세포내 이차대사산물 생산을 위한 이단계 연속식 세포배양 방법

본 발명은 세포에 의한 생합성 물질 생산을 위한, 세포생성기를 이용한 이단계 연속배양 시스템에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 일단계인 고정상 세포배양기에서 고농도의 세포를 생성하여 이단계인 현탁 세포배양기로 공급해주어 세포농도를 높게 유지함으로써 생산성을 높이는 이단계 연속공정에 관한 것이다.

단순 회분배양의 문제점은 생산성이 낮다는 점이다. 이의 극복을 위해 연속 현탁 세포배양을 채택할 수 있으나, 종래의 연속 현탁 세포배양의 문제점은 일반적으로 배양기 내의 세포농도가 낮은 것 외에도 공정상의 희석속도가 성장속도보다 클 경우 세포가 반응기내에 거의 남지 않는 현상(wash-out)이다. 고정상 세포배양은 연속배양시 현탁 세포배양에 비해 높은 희석속도에서도 고농도의 세포를 연속적으로 생산할 수 있다. 또한 균사형성 곰팡이류 균주 배양의 경우, 고정화를 통해 배양액의 유변학적 특성상 저점도를 유지할 수 있어 결과적으로 산소, 기질 등의 물질전달이 원활하고 이런 양호한 환경 하에서 고농도 고정상 세포의 성장과 이로 인한 높은 농도의 유리세포를 수확할 수 있다는 장점이 있을 수 있다.

이러한 고정상 세포배양의 잇점때문에 일반적으로 분비가 되는 일차대사산물이나 세포외 이차대사산물의 생산의 경우에는 Bioproces Engineering; Basic concept, ML Shuler F. Kargi PP. 232-269에서 고정상 세포배양은 세포외 대사산물의 생산시 장점이 있다고 언급하고 있으면, Continuous Production of thienamycin in immobilized cell System, EJ Arcuri Biotechnol Bioeng, Vol 28, 824-849(1986)에서 세포외 2차 대사산물인 thienamycin의 고정상 배양에 의해 뚜렷한 생산성 증가를 보이고 있다고 하였고, Continuous Production of penicillin-G by penicillium chrysogenum cells immobilized on celite biocatalyst Support particles, A. Jones, Can J. Chem Eng., Vol 64, 547-551에서 세포외 2차 대사산물인 Penicillin-G의 고정상 배양에 의한 뚜렷한 생산성 증가를 보였다고 하였다. 이와같이 많은 연구에서 처럼 단일 연속 고정상 세포배양기만으로도 고농도의 세포농도에 기인한 높은 농도의 생합성물을 연속으로 얻을 수 있다. 하지만, 세포내 이차대사산물의 경우에는 생성물이 주로 세포 내에 축적되므로 높은 농도의 생성물을 얻기 위해서는 세포농도 역시 고농도로 연속 수확되어야만 한다. 이는 세포 성장속도가 높아야 하는 것을 의미하는데, 성장속도가 어느 정도 이상이 되면 이차대사산물 생산 자체가 크게 억제되는 공정상의 문제점이 있다. 이러한 이유로 세포내 산물의 생산에는 고정상 배양이 별 효용성을 가지지 못한다는 것이 일반적인 인식이었다.

이에 본 발명자들은 단일 현탁 세포배양이나 단일 고정상 세포배양을 통한 세포내 이차대사산물의 생산시 발생하는 상기의 문제점을 해결하고 세포내 산물 생산에도 고정상 배양을 사용하여 생산성을 크게 높일 수 있음을 보여주기 위해 예의 연구 노력한 결과, 고정상 세포 배양기를 세포생성기로서 일단계로 배치하고 현탁 세포배양기를 이차대사산물 생산단계로서 이단계에 배치함으로써 고농도의 세포수확과 동시에 세포내 이차대사산물의 생산성을 획기적으로 개선할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다. 본 발명의 시스템을 좀 더 자세히 설명하면, 일단계에서는 이차대사산물 생산과 함께 세포성장도 중요하므로 세포성장이 유리한 배지(배지 1)를 사용하였으며, 생산단계인 이단계에서는 세포성장이 낮을수록 유리하므로 이에 적합한 다른 배지(배지 2)를 사용하였다. 이렇게 함으로써 높은 농도로 존재하는 세포에 의해 이차대사산물이 활발하게 생산될 수 있는 환경을 제공할 수 있었고 따라서 생산성을 크게 높일 수 있었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 세포내 이차대사산물의 생산에 있어서 단순 회분 배양대신 고정상 세포 배양기를 사용한 연속배양을 통해 생산성 향상을 획기적으로 제고할 수 있는 방법을 제시하고, 더 나아가 현탁 배양기를 이단계로 추가함으로써 다시 생산성을 상당히 높일 수 있는 공정기술을 제공하는 것이다.

제1도는 본 발명의 공정을 모식적으로 나타낸 그림이다.

제2도는 본 발명의 이단계 연속 세포배양 시스템을 이용한 사이클로스포린 에이 생산을 나타내는 그래프이다.

(a) 일단계 고정상 세포배양기 내의 결과.

(b) 일단계에서 유출되는 배양액으로부터의 결과.

(c) 이단계에서 유출되는 배양액으로부터의 결과.

전체 공정 구성도는 제1도에 나타낸 바와 같다. 이하, 본 발명의 배양시스템을 부분 공정별로 나누어 설명하기로 한다.

제1부분 공정: 회분배양에 의한 고정상 세포의 담체 내 정착 및 성장이는 세포생성기인 고정상 세포배양기내에서 고정상세포를 정착 및 성장시킴으로써 이후의 연속배양시 고농도의 세포를 연속적으로 이단계인 현탁 세포배양기로 공급하기 위한 준비단계이다. 먼저 다공성 담체에 세포 또는 포자를 무균기법으로 침투시킨 후 농축된 배지를 공급하여 세포의 성장 속도에 따라 1 ∼ 5 일간 배양한다. pH, 온도, 배지조성 등은 사용된 세포의 최적 성장 환경에 따라 정해준다.

제2부분 공정: 연속배양에 의한 이단계 배양 제1공정에서 일단계 고정상 세포배양기 내에서 고정상 세포가 적절히 성장하면 폄프 1을 작동시켜 배지 1을 각 세포종류나 성장속도를 고려한 일정 희석속도로 일단계 고정상 세포배양기에 연속적으로 공급하며, 폄프 2의 작동에 의해 조업 부피이상의 배양액은 고정상 세포분리기를 통해 고정상세포를 분리하여 반응기로 되돌려 보내고 유리세포만 이단계로 이동시킨다. 배지 1과 일부조성이 같거나 다른 배지 2는 펌프 3에 의해 성장제한을 가할 수 있을 정도의 적정 유속으로 이단계 현탁 세포배양기로 공급된다. 펌프 4는 이단계 현탁 세포배양기의 조업부피이상의 배양액을 유출시켜 준다.

한편, 본 발명의 공정에 따라 각 배양기의 부피 및 각 공급배지의 공급속도는 조업 조건에 따라 달라 질 수 있으며 이 두 가지 공정변수의 조절에 따라 희석속도는 0.01 ∼ 1.00 hr ^-1 의 조건에서까지도 다양하게 조업될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.

[실시예 1]

대상균주로서 균사를 형성하는 곰팡이인 톨리포클라디움 인플라툼(Tolypocladium inflatum ATCC 34921)을 사용하였고, 톨리포클라디움 인플라툼의 포자를 고정화하기 위한 담체로서는 셀라이트R-560(Manville Co., USA)을 이용하였다. 대상균주의 선택은 이 균주가 생산하는 사이크롤스포린 에이(cyclosporin A)가 전형적인 세포내 이차대사산물이기 때문이었다. 이하 자세한 포자 수확을 위한 배지 조성 및 고정화 방법은 발명자가 제시한 방법과 같다. 배양은 전체적으로 27℃, pH 5.7, 교반속도 350 rpm의 조건에서 수행되었으며, 일단계 및 이단계 배양기의 조업 부피는 각각 2L와 4L였다. 또한 일단계의 희석속도는 0.1hr ^-1 이었으며 이단계의 희석속도는 배지 2의 이차공급 여부에 따라 각각 0.050 및 0.065hr ^-1 이었다. 배지 1 및 2의 조성을 표 1에 나타내었다.

[실시예 2]

일단계 고정상 배양기의 조업조건(희석속도)을 알아보기 위해 실험방법 및 재료, 그리고 기타 실험 조건은 상기 실시예 1과 동일하며 배지 조성은 표 1의 배지 1을 사용하였다. 각각의 실험은 희석속도 0.065, 0.1, 0.2hr ^-1 에서 실시되었다. 이 실험에서 일단계 배양기 내부의 전체 세포농도, 세포 부하(cell loading)등은 비슷하였으나, 연속적으로 얻어지는 유출액의 결과에 있어 희석속도 0.065hr ^-1 과 0.1hr ^-1 의 경우에는 두 경우 비슷한 약 6 - 7g/L의 세포와 약 20 - 25mg/L의 사이클로스포린 에이를 얻을 수 있었으며 희석속도 0.2hr ^-1 에서는 1.5-2g/L의 세포와 약 8-10mg/L의 사이클로스포린 에이를 얻을 수 있었다. 통상적인 생산성에 있어서는 얻어진 농도에 희석속도를 곱한 부피생산성이 그 기준으로 이용됨을 감안할 때 실험한 희석속도 중에서는 0.1hr ^-1 이 가장 바람직한 조건으로 나타났다. 이 결과로부터 일단계의 조업변수인 희석속도는 대략 0.08-0.13 정도가 적절할 것으로 사료되며 본 발명의 이단계 연속배양에 대한 실시예에서는 희석속도 0.1을 사용했다.

[실시예 3]

실시예 1과 동일한 방법으로 하고 배지 2의 과당 농도만 30g/L로 했다. 이 경우 일단계에서의 결과는 비슷하게 얻어졌으나, 이단계로 들어가는 배지의 과다공급 즉, 이단계에서의 높은 과당농도에 의한 사이클로스포린 에이의 생산저하로 인해 세포농도는 9 - 11g/L로 높아졌음에도 불구하고 사이클로스포린 에이는 19 - 22mg/L 정도로 낮게 얻어졌다. 이 결과를 저농도 과당을 이용한 이단계 연속배양과 비교하면 세포농도는 약 2배로 얻어졌지만, 사이클로스포린 농도는 절반으로 감소함으로써 운전조건이 생산성을 좌우함을 알 수 있었다.

제2도(a)에서 보는 바와 같이 일단계 반응기 내의 결과에서 반응기내의 세포농도나 사이클로스포린 에이의 농도는 고정상 세포의 증가에 의해 전 배양기간에 걸쳐 꾸준히 증가하였다. 고정상 세포가 제거된 일단계로부터의 연속 유출액을 분석한 결과(제2도(b)) 약 4 ∼ 5g/L의 유리세포와 약 20mg/L의 사이클로스포린 에이가 얻어졌다. 이는 0.1hr ^-1 이라는 높은 희석속도에서도 고농도의 유리세포가 이단계로 공급됨을 의미한다. 한편 이단계 현탁 세포배양기에서 얻어진 결과에서는 배지 2의 이차공급이 없는 초기의 경우에는 낮은 희석속도와 비교적 높은 과당농도에 기인해 세포의 농도가 급속히 증가하였으나 사이클로스포린 에이의 농도는 상기에 언급한 고성장시 저 생산성이라는 이차대사산물의 생산특성상 저 농도로 유지되었나. 그러나 배지 2의 이차공급이 개시된 이후 배지 2 내의 낮은 과당농도에 기인한 성장 제한과 높아진 희석속도에 의해 세포농도는 저하되었으나 사이클로스포린 에이의 농도는 크게 증가하였으며 궁극적으로 일단계 배양기 유출액 값보다 훨씬 큰 값을 보였다. 공정 성능비교시 가장 유용한 지표인 사이클로스포린 에이 생산성 면에서 본 발명의 이단계 공정을 기존의 공정들과 비교한 것이 표 2에 정리되어 있다.

일단계만을 사용한 연속 배양 결과를 단순 회분식 결과(참고문헌 [1])와 비교하면 사이클로스포린 에이의 생산성에 있어서 8배의 향상이 있었다. 본 발명의 이단계 연속 배양결과를 일단계 연속배양 결과와 다시 비교하면 알 수 있듯이 이단계 배양기가 추가됨으로써 사이클로스포린 에이의 생산성에 있어서 1.3 배의 향상이 있었다. 결과적으로 이단계 배양시스템의 도입으로 단순 회분식 배양의 결과보다 훨씬 큰 약 11 배의 생산성 향상이 가능했다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명의 이단계 연속배양시스템은 세포내 이차대사산물의 생산에 있어서의 기존 일단계 고정상 세포배양기만을 이용한 단일 연속배양 시스템 또는 단순 현탁 세포배양기 시스템에 비해 획기적인 공정개선 효과를 제공한다. 본 발명의 공정은 높은 생산성은 물론 여러 생산물에 대해 매우 유연하면서도 효과적인 조업 다양성과 생산성 향상등의 장점을 가진다.