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海洋链霉菌产生的化合物及其应用

阅读:1035发布:2020-08-22

专利汇可以提供海洋链霉菌产生的化合物及其应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种海洋链霉菌产生的化合物及其应用。本发明提供了一种式I所示化合物,还提供了制备该化合物的方法,包括如下步骤:1) 发酵 链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ8.012 CGMCC No.4950,收集发酵液,离心取菌丝体;2)将步骤1)得到的菌丝体用 乙醇 抽提,收集抽提液、浓缩、干燥,得到乙醇粗提物;本发明的实验证明,通过菌株的细胞内产生的 次级代谢产物 化合物8.012-1和8.012-2将 矿石 或 水 体 中的重 金属离子 吸附 进入菌体内部,进而使得金属离子在菌体内部得到富集;回收菌体从而实现重金属离子的回收。,下面是海洋链霉菌产生的化合物及其应用专利的具体信息内容。

1.链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ8.012,其保藏号为CGMCC No.4950。
2.式I所示化合物,
所述式I中,*代表手性,其特征在于:
所述式I所示化合物为如下式I-1所示化合物或如下式I-2所示化合物:
3.权利要求1所述的链霉菌CGMCC No.4950在制备如权利要求2所述的式I-1或式I-2所示化合物中的应用。
4.一种制备权利要求2所述的式I-1或式I-2所示化合物的方法,包括如下步骤:
1)发酵权利要求1所述的链霉菌CGMCC No.4950,收集发酵液,离心取菌丝体; 其中,所述发酵的时间为5天-10天,所述发酵的温度为25℃-30℃,发酵所使用的培养基配方为:可溶性淀粉10.0g,葡萄糖10.0g,蛋白胨5.0g,酵母提取物2.0g,海盐1.0g,CaCO33.0g,自来1000.0ml;所述离心的时间为10分钟-20分钟,所述离心的温度为
25℃-28℃;所述发酵采用转速为150r/min-170r/min进行振荡培养;所述振荡的旋转半径为16mm,所述离心的转速为6000r/min-8000r/min,所述离心半径为25.4cm;
2)将步骤1)得到的菌丝体用无水乙醇抽提,收集抽提液、浓缩、干燥,得到乙醇粗提物;
其中,所述抽提为将无水乙醇和步骤1)得到的菌丝体等体积震荡混合;所述抽提的时间为8h-12h,所述抽提的温度为25℃-28℃;
3)将步骤2)得到的乙醇粗提物进行胶柱层析分离,得到一次分离产物;
其中,所述硅胶柱层析分离为将所述乙醇粗提物流过硅胶柱以进行吸附,再用洗脱缓冲液进行洗脱,收集洗脱液;所述洗脱缓冲液为氯仿和甲醇的混合液;所述洗脱为梯度洗脱,所述梯度洗脱的方式为:所述洗脱缓冲液中的氯仿的体积百分含量由100%匀速降为
90%,其余为甲醇;所述洗脱缓冲液的速度为1.8ml/min-2.2ml/min,所述洗脱缓冲液的量为15-18倍柱体积,收集第4-13个柱体积的洗脱液;所述乙醇粗提物和所述硅胶的体积比为1:6;所述硅胶的粒径为100-200目;所述硅胶柱的柱高80cm;柱外径3.6cm,内径
3.0cm;
4)将步骤3)得到的一次分离产物进行凝胶色谱分离,得到二次分离产物;
其中,所述凝胶色谱分离为将所述一次分离产物流入凝胶柱,再用洗脱缓冲液进行洗脱,收集洗脱液;所述洗脱缓冲液为甲醇;所述洗脱缓冲液的速度为0.4ml/min-0.6ml/min,所述洗脱缓冲液的体积用量为所述凝胶柱体积的0.4-0.6倍;收集第0.1-0.3个柱体积的洗脱液;所述凝胶柱为Sephadex LH-20;
5)将步骤4)得到的二次分离产物进行HPLC分离,得到式I-1所示化合物或式I-2所示化合物;
其中,所述HPLC为将所述二次分离产物流过色谱柱以进行吸附,再用洗脱缓冲液进行洗脱,收集洗脱液;所述洗脱缓冲液为甲醇和水体积比为68:32的混合液;所述洗脱缓冲液的速度为1.0ml/min;
所述收集洗脱液为如下A或B:
A为收集保留时间为22.5min的洗脱液,得到式I-1所示化合物;
B为收集保留时间为20.2min的洗脱液,得到式I-2所示化合物;
所述HPLC的波长为190-800nm。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:
步骤1)中,所述发酵的时间为5天、7天或10天,所述发酵的温度为25℃、28℃或30℃;
所述离心的时间为10分钟、15分钟或20分钟,所述离心的温度为25℃、26℃或28℃。
6.根据权利要求4或5所述的方法,其特征在于:
步骤1)中,所述发酵采用转速为150r/min、165r/min或170r/min进行振荡培养;所述离心的转速为6000r/min、7000r/min或8000r/min;
步骤2)中,所述抽提的时间为8h、10h或12h,所述抽提的温度为25℃、26℃或28℃;
步骤3)中,所述洗脱缓冲液的速度为1.8ml/min、2ml/min或2.2ml/min,所述洗脱缓冲液的量为15倍柱体积;
步骤4)中,所述洗脱缓冲液的速度为0.4ml/min、0.5ml/min或0.6ml/min,所述洗脱缓冲液的体积用量为所述凝胶柱体积的0.4倍。
7.权利要求1所述的链霉菌CGMCC No.4950在吸附金属离子中的应用,所述金属离子
3+ 2+
为Fe 和/或Cu 。
8.权利要求2所述的式I-1或式I-2所示的化合物在吸附金属离子中的应用,所述金
3+ 2+ 2+
属离子为Fe 、Cu 和/或Zn 。
9.一种用于吸附金属离子的产品,其活性成分为权利要求2所述的式I-1或式I-2所示化合物或权利要求1所述的链霉菌CGMCC No.4950。

说明书全文

海洋链霉菌产生的化合物及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域,尤其涉及一种海洋链霉菌产生的化合物及其应用。

背景技术

[0002] 放线菌是一类基因组DNA的G+C mol%含量高、具有复杂形态分化的革兰氏阳性细菌,因其菌落多呈放射状而得名。放线菌能生产多种具有极高经济价值的生物活性物质,被认为是一类重要的工业微生物资源,迄今发现的两万余种微生物来源的生物活性物质中,约一半是由放线菌产生的。
[0003] 目前,世界上绝大多数的金属开采业采用机械加化学方法进行,采矿同时产生的大量粉尘、噪声、有毒有害等所造成的严重污染已被举世公认。并且限于技术手段的原因,所开采的矿石多限于中、高品位矿石,大量的对于“机械加化学方法”来说是较低品位的矿源以及对中、高品位矿石开采后残留的较低品位矿全部处于搁置甚至浪费状态。
[0004] 来源于矿、矿及金属硫化物矿山等的重金属离子废水,以及其它工业过程产生的重金属离子废水,主要以自然净化、化学沉淀、离子交换、蒸发电解、高分子材料吸附等物理、化学法处理,而这些方法都面临能耗高、金属离子残留大、对金属离子的回收利用度低、方法不够环保等问题。
[0005] 传统的使用微生物转化法处理矿石、水体中重金属离子的方法,多集中在微生物通过其自身的代谢特点改变金属离子的化学存在状态方面,能耗高,产率低,金属回收效率低下。

发明内容

[0006] 本发明的一个目的是提供链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ8.012。
[0007] 本发明提供的链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ8.012,其保藏号为CGMCC No.4950。
[0008] 所述的链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ8.012 CGMCC No.4950在制备下述的式I所示化合物中的应用也是本发明保护的范围。
[0009] 本发明的第二个目的是提供一种式I所示化合物。
[0010] 本发明提供了式I所示化合物,
[0011]
[0012] (式I)
[0013] 所述式I中,*代表手性
[0014] 所述式I所示化合物为如下式I-1所示化合物或如下式I-2所示化合物:
[0015]
[0016] (式I-1) (式I-2)。
[0017] 本发明的第三个目的是提供一种制备所述的式I所示化合物的方法,包括如下步骤:
[0018] 1)发酵所述链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ8.012 CGMCC No.4950,收集发酵液,离心取菌丝体;
[0019] 2)将步骤1)得到的菌丝体用无水乙醇抽提,收集抽提液、浓缩、干燥,得到乙醇粗提物;
[0020] 3)将步骤2)得到的乙醇粗提物进行胶柱层析分离,得到一次分离产物;
[0021] 4)将步骤3)得到的一次分离产物进行凝胶色谱分离,得到二次分离产物;
[0022] 5)将步骤4)得到的二次分离产物进行HPLC分离,得到式I所示化合物,即为式I-1所示化合物或式I-2所示化合物。
[0023] 步骤1)中,所述发酵的时间为5天-10天,所述发酵的温度为25℃-30℃;所述离心的时间为10分钟-20分钟,所述离心的温度为25℃-28℃;
[0024] 所述发酵的时间具体为5天、7天或10天,所述发酵的温度具体为25℃、28℃或30℃;
[0025] 所述离心的时间具体为10分钟、15分钟或20分钟,所述离心的温度具体为25℃、26℃或28℃;
[0026] 步骤2)中,所述抽提为将步骤1)得到的所述菌丝体和所述乙醇等体积震荡混合,[0027] 步骤3)中,所述硅胶柱层析分离为将所述乙醇粗提物流过硅胶柱以进行吸附,再用洗脱缓冲液进行洗脱,收集洗脱液;
[0028] 所述洗脱缓冲液为氯仿和甲醇的混合液,所述洗脱为梯度洗脱,
[0029] 所述梯度洗脱的方式为:所述洗脱缓冲液中的氯仿的体积百分含量由100%匀速降为90%,其余为甲醇;
[0030] 步骤4)中,所述凝胶色谱分离为将所述一次分离产物流入凝胶柱,再用洗脱缓冲液进行洗脱,收集洗脱液;
[0031] 所述洗脱缓冲液为甲醇;
[0032] 步骤5)中,所述HPLC为将所述二次分离产物流过色谱柱以进行吸附,再用洗脱缓冲液进行洗脱,收集洗脱液;
[0033] 所述洗脱缓冲液为甲醇和水体积比为68∶32的混合液。
[0034] 步骤1)中,所述发酵采用转速为150r/min-170r/min进行振荡培养;所述振荡的旋转半径为16mm,所述离心的转速为6000r/min-8000r/min,所述离心半径为25.4cm;
[0035] 所述发酵采用转速为150r/min、165r/min或170r/min进行振荡培养;所述离心的转速为6000r/min、7000r/min或8000r/min;
[0036] 步骤2)中,所述抽提时间为8h-12h,所述抽提温度为25℃-28℃;所述抽提时间具体为8h、10h或12h,所述抽提温度具体为25℃、26℃或28℃;
[0037] 步骤3)中,所述洗脱缓冲液的速度为1.8ml/min-2.2ml/min,所述洗脱缓冲液的量为15-18倍柱体积,所述收集第4-13个柱体积的洗脱液;
[0038] 所述洗脱缓冲液的速度具体为1.8ml/min、2ml/min或2.2ml/min,所述洗脱缓冲液的量具体为15倍柱体积;
[0039] 步骤4)中,所述洗脱缓冲液的速度为0.4ml/min-0.6ml/min,所述洗脱缓冲液的体积用量为所述凝胶柱体积的0.4-0.6倍;所述收集第0.1-0.3个柱体积的洗脱液;
[0040] 所述洗脱缓冲液的速度具体为0.4ml/min、0.5ml/min或0.6ml/min,所述洗过缓冲液的体积用量具体为所述凝胶柱体积的0.4倍;
[0041] 步骤5)中,所述洗脱缓冲液的速度为1.0mi/min;
[0042] 所述收集洗脱液为如下A或B:
[0043] A为收集保留时间为22.5min的洗脱液,得到式I-1所示化合物;
[0044] B为收集保留时间为20.2min的洗脱液,得到式I-2所示化合物。
[0045] 步骤3)中,所述乙醇粗提物和所述硅胶的体积比为1∶6-1∶10;所述乙醇粗提物和所述硅胶的体积比具体为1∶6、1∶8或1∶10;
[0046] 所述硅胶的粒径为100-200目;
[0047] 所述硅胶柱的柱高80cm;柱外径3.6cm,内径3.0cm;
[0048] 步骤4)中,所述凝胶柱为Sephadex LH-20;
[0049] 步骤5)中,所述HPLC的波长为190-800nm。
[0050] 所述的链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ8.012 CGMCC No.4950或所述的式I所示化合物或所述的方法在吸附金属离子中的应用也是本发明保护的范围;所述金属离子具体3+ 2+ 2+
为Fe 、Cu 和/或Zn 。
[0051] 本发明的第四个目的是提供一种用于吸附金属离子的产品。
[0052] 本发明提供的产品,其活性成分为所述的式I所示化合物或所述链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ8.012 CGMCC No.4950。
[0053] 海洋链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ8.012于2011年6月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路一号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号CGMCC No.4950,该菌株的分类命名为链霉菌Streptomyces sp.。
[0054] 本发明的实验证明,本发明利用海洋链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ8.012 CGMCCNo.4950能产生化合物8.012-1和8.012-2,并在金属离子吸附方面表现出明显活性,因此可以通过菌株的细胞内产生的次级代谢产物将矿石或水体中的重金属离子吸附进入菌体内部,进而使得金属离子在菌体内部得到富集;回收菌体从而实现重金属离子的回收,本方法相对能耗低,不占用微生物自身的代谢途径,化合物的金属离子回收效率高。本发明为矿石、水体中重金属的回收再利用提供了一条可选的途径。附图说明
[0055] 图1为化合物8.012-1的氢谱(600MHz,氘代丙)
[0056] 图2为化合物8.012-1的谱(150MHz,氘代丙酮)
[0057] 图3为化合物8.012-1的COSY二维核磁共振谱图
[0058] 图4为化合物8.012-1的HSQC二维核磁共振谱图
[0059] 图5为化合物8.012-1的HMBC二维核磁共振谱图
[0060] 图6为化合物8.012-1的NOESY二维核磁共振谱图
[0061] 图7为化合物8.012-1的紫外光谱
[0062] 图8为化合物8.012-1的红外光谱图(横坐标为波长(nm)(wavenumber(cm-1)),纵坐标为吸收相对强度(T%))
[0063] 图9为化合物8.012-2的氢谱(600MHz,氘代丙酮)
[0064] 图10为化合物8.012-2的碳谱(150MHz,氘代丙酮)
[0065] 图11为化合物8.012-2的COSY二维核磁共振谱图
[0066] 图12为化合物8.012-2的HSQC二维核磁共振谱图
[0067] 图13为化合物8.012-2的HMBC二维核磁共振谱图
[0068] 图14为化合物8.012-2的NOESY二维核磁共振谱图
[0069] 图15为化合物8.012-2的紫外光谱图
[0070] 图16为化合物8.012-2的红外光谱图(横坐标为波长(nm)(wavenumber(cm-1)),纵坐标为吸收相对强度(T%))

具体实施方式

[0071] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法。
[0072] 下述实施例中所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
[0073] 实施例1、化合物8.012-1及8.012-2的制备
[0074] A、海洋链霉菌FXJ8.012的分离
[0075] 一、菌种分离
[0076] 2008年10月间从东经72.00度、南纬37.83度的印度洋海平面下深3838米处取得海水样品,样品浓缩后带回实验室中进行处理。海水样品用无菌水稀释后用制成悬浮液,采用60℃加热十分钟的方法进行预处理,采用ISP-3(加入3.3%海盐)培养基作为分离培养基,于28℃培养14天,挑单菌落于GYM琼脂培养基(葡萄糖4.0g酵母提取物4.0g,麦芽提取物10.0g,碳酸2.0g,琼脂15.0g,蒸馏水1000.0ml)上纯化,得到海洋链霉菌FXJ8.012。
[0077] 二、菌种形态特征及生理生化鉴定
[0078] 1、16S rRNA分析
[0079] 提取海洋链霉菌FXJ8.012基因组DNA,采用放线菌16S rRNA通用引物(27f:5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’;1492r:5’-TACGGYTACCTTACGACTT-3’)扩增16SrRNA基因并纯化测序,序列测定结果通过NCBI的BLASTN程序进行相似性比较。
[0080] 序列分析结果表明,海洋链霉菌FXJ8.012的16S rRNA的核苷酸序列为序列表中的序列1。
[0081] 2、形态特征
[0082] 观察形态结果如下:在GYM琼脂培养基(葡萄糖4.0g酵母提取物4.0g,麦芽提取物10.0g,碳酸钙2.0g,琼脂15.0g,蒸馏水1000.0ml)中,海洋链霉菌FXJ8.012培养3天后可见浅褐色的基内菌丝,培养4-5天后即可见铅灰色的气生菌丝和孢子丝,不产色素;
[0083] 3、生理生化鉴定
[0084] 方法详见东秀珠、蔡妙英等编《常见细菌系统鉴定手册》(科学出版社,2001年出版)pp365-366。
[0085] 生理生化的结果具体见下表1所示:
[0086] 表1海洋链霉菌FXJ8.012的生理生化实验结果
[0087]生理生化指标 FXJ8.012 生理生化指标 FXJ8.012 生理生化指标 FXJ8.012
pH 6--11 氮源利用 水解实验
氯化钠耐受 5-20% 丙酸 + 明胶液化 +
碳源利用 半胱氨酸 w 淀粉 +
葡萄糖 + 甘氨酸 + 七叶苷 +
纤维二糖 + 腺苷酸 + 熊果苷 -
甘露糖 - 酪氨酸 + 奶胨化 +
籽糖 + 丝氨酸 硝酸盐还原 +
海藻糖 + 脯氨酸 w 其它
鼠李糖 + 谷氨酰胺 黑色素产生
甘油 + 降解实验 过化氢酶 +
木糖 + 酪素 w 硫化氢产生
核糖 脱乙酰几丁质 M-R实验
半乳糖 - 嘌呤 - V-P实验 -
甘露醇 + 次黄嘌呤 -
蔗糖 + 黄嘌呤 w
阿拉伯糖 + 尿素
[0088] “+”表示实验结果为阳性;“-”表示实验结果为阴性;“w”表示实验结果为微弱阳性。
[0089] 通过上述的鉴定结果,可确定海洋菌FXJ8.012为链霉菌(Streptomyces sp.)。海洋链霉菌FXJ8.012于2011年6月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路一号院3号,中国科学院微生物研究所,保藏编号CGMCC No.4950,该菌株的分类命名为链霉菌Streptomyces sp.。
[0090] B、化合物8.012-1及8.012-2的制备
[0091] 方法一:
[0092] 一、菌种FXJ8.012菌丝体的制备
[0093] 1、活化链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ8.012
[0094] 挑取链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ8.012CGMCC No.4950的菌丝体接种于GYM琼脂培养基(葡萄糖4.0g酵母提取物4.0g,麦芽提取物10.0g,碳酸钙2.0g,琼脂15.0g,蒸馏水1000.0ml)中,28℃培养7天,得到活化的菌种FXJ8.012。
[0095] 2、发酵链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ8.0127
[0096] 利用活化好的菌种FXJ8.012制备孢子悬液(孢子浓度约10 个/ml,悬液的溶剂为水),孢子悬液接种于发酵培养基中(每100ml液体发酵培养基中接种2ml孢子悬液,共使用100个三瓶,发酵量10L),28℃振荡培养7天,振荡器转速均为165r/min(离心半径16mm)。发酵培养基配方为:可溶性淀粉10.0g,葡萄糖10.0g,蛋白胨5.0g,酵母提取物2.0g,海盐1.0g,CaCO33.0g,自来水1000.0ml,得到发酵液。
[0097] 待发酵完毕后,6000r/min离心(离心半径25.4cm)发酵液15分钟使得菌丝体和上清液实现分离,收集菌丝体。
[0098] 二、乙醇抽提菌丝体
[0099] 将上述一获得的菌丝体与等体积的无水乙醇混合后震荡抽提过夜(12h,震荡温度为25℃)。反复抽提三次后将乙醇抽提液减压浓缩至干燥,得乙醇粗提物1.5g。
[0100] 三、硅胶柱层析分离
[0101] 将上述乙醇粗提物使用氯仿:甲醇体系(100%氯仿-90%氯仿)进行硅胶柱层析(洗脱流速为1.8ml/min,乙醇粗提物和与硅胶的配比为1∶6,硅胶的粒径为100-200目,洗脱缓冲液的量为15倍柱体积,硅胶柱的柱高80cm;柱外径3.6cm,内径3.0cm),硅胶柱层析的洗脱为梯度洗脱,洗脱液为氯仿和甲醇混合液,梯度洗脱的方式为:所述洗脱液中的氯仿的体百分含量由100%匀速降为90%,其余为甲醇;收集洗脱液。将洗脱液用薄层层析监测(展层溶剂为氯仿∶甲醇=20∶1,在254nm紫外光下监测,呈淡蓝白色荧光的组分即为所要产物)具有目标产物的组分,合并有同一产物的组分后得产物一(即对应的是收集的硅胶柱层析第4-13个柱体积的洗脱液)。
[0102] 四、凝胶色谱分离
[0103] 将上述三得到的产物一通过Sephadex LH-20凝胶色谱(洗脱缓冲液的速度为0.4ml/min,洗过缓冲液的体积用量为所述凝胶柱体积的0.4倍;Sephadex LH-20的柱高
100cm;柱外径1.6cm,内径1.0cm,),以甲醇作为流动相,收集洗脱液。将洗脱液用薄层层析监测(展层溶剂为氯仿∶甲醇=20∶1,在254nm紫外光下监测,呈淡蓝白色荧光的组分即为所要产物)具有目标产物的组分,合并有同一产物的组分后得产物二(即对应的是收集的Sephadex LH-20凝胶色谱第0.1-0.3个柱体积的洗脱液)。
[0104] 五、HPLC纯化
[0105] 将上述四得到的产物二通过HPLC纯化后得到化合物8.012-1(19.1mg)及8.012-2(6.6mg)。其中HPLC条件是:采用Shimadzu SPD-M20A型半制备高压液相色谱仪,Ascentis RP-Amide反相分析型色谱柱(5μm,4.6×150mm,sigma,565324-U),流速1.0ml/min,使用甲醇∶水=68∶32比例作为流动相,收集保留时间Rt=22.5min的样品,得到化合物8.012-1粗提物;收集保留时间Rt=20.2min的样品,得到8.012-2粗提物。
[0106] HPLC的洗脱流速为1.0ml/min;HPLC的波长为190-800nm;HPLC的洗脱液为甲醇∶水=68∶32;HPLC的色谱柱的孔径为5μm,柱内径及柱长为4.6×150mm;
[0107] 综上,1.5g化合物8.012-1粗提物和1.5g化合物8.012-2粗提物经上述分离纯化后分别获得19.1mg的化合物8.012-1及6.6mg的化合物8.012-2,其纯度均大于99%,收率分别为1.27%和0.44%。
[0108] 方法二:
[0109] 一、菌种FXJ8.012菌丝体的制备
[0110] 与方法一基本相同,不同的是发酵的时间为5天,发酵的温度具体为25℃;振荡培养的转速为150r/min(离心半径16mm);离心的转速为7000r/min(离心半径25.4cm);离心的时间为10分钟,离心的温度为26℃。
[0111] 二、乙醇抽提菌丝体
[0112] 与方法一基本相同,不同的是抽提时间为8h,抽提温度为26℃;
[0113] 三、硅胶柱层析分离
[0114] 与方法一基本相同,不同的是洗脱缓冲液的速度为2ml/min;
[0115] 四、凝胶色谱分离
[0116] 与方法一基本相同,不同的是洗脱缓冲液的速度为0.5ml/min;乙醇粗提物和所述硅胶的配比为1∶8;硅胶的粒径为100-200目;
[0117] 五、HPLC纯化
[0118] 与方法一相同。
[0119] 方法三:
[0120] 一、菌种FXJ8.012菌丝体的制备
[0121] 与方法一基本相同,不同的是发酵的时间为10天,发酵的温度具体为30℃;振荡培养的转速为170r/min(离心半径16mm);离心的转速为8000r/min(离心半径25.4cm);离心的时间为20分钟,离心的温度为28℃。
[0122] 二、乙醇抽提菌丝体
[0123] 与方法一基本相同,不同的是抽提时间为10h,抽提温度为28℃;
[0124] 三、硅胶柱层析分离
[0125] 与方法一基本相同,不同的是洗脱缓冲液的速度为2.2ml/min;
[0126] 四、凝胶色谱分离
[0127] 与方法一基本相同,不同的是洗脱缓冲液的速度为0.6ml/min;乙醇粗提物和所述硅胶的配比为1∶10;硅胶的粒径为100-200目;
[0128] 五、HPLC纯化
[0129] 与方法一相同。
[0130] C、化合物8.012-1及8.012-2的表征
[0131] 对上述步骤B的方法一得到的化合物8.012-1及8.012-2分别进行紫外光谱、红外光谱、有机质谱及核磁共振谱分析,其中红外光谱及核磁共振谱由北京化工大学分析测试中心提供测试(仪器型号分别为Nicoiet 8700和Bruker AV600),有机质谱及紫外光谱由中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室提供测试(仪器型号分别为Thermo-Finnigan LCQ DECA XP和Beckman Coulter DU 800)。
[0132] 化合物8.012-1的各种检测结果如下如图1-8所示,其中,图1为化合物8.012-1的氢谱(600MHz,氘代丙酮);图2为化合物8.012-1的碳谱(150MHz,氘代丙酮);图3为化合物8.012-1的COSY二维核磁共振谱图;图4为化合物8.012-1的HSQC二维核磁共振谱图;图5为化合物8.012-1的HMBC二维核磁共振谱图;图6为化合物8.012-1的NOESY二维核磁共振谱图;图7为化合物8.012-1的紫外光谱图;图8为化合物8.012-1的红外光谱图。
[0133] 从上面实验结果看出,本发明制备的化合物8.012-1的理化数据为:黄色粉末;紫外最大吸收峰位于243nm和303nm;分子式:C34H40N6O6S4;分子量756;质谱ESI-MS:m/+ +
z757.3[M+H],779.3[M+Na] ;红外光谱IR(KBr压片)vmax:3430.8,3060.5,2925.5,2856,-1
1668,1639.4,1615.4,1581.4,1491.4,1460.3,1366.6,1258,1230.9,757.1cm 氢 谱
1 13
(H-NMR)和碳谱( C-NMR)见表2。
[0134] 表2化合物8.012-1的氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)数据
[0135]
[0136]
[0137] a在600MHz及Acetone-d6中测定;b在150MHz及Acetone-d6中测定。
[0138] 化合物8.012-1的各种检测结果如下如图9-16所示,图9为化合物8.012-2的氢谱(600MHz,氘代丙酮);图10为化合物8.012-2的碳谱(150MHz,氘代丙酮);图11为化合物8.012-2的COSY二维核磁共振谱图;图12为化合物8.012-2的HSQC二维核磁共振谱图;图13为化合物8.012-2的HMBC二维核磁共振谱图;图14为化合物8.012-2的NOESY二维核磁共振谱图;图15为化合物8.012-2的紫外光谱图;图16为化合物8.012-2的红外光谱图;
[0139] 从上面实验结果看出,本发明制备的化合物8.012-2的理化数据为:黄色粉末;紫外最大吸收峰位于243nm和303nm;分子式:C34H40N6O6S4;分子量756;质谱ESI-MS:
m/z757.3[M+H]+,779.3[M+Na]+;红 外光 谱IR(KBr 压片 )vmax:3434.2,3064.4,2926.5,
2858,1668.9,1639.6,1615,1581,1491.3,1460.3,1366.7,1258.3,1230,758.3cm-1;氢 谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)见表3。
[0140] 表3化合物8.012-1的氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)数据
[0141]
[0142]
[0143] a在600MHz及Acetone-d6中测定;b在150MHz及Acetone-d6中测定。
[0144] 依据上述化合物的理化数据、氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)数据、以及其二维核磁共振谱(COSY+HSQC+HMBC+NOESY),最终确证化合物8.012-1及8.012-2的结构如下(图中构型均为相对构型),其结构式分别为式I-1和式I-2:
[0145]
[0146] 式I-1 式I-2
[0147] 采用同样的方法检测方法二和方法三得到的化合物8.012-1及8.012-2的表征,结果与方法一无显著差异。
[0148] 实施例2、化合物8.012-1及8.012-2对金属离子Fe3+、Cu2+及Zn2+的吸附活性[0149] 预实验测定发现,化合物8.012-1及8.012-2均与硫酸铁、三氯化铁、柠檬酸铁、磷酸铁迅速生成紫红色沉淀;均与硫酸、氯化铜迅速生成绿色沉淀;均与硫酸锌、氯化锌迅速生成白色沉淀。而与相应的铬盐、锰盐、铅盐无作用。
[0150] 一、实验用试剂的配制
[0151] 将由实施例1得到的步骤B的方法一得到的化合物8.012-1及化合物8.012-2分别取1mg用少量DMSO溶解后分别加入含有2ml无菌超纯水的试管中各自配制成0.5mg/ml的化合物8.012-1溶液和化合物8.012-2溶液;将三氯化铁、硫酸铜及硫酸锌分别用无菌超纯水配制成0.1mol/L的标准溶液。
[0152] 二、沉淀滴定法测定化合物对金属离子的吸附比例
[0153] 1、以化合物8.012-1的溶液及三氯化铁溶液为例
[0154] 用eppendorf的微量移液器分别将0.1mol/L的三氯化铁标准溶液、硫酸铜标准溶液及硫酸锌标准溶液移入化合物8.012-1的溶液中,每次移入1ul,边移入边震荡,直至无明显有色沉淀为止(三氯化铁为直至无明显紫红色沉淀为止,硫酸铜为直至无明显绿色沉淀为止,硫酸锌为直至无明显白色沉淀为止)。实验重复三次,结果取平均值。
[0155] 结果如下:化合物8.012-1对金属离子Fe3+、Cu2+及Zn2+的吸附摩尔比例均为1∶2。
[0156] 采用同样的方法检测化合物8.012-2对金属离子的吸附比例,结果为化合物3+ 2+ 2+
8.012-2对金属离子Fe 、Cu 及Zn 的吸附摩尔比例均为1∶2。
[0157] 采用同样的方法用方法二和方法三得到的化合物8.012-1及8.012-2检测吸附比例,结果与方法一无显著差异。
[0158] 实施例3、产生化合物8.012-1和化合物8.012-2的链霉菌FXJ8.012对金属离子3+ 2+
Fe 、Cu 的吸附性
[0159] 一、实验用试剂的配制
[0160] 按照实施例2中的一的方法配制浓度为0.1mol/L的三氯化铁标准溶液100ml×2瓶(颜色为绿色)、浓度为0.1mol/L的硫酸铜标准溶液100ml×2瓶(颜色为蓝色)。
[0161] 二、测定链霉菌FXJ8.012对金属离子的吸附活性
[0162] 上述4瓶标准溶液中每瓶加入20g链霉菌(Streptomyces sp.)FXJ8.012 CGMCCNo.4950的干燥菌丝体,室温(25℃)振荡4小时后6000r/min离心15分钟固液分离,发现溶液褪色明显(即颜色被菌吸入菌体内部了从而使得溶液颜色变浅),表明链霉菌3+ 2+
FXJ8.012对金属离子Fe 、Cu 有较好的吸附性。
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