一种从海洋微生物发酵液中筛选1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂的方法
阅读：1043发布：2020-06-09
专利汇可以提供一种从海洋微生物发酵液中筛选1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种从海洋 微 生物 发酵 液中筛选1‑脱 氧 木 酮 糖‑5 磷酸 消旋酶 抑制剂 的方法，具体为，1）海洋微生物发酵液样品的制备：接种 真菌 ，发酵，提取代谢产物，浓缩，洗脱；2）以创伤弧菌全基因组为模板，设计引物PCR扩增后，克隆入载体，转化大肠杆菌后诱导目的蛋白表达，目的蛋白经洗脱， 透析 ， 超滤 ，除盐得到His‑DXR；3）将菌悬液、刃天青溶液和1）所得进行反应后测定其 荧光 值并通过公式计数出抑制率，筛选出抑制率在80%以上的馏分；4）将步骤3）筛选的馏分与步骤2）所得His‑DXR进行反应，计算抑制率；筛选出抑制率≥50%的馏分。本方法简单准确，为发现以Dxr为靶点的新型抗菌药物或先导化合物奠定 基础 。，下面是一种从海洋微生物发酵液中筛选1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂的方法专利的具体信息内容。
1.一种从海洋微生物发酵液中筛选1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤，
1)海洋微生物发酵液样品的制备：海水PDA液体培养基接种真菌，培养后作为种子液继续发酵，待真菌发酵成熟后，提取代谢产物；并提取胞内物质，提取的液体浓缩至浸膏，得到初级浸膏；
初级浸膏利用正相硅胶柱进行等度洗脱，根据信号峰出峰的时间收集洗脱液，减压浓缩，得到初级馏分；
初级馏分使用反相C18制备柱进行梯度洗脱，根据信号峰出峰的时间收集洗脱液，减压蒸馏至浸膏，得到次级馏分，次级馏分溶于DMSO使之达到次级馏分蒸馏前的体积即为海洋微生物发酵液样品；
2)His-DXR的制备：以创伤弧菌全基因组为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物进行PCR扩增后，克隆入pET-22b载体得到重组质粒pET22b-DXR；将重组质粒pET22b-DXR转化大肠杆菌后用IPTG诱导，离心收集菌体细胞后重悬，进行超声裂解菌体，离心收集上清，将上清经过Ni2+-NTA亲合层析柱洗脱，收集到目的蛋白溶液His-DXR并溶于透析液中，用Amicon Ultra-4Centrifugal Filter Devices反复离心超滤除盐，得到His-DXR；
3)抑菌活性筛选：将175μL菌悬液、20μL刃天青溶液和5μL步骤1)所得海洋微生物发酵液样品同时加入到96微孔板中；同时设定阴性和阳性对照，恒温培养箱中培养24小时后，在酶标仪中的激发波长为530nm，发射波长为590nm处测定其荧光值，并通过公式计数出抑制率，筛选出抑制率在80％以上的馏分留做下一步酶活筛选；
所述菌悬液为轮虫弧菌或坎式弧菌或创伤弧菌悬液；阴性对照为：5μL DMSO+175μL菌悬液+20μL刃天青；阳性对照为：5μL DMSO+175μL LB+20μL刃天青；
4)酶活抑制试验筛选：将步骤3)筛选出的馏分溶于DMSO中配置待筛选馏分，在含有Tris-HCl缓冲液，MgCl2，DTT，NADPH及DXP，一定pH的反应液中，分别加入待筛选馏分，加入步骤2)所得His-DXR开始反应，在340nm下测定吸光值，设置对照和空白组，对照组以DMSO代替待筛选馏分，空白组不加His-DXR，重复三次，计算抑制率；≥50％的酶活抑制率的馏分即为筛选到的1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂；
所述抑制率的计算公式为：抑制率％＝100％-(实验孔荧光值-阳性对照荧光值)/(阴性对照荧光值-阳性对照荧光值)×100％。
2.权利要求1所述从海洋微生物发酵液中筛选1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤1)中，海洋微生物发酵液样品的制备为海水PDA液体培养基接种真菌，培养后作为种子液；大米固体发酵培养基进行发酵，待真菌发酵成熟后，采用乙酸乙酯浸泡发酵产物，提取代谢产物，反复提取3次，每次浸泡24h；并采用高压乳化切割机以乙酸乙酯为溶剂处理发酵产物，提取胞内物质，提取的液体采用旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏，得到初级浸膏；
初级浸膏利用正相硅胶柱，设置正己烷，乙酸乙酯比例进行等度洗脱，通过紫外检测器检测信号，220nm下接收信号，根据信号峰出峰的时间收集洗脱液，洗脱液减压浓缩，得到初级馏分；
初级馏分使用反相C18制备柱进行次级馏分的制备，设置乙腈：水梯度洗脱条件，通过紫外检测器检测信号，220nm下接收信号，根据信号峰出峰的时间收集洗脱液，减压蒸馏至浸膏，得到次级馏分，次级馏分溶于DMSO使之达到次级馏分蒸馏前的体积即为海洋微生物发酵液样品。
3.权利要求1所述从海洋微生物发酵液中筛选1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤2)中，以创伤弧菌E1758全基因组为模板，用高保真DNA聚合酶Primerstar进行PCR，反应条件：94℃变性30s；53℃退火30s；72℃延伸1.5min共30个循环；
PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收，将其克隆到pET-22b载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在加氨苄青霉素的LB平板上37℃培养12h；挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振摇过夜；建质粒命名为pET22b-DXR；将阳性重组质粒转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)；挑取单菌落，置于5ml LB(Amp+)培养基中，37℃振摇培养至D600为0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG 28℃诱导，继续振摇6h；对有His-DXR融合蛋白表达的菌落进行菌液扩增诱导，菌体细胞进行离心收集7800rpm/min，4℃离心5min后，重悬于10ml结合缓冲液NPI-10，并加入1.5％Trioton×100,1mmol/L的DTT，1mmol/L的PMSF，在冰上超声裂解菌体，超5s，停5s，50％功率；4℃离心收集上清7800rpm×20min，将上清转入经结合缓冲液平衡过的Ni2+-NTA亲合层析柱中，4℃下轻缓旋转结合60min后，弃流出液；
用10倍Ni2+-NTA亲合层析柱体积的洗涤缓冲液NPI-20；洗涤Ni2+-NTA亲合层析柱，洗涤掉非特异结合蛋白，弃流出液，重复一次；
最后用5倍Ni2+-NTA亲合层析柱体积的NPI-250；洗脱并收集目的蛋白溶液His-DXR，将收集的蛋白再加回去重新洗脱1-3次；收集的蛋白溶液His-DXR溶于透析液中，用Amicon Ultra-4Centrifugal Filter Devices反复离心超滤除盐，得到His-DXR；
所述结合缓冲液NPI-10为50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，10mmol/L咪唑，pH 8.0；
洗涤缓冲液NPI-20为50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，20mmol/L咪唑，pH 8.0；NPI-250为50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，250mmol/L咪唑，pH 8.0；透析液为50mmol/LTris-HCl缓冲液，2mmol/L DTT，pH为7.5。
4.权利要求1所述从海洋微生物发酵液中筛选1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤3)中所述菌悬液为104CFU/mL的轮虫弧菌或104CFU/mL坎式弧菌或
105CFU/mL创伤弧菌；当为轮虫弧菌及坎式弧菌时，刃天青溶液为500μg/mL，当为创伤弧菌时，刃天青溶液为200μg/mL；阴性对照为：5μL DMSO+175μL菌悬液+20μL刃天青；阳性对照为：5μL DMSO+175μL LB+20μL刃天青。
5.权利要求1所述从海洋微生物发酵液中筛选1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂的方法，其特征在于，所述步骤4)为将步骤3)筛选出的馏分溶于DMSO中,在含有50mmol/LTris-HCl缓冲液，3mmol/L的MgCl2，2mmol/L DTT，0.15mmol/L的NADPH及0.25mmol/L的DXP，pH为
7.5的100μl反应液中，在37度下，分别加入5μl待筛选馏分，加入步骤2)所得His-DXR开始反应，5min后在340nm下测定吸光值，设置对照和空白组，对照组以DMSO代替待筛选馏分，空白组不加His-DXR，重复三次，计算抑制率；≥50％的酶活抑制率的馏分即为筛选到的筛选1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂。
一种从海洋微生物发酵液中筛选1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶
抑制剂的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种从海洋微生物发酵液中筛选1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂的方法。
背景技术
[0002] 自1929年弗莱明从真菌中发现了青霉素以来，微生物活性代谢产物成为了药物发现的重要资源。青霉素的应用标志着抗生素时代的开始，越来越多的陆源微生物代谢产物被开发成天然药物。在过去的70多年里，已经从微生物中发现了约30000-50000种天然产物，其中10000多种有生物活性，8000多种是抗菌和抗肿瘤剂，据不完全统计至今已有100多种由微生物生产并应用于临床的农药、抗肿瘤剂和抗生素，每年全球抗生素产量超过10万吨，产值超过50多亿（五株海洋真菌次生代谢产物及其生物活性研究，2010）。然而，在对陆源微生物的长期研究开发过程中，从陆生微生物次级代谢产物中发现新的先导化合物或抗生素的难度越来越大，而抗药性问题的日益严重使新药的开发面临着严峻挑战。
[0003] 海洋覆盖地球表面积的71%，是生命的起源地。动物界中28个主要动物门有26个是生活在水中，其中还有8个门为完全水生，估计海洋动物约有50多万种。海洋生物中海洋微生物由于其生活在寡营养、弱碱性的含盐海洋环境中，为了维持其生命活动，形成了独特的耐饥、耐碱和耐盐等生理特征和代谢机制，在生长和代谢过程中产生了有别于陆地微生物的大量结构新颖、活性强的次生代谢产物。另外，由于海洋微生物具有生长周期短、不受季节及自然生物量等方面的限制、可人工大规模培养等优势，理所当然的受到越来越多的重视。就寻找新的化合物和抗生素而言，目前仅有1%左右的海洋微生物被分离鉴定，具有产生新型生物活性物质的巨大潜力，人们对于从中寻找新的特效药物寄予了极大的希望。
[0004] 近年来,随着分子生物化、学生物学、生物信息学等学科的发展,对萜类化合物的研究日趋深入,它的生物合成途径也逐渐清晰,已得到克隆和分析了许多关键酶基因。其中包括萜类生物合成途径中的相关酶之一：脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶(DXR)，DXR催化DXP生成MEP,是DXP途径的限速酶。DXR是潜在的抗疟药物、抗生素和除草剂的靶标位点,而且是一个更有效率的靶标位点。Kuntz等(2005)报道,膦胺霉素(fosmidomycin)是传统的DXR抑制剂,在2个新型DXR抑制剂4-(hydroxyamino)-4-oxobutylphosphonicacid和4-[hydroxy(methyl)amino]-4-oxobutylphosphonicacid中,其中后者表现出很高的抑制DXR的活性。在细菌、藻类、植物和原生动物中已发现存在DXR,但目前在人体中还未找到,因此用DXR这一靶标位点研制抗菌和抗疟药物更加引起了人们的兴趣。在研究拟南芥的DXR基因中,Rohdich等(2006)将去除N端转运肽序列后的重组体在大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达,通过亲和色谱法得到的纯化蛋白可用DXP催化形成MEP,催化速率为5.6molmin-1mg-1(蛋白),此反应需NADPH参与，需要二价金属离子Mn2+和Mg2+,最适pH值为8.0,NADPH虽然可用NADH替代,但替代后的反应速率降至原来的14%。
[0005] 20世纪90年代中期,运用分子生物学和比较基因组学方法证实,在某些细菌、原虫和植物质体存在一条MEP(2-甲基-赤藓糖醇磷酸)途径用于合成类异戊二烯的前体物质异戊酰焦磷酸(IPP)或二甲烯丙基焦磷酸(DMAPP)。该途径完全不同于哺乳动物和植物胞浆中的甲羟戊酸(MVA)途径。由于该途径合成的类异戊二烯及其衍生物在生物代谢和细胞壁合成中至关重要,因此MEP途径已成为药靶研究的热点,是极有希望的抗菌、抗疟和除草剂的药靶之一。结核杆菌合成异戊二烯类物质的途径不同于哺乳动物细胞,依赖于2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸盐途径(MEP途径)。经过MEP途径合成的异戊二烯类化合物参与结核杆菌的多种生物过程,MEP途径对结核杆菌的生长是必需的[见EohH,BrenanPJ,CrickDC.TheMycobacteriumtuberculosisMEP(2C-methyl-D-erythritol4-phosphate)pathwayasanewdrugtarget[J].Tuberculosis2009,89(1):1-1]。MEP途径[4]经历7步反应,
7种酶催化,将丙酮酸和3-磷酸甘油醛转化成异戊二烯二磷酸(IPP)和二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)。参与MEP途径的7种酶分别为:1-脱氧-D-5-磷酸木酮糖合酶(DXS)、1-脱氧-D-5-磷酸木酮糖还原酶(DXR)、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶(CMS)、4-二磷酸胞苷-
2C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环丙二磷酸合酶(MECDS)、1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯-4-二磷酸合酶(HMS)和1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯-4-二磷酸还原酶(HMR)。DXR是MEP途径中的关注度最高的酶。首先,DXR是合成异戊二烯类化合物的重要酶;
其次,它仅存在于藻类、植物、结核杆菌等细菌中,人体内不表达;再者,发现膦胺霉素(fosmidomycin,7)是进入临床试验阶段的有效的抗DXR药物。基于这些原因,DXR被视为一个很好的抗结核靶点[见SinghN,etal.Targetingthemethylerythritolphosphate(MEP)pathwayfornovelantimalarial,antibacterialandherbicidaldrugdiscovery:
inhibitionof1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatereductoisomerase(DXR)enzyme[J].CurPharmDes,207,13(1):1161-117]。研究人员以膦胺霉素为先导化合物,先后发现了乙酰基衍生物(FR9098,8),羟基脲类似物(化合物9),羧酸类似物(化合物10),α-芳基取代类似物(化合物1)[见HaemersT , etal .Synthesisofalpha-sub-
stitutedfosmidomycinanaloguesashighlypotentPlasmodiumfalciparumgrowthinhibitors[J].BiorgMedChemLet,2006,16(7):18-1891]等DXR抑制剂。
7种酶催化,将丙酮酸和3-磷酸甘油醛转化成异戊二烯二磷酸(IPP)和二甲烯丙基二磷酸(DMAPP)。参与MEP途径的7种酶分别为:1-脱氧-D-5-磷酸木酮糖合酶(DXS)、1-脱氧-D-5-磷酸木酮糖还原酶(DXR)、4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤藓糖醇合成酶(CMS)、4-二磷酸胞苷-
2C-甲基-D-赤藓糖醇激酶(CMK)、2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环丙二磷酸合酶(MECDS)、1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯-4-二磷酸合酶(HMS)和1-羟基-2-甲基-2(E)-丁烯-4-二磷酸还原酶(HMR)。DXR是MEP途径中的关注度最高的酶。首先,DXR是合成异戊二烯类化合物的重要酶;
其次,它仅存在于藻类、植物、结核杆菌等细菌中,人体内不表达;再者,发现膦胺霉素(fosmidomycin,7)是进入临床试验阶段的有效的抗DXR药物。基于这些原因,DXR被视为一个很好的抗结核靶点[见SinghN,etal.Targetingthemethylerythritolphosphate(MEP)pathwayfornovelantimalarial,antibacterialandherbicidaldrugdiscovery:
inhibitionof1-deoxy-D-xylulose-5-phosphatereductoisomerase(DXR)enzyme[J].CurPharmDes,207,13(1):1161-117]。研究人员以膦胺霉素为先导化合物,先后发现了乙酰基衍生物(FR9098,8),羟基脲类似物(化合物9),羧酸类似物(化合物10),α-芳基取代类似物(化合物1)[见HaemersT , etal .Synthesisofalpha-sub-
stitutedfosmidomycinanaloguesashighlypotentPlasmodiumfalciparumgrowthinhibitors[J].BiorgMedChemLet,2006,16(7):18-1891]等DXR抑制剂。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种简便的，从海洋微生物发酵液中筛选1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂的方法。
[0007] 为实现上述目的，本发明提供一种从海洋微生物发酵液中筛选1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂的方法，其特征在于，包括如下步骤，
[0010] 初级馏分使用反相C18制备柱进行梯度洗脱，根据信号峰出峰的时间收集洗脱液，减压蒸馏至浸膏，得到次级馏分，次级馏分溶于DMSO使之达到次级馏分蒸馏前的体积即为海洋微生物发酵液样品；
[0011] 2）His-DXR的制备：以创伤弧菌全基因组为模板，SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2为引物进行PCR扩增后，克隆入pET-22b载体得到重组质粒pET22b-DXR；将重组质粒pET22b-DXR转化大肠杆菌后用IPTG诱导，离心收集菌体细胞后重悬，进行超声裂解菌体，离心收集上清，将上清经过Ni2＋-NTA亲合层析柱洗脱，收集到目的蛋白溶液His-DXR并溶于透析液中，用Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Devices反复离心超滤除盐，得到His-DXR；
[0012] 3）抑菌活性筛选：将175μL菌悬液、20μL刃天青溶液和5μL步骤1）所得海洋微生物发酵液样品同时加入到96微孔板中；同时设定阴性和阳性对照，恒温培养箱中培养24小时后，在酶标仪中的激发波长为530nm，发射波长为590nm处测定其荧光值，并通过公式计数出抑制率，筛选出抑制率在80%以上的馏分留做下一步酶活筛选；
[0013] 所述菌悬液为轮虫弧菌或坎式弧菌或创伤弧菌悬液；阴性对照为：5μL DMSO+175μL菌悬液+20μL刃天青；阳性对照为：5μL DMSO+175μL LB+20μL刃天青；
[0014] 4）酶活抑制试验筛选：将步骤3）筛选出的馏分溶于DMSO中配置待筛选馏分，在含有Tris-HCl缓冲液，MgCl2，DTT，NADPH及DXP，一定pH的反应液中，分别加入待筛选馏分，加入步骤2）所得His-DXR开始反应，在340nm下测定吸光值，设置对照和空白组，对照组以DMSO代替待筛选馏分，空白组不加His-DXR，重复三次，计算抑制率；≥50%的酶活抑制率的馏分即为筛选到的1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂。
[0015] 所述步骤1）中，海洋微生物发酵液样品的制备为海水PDA液体培养基接种真菌，培养后作为种子液；大米固体发酵培养基进行发酵，待真菌发酵成熟后，采用乙酸乙酯浸泡发酵产物，提取代谢产物，反复提取3次，每次浸泡24h；并采用高压乳化切割机以乙酸乙酯为溶剂处理发酵产物，提取胞内物质，提取的液体采用旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏，得到初级浸膏；
[0016] 初级浸膏利用正相硅胶柱，设置正己烷，乙酸乙酯比例进行等度洗脱，通过紫外检测器检测信号，220nm下接收信号，根据信号峰出峰的时间收集洗脱液，洗脱液减压浓缩，得到初级馏分；
[0017] 初级馏分使用反相C18制备柱进行次级馏分的制备，设置乙腈：水梯度洗脱条件，通过紫外检测器检测信号，220nm下接收信号，根据信号峰出峰的时间收集洗脱液，减压蒸馏至浸膏，得到次级馏分，次级馏分溶于DMSO使之达到次级馏分蒸馏前的体积即为海洋微生物发酵液样品。
[0018] 所述步骤2）中，以创伤弧菌E1758全基因组为模板，用高保真DNA聚合酶Primerstar进行PCR，反应条件：94℃变性30s；53℃退火30s；72℃延伸1.5min共30个循环；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收，将其克隆到pET-22b载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在加氨苄青霉素的LB平板上37℃培养12h；挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振摇过夜；建质粒命名为pET22b-DXR；将阳性重组质粒转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)；挑取单菌落，置于5ml LB (Amp＋)培养基中，37℃振摇培养至D600约为0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG 28℃诱导，继续振摇6h；对有His-DXR融合蛋白表达的菌落进行；菌液扩增诱导，菌体细胞进行离心收集7800 rpm/min，4℃离心5min后，重悬于10 ml结合缓冲液NPI-10 ，并加入1.5%Trioton×100,1mmol/L的DTT，1mmol/L的PMSF，在冰上超声裂解菌体，超5s，停5s，50%功率；4℃离心收集上清 7800 rpm× 20min，将上清转入经结合缓冲液平衡过的Ni2＋-NTA亲合层析柱中，4℃下轻缓旋转结合60min后，弃流出液。用10倍Ni2＋-NTA亲合层析柱体积的洗涤缓冲液NPI-20；洗涤Ni2＋-NTA亲合层析柱，洗涤掉非特异结合蛋白，弃流出液，重复一次。最后用5倍Ni2＋-NTA亲合层析柱体积的NPI-250；洗脱并收集目的蛋白溶液His-DXR，将收集的蛋白再加回去重新洗脱1-3次；收集的蛋白溶液His-DXR溶于透析液中，用Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Devices反复离心超滤除盐，得到His-DXR；
[0019] 所述结合缓冲液NPI-10 为50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，10mmol/L 咪唑，pH 8.0；洗涤缓冲液NPI-20为50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，20mmol/L 咪唑，pH 8.0；NPI-250为50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，250mmol/L 咪唑，pH 8.0；透析液为50mmol/LTris-HCl缓冲液，2mmol/L DTT，pH为7.5。
[0020] 所述步骤3）中所述菌悬液为104 CFU/mL的轮虫弧菌或104 CFU/mL坎式弧菌或105 CFU/mL创伤弧菌；当为轮虫弧菌及坎式弧菌时，刃天青溶液为500μg/mL，当为创伤弧菌时，刃天青溶液为200μg/mL；阴性对照为：5μL DMSO+175μL菌悬液+20μL刃天青；阳性对照为：5μL DMSO+175μL LB+20μL刃天青。
[0021] 所述步骤4）为在含有50mmol/LTris-HCl缓冲液，3mmol/L的MgCl2，2mmol/L DTT，0.15mmol/L的NADPH及0.25mmol/L的DXP，pH为7.5的100μl反应液中，在37度下，分别加入5μl的待筛选馏分，加入步骤2）所得His-DXR开始反应，5min后在340nm下测定吸光值，设置对照和空白组，对照组以DMSO代替待筛选馏分，空白组不加His-DXR，重复三次，计算抑制率；
≥50%的酶活抑制率的馏分即为筛选到的筛选1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂。
≥50%的酶活抑制率的馏分即为筛选到的筛选1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂。
[0022] 所述步骤4）中，所述反应温度为37度。
[0023] 本发明55到60度是酶的最适活性温度，在37度时酶也有活性，活性物质也不因温度的改变而发生未知的改变。
[0024] MEP途径（即类异戊二烯及其衍生物合成途径）中关键酶1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶（Dxr）抑制剂的方法。MEP途径（即类异戊二烯及其衍生物合成途径）在生物代谢和细胞壁合成中至关重要，它在某些细菌、原虫和植物质体内存在，而在哺乳动物中并没有发现，是极有希望的抗菌、抗疟和除草剂的药靶之一。其中，该途径中最为关键的酶之一是1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶（1-deoxy- d-xylulose 5-phosphate reductoisomeraseDxr)，通过氧化NADPH催化1-脱氧木酮糖-5磷酸（1-deoxy- d-xylulose-5-phosphate DXP）生成MEP。我们推测抑制Dxr酶活性的化合物，必然会在一定程度上抑制菌的生长。通过在大肠杆菌中克隆及表达创伤弧菌Dxr蛋白并优化其酶活测定方法，在此基础上建立弧菌Dxr抑制剂高通量筛选模型，为发现以Dxr为靶点的新型抗菌药物或先导化合物奠定基础。
[0025] 本发明实施例提供了具体的筛选步骤和方法。可以看出，本发明得到的21个有活性的馏分，最终筛选到6个馏分对His-DXR的抑制率大于50%，说明该海洋微生物发酵液的6个馏分样品对His-DXR是有抑制效果的，所筛选的馏分是本发明需要的抑制剂。
[0027] 图1是重组质粒pET22b-DXR的酶切电泳图。
[0028] 图2是SDS-PAGE分析His-DXR表达及纯化结果图。
[0029] 图3是不同浓度NADPH与OD（340nm）吸收值的关系图。
[0030] 图4是NADP生成量与时间的关系图。
[0031] 图5A是不同温度、5B是不同 pH值、5C是不同浓度Mg2+、5D是不同底物浓度DXP对重组His-DXR催化反应的影响图。
[0032] 图6是磷胺霉素不同浓度的抑制率图。
具体实施方式
[0033] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0034] 实施例1：从海洋微生物发酵液中筛选1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶抑制剂[0035] 菌种和质粒
[0036] pET-22b载体、大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）均由本实验室保存，创伤弧菌（MCCC E1758）轮虫弧菌（MCCC E385）,坎氏弧菌（MCCC E333）保存于中国海洋微生物菌种保藏管理中心。
[0037] 主要试剂
[0038] 引物由厦门安特奥生物科技有限公司合成，DNA序列由Invitrogen公司测定。
[0039] 限制性内切酶（Xho I、EcoR I）、EcoR III连接酶、高保真DNA聚合酶Primerstar、DL 2 kb DNA Marker均购自TaKaRa 公司；Unstained Protein Molecular Weight Marker及BCA Protein Assay Kit购自美国Thermo公司；异丙基-β -D- 硫代半乳糖（isopropyl-β -D-thiogalactoside, IPTG）、二硫苏糖醇（DL-Dithiothreitol，DTT）、氨苄青霉素、氯化钠（NaCl）购自上海生工；Ni2+-NTA 亲和树脂购自MACHEREY NAGEL公司；1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate sodium salt（DXP）、还原型β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 2′-磷酸四钠盐水合物（NADPH）、二甲基亚砜(DMSO)、二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、Triton-X 100、苯甲磺氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、十二烷基磺酸钠 (SDS)购自美国Sigma公司； Tryptone、Yeast Extract、Agar购自英国OXOID公司；Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Devices购自美国Millipore公司，刃天青：国药化学试剂有限公司，货号：
71035931）
71035931）
[0040] 培养基
[0041] 实验所用菌种活化培养基为LB培养基，蛋白表达培养基为2×YT培养基，并根据需要添加氨苄青霉素（50μg/mL）。
[0042] 1、 海洋微生物发酵液样品的制备：
[0043] 以海洋真菌为发酵菌种，先后采用固体发酵，溶剂萃取和硅胶色谱柱得到次级馏分；
[0044] 1）采用海水PDA液体培养基；于高温灭菌后，严格无菌操作，超净台接种真菌，28℃振荡培养2-3天，将该培养物作为种子液；
[0045] 2）采用大米固体发酵培养基进行发酵，每1L的三角锥瓶装大米 105g,小米45g,加入150 mLPDA培养液，121℃，20min 高温灭菌，15%接种量接种，室温放置28天；
[0046] 3）待真菌发酵成熟后，采用乙酸乙酯浸泡发酵产物，提取代谢产物，反复提取3次，每次浸泡24h。并采用高压乳化切割机以乙酸乙酯为溶剂处理发酵产物，提取胞内物质，提取的液体采用旋转蒸发仪减压浓缩至浸膏，得到初级浸膏；
[0047] 4）初级浸膏利用正相硅胶柱，设置正己烷，乙酸乙酯比例进行等度洗脱，通过紫外检测器检测信号，220nm下接收信号，根据信号峰出峰的时间收集洗脱液，洗脱液减压浓缩，得到初级馏分；
[0048] 5）初级馏分使用反相C18制备柱进行次级馏分的制备，设置乙腈：水梯度洗脱条件，通过紫外检测器检测信号，220nm下接收信号，根据信号峰出峰的时间收集洗脱液，减压蒸馏至浸膏，得到次级馏分；
[0049] 6）将馏分等体积（与蒸馏前体积相等）溶于DMSO待用；
[0050] 2、His-DXR的制备
[0052] 1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶（1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase）基因克隆及测序
[0053] 根据在NCBI上16S比对结果，创伤弧菌（MCCC E1758）与Vibrio vulnificusCMCP6相似性达99%，故根据Vibrio vulnificusCMCP6基因1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶（以下简称DXR）序列[ NP_760741.1 ]设计引物（D1和D2），并在上下游引物5’端添加EcoR I、Xho I酶切位点，引物序列如下：
[0054] D1：5’- TTCGGATCCGAATTCGATGCAAAAGCTAACGATTCT-3’，下划线为EcoR I酶切位点，序列见SEQ ID NO:1
[0055] D2:5’-GTGGTGGTGCTCGAGTTTTGCAAGATAGTGGCG-3’，不含终止密码子,下划线为Xho I酶切位点。序列见SEQ ID NO:2
[0056] 采用常规分子克隆技术，以E1758全基因组为模板，用高保真DNA聚合酶Primerstar进行PCR，反应条件：94℃变性30s；53℃退火30s；72℃延伸1.5min共30个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳回收，将其克隆到pET-22b载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在加氨苄青霉素的LB平板上37℃培养12h。挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振摇过夜。小量提取质粒，分别进行PCR、酶切及测序鉴定。构建质粒命名为pET22b-DXR。从转化子提取重组质粒pET22b-DXR，采取EcoR I-Xho I双酶切该质粒，获得1209bp的DNA片段，说明DXR成功插入pET-22b载体中（结果见图1）。通过核苷酸测序结果显示插入的DXR与已知序列完全一致（NP_760741.1）。
[0057] His-DXR融合蛋白的原核表达及纯化
[0058] 将阳性重组质粒转化大肠杆菌菌株BL21(DE3)。挑取单菌落，置于5ml LB (Amp＋)培养基中，37℃振摇培养至D600约为0.6时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG 28℃诱导，继续振摇6h。利用12%SDS-PAGE来鉴定表达融合蛋白的菌落。将重组正确的质粒转化为大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导后，细菌裂解液在约44kD处得到一条蛋白条带（结果见图2）对有His-DXR融合蛋白表达的菌落进行（100ml）菌液扩增诱导，菌体细胞进行离心收集7800 rpm/min，4℃离心5min后，重悬于10 ml结合缓冲液NPI-10 （50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，10mmol/L 咪唑，pH 8.0），并加入1.5%Trioton×100,1mmol/L的DTT，1mmol/L的PMSF，在冰上超声裂解菌体（超5s，停5s，50%功率），4℃离心收集上清 7800 rpm× 20min，将上清转入经结合缓冲液平衡过的Ni2＋-NTA亲合层析柱中，4℃下轻缓旋转结合60min后，弃流出液。用10倍Ni2＋-NTA亲合层析柱体积的洗涤缓冲液NPI-20（50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，20mmol/L 咪唑，pH 8.0）洗涤Ni2＋-NTA亲合层析柱，洗涤掉非特异结合蛋白，弃流出液，重复一次。最后用5倍Ni2＋-NTA亲合层析柱体积的NPI-250（50mmol/L NaH2PO4，300mmol/L NaCl，250mmol/L 咪唑，pH 8.0）洗脱并收集目的蛋白溶液His-DXR，将收集的蛋白再加回去重新洗脱1-3次。收集的蛋白溶液His-DXR溶于透析液（50mmol/LTris-HCl缓冲液，2mmol/L DTT，pH为7.5）中，用Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Devices反复离心超滤除盐，用12% SDS-PAGE鉴定结果。
[0059] 1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶（His-DXR）的活性测定
[0060] 鉴于NADPH和NADP＋在340及260nm处有各自的最大吸收峰，因此以NADPH为辅酶通过测定340nm吸光值的变化，定量测定酶的活性。以不同浓度的NADPH对应的340nm吸光值作图（图3），对应实验中测出的OD340的值可根据所作图的线性关系计算出NADP的生成量。His-DXR在金属离子Mg2+的作用下催化DXP生成2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate(MEP)使NADPH被氧化成NADP，测定340nm处吸光值的降低能反映His-DXR的活性。在实验组及空白对照组中反应体系均为100μl，其中都含有50mmol/LTris-HCl缓冲液，3mmol/L的MgCl2，2mmol/L DTT，0.15mmol/L的NADPH及0.5mM的DXP，pH为7.5。向实验组中加入5ul浓度为
0.58ug/ul的（即2.9μg的）酶（His-DXR），在37℃下反应，测定340nm处吸光值的变化，每1min读取一次，以NADP生成量对反应时间作图，取△NADP/min的最大值表示酶活力的大小；空白对照组中则不加His-DXR酶，每1min读取一次NADPH的OD340，根据时间的推移对其吸收值的变化作图（图4）；
0.58ug/ul的（即2.9μg的）酶（His-DXR），在37℃下反应，测定340nm处吸光值的变化，每1min读取一次，以NADP生成量对反应时间作图，取△NADP/min的最大值表示酶活力的大小；空白对照组中则不加His-DXR酶，每1min读取一次NADPH的OD340，根据时间的推移对其吸收值的变化作图（图4）；
[0061] 活性测定结果如下：
[0062] 不同浓度的NADPH对应的340nm吸光值作图发现成线性关系（y=1.660x+0.0537,R2=0.9915），见图3。根据反应中测定的OD340的值可计算出NADPH反应前后浓度的变化，从而可计算出NADP的生成量，从而确定His-DXR的活力；
[0063] 对重组His-DXR进行活性检测测定，结果表明底物DXP在NADPH存在的条件下，能使NADPH被氧化成NADP，每1min测定NADPH在340nm处的吸光值，以NADP生成量对反应时间作图（结果见图4），可以发现在5min内的NADP的生成量与反应时间处于良好线性关系（y=0.0228x，,R2=0.999），其酶活力为0.0228 mmol / L·min。所以反应时间应选择在5min内，测定的酶活反应速率是在底物充足情况下的最大反应速率。空白对照组NADPH在不加酶的情况下，随着时间推移其OD340吸光值基本不发生变化，即NADPH在5min内其量是不会发生变化的，即不会影响酶活的测定；
[0064] 对重组His-DXR进行活性检测测定，结果表明底物DXP在NADPH存在的条件下，能使NADPH被氧化成NADP，每2min测定NADPH在340nm处的吸光值，以NADP生成量对反应时间作图，可以发现在8min内的NADP的生成量与反应时间处于良好线性关系，反应时间超过18min后，NADP的生成量曲线明显趋于平直而不再上升，说明反应已达终末，此后的数据不应再作为统计NADP生成量变化的依据。所以反应时间应选择在5min内，测定的酶活反应速率是在底物充足情况下的最大反应速率；
[0065] 为了优化重组His-DXR酶活性的测定条件，分别对不同温度、不同pH值及不同浓度底物DXP、Mg2+对酶活性影响进行了研究，结果表明His-DXR的最适反应温度为55-60℃（图5A），最适反应pH值7.5-8（图5B），Mg2+的最佳浓度为3mmol/L（图5C），DXP的最适浓度为
0.25mmol/L（图5D）；
0.25mmol/L（图5D）；
[0066] 酶性质的测定
[0067] 1）最适反应温度：在32 68℃范围内，在含有50mmol/LTris-HCl缓冲液，3mmol/L的~MgCl2，2mmol/L DTT，0.15mmol/L的NADPH及0.5mmol/L的DXP，pH为7.5的反应液中分别测定酶活。以底物NADP生成量对温度作图。见图5A；
[0068] 2）最适反应pH值：37℃下，在不同的pH条件下分别测定酶活，以NADP生成量对反应pH值作图，所用反应液中含有50mmol/L的Tris，3mmol/L的MgCl2，2mmol/L DTT，0.15mmol/L的NADPH及0.5mmol/L的DXP，用HCl调节pH值为3 10。见图5B；~
[0069] 3）最适金属离子浓度：在不同的Mg2+浓度下分别测定酶活，以NADP生成量对Mg2+浓度作图，所用反应液中含有50mmol/L的Tris， 2mmol/L DTT，0.15mmol/L的NADPH及0.5mmol/L的DXP及0 8mmol/L不同浓度的Mg2+，pH为7.5。见图5C；
~
~
[0070] 4）底物浓度的测定：37℃下测定底物DXP在不同浓度时的酶活，以NADP的生成量对底物DXP的浓度作图。所用反应液中含有50mmol/LTris-HCl缓冲液，3mmol/L的MgCl2，2mmol/L DTT，0.15mmol/L的NADPH及0 0.5mmol/L 的DXP，pH为7.5。见图5D；
~
~
[0071] 3、抑菌活性筛选：
[0072] 采用刃天青显色法作为检测活性的方法，刃天青显色法的原理是：活细胞中的乳酸脱氢酶能将刃天青(蓝色)转化为荧光物质试卤灵(粉红红色), 产生荧光信号，在激发波长为530nm、发射波长为590nm下能检测到荧光值。试卤灵会继续被细胞还原为无荧光的物质二氢试卤灵(白色), 使荧光信号下降, 无活性的或死亡的细胞丧失了代谢能力而不能还原刃天青, 也就不能产生荧光信号，所以该法能特异性检测活性细胞；
[0073] 实验采用96孔板操作，根据96孔板孔的颜色及荧光值计算出的抑制率判定物质是否具有抑菌活性。孔中颜色呈蓝色，则代表样品对目标菌株有抑制活性；96孔中颜色呈粉红色或红色，则代表样品对目标菌株没有抑制活性。抑制率公式的计算公式为
[0074] 抑制率%=100%-（实验孔荧光值-阳性对照荧光值）/（阴性对照荧光值-阳性对照荧光值）×100%。抑制率在80%以上，则代表样品对目标菌株有较强的抑制作用；
[0075] 实验菌株轮虫弧菌（MCCC E385）,坎氏弧菌（MCCC E333）,创伤弧菌（MCCC E1758）分离于广东湛江感染对虾，保存于在30%甘油中，-80℃冻存。将三株菌分别接种于5mL LB培养液中，于37℃振荡培养3小时后，收集菌体，用0.9%生理盐水稀释，用血球计数板计数，用LB培养液稀释调整菌悬液浓度为104 CFU/mL（轮虫弧菌和坎式弧菌）和105 CFU/mL（创伤弧菌）；
[0076] 用无菌水配置刃天青浓度为5000μg/mL的母液，并用0.22μm的滤膜过滤分装，冻存在-20℃。取一管将其分别稀释为500μg/mL（适用于轮虫弧菌及坎式弧菌）和200μg/mL（适用于创伤弧菌）；
[0077] 将175μL菌悬液、20μL刃天青溶液和5μL步骤1的馏分同时加入到96微孔板中；在96孔板中设定阴性对照和阳性对照。（阴性对照为：5μL DMSO+175μL菌悬液+20μL刃天青；阳性对照为：5μL DMSO+175μL LB+20μL刃天青），将96孔板放入到37℃恒温培养箱中培养24h，24h后观察96微孔板中各个孔的颜色，并将96孔板放入酶标仪中在激发波长为530nm发射波长为590nm处测定的荧光值并通过公式计数出抑制率。抑制率在80%以上的馏分留做下一步酶活筛选；
[0078] 4、酶活抑制试验筛选：
[0079] （1）标准品膦胺霉素（Fosmidomycin）的酶活抑制实验
[0080] 将膦胺霉素溶于DMSO中，配成浓度为50μmol/L母液，按两倍梯度稀释成：25μmol/L,12.5μmol/L，6.25μmol/L，3.125μmol/L，在5孔含有50mmol/LTris-HCl缓冲液，3mmol/L的MgCl2，2mmol/L DTT，0.15mmol/L的NADPH及0.25mmol/L的DXP，pH为7.5的100μl反应液中，分别加入各浓度的膦胺霉素5μl，即100μl体系中膦胺霉素的浓度为2500nmol/L，1250nmol/L，625nmol/L，312.5nmol/L，156.25nmol/L。然后分别加入步骤2所得浓度为0.58ug/ul（即2.9μg的）His-DXR 5ul开始反应。5min后在340nm下测定吸光值。设置对照和空白组，对照组以DMSO代替膦胺霉素，空白组不加酶（即不加His-DXR），重复三次，计算抑制率。抑制率（%）=（样品吸光值－对照吸光值）/（空白吸光值－对照吸光值）×100%
[0081] 膦胺霉素因其结构与酶活反应底物DXP异构化产物结构相似，故被认为是专一性抑制
[0083] 霉素对于创伤弧菌1-脱氧木酮糖-5磷酸消旋酶（DXR）的IC50（半抑制浓度）为390nmol/L，
[0084] 见图6；
[0085] （2）海洋微生物发酵液样品酶活抑制实验
[0086] 将抑菌活性≥80%的馏分按标准品膦胺霉素酶活抑制实验方法及抑制率计算方法，检测待测样品的抑制活性，≥50%的酶活抑制率视为有活性的馏分。本实验共筛选了21个馏分，抑制率见表1和2，其中6个馏分是有效的。
[0087] 利用上述方法构建的His-DXR抑制剂筛选模型，对用刃天青方法筛选出的有活性的21个微生物发酵物进行筛选，根据抑制率大于50%确定阳性结果。
[0088] 表1：6个馏分的抑制率
[0089]
[0090] 表2：15个馏分的抑制率
[0091]馏分标号 实验组 对照组 空白组 抑制率
236-12 0.22 0225. 0.311 0.00%
236-13 0.235 0225. 0.311 11.40%
236-14 0.232 0.225 0.311 7.89%
236-15 0.238 0.225 0.311 14.91%
236-18 0.225 0.225 0.311 0.00%
235-27 0.263 0.225 0.311 44.30%
236-46-1 0.258 0.225 0.311 37.97%
236-46-2 0.254 0.225 0.311 34.18%
236-46-3 0.263 0.225 0.311 44.03%
236-46-6 0.232 0.225 0.311 8.05%
236-60 0.237 0.225 0.311 13.79%
236-83 0.248 0.225 0.311 26.44%
251-18 0.222 0.212 0.324 9.02%
251-31-1 0.231 0.212 0.324 17.21%
251-31-2-1 0.215 0.212 0.324 2.46%
236-12 0.22 0225. 0.311 0.00%
236-13 0.235 0225. 0.311 11.40%
236-14 0.232 0.225 0.311 7.89%
236-15 0.238 0.225 0.311 14.91%
236-18 0.225 0.225 0.311 0.00%
235-27 0.263 0.225 0.311 44.30%
236-46-1 0.258 0.225 0.311 37.97%
236-46-2 0.254 0.225 0.311 34.18%
236-46-3 0.263 0.225 0.311 44.03%
236-46-6 0.232 0.225 0.311 8.05%
236-60 0.237 0.225 0.311 13.79%
236-83 0.248 0.225 0.311 26.44%
251-18 0.222 0.212 0.324 9.02%
251-31-1 0.231 0.212 0.324 17.21%
251-31-2-1 0.215 0.212 0.324 2.46%
[0092] 表1和表2中，251代表尖刀镰孢菌发酵所得馏分；236代表白色侧齿霉发酵所得馏分。
[0093] 实验组为：NADPH+DXP+馏分+反应液+酶DXR；
[0094] 对照组为：NADPH+DXP+DMSO+反应液+酶DXR；
[0095] 空白组为：NADPH+DXP+DMSO+反应液；
[0096] 由表1可以看出，表中的6个馏分对His-DXR的抑制率大于50%，说明该海洋微生物发酵液的6个馏分样品对His-DXR是有抑制效果的，所筛选的馏分是本发明需要的抑制剂。
[0097] 由表2可以看出，表中的15个馏分对His-DXR的抑制率小于50%。说明该海洋微生物发酵液的15个馏分样品对His-DXR的抑制效果不明显，所筛选的馏分不是本发明需要的抑制剂。
[0098] 尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
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