技术领域
[0001] 本
发明属于
微生物药物领域，具体涉及一种活性化合物BTH-II0204-207:B的制备方法与应用。
背景技术
[0002] 三联苯芳香
烃类化合物的结构中含有3个苯环，根据苯环连接的
位置不同分为邻/间/对三种异构体，此类化合物结构多变，活性显著。其中，对三联苯类化合物大多分离自
真菌，来自于链霉菌的约有10个化合物。此类化合物具有细胞毒、抗
氧化、抗菌、抗凝、神经保护、免疫抑制和脂氧合酶抑制等生物活性。本发明中BTH-II0204-207:B属于对三联苯类化合物，该化合物作为天然产物首次分离自一株单操纵子诱导表达的B.pseudomallei K96243(Biggins,J.B.；Liu,X.；Feng,Z.；et al.Metabolites from the induced expression of cryptic single operons found in the genome of Burkholderia pseudomallei.J.Am.Chem.Soc.2011,133,1638-1641.)。从结构上看，该化合物是首次从链霉菌中得到，在迄今已有的报道中，尚未涉及到与本发明相同的具有抑制
乳腺癌细胞MCF-7、人体肝癌体外细胞Bel7402和人
口腔表皮样癌细胞KB的作用。
发明内容
[0003] 本发明的首要目的在于提供一种来源于红树林链霉菌219807的对三联苯类化合物BTH-II0204-207:B的制备方法。
[0004] 本发明的另一目的在于提供对三联苯类化合物BTH-II0204-207:B在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0005] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0006] 本发明提供一种利用红树林链霉菌219807制备对三联苯类化合物BTH-II0204-207:B的方法，所述BTH-II0204-207:B的结构式见式Ⅰ，准分子离子峰m/z 293.1173(计算值[M+H]+293.1099)，分子式为C19H16O3，
[0007]
[0008]
[0009] 所述的化合物BTH-II0204-207:B是从红树林链霉菌219807的
发酵培养物中制备得到，所述的红树林链霉菌219807是来源于中国海南省三亚红树林
土壤，保藏编号为CCTCC NO.M2015276。
[0010] 优选地，具体包括如下步骤：
[0011] (1)将红树林链霉菌219807经固体培养基活化后接种于ISP2液体培养基中进行培养，培养条件为28℃、220r/min振荡培养3d，之后以10％的接种量接种到DO培养基中，在28℃、220r/min振荡条件下培养8d；DO培养基的配方为：
葡萄糖10g/L，糊精25g/L，燕麦粉20g/L，
棉籽饼粉10g/L，鱼粉5g/L，
酵母提取物2g/L，CaCO3 3g/L，pH值为6.0；
[0012] (2)将步骤(1)所得的发酵液利用离心的方法使得固液分离，菌丝体部分用丙
酮超声破壁三次，将合并的提取液减压浓缩至不含丙酮后，用乙酸乙酯进行萃取三次，浓缩得到菌丝体部分的粗提物；
[0013] (3)将步骤(2)获得的粗提物在正相
硅胶柱层析中以环己烷和丙酮为洗脱液进行梯度洗脱，比例依次为环己烷：丙酮＝9:1、7:1、5:1、3:1、7:3、3:2、1:1、2:3、1:3、1:5，每个梯度洗脱体积为1.5L，共获得十个洗脱组分，分别减压浓缩；
[0014] (4)将步骤(3)获得的洗脱比例为环己烷：丙酮＝7:1部分的浓缩浸膏再进行正相硅胶柱层析的分离，洗脱液为石油醚：乙酸乙酯＝9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、4:6、1:9，共获得七个洗脱组分，分别减压浓缩；
[0015] (5)将步骤(4)获得的洗脱比例为石油醚：乙酸乙酯＝8:2部分的浓缩浸膏经C18反相色谱柱进行高效液相(HPLC)的分离纯化，半制备条件为等度CH3CN:H2O＝65:35，流速3.0mL/min，在10.48min时得到BTH-II0204-207:B的
单体化合物。
[0016] 本发明的第二个目的是提供红树林链霉菌219807在制备对三联苯类化合物BTH-II0204-207:B中的应用。
[0017] 本发明采用MTT法测试了对三联苯类化合物BTH-II0204-207:B对乳腺癌细胞MCF-7、人体肝癌体外细胞Bel7402和人口腔表皮样癌细胞KB 50％抑制浓度(IC50)。实验结果显示BTH-II0204-207:B对所试验的肿瘤细胞具有非常显著的抗性，表明BTH-II0204-207:B可用作制备抗肿瘤药物。以所述化合物BTH-II0204-207:B作为活性成分，与药学上可接受的一种或多种载体、赋形剂或辅料配伍，可制成抗肿瘤的药物组合物。所述药物及药物组合物可用于肿瘤相关
疾病的
治疗。所述化合物也可与已知药物组成复方制剂用于肿瘤相关疾病的治疗。
[0018] 本发明的第三个目的是提供对三联苯类化合物BTH-II0204-207:B在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0019] 优选地，所述的抗肿瘤药物为抗乳腺癌、肝癌、口腔表皮样癌的药物。
[0020] 本发明的第四个目的是提供一种抗肿瘤的药物组合物，其中对三联苯类化合物BTH-II0204-207:B作为有效成分。
[0021] 优选地，上述药物组合物还包含药学上可接受的一种或多种载体、赋形剂或辅料配伍。
[0022] 本发明的第五个目的是提供上述抗肿瘤的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0023] 优选地，所述的抗肿瘤药物组合物为抗乳腺癌、肝癌、口腔表皮样癌的药物。
[0024] 本发明中经红树林链霉菌219807的发酵培养物中制备分离得到对三联苯类化合物BTH-II0204-207:B具有良好的抗肿瘤活性，可为新药研发提供化学实体。
附图说明
[0025] 图1是BTH-II0204-207:B的高分辨质谱图。
[0026] 图2是BTH-II0204-207:B的1H-NMR谱。
[0027] 图3是BTH-II0204-207:B的13C-NMR谱。
具体实施方式
[0028] 通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的
实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
[0029] 本
申请的对三联苯类化合物BTH-II0204-207:B从红树林链霉菌219807的发酵培养物中分离得到，该链霉菌的特性已在ZL201510260295.0中公开。
[0030] 【实施例1】化合物的分离及结构确认
[0031] (1)化合物分离
[0032] 将发酵处理后所得的菌丝体部分的粗提物采用干法上样，通过300～400目的硅胶中进行梯度洗脱，洗脱液为环己烷和丙酮，二者比例依次为9:1、7:1、5:1、3:1、7:3、3:2、1:1、2:3、1:3、1:5，每个梯度洗脱体积为1.5L，将各部分洗脱液减压浓缩，将7：1部分的浓缩浸膏在正相硅胶中以石油醚：乙酸乙酯＝9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、4:6、1:9，共获得七个洗脱组分，分别减压浓缩。再将8：2部分减压浓缩后的组分进行C18半制备液相分离纯化，半制备条件为等度CH3CN:H2O＝65:35，流速3.0mL/min，在10.48min时得到化合物BTH-II0204-207:B。
[0033] (2)结构确认
[0034] 通过MS和NMR，确定了BTH-II0204-207:B的结构。其中，化合物BTH-II0204-207:B的质谱图、1H-NMR谱和13C-NMR谱见附图1-3。
[0035] a)化合物BTH-II0204-207:B的结构鉴定
[0036] 该化合物为黄色粉末，HRESI-MS(+)得到准分子离子峰m/z 293.1173(计算值[M+H]+293.1099)，得到分子式为C19H16O3。1H-NMR谱中，低场区7.20～7.60ppm出现了10个较为重叠的耦合常数在7～8Hz之间的芳香质子，一个[δH 6.39(s)]的单峰
信号，以及一个甲氧基氢信号[δH 3.30(s)]，由此推测此化合物可能是存在不止一个苯环。在13C-NMR-DEPT谱(CD3OD)共显示出19个
碳信号，包括18个芳香碳信号，其中的4个次甲基碳信号非常显著，推测可能是有较为对称的结构使得信号重叠，此外还有一个甲氧基碳信号。这些信号表明，此化合物可能存在三个苯环，其中有两个处在对称位置，另一个为五取代，其中两个取代基为苯环，一个与甲氧基相连，余下两个取代很可能是羟基。通过查阅文献(Biggins,J.B.；Liu,X.；Feng,Z.；et al.Metabolites from the induced expression of cryptic single operons found in the genome of Burkholderia
pseudomallei.J.Am.Chem.Soc.2011,133,1638-1641.)，证实了以上推测，确定化合物为对三联苯类化合物BTH-II0204-207:B，这是首次从野生菌中得到此化合物，核磁数据见表1。
[0037] 表1化合物BTH-II0204-207:B的1H和13C-NMR数据(CD3OD,δin ppm)
[0038]
[0039]
[0040] BTH-II0204-207:B的理化性质与波谱数据如下：
[0041] 黄色粉末；
[0042] 分子式：C19H16O3；
[0043] 分子量：292.11；
[0044] HRESI-MS(m/z)：293.1173(计算值[M+H]+293.1099)；
[0045] 最大紫外吸收为217、264nm；
[0046] 1H和13C-NMR数据(500和125MHz，CD3OD)见表1。
[0047] 【实施例2】BTH-II0204-207:B抗肿瘤活性试验
[0048] 1、
试剂来源：RPMI1640培养基购自美国Hyclone公司，胎
牛血清购自美国Gibco公司，胰酶消化液购自美国Gibco公司，MTT购自Biosharp公司。
[0049] 2、细胞株：乳腺癌细胞MCF-7、人体肝癌体外细胞Bel7402和人口腔表皮样癌细胞KB。
[0050] 3、活性评价试验方法参考文献Mosmann,T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays.J.Immunol.Methods.1983,65(1-2),55-63.优化步骤后进行，具体步骤如下：
[0051] (1)样品配制：精密称取BTH-II0204-207:B 1mg，加入适量的DMSO将样品溶解成20mg/mL的储备液。取上述储备液26μL，加入104μL无菌培养基，稀释后得到样品测试母液(4mg/mL)。继续采用无菌培养基进行梯度稀释，分别稀释得到浓度为400、40、4、0.4、0.04μg/mL的样品液作为备用。
[0052] (2)配置细胞悬液：弃去细胞培养基后用PBS清洗两次，用0.25％胰酶消化适当时间，之后加入等量的培养基终止消化，吹打溶液成悬液状，800rpm离心5min，弃去上清，将细胞用1mL培养基吹打均匀，稀释适当倍数进行计数，调整其浓度至3～4×104/mL。
[0053] (3)检测方法：将制备好的细胞悬液再次吹打混匀后加至加样槽中，用排枪吸取190uL/孔细胞悬液至96孔板，得到待测细胞的
密度为6000～8000/孔(边缘孔用无菌PBS填充)。震荡96孔板使孔内细胞均匀分布，之后
培养箱中贴壁24h。将待测样品用培养基稀释成适当浓度取10μL加入接种了细胞的96孔板中，使样品终浓度为200、20、2、0.2、0.02、0.002μg/mL(每个样品做3个平行复孔)，阴性对照组为不加药的DMEM培养基。5％CO2，37℃孵育72小时，倒置
显微镜下观察药物的作用效果。用PBS配置浓度为5mg/mL的MTT溶液，0.22μm滤
膜过滤后每孔加入20μL，继续培养。4h后终止培养，将上清去掉，每孔加入100μL的DMSO，置于摇床上低速振荡10min，待结晶物充分溶解后用酶标仪在550nm处测量各孔的吸光度，参比
波长设置为690nm。
[0054] 结果计算：根据公式细胞存活率(％)＝[(化合物处理组–空白组)/(阴性对照组–空白组)]×100％计算细胞生长存活率，最后计算出IC50值。
[0055] 4、实验结果
[0056] 化合物BTH-II0204-207:B对MCF-7、Bel7402和KB细胞的IC50值见表2。实验结果表明，BTH-II0204-207:B对所试验的肿瘤细胞具有显著的抗肿瘤活性，尤其是对MCF-7和KB细胞，抑制活性的IC50值达到了纳克级别。BTH-II0204-207:B可用作制备抗肿瘤药物，或以其为活性成分，与药学上可接受的一种或多种载体、赋形剂或辅料配伍，制成抗肿瘤的药物组合物。
[0057] 表2.BTH-II0204-207:B对MCF-7、Bel7402和KB细胞的抑制活性
[0058]
