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一种朝鲜淫羊藿内生菌、培养方法及其代谢产物

阅读：814发布：2020-05-14

专利汇可以提供一种朝鲜淫羊藿内生菌、培养方法及其代谢产物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提出了一种朝鲜淫羊藿内生菌的分离菌株Ek-Endogenous-S10、培养基、培养方法、分离方法及其次级代谢产物，所述一种朝鲜淫羊藿内生菌的分离菌株Ek-Endogenous-S10，所述分离菌株在生物学上是纯的。本发明方法分离得到的菌株可产生与宿主细胞中相同的化学成分，且具有不受时间季节限制快速、定向、易分离等优点，该真菌的结构相对简单，代谢成分简单、稳定、定向，与传统中药材相比，化学成分的提取分离效率势也大大的提高。，下面是一种朝鲜淫羊藿内生菌、培养方法及其代谢产物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种朝鲜淫羊藿内生菌的分离菌株Ek-Endogenous-S10，已于2019年7月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，其保藏号为：CGMCC NO.18131。
2.根据权利要求1所述一种朝鲜淫羊藿内生菌的分离菌株Ek-Endogenous-S10，其特征在于，所述分离菌株在生物学上是纯的。
3.一种朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10的培养基，所述培养基分为液体培养基和固体培养基，所述液体培养基配方：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水
1000mL，pH值为7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min，所述固体培养基是在所述液体培养基配方基础上添加加琼脂20.0g/L，其特征在于，还加入碳源和氮源。
4.根据权利要求3所述一种朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10的培养基，其特征在于，所述固体培养基可以替换为PDA培养基、荞麦、高粱培养基，另外加入碳源和氮源。
5.根据权利要求3或4所述一种朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10的培养基，其特征在于，所述碳源为α-乳糖，所述氮源为甘氨酸。
6.一种朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：取干净的朝鲜淫羊藿叶片，用自来水洗净后用次氯酸钠溶液处理4-5min；无菌水漂洗4次后用无菌滤纸吸去残留无菌水；再用乙醇溶液处理根茎4-5min；然后用无菌水漂洗4次并吸去残留无菌水；用无菌刀片将处理后的切成边长约为1-2mm，种植在培养基上；将培养基于23-25℃恒温培养3-5天，待长出菌落后，用接种环挑取菌体转接至新鲜的所述培养基上进行纯化，至3次纯化后的菌落均为纯种；将纯种菌转接到斜面培养基上保藏备用。
7.根据权利要求6所述分离方法，其特征在于，所述次氯酸钠溶液浓度为5％(v/v)，所述乙醇溶液浓度为75％(v/v)。
8.一种朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：取保藏的菌种，挑取少量菌种到新鲜培养基上划线并于23-25℃恒温活化3-5天，将活化的单菌落转接至新鲜配制的培养基中，在合适的培养条件下培养。
9.根据权利要求8所述一种朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10的培养方法，其特征在于，所述合适的培养条件为温度为25℃，光照时间12h，pH值为6。
10.一种朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10的次级代谢产物，其特征在于，主要包括宿主细胞中产生的淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C。

说明书全文

一种朝鲜淫羊藿内生菌、培养方法及其代谢产物

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种朝鲜淫羊藿内生菌、培养方法及其代谢产物。

背景技术

[0002] 药用植物体内普遍存在着内生菌，在药用植物的生长、道地性、产量、质量、功效成分、抗逆性等方面都产生重要的影响；另一方面，药用植物内生菌自身也能产生一些生理活性物质，在新药研发、药用植物栽培生产、菌肥开发、生防菌研发、土壤生态修复、工业化酶生产应用等方面都显示出巨大的开发潜力。

[0003] 朝鲜淫羊藿(EpimediumkoreanumNakai)为小檗科淫羊藿属多年生草本植物，是我国东北地区特有的中药资源，具有温补肾阳、强筋骨、祛风湿等功效。人工栽培困难、用量有增无减的趋势使得朝鲜淫羊藿的野生资源逐年减少。因此，扩大朝鲜淫羊藿的引种栽培及寻找其代替品亟待解决。

[0004] 现有黄酮类成分的获得大多从植物体中粗提取，之后通过酶分解、转化、分离等进一步提纯，不仅植物栽培过程中生长周期长，人工田间管理等成本高，后期的分离转化等成本也不容小觑。同时，由于中药材成分复杂性，无论是传统的水提法、醇提法还是现代的膜分离、新材料提取技术对中药材中有效成分提取效率不超过50％，大概在30％左右，其余均以废弃药渣处理，不仅浪费资源废物处理不当也会对环境造成污染。真菌的结构相对简单，代谢成分简单、稳定、定向，与传统中药材相比，化学成分的提取分离效率势必会大大的提高。另一方面，药用植物大多需要较长的生长周期，其道地性对环境、生长条件等要求较高，真菌则不然，只需要足够的光照、碳源、氮源即可良性生长，不受时间季节的影响，目标产物的产出率倍增。

[0005] 中国专利CN10471130A和CN106995829A公开了产生淫羊藿总黄酮的方法，主要是从药材中提取总提取物，通过酶解法、转化的方法得到较纯的黄酮苷元，但该类方法产生黄酮类成分受时间季节限制且难于分离。

发明内容

[0006] 为了解决上述的技术问题，本发明提供一种朝鲜淫羊藿内生菌、培养方法及其代谢产物，其目的在于，提供一种朝鲜淫羊藿内生菌，该真菌的结构相对简单，代谢成分简单、稳定、定向，与传统中药材相比，化学成分的提取分离效率势也大大的提高。

[0007] 本发明提供一种朝鲜淫羊藿内生菌的分离菌株Ek-Endogenous-S10，已于 2019年7月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，其保藏号为：CGMCC NO.18131。

[0008] 作为本发明进一步的改进，所述分离菌株在生物学上是纯的。

[0009] 本发明进一步保护一种朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10的培养基，所述培养基分为液体培养基和固体培养基，所述液体培养基配方：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，蒸馏水1000mL，pH值为7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min，所述固体培养基是在所述液体培养基配方基础上添加加琼脂20.0g/L，其特征在于，还加入碳源和氮源。

[0010] 作为本发明进一步的改进，所述固体培养基可以替换为PDA培养基、荞麦、高粱培养基，另外加入碳源和氮源。

[0011] 作为本发明进一步的改进，所述碳源为α-乳糖，所述氮源为甘氨酸。

[0012] 本发明进一步保护一种朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10的分离方法，包括以下步骤：取干净的朝鲜淫羊藿叶片，用自来水洗净后用次氯酸钠溶液处理4-5min；无菌水漂洗4次后用无菌滤纸吸去残留无菌水；再用乙醇溶液处理根茎4-5min；然后用无菌水漂洗4次并吸去残留无菌水；用无菌刀片将处理后的切成边长约为1-2mm，种植在培养基上；将培养基于23-25℃恒温培养3-5 天，待长出菌落后，用接种环挑取菌体转接至新鲜的所述培养基上进行纯化，至 3次纯化后的菌落均为纯种；将纯种菌转接到斜面培养基上保藏备用。

[0013] 作为本发明进一步的改进，所述次氯酸钠溶液浓度为5％(v/v)，所述乙醇溶液浓度为75％(v/v)。

[0014] 本发明进一步保护一种朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10的培养方法，包括以下步骤：取保藏的菌种，挑取少量菌种到新鲜培养基上划线并于23-25℃恒温活化3-5天，将活化的单菌落转接至新鲜配制的培养基中，在合适的培养条件下培养。

[0015] 作为本发明进一步的改进，所述合适的培养条件为温度为25℃，光照时间 12h，pH值为6。

[0016] 本发明进一步保护一种朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10的次级代谢产物，主要包括宿主细胞中产生的淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C。

[0017] 本发明具有如下有益效果：本发明方法分离得到的菌株可产生与宿主细胞相同的化学成分，且具有不受时间季节限制快速、定向、易分离等优点，该真菌的结构相对简单，代谢成分简单、稳定、定向，与传统中药材相比，化学成分的提取分离效率势也大大的提高。该技术可为药用真菌的开发，药用植物的保护提供思路，也为内生菌与其宿主细胞有效成分合成的相关性提供科学基础。附图说明

[0018] 图1是朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10表观形态图；

[0019] 图2是不同条件下朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10菌株的形态图；

[0020] 图3是碳源对朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10生长的影响图；

[0021] 图4是氮源对朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10生长的影响图；

[0022] 图5是pH对朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10生长的影响图；

[0023] 图6是光照对朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10生长的影响图；

[0024] 图7是温度对朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10生长的影响图

[0025] 图8是HPLC标准品图；

[0026] 图9是朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10次级代谢产物的HPLC图。

具体实施方式

[0027] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所述的实施例只是本发明的部分具有代表性的实施例，而不是全部实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他所有实施例都属于本发明的保护范围。

[0028] 实施例1朝鲜淫羊藿内生菌的分离方法和鉴定

[0029] 取干净的朝鲜淫羊藿叶片，用自来水洗净后用5％(v/v)次氯酸钠溶液处理 4-5min；无菌水漂洗4次后用无菌滤纸吸去残留无菌水；再用75％(v/v)乙醇溶液处理根茎4-
5min；然后用无菌水漂洗4次并吸去残留无菌水。用无菌刀片将处理后的切成边长约为1-
2mm，种植在PDA培养基上；将培养基于23-25℃恒温培养3-5天，待长出菌落后，用接种环挑取菌体转接至新鲜PDA培养基上进行纯化，至3次纯化后的菌落均为纯种；将纯种菌转接到PDA斜面培养基上保存备用。

[0030] 该液体培养基配方：蛋白胨10.0g，酵母提取物5.0g，NaCl 10.0g，α-乳糖 10g，甘氨酸5g，蒸馏水1000mL，pH7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min；

[0031] 固体培养基是在上述配方加琼脂20.0g/L。

[0032] 该菌落形态绒毛状，黄白色，孢子清晰可见，呈黄棕色。菌落大小扩展到整个固体培养基，呈同心轮纹状。经基因组DNA提取、16SrDNA特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA测序、序列比对等步骤。该菌株被鉴定为Ilyonectria，为Ilyonectria cyclaminicola。

[0033] 表1

[0034]

[0035] 脚注：1.保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏时间：2019年6月19日。

[0036] 实施例2朝鲜淫羊藿内生菌的培植方法

[0037] 取保藏的斜面菌种，挑取少量菌种到新鲜PDA培养基上划线并于23-25℃恒温活化3-5天。将活化的单菌落转接至新鲜配制的改良PDA(加入氮源、碳源等)培养基中。在基础生长培养基上，通过单因素变量法，分别考察温度、光照、碳源、氮源、pH值等条件对菌株的生长情况的影响。结果参见附图3-7。

[0038] 结果表明碳源方面菌株对α-乳糖利用最好，氮源方面对甘氨酸利用最佳，最适温度为25℃时，最适光照为12h黑暗12h光照，最适pH值为6。

[0039] 实施例3次级代谢产物的质量学研究

[0040] 色谱条件：色谱柱 ODS-3(4.6mm×250mm，5μm)；流动相水(A) -乙腈(B)；梯度洗脱程0-37min，24％B；37-47，24％-38％B；47-60min，38％-24％B；检测波长360nm；柱温30℃；进样量10μL。

[0041] 对照品溶液的制备：精密称取淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C对照品适量，加甲醇分别制成含淫羊藿苷0.105mg·mL-1、朝藿定A0.106mg·mL-1、朝藿B0.101mg·mL-1、朝藿定C0.108mg·mL-1的混合溶液，即得。

[0042] 供试品溶液的制备：取该菌株粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20mL，超声(250W，30KHz)处理1h，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

[0043] 测定：精密吸取混合对照品溶液及供试品溶液10μL注入高效液相色谱仪。

[0044] 结果见附图8-9。图8是HPLC标准品图；其中①-④依次为朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷；图9是朝鲜淫羊藿内生菌Ek-Endogenous-S10次级代谢产物的HPLC图，根据图9，确定①-④依次为朝藿定A、朝藿定B、朝藿定 C和淫羊藿苷。结果表明该菌产生与宿主细胞相类似的成分，主要为黄酮类成分。

[0045] 通过高效液相的方法，和已知标准品进行对比，表明该菌次级代谢产物中含有大量的已知黄酮苷类成分及一些其他未知黄酮类成分，为黄酮类成分的大量生产而不通过从植物体中提取提供可能。即保护野生资源又节约时间、材料等成本。

[0046] 与现有技术相比，本发明方法分离得到的菌株可产生与宿主细胞相同的化学成分，且具有不受时间季节限制快速、定向、易分离等优点，该真菌的结构相对简单，代谢成分简单、稳定、定向，与传统中药材相比，化学成分的提取分离效率势也大大的提高。该技术可为药用真菌的开发，药用植物的保护提供思路，也为内生菌与其宿主细胞有效成分合成的相关性提供科学基础。

[0047] 本领域的技术人员在不脱离权利要求书确定的本发明的精神和范围的条件下，还可以对以上内容进行各种各样的修改。因此本发明的范围并不仅限于以上的说明，而是由权利要求书的范围来确定的。

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