了poly dT的微孔中，按体积比4﹕1的比例混合核酸杂交液和探针液(捕获探针和检测探针按一定浓度先以体积比1﹕1的比例混合)，吸取125μL加到每一个微孔中，在室温下于轨道式摇床上以150rpm速度摇板2分钟后置于
培养箱中进行温育。温育后用1×PBST Buffer洗板5次，加150μL TMB显色液到每一个微孔中室温下温育20分钟，最后加入100μL 2M的
硫酸终止液，放入多功能酶标仪中读取450nm处的吸光度。
[0026] (4)结果判定(菌液OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值)≥2.1即可判定为阳性，且显色液加入微孔后变为蓝色，
颜色越深说明待测菌浓度越高。
[0027] 本发明的原理是：从genbank下载副溶血性弧菌Tlh基因序列，进行多序列比对，选择特异性保守区域，分别设计特异性的捕获探针和检测探针两种探针，由捕获探针将靶标核酸
片段锚定，在检测探针末端标记辣根过
氧化物酶，两种探针与目标致病菌靶基因的特异性结合，确保检测结果的准确性。结果检测可通过催化颜色反应，进行OD值的测定，检测灵敏度可达到15CFU/mL样品。
[0028] 夹心DNA杂交是一种简便、快速、高度特异性的核酸分子杂交技术。将夹心DNA杂交技术与PCR技术进行比较，可发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上相当于或优于PCR技术，
假阳性和假阴性率低，结果准确，最大程度地降低样品基质对分析结果的影响；增菌培养时间短，无需提取核酸，样品处理程序简单，减少试验操作及其带来的误差，结果直观。现有的VP检测周期较长，约3～5天，操作繁琐，而本发明的试剂盒仅需2小时。
[0029] 本发明的优点是(1)、样品预处理简单，无需提取核酸，直接将菌液作为
模版；(2)、高特异性：两条探针特异性地与目标致病菌不耐热溶血素(tlh)基因结合，根据辣根过氧化物酶是否显色就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达于99.9％，假阳性率小于0.1％；(3)、快速、高效扩增：检测时间2小时左右；(4)、灵敏度高：最低检出限为15CFU/mL；(5)、鉴定简便：只需通过加入TMB显色液观察颜色变化或多功能酶标仪测定OD值判定结果，显色液加入微孔后变为蓝色且(菌液OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值)≥2.1即可判定为阳性(6)、用途广：可广泛用于VP的安全快速检测。
附图说明
[0030] 图1 VP的夹心DNA杂交扩增特异性试验结果；
[0031] 图2 VP的夹心DNA杂交扩增灵敏性试验结果；
[0032] 图3阴阳性对照夹心DNA杂交检测结果；
[0033] 图1中：1：副溶血性弧菌；2-13分别为：金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、粪链球菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌、河流弧菌、创伤弧菌、绿脓杆菌、阪崎肠杆菌、弗氏
柠檬酸杆菌、阴性对照、空白对照。
[0034] 图2中：1、1.5×107CFU/mL VP菌液，2、1.5×106CFU/mL VP菌液，3、1.5×105CFU/mL VP菌液，4、1.5×104CFU/mL VP菌液，5、1.5×103CFU/mL VP菌液，6、1.5×102CFU/mL VP菌液，7、1.5×101CFU/mL VP菌液，8、1.5CFU/mL VP菌液。
具体实施方式
[0035]
实施例1，VP夹心DNA杂交技术快速检测试剂盒包括一块包被了poly dT的96孔板、两瓶浓的菌液裂解液、一瓶裂解缓冲液、一瓶杂交液、一瓶探针液、一瓶洗涤液、一瓶显色液、一瓶终止液、一瓶阳性对照液和一瓶阴性对照液，其中：所述阳性对照液，管内为VP菌液，体积为5mL；所述阴性对照液，管内为非VP菌液，体积为5mL。
[0036] 探针液由以下成分组成：DNA序列为SEQ ID NO.1的10μmol/L的VP捕获探针12.5μL；DNA序列为SEQ ID NO.2的10μmol/L的VP检测探针12.5μL；裂解液，体积为25μL；杂交液，体积为100μL；洗涤液，需10倍稀释后使用，体积为750μL；显色液，体积为150μL；终止液，体积为100μL；以上为一个微孔反应的用量。
[0037] 实施例2，探针的设计
[0038] VP夹心DNA杂交探针组，其设计是根据GenBank公布的VP的Tlh基因参考序列，用Clustal W进行多重比对，分析序列的保守区。采用探针设计
软件Primer 5，设计特异性探针，分别标记为：SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2。其中探针组中捕获探针:SEQ ID NO.1；检测探针:SEQ ID NO.2；体积比为1:1；在捕获探针3’端标记poly dA，在检测探针5’端标记辣根过氧化物酶；所有探针均由宝
生物工程(大连)有限公司合成。探针序列如下：
[0039]探针序列号 序列(5′～3′)
SEQ ID NO1 ACATCAACCGCTCATCGTCT
SEQ ID NO2 GTTCATCAAGGCACAAGCGA
[0040] 实施例3，阳性对照品的制备
[0041] 用3％氯化钠碱性蛋白胨水培养标准阳性VP菌液48h。利用平板菌落计数法测定菌7 8
液的浓度，使其浓度控制在1.0×10～1.0×10CFU/mL，一瓶5mL。
[0042] 实施例4，阴性对照品的制备
[0043] 用3％氯化钠碱性蛋白胨水培养大肠杆菌48h，取出分装，一瓶5mL。
[0044] 实施例5、制备待检样品的菌液模板
[0045] 取200μL～300μL或200mg～300mg待检样品，用3％氯化钠碱性蛋白胨水扩增48h，即为菌液模板。
[0046] 实施例6、杂交条件的优化
[0047] 以副溶血性弧菌的菌液为模板，采用
正交试验的方法，进行优化。首先挑选出影响DNAH检测的因素主要有探针液浓度、探针杂交液配比、杂交温度、杂交时间，每个因素都取4个水平即探针液浓度分别设计为2、3、4、5umol/L；探针杂交液配比分别设计为1：2、1:3、1:4、1:5(体积比)；杂交温度设计为35、45、55、65℃；杂交时间设计为50、60、70、80min。采用四因素四水平进行试验，最终确定副溶血性弧菌夹心DNA杂交反应条件。
[0048] 实施例7、特异性和灵敏度
[0049] 采用上述优化的杂交条件，对标准阳性副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特氏菌、粪链球菌、溶藻弧菌、霍乱弧菌、河流弧菌、创伤弧菌、绿脓杆菌、阪崎肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、福氏志贺氏菌、肠炎沙门氏菌等菌液进行扩增，除副溶血性弧菌外，其余均无非特异性杂交。酶标仪中450nm处的吸光度如下表。
[0050]
[0051]
[0052] 用灭菌生理盐水梯度稀释阳性VP菌液，采用上述优化的杂交条件进行反应，本发明的最低
检测限分别约为15CFU/mL。
[0053] 参见图2可以得到反应灵敏度结果。
[0054] 图中1-8:1.5×107CFU/mL到1.5CFU/mL
[0055] 实施例8、试剂盒的组装
[0056] 一块包被了poly dT的96孔板、两瓶浓的菌液裂解液、一瓶裂解缓冲液、一瓶杂交液、一瓶探针液、一瓶洗涤液、一瓶显色液、一瓶终止液、一瓶阳性对照液和一瓶阴性对照液，贴上生产日期及产品标签。低温保存及运输。
[0057] 实施例9、VP夹心DNA杂交快速检测方法，包括如下步骤：
[0058] (1)增菌用3％氯化钠碱性蛋白胨水培养VP菌液48h。
[0059] (2)菌液裂解反应将VP菌液和裂解液按体积比4﹕1的比例在玻璃管中混合，放入65℃水浴锅中培养5分钟。
[0060] (3)杂交反应吸取150μL步骤(2)裂解后的菌液加到包被了poly dT的微孔中，按4﹕1的比例混合核酸杂交液和探针液(捕获探针和检测探针以1﹕1的比例混合)，吸取125μL加到每一个微孔中，在室温下于轨道式摇床上以150rpm速度摇板2分钟后置于45℃培养箱中温育1h。温育后用1×PBST Buffer洗板5次，加150μL TMB显色液到每一个微孔中室温下温育20分钟，最后加入100μL 2M的硫酸终止液，放入多功能酶标仪中读取450nm处的吸光度。
[0061] (4)结果判定(菌液OD值-空白对照OD值)/(阴性对照OD值-空白对照OD值)≥2.1即可判定为阳性，且显色液加入微孔后变为蓝色，颜色越深说明病原菌浓度越高。
[0062] 参见图3可以明显得出+含有VP。酶标仪中450nm处的吸光度如下表。
[0063]
