후라보노이드(Flavonoid)화합물로 된 암화학예방요법제

본 발명은 후라보노이드 화합물의 암화학예방요법제로서의 새로운 용도에 관한 것이다.

일반적으로 암발생과정은 많은 시간을 필요로 하며 전암상 태로의 변화에서도 수년간 지속된다. 실제로 사람 몸에는 전암세포상태가 많다.

혀와 구강점막세포가 계속적인 기계적자극을 받아 생기는 백반증(leukoplakia), B형 간염바이러스감염과 과도한 알콜섭취로 인한 간경변, 재발성위염으로 인한 위점막의 손상상태 등이 그 예이다. 그러므로 암예방을 위해서는 환경성 돌연변이 및 발암성 물질의 노출을 피하는 한편, 각종 항돌연변이원성물질과 암예방물질들의 섭취를 늘리는 것이 중요하다. 따라서, 이러한 목적의 암 화학예방요법제의 개발이 절실하게 필요한 실정이다.

그런데 최근에 이르기까지 시스플라틴(cisplation)유도체와 같은 암화학치료요법제(cancer chemotherapeuticament)개발에 많은 노력이 경주되고 있지만 이상적인 항암제의 출현은 아직도 요원한 실정이다.

따라서 본 발명자등은 녹황색 채소나 과일을 많이 섭취하는 사람에게서 암발생율이 적다는 사실에 착안하여 식물류에 널리 분포하고 있는 다음식(1)로 표시되는 구조를 갖는 후라보노이드 유도체들이 중시되고 있고, 이를 대상으로 암화학예방요법제로서의 효과에 대하여 규명하였든 바, 그 예방효과가 우수함을 알게 되었다.

이러한 효과의 시험방법으로 종래의 발암시험은 BN Ames가 개발한 살모넬라균을 이용한 돌연변이 검출시험은 동물시험에서 발암성이 증명된 물질의 85∼90%가 동시에 살모넬라균의 변이원성을 나타내었고, 반대로 동물에서 발암성이 인정된 물질의 85%가 동시에 변이원성이 인정된 사실로부터 신뢰성, 재현성, 경제성, 간편성 때문에 널리 이용되었다.

그러나 Ames시험은 시험관내(in vitro)에서 박테리아를 이용하고 있는 유전자수준의 돌연변이 검출방법이기 때문에 최근에는 포유류 동물세포를 이용하여 염색체수준의 변이원성시험인 배양세포의 염색체이상시험과 자매염색분체시험 및 생체내(invivo)에서의 마우스 골수소핵시험 등을 시행하여 효과를 평가하는 방법을 실시하고 있다.

본 발명에서도 위에서와 같은 방법으로 실시하여 본 발명에 다음식(1)로 표시되는 후라보노이드화합물이 암화학예방요법제임을 규명하였다.

후라보노이드 화합물은 주로 배당체의 형태로 식물계에 널리 분포되어 있으며 이중 가장 흔하고 생리활성이 큰 화합물은 퀘르쌔틴(quercetin)과 그 배당체들로서 이 퀘르세틴은 실험동물을 이용한 일반적 시험방법인 두단계 피부암 시험에서도 암의 개시작용이나 촉진작용을 보이지 않았으며 방광이나 간에서도 발암촉진작용을 하지 않았다.

이 후라보노이드화합물들의 화학구조는

* 구조식위치번호애 대입될 수 있는 화합물질은 다음과 같다.

이다.

또한 가란진(galangina)을 비롯한 후라보노이들은 발암물질의 유전독성을 억제할 수 있는 강력한 염색체손상억제물질(amticlastogen)으로서 암화확 예방 요법체로서의 작용이 매우 큰 물질로 밝혀졌다.

이하 실시예에서 본 발명에 따른 후라보노이드 화합물들의 암화학예방요법제로서의 효과를 상세히 설명한다.

[실시예 1]

본 연구에서는 먼저 후라보노이드를 대상으로 2차 발암물질로서 잘 알려져 있는 벤조에이피렌(benzo(a)pyrene, B(a)P)에 대한 소핵생성억제효과를 관찰하였다.

실험방법은 벤조에이피렌을 마우스 (6-8주 ICR, C57B L/6J 및 C3H mice(♂,20∼25g)등을 공급받아 사용)에 복강내 투여하였고 소핵생성억제효과를 관찰하기 위해서는 후라보노이드를 발암물질 투여후 즉시 경구투여 한 후 발암물질을 투여하였다. 일정시간 후에 마우스를 경추탈구하여 희생시킨 후 골수세포 현탁액을 1000rpm으로 5분간 원심분리한 후 상등액을 버린 뒤 소량의 FBS로 세포를 현탁시키고, 세포현탁액 소량을 파스퇴르 피펫(pasteur pipette)으로 취하여 미리 세척하여 건조시킨 슬라이드 상에 도말유리(cover glass)를 이용하여 도말한다. 제작된 슬라이드를 24시간 풍건 후 건조된 슬라이드를 메탄올로 10분간 고정한 뒤, pH 6.8의 소렌센 완충액(Sorensen buffer)에 5% 젬사(Gemsa) 염색시약으로 30분간 염색한 다음 증류수로 수회 세척하여 건조한 후 현미경으로 관찰(x1000)하였다. 마우스당 1000개의 PCE를 관찰하여 그중 MNPCE의 빈도를 구하여 %로 표시하였다.

이와 같은 소핵시험을 이용한 유전독성 억제실험결과 큰 생리활성을 보이는 후라보노이드는 표 1에서 보듯이 2,3 이중결합과 3,5, 7-트리하이드록실(3, 5, 7-trihydroxyl)기를 갖는 폴리 하이드록시후라보놀(polyhydroxyflavonol)화합물이었다.

또한 B(a)P-DNA 결합에 미치는 가란진(galangin)의 영향을 알기 위하여 송아지 흉선 DNA(calfthtymusDNA)에 [ ₃ H] - Bap 및 횐쥐 간마이크로솜의 팩터(rat liver microsomal factor) 및 인산완충액(pH 7.5) 및 염화마그네슘, 이소시트레이트와 이소시트레이트 디하이드로겐나제 및 검체를 여러농도 단계로 넣고 NADPH를 가해 반웅을 개시한 다음 37℃에서 1시간후 DNA를 95%에탄올로 추출하고 세척한 다음 방사능(radioactivity)을 액체방사능 측정장치(liguid scintillation counter)로 측정하였다.

상기 실험 결과 유전독성억제효과는 표 2에 나타나듯이 가란진(galangin)과 같은 후라보노이드 투여시 B(a)P 대사활성화가 감소되고 활성본태산물들의 DNA 결합(DNA binding)을 저해함으로서 나타났다.

* p0.01, 분산분석(Analysis of Variance)

*p0.05, ** p0.01 스튜던트 t-테스트(Student's t-test)

[실시예 2]

실시예 1에서와 같은 소핵 실험방법으로 실시한 결과 표 3에서 나타나듯이 가란진 (galangin)을 비롯한 후라보노이드화합물들은 대사활성화가 필요없는 1차 발암물질인 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-Nitroso Guam-dine MNNG)에 의한 소핵생성도 감소시키는 효과를 가진 것으로 나타났다. 이러한 알킬화제(alkylating agent)에 대한 유전독성 억제효과는 다음과 같은 송아지 흉선 DNA(calfthymus DNA)를 이용한 실험에서 DNA의 메칠화를 저해하는 기전 때문에 나타나는 것으로 판단된다. (표4 참조)

이 실험방법은 송아지흉선 DNA(Calf thymus DNA)100ug/100u1, Tris-HCI(pH 7.4)100u1, 에탄올 100u1에 MNNG 2.5x10-2M이 되게 한 후 후라보노이드를 농도별로 가하여 24시간 배양한 다음 에탄올로 DNA를 침전시키어 DNA를 마이크로 튜브(microtube)로 옮겨 질소가스로 DNA 펠렛(DNA pellet)을 만든다음 50mMEDTA/0.1M NaCL에 서서히 용해시켜 그 중 일부를 DNA로 정량하였다. 나머지 DNA용액은 0.1 MHCL 70℃에서 1시간동안 가수분해한 다음 NaOH로 중화하여 원심분리(5000 rpm. 10min)한다음 상등액을 얻어 -4℃에서 보관하면서 HPLC로 분석하였다. HPLC컬럼은 시마쯔 C-18(SHimazu C-18)을 사용하였으며, 이동상(mobilephase)은 5% 메탄올을 함유한 500mM 시트레이트 완충액(pH 3.8)을 사용하였다. 검액을 10ul 주입하여 나온 7-메틸구아닌 피크를 고도(height)산정법으로 정량하였다.

*p0.01, 분산분석(Analysis of Variance)

* p0.01, 분산분석(Analysis of Variance)

[실시예 3]

방사선과 유사한 효과를 나타내는 브레오마이신(Bleonycin)과 MNNG에 유도된 염색체 이상에 대한 가란진을 비롯한 후라보노이드 화합물들의 효과를 다음과 같은 방법으로 실험하였다.

즉, 후라보노이드가 용량별로 투여된 마우스에서 무균적으로 지라(spleen)을 적출하여 RPMI시 1640용액으로 2회 세척후 지라 임파구(spleen Iymphocyte)를 분리하여 뉴바우어 헤모사이토 메터(Neubauer haemocyto meter)로 세포수를 세어 세포현탁액 1ml당 20×10 ⁶ 개 세포가 되도록 조절하여 배양튜브당 10×10 ⁶ 개 세포를 가하였다. 배양은 42시간 하였으며 콘카나발린A(concanavalin-A)로 개시시키고난 후 5% CO2-배양기에서 배양하면서 17-18시간애 Brdu를 가하고 24시간 지난다음 방사선작용을 가지고 있는 브레오마이신(breomycin)을 가하고 수거 2시간전 최종농도가 0.4μg/mg가 되도록 가하였다.

72시간 배양후 0.07M KCL용액으로 저장(hypotonic)처리를 하고 카노이 고장기(Carnoy's fixative)로 고정한 후 원심분리하여 소량의 고정기(fixative)에 현탁시킨 세포(cell)현탁액을 냉습슬라이드(chilled wet slide)에 떨어뜨린 후 건조한다.

건조한 슬라이드를 획스트 33258(6.25μg/ml)액으로 30분간 염색후 매클베인 완충액(Macllvain's buffer, 0.25M Na ₂ HP0 ₄ : 0.1M 시트르산=36:1)에 담구어 57℃로 가열하고 흑광(black light)를 30분간 폭로시킨후 10% 젬사 스테인(Giemsa stain)으로 5분간 염색한다.

관찰은 현미경하(x1000)에 1차중기(first metaphase)를 관찰하여 염색체이상을 분석하였다. 염색체이상은 염색체형(chromosome type)과 염색분체형(chormatid type)으로 구분하여 기록하였다.

이러한 실험결과 표 5에서 보듯이 후라보노이드는 브레오마이신과 MNNG에 유도된 염색체이상에도 억제효과를 나타내었다.

브레오마이신(bleomycin)에의해 야기되는 방사선양작용(radiomimetic action)은 DNA가 닥파손(DNA sarand break), 지질과산화(lipid peroxidarion)등의 독성은 자유기(free radical)생성을 통해서 일어난다. 따라서 브레오마이신(bleomycin)에 대한 가란진(galangin)같은 후라보노이드의 유전독성억제효과는 방사선양작용(radiomimetic action)에 의해 생성되는 자유기의 소거작용기전((roe radical scavenging mechanism)에 의해 일어난다고 판단된다.

[실시예 4]

실시예 1에서와 같은 소핵실험방법으로 발암물질로 B(a)P대신 마이토신(mytosin)을 사용하여 실시한 결과 가란진(galangin)과 같은 후라보노이드는 DNA교차연결제 (DNA cross-linking agent)인 마이토마이신(mitomycin)에 의한 소핵생성에도 억제효과를 나타내었다.

특히, 동시투여시(simultaneous treatment)나 사후투여(post-treatment)시보다 사전투여(pre-treatment)시에 저용량에서도 소핵생성억제효과가 컸다. 따라서 표6에 나타난 바와 같이 가란진(galangin)과 같은 후라보노이들은 저용량사전투여에 의해서 암예방효과를 나타내었다.

* p0.01 분산분석(Analysis of Variance)

[실시예 5]

한편 가란진(galangin)과 같은 후라보노이드의 B(a)P에 의해 유도된 자매염색 분체교환에 대한 억제효과를 알기위해 자매염색 분체교환시험을 실시하였다. 즉 성인남성의 혈액을 체취하여 전혈배양(whole blood culture)을 실시하였다. 양성 대조물질로는 B(a)P를 사용하였으며 후라보노이를 여러 농도로 동시처리하였다.

S-9 mix를 각 실험 튜브 당 200㎕씩 가하였다. 실험은 전혈(whole blood) 0.5ml를 혈청(serum)이 없는 배지에서 S-9 mix존재하 1시간동안 처리한 후 RPMI 배지로 세척하고 15% FBS, 1%글루타민, 1%소디움 헤파린, 1% 팬-스트랩, 2% PHA 조성의 RPMI배지에 가하여 37℃에 72시간 배양하였다. 5-브로모-2 -데옥시우리딘은 PHA 개시 6시간에 20μM이 되도록 가하였고 콜세이드(colcemid)는 수거 2시간전 최종농도가 0.4μg/ml가 되도록 가하였다. 72시간 배양후 0.075M KCL 용액으로 저장(hypotonic) 처리를 하고 카노이 픽사티브(carnoy's fixative)로 고정한 후 원심분리하여 소량의 픽사티브(fixative)에 현탁시킨 세포 현탁액을 냉습슬라이드(chilled wet slide)에 떨어뜨린 후 건조한다.

건조한 슬라이드 획스트 33258(6.2μg/ml)액으로 30분간 염색후 매클베인 완충핵(Macllvain's buffer, 0.25MNa2HP04 :0.IM 시트르산=36:1)에 담가 57℃로 가열하고 흑광(black light)를 30분간 폭로시킨후 10% 젬사 스테인(Gemsa stain)로 5분간 염색하였다. 관찰은 분산이 잘된 2차중기(second metaphase) 25개를 선택하여 현미경으로 관찰하였다.

이러한 시험결과 후라보노이드는 B(a)P에 의해 유도된 자매 염색분체교환에 대해서 표 7에 나타나듯이 농도의존적인 억제 효과를 나타내었다.

* p0.05, ** p0.0l 스튜던트 t-테스트(Student's t-test)

이상을 종합하면 가란진(galangin)을 비롯한 후라보노이드화합물들은 벤조에이피렌(bengo(a)pyrene)과 같은 2차 발암물질에 대한 소핵생성억제효과가 컸으며, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(N-methyl-N'-nitro-N-nitroso guanidine)와 같은 1차 발암물질에 대해서도 소핵생성억제효과가 컸다. 또한 방사선양작용(radiomimetic action)을 나타내는 브레오마디릭(breomycin)에 의한 염색체이상에 대해서도 강력한 억제효과를 나타내었다. 한편 가란진(galangin)과 같은 후라보노이드들은 벤조에이피렌(benzo(a)pyrene)에 의한 자매염객분체교환현상도 억제시켰다.

이러한 유전독성 억제작용기전은 MNHG와 같은 알킬화제(alkylating agent)에 대하여 가란진(galangin)을 비롯한 후라보노이들이 1차발암물질에 대해서는 DNA메틸화(DNA methylation)의 저해, B(a)P와 같은 2차 발암물질에 대해서는 대사활성화의 저해와 활성본태산물들의 DNA결합(DHA binding)저해에 기인하는 것으로 나타났다.

따라서 가란진(galangin)을 비롯한 후라보노이드화합물들은 여러가지 유형의 발암물질(1차, 2차 발암물질 및 방사선등)의 유전독성을 억제할 수 있는 강력한 염색체손상억제물질(antic-lastogen)로서암화학예방요법제(cancer chemproventive agent)로서의 작용이 매우 큰 물질로 밝혀졌다.