技术领域
[0001] 使用有效地保留唾液酸和
蛋白质的提取方法从培育燕窝精华中提取酸。
背景技术
[0002] 燕窝是一种传统的中国食物，自古以来就因其健康和美容属性而被人们食用和垂涎。
[0003] 它主要产于中国南部沿海地区、
马来西亚、泰国和印度尼西亚。燕窝成分含有一种叫做燕窝酸的活性物质，其也称为唾液酸。
[0004] 燕窝提取唾液酸和蛋白质的主要方法之一是在30℃至60℃下使用
水溶液30分钟至12小时，通过搅拌并抽
真空溶液，然后加入蛋白酶进行
水解、过滤、浓缩和灭菌来获得唾液酸。
[0005]
现有技术之一(即WO2017012088)的提取方法采用在进行蛋白酶处理之前搅拌和抽真空食用燕窝提取物的常用技术。用于这种水解的酶是单独使用或组合使用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶或菠萝酶。停止蛋白酶反应，然后过滤、浓缩和灭菌食用燕窝水解物来得到食用燕窝提取物。该方法要求唾液酸保留1％-13％，并且以燕窝提取物的4％-15％(按重量计)获取蛋白质。MOLTI-TOF-MS(MZ)结果列出了许多检测到的化合物，但未明确表明发现了哪种化合物，也没有表明哪种MZ指的是唾液酸，以及EGF的两种生长因子(上皮生长因子)和FGF(
成纤维细胞生长因子)。用高效液相色谱法分别确认唾液酸的量，其中确定的量范围为1％-13％。通过使用十二烷基
硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶
电泳(SDS-PAGE)分别确定在该提取物中发现的蛋白质(EGF和FGF)的分子量，其中确定的分子量范围为从100DA至300KDA。通过ELISA和商业EGF和FGF
试剂盒作为标准来确定提取的食用燕窝中EGF和FGF二者是否存在。
基于商业EGF和FGF试剂盒确定EGF和FGF的浓度。现有技术未提及在SDS凝胶上分离的EGF和FGF的条带是否对应于EGF和FGF。需要进行LC-MS-MS(液相色谱-质谱-质谱)分析并且有必要确认EGF和FGF的化学结构，该分析没有在现有技术中进行。此外，所报道的总蛋白质的分子量分布很大，其范围为从100DA到300KDA，并且检测到的总蛋白质含量小于6.5KDA，为
0.6％-6.4％(按重量计)。鉴于分子量分布巨大以及在食用燕窝中检测到的总蛋白含量小于6.5KDA(0.6％-6.4％)，很可能无法确认SDS凝胶上分离出的条带是否与EGF和FGF具体对应。应该对这两个条带的提取进行LC-MS-MS分析，以确认EGF和FGF的化学结构。此外，现有技术在
冷冻干燥过程中向食用燕窝提取物中添加高达10％的糊精(作为赋形剂)以获得粉末状食用燕窝提取物。添加糊精的目的是避免在冷冻干燥过程中产生气泡并保持反应过程的
稳定性。糊精是由
淀粉或糖原经由水解产生的低分子量
碳水化合物。糊精是由α-(1→4)或α-(1→6)糖苷键连接的D-
葡萄糖单元
聚合物的混合物。它是用作
增稠剂和
粘合剂的
食品添加剂。这可能会引起人们对食用燕窝纯度的担忧，因为糊精在制备食用燕窝提取物时充当增稠剂和粘合剂。
[0006] 在现有技术WO2017012088中的提取方法具有以下缺点：使用长达12小时(长时间处理)的蛋白酶处理(木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和菠萝酶)可能将所有蛋白质消化(
破碎)成小肽。在该方法中报道的蛋白
质量仅为食用燕窝重量的4％-15％，并且如何得出4％-15％的数字缺乏清晰度。对于所分析的总蛋白质含量，没有上述现有技术中描述的分析方法的细节。另一方面，发现的总蛋白质含量基于使用SDS-PAGE凝胶分离的分子量分布。巨大的分子量分布范围为从100DA至300KDA，仅检测到从0.6％至6.4％的蛋白质低于6.5KDA。与报道的其他研究相比，该方法报道的蛋白质含量较低。一些研究报道了40％-60％的食用燕窝粗提物。
[0007] 上述现有技术方法可以提取并保留相当数量的1％-13％的唾液酸(其取决于不同的燕窝样品)，唾液酸的百分比是基于高效液相色谱(HPLC)确定的，并且未通过在所述
申请中使用的MALDI-TOF-MS检测到的结果进行确认。在市购EGF和FGF之间进行比较，并且EGF和FGF通过SDS-PAGE分离在食用燕窝中出现，在1克食用燕窝粉(破碎的食用燕窝)中仅发现0.09832μg的EGF和38ng-835ng至261.88ng的EGF。基于商业EGF和FGF估计该量。应提取在SDS PAGE凝胶上分离的EGF和FGF，并进行LC-MS-MS分析以确认其化学结构并决定其浓度。
[0008] 所述现有技术还具有基于用不同MZ的MALDI-TOF-MS分析检测的化合物列表(质量是指碎片分子的离子电荷)，但是现有技术没有具体表明所发现的化合物是什么，并且也没有表明哪个MZ指的是唾液酸，并且EGF(上皮生长因子)和FGF(成纤维细胞生长因子)的两种生长因子糊精被添加到食用燕窝中以在冷冻干燥过程中稳定提取物。这可能会改变食用燕窝提取物的
颜色、
味道和质地。
发明内容
[0009] 鉴于上述问题，本发明是一种使用保留相当大量唾液酸的定制设备来提取燕窝提取物的方法。为了实现上述目的，根据本发明的用于提取燕窝的方法包括去除燕窝样品中的异物
羽毛和污垢的步骤，将不洁净的燕窝浸泡在双蒸水中
软化，用
镊子从软化的燕窝中去除异物，然后过滤所述燕窝以去除含有较小尺寸异物的水，清洁后的燕窝形成食用燕窝样品，其中清洁过的食用燕窝样品在30℃至50℃的烘箱中干燥3至6天，以去除清洁过的燕窝样品中存在的任何过多水分达到适当的干燥度和脆度；将干燥的燕窝样品
研磨成粉末状，避免样品变成凝胶，然后将粉末燕窝样品悬浮在0.2％(W/V)的蒸馏去离子水中，然后将悬浮的样品在4℃的冷蒸馏去离子水中洗脱，以确保燕窝样品的膨胀能
力达到最佳水平，燕窝和燕窝样品的最大膨胀能力将使样品暴露在硫酸中进行完全提取。
[0010] 在一个
实施例中，燕窝提取物的提取方法步骤还包括将洗脱的燕窝样品在定制的设备步骤中使用0.4M酸性硫酸在规定的最佳
温度80℃下煮沸4个小时，直到燕窝样品完全溶解并形成单一混合物。
[0011] 在一个实施例中，其中在提取方法步骤中将
沸腾的混合物步骤留下以待冷却并过滤去除任何不溶物。
[0012] 在一个实施例中，其中在提取方法步骤中使用氢
氧化钡粉末将所述过滤的混合物步骤调节至pH7.0，以形成上清液和沉淀的混合物。
[0013] 在一个实施例中，其中在提取方法中将粉末状的氢氧化钡加入到酸水解的燕窝提取物中以中和酸性硫酸、中和导致形成硫酸钡沉淀，通过离心分离去除所述硫酸钡沉淀的步骤，在本发明中使用氢氧化钡克服了食用燕窝提取物中酸性硫
酸溶液的问题，酸性硫酸的含量可以通过氢氧化钡完全去除，离心分离是更安全也更容易去除沉淀硫酸钡的方法。
[0014] 在一个实施例中，其中在提取方法中将混合物离心分离以从上清液中去除沉淀物。
[0015] 在一个实施例中，提取方法还包括冻干步骤并保持在-80℃，以产生燕窝提取物。
[0016] 如上所述，实施本发明的燕窝提取物的提取方法具有相当数量的唾液酸。本发明能够提取总共36种化合物，这些化合物可以分为5类；肽和
氨基酸；碳水化合物；脂质；维生素；和
次级代谢产物。
[0017] 发现的两种唾液酸是N-乙酰基-b-神经氨酸和2,7-脱水-α-N-乙酰神经氨酸。
附图说明
[0018] 图1是用于维持调节后最佳温度的定制加热设备。
[0019] 图2是被分为5个类别的36种主要化合物的提取的描述。
[0020] 图3是肽和氨基酸的化合物的描述。
[0021] 图4是碳水化合物的化合物的描述。
[0022] 图5是脂质的化合物的描述。
[0023] 图6是维生素的化合物的描述。
[0024] 图7是次级代谢产物的化合物的描述。
具体实施方式
[0025] 本发明涉及一种制备燕窝以从精华中提取酸的方法，包括原料和部署使用加
热处理方法以去除过量的水和0.2％(W/V)的蒸馏去离子水以提取样品，该样品随后用于提取酸和任何其他有用的组合物。
技术领域
[0026]
[0027] 雨燕科金丝燕是多种多样的
鸟类，它们分泌唾液或把唾液与羽毛混合以
凝结用于在马来西亚、印度尼西亚、越南等东南亚国家的悬崖和
建筑物上筑巢，其中燕窝通常在中医用来
治疗各种病症如痰哮喘、咯血、慢性痢疾、咳嗽、痰、慢性支气管炎、
肺结核、呕吐等。现代医学还利用燕窝促进免疫功能并延缓人衰老。
[0028] 燕窝含有一种叫做燕窝酸的活性物质，其也被称为唾液酸。从燕窝中提取的酸已显示出再生
铝诱导的退化人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)并促进人神经干
细胞增殖的能力。食用燕窝中存在的物质之一是唾液酸。唾液酸或N-乙酰神经氨酸(NeuAc)是氨基糖神经氨酸的乙酰基衍
生物。它存在于
哺乳动物和细菌中的许多糖蛋白、糖脂和多糖中。它是合成聚唾液酸(PSA)的重要前体。聚唾液酸是α-2,8连接的唾液酸的线性均聚物，其通常附着在哺乳动物脑中神经细胞粘附分子的细胞表面分子。在大脑发育期间，聚唾液
酸化神经细胞粘附分子调节参与突触发生、神经可塑性、髓鞘形成、神经元寻路、神经突增生、迁移和神经元干细胞增殖和分化的细胞-细胞粘附相互作用。
[0029] 在急性和慢性神经变性
疾病中，中枢神经系统不能启动内在的神经再生机制通常是由于神经干细胞群的减少和不允许微环境的存在，例如抑制再生过程的抑制分子。这种环境可以抑制病变部位的发芽轴突并使其转变成为肿胀的营养不良形态，其对中枢神经系统中的神经元细胞造成永久和不可逆的损伤。PSA是神经系统发育和突触可塑性的重要组成部分，其已经发展成具有潜在的神经再生作用。在受损的成人皮质脊髓束组织中存在PSA能够创造允许的条件来减缓瘢痕组织中存在的生长抑制分子(比如肝配蛋白或硫酸软骨素)的有害影响。此外，这种允许条件使神经前体、少突胶质细胞前体、嗅球中间神经元前体和施万细胞(SCs)能够快速大量迁移到神经元病变区域，并以区域适当的方式区分，以促进受损神经元细胞的架构改造和重建。
[0030] 本发明方法能够提取总共36种主要化合物，其分布在5个类别中(图2)，它们是肽和氨基酸(图3)、碳水化合物(图4)、脂质(图5)、维生素(图6)和次级代谢产物(图7)。这些包括13种小肽，其由2-3个氨基酸、5种碳水化合物、9种脂质、2种维生素和7种次级
代谢物组成。通过LCMS-Q-TOF检测这些化合物。图3-图7示出了在食用燕窝提取物中发现的代谢产物的鉴定化学结构的M/Z的对应性。基于LCMS-Q-TOF分析，检测到两种具有不同官能团的唾液酸(图4)。发现的两种唾液酸是N-乙酰基-b-神经氨酸和2,7-脱水-α-N-乙酰神经氨酸。通过LCMS-MS-Q-TOF分析鉴定和确认这两种唾液酸。通过LCMS三-Q-TOF分析来确定该提取物中存在的这两种唾液酸的量，并且确定的总量为EBN提取物的114.8毫克/升或1毫克的5.74％。
[0031] 食用燕窝提取物中两种不同的唾液酸和肽的存在可以证明这种食用燕窝再生铝诱导的退化人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)和促进人神经干细胞增殖的能力。
[0032] 鉴于上述益处，本发明的一个目的是提供一种使用定制设备提取酸提取物的燕窝提取方法，该设备具有提供调节温度(在80℃下控制煮沸4小时)来提取酸的能力。现在参照附图1通过示例的方式描述定制加热设备。定制加热设备(1)的主要功能是使用加热元件(4)将调节的最佳温度保持在60℃-80℃持续2小时-4小时。该装置的设计是提供这样一种条件：其中食用燕窝可以通过圆形金属(3)在封闭系统中煮沸，该圆形金属被紧固以固定
盖子和烧瓶以使温度能够被控制在最佳温度长达4个小时。
温度计(2)通过盖子(5)固定到定制设备上，盖子(5)用于指示通过4小时沸腾的最佳温度。
[0033] 为了从燕窝中提取酸，提取的步骤是必不可少的，并且要在恰当的条件下进行。
[0034] 步骤S1：清洁燕窝样品以去除任何异物，如羽毛和污垢。未清洁的食用燕窝浸泡在双蒸水中以软化燕窝。一旦食用燕窝变软，用镊子去除羽毛或污垢。然后过滤食用燕窝以除去含有较小污垢或特征的水。清洁过的生燕窝将形成食用的燕窝样品。
[0035] 步骤S2：清洁过的食用燕窝必须在30℃-50℃的烘箱中干燥3至6天，以清除在清洁过的样品中存在的任何过量水分。该步骤是为了实现适当的干燥和脆度水平，以使样品能够被研磨成粉末状并且避免样品变成凝胶。
[0036] 步骤S3：然后将细磨的燕窝样品(现在呈粉末状)悬浮在0.2％(W/V)的蒸馏去离子水中。与
自来水相比，蒸馏去离子水用于确保安全并且仅使用超纯水来提取样品。自来水可能含有可能影响提取过程和最终产物(精华)的未知物质。
[0037] 步骤S4：然后必须将悬浮的样品在4℃的冷蒸馏去离子水中洗脱。该步骤将确保食用燕窝样品的膨胀能力达到最佳水平。在这种条件下，样品只能溶解到最大溶胀能力并暴露在酸性硫酸中并允许完全提取。将洗脱过的燕窝样品用0.4M酸性硫酸在80℃下在定制设备中煮沸4小时，直到燕窝样品溶解并形成单一混合物。
[0038] 步骤S5：然后将沸腾的混合物留待冷却并过滤以除去任何不溶物质。样品将完全溶解而形成均匀的混合物。
[0039] 步骤S6：然后使用氢氧化钡粉末将过滤的产物调节至pH7.0，以形成上清液和沉淀的混合物。
[0040] 步骤S7：将粉末状的氢氧化钡添加到酸水解的食用燕窝提取物中以中和酸性硫酸，中和导致形成硫酸钡(不溶于水)沉淀。通过离心分离去除该沉淀物(硫酸钡)。在本发明中使用氢氧化钡克服了在食用燕窝提取物中含有酸性硫酸溶液的问题；酸性硫酸的含量可以通过氢氧化钡完全去除。此外，离心分离也是一种更容易和更安全的去除沉淀硫酸钡的方法。
[0041] 步骤S8：离心分离混合物以除去上清液中的沉淀。
[0042] 步骤S9：然后将上清液冻干并保持在-80℃。
[0043] 实验示例：使用上述提取方法获得的燕窝提取物具有以下特征：-
[0044] 实验示例：在上述燕窝和粉末提取实验示例中获得的燕窝提取物能够再生铝诱导的退化人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5S)，并在细胞样品中测试促进人神经干细胞增殖，初步结果表明从燕窝中提取的酸在神经干细胞增殖中增加14％，和在神经再生中再生51.85％。
[0045] 通过使用MTT试验来测试促进人神经干细胞增殖的能力。当分别用不同浓度(以0.0156mg/ml、0.0313mg/ml、0.0625mg/ml、0.125mg/ml和0.25mg/ml提取)的食用燕窝提取物处理时，酸提取的食用燕窝可提高细胞增殖率，其范围为2％、12％、14％、13％和3％。这表明在食用燕窝提取物中发现的由2-3个氨基酸和其他氨基酸组成的小肽可以作为神经干细胞生长的主要营养来源。
[0046] 通过使用MTT试验确定细胞活力和神经元树突的形态变化(在退化或再生的条件下)，和通过使用Hoechst和PI(碘化丙锭)
染色观察细胞凋亡形态的变化和核碎裂来确定再生铝诱导的退化的人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的能力。
[0047] 未经铝处理的SH-SY5Y细胞看起来健康并具有完整的细胞膜和独特的神经元形状并具有伸长的树突增生。用DNA结合
荧光染料Hoechst和PI染色细胞核仅产生少量明亮的荧光核，其表明核碎裂水平低，并且只有极少的死细胞。在2.5mM铝处理24小时后，观察到许多细胞形态变化，这包括
细胞质浓缩、质膜起伏或起泡、细胞膨胀或收缩、树突缩短或消失。细胞死亡是显而易见的，存的漂浮的、有光泽的和圆形细胞。Hoechst-PI荧光双染色显示明亮荧光核的数量显着增加，具有强烈的蓝色和红色点，其表明染色质浓缩以及核碎裂。在PI染色中观察到大量强烈的红点，这表明细胞处于其晚期凋亡或
坏死阶段。酸提取的食用燕窝提取物成功地诱导了细胞活力的显著增加，其中这表明在该提取物中发现的两种类型的唾液酸的能力可以再生由铝引起的受损细胞。用范围为0.0073mg/ml、0.0156mg/ml、0.0313mg/ml、0.0625mg/ml、0.125mg/ml和0.25mg/ml的不同浓度的食用燕窝处理铝诱导的退化SH-SY5Y细胞72小时。获得用食用燕窝处理的细胞存活率的百分比增量为3.70％、
11.11％、40.74％、51.85％、33.33％和5.55％。用0.0625mg/ml食用燕窝处理的细胞在
51.85％的细胞存活率上获得最高的增量。
[0048] 基于所做的研究观察，铝诱导的退化SH-SY5Y细胞显示出典型的凋亡形态，具有明显的细胞收缩和完整细胞膜损失，独特的神经元形状和树突，Hoechst和碘化丙啶荧光双重染色显示出明显的染色质浓缩和核碎裂，其示出了强烈的蓝点和红点。以最佳浓度为0.0625mg/ml的EBN提取物处理铝诱导的退化SH-SH5Y细胞时，观察到的最明显的变化是细胞凋亡形态的减少和健康细胞数量的增加。细胞通过树突再生和从完整细胞体突出来恢复其膜完整性。Hoechst/Pi双染色显示染色质浓缩和细胞核碎裂明显减少，其显示凋亡细胞和死细胞减少。。
