技术领域
[0001] 本
发明属于丝状真菌载体构建方法，具体涉及一种快速构建丝状真菌表达载体的方法。
背景技术
[0002] 丝状真菌作为细胞工厂广泛应用于多种产品的生产，也成为真菌来源酶与非真菌来源酶生产中不可缺少的表达宿主。除此之外，丝状真菌自身能够产生丰富的
次级代谢产物，并成为具有临床意义的药物开发的宝库。特别地，内生丝状真菌由于能与
植物互惠共生，可促进植物生长、增产、抗病等功能，越来越受到重视。丝状真菌在实际应用中的优势主要体现在：1)丝状真菌生长能
力强，能在简单、便宜的培养基中生长，在表达和分泌蛋白方面，也具有明显的优势，能够表达多种具有商业开发价值的蛋白，因此长期得到人们的关注，如：黑曲霉和米曲霉被美国食品和药品管理局认为安全性达到GRAS级；2)除发现有少数自主复制质粒的转化外，丝状真菌一般是整合转化，筛选的重组子稳定，有利于遗传育种[Fabrizio Alberti,et al.,Appl Microbiol Biotechnol.2017,101(2):493–500]；3)翻译后蛋白的修饰和折叠更接近高等真核
生物，一些在细菌和
酵母中不能表达的蛋白可以在丝状真菌中表达；4)可用于研究内生真菌与植物的相互作用机制；5)可用于丝状真菌次级代谢产物的调控
水平研究。随着1979年Case等人首次在粗糙脉孢霉中建立了DNA转化系统，人们开始致力于丝状真菌在基因表达上的研究[Case ME,et al.,PNAS，1979，76(10):5259-5263]。然而，丝状真菌表达载体的构建方法主要采取的是限制性内切酶消化，融合PCR、连接酶连接等技术。本实验室在研究中多次发现现有
试剂盒不适合多
片段或较长途径的载体构建，非特异性融合片段多，错误率较高、成本较高，载体构建正确率低下。因此，快速高效构建丝状真菌表达载体的方法技术显得尤为重要。本研究基于酵母高效的同源重组原理，仅仅利用PCR技术及电转化即可完成载体的快速构建，再采用丝状真菌原生质体转化技术即可获得目标基因的高表达。其优点在于：快速、准确性高、无需使用限制性内切酶、可用于多片段和长片段载体的构建或替换，弥补了现有丝状真菌载体构建限制性内切酶选择难及不适用于多片段或长片段的
缺陷。
发明内容
[0003] 针对现有问题的不足，本发明的目的是提供一种快速构建丝状真菌表达载体的方法。
[0004] 本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
[0005] 一种快速构建丝状真菌表达载体的方法，基于
酿酒酵母同源重组机制及不同微
生物质粒复制特点，将细菌质粒复
制模块、酵母质粒复制模块、丝状真菌复制模块及表达模块共转化入酵母细胞，使其组装成一个完整的丝状真菌表达载体，将质粒提取后转化丝状真菌，检测目标基因或产物的表达情况。
[0006] 作为本
申请的优选技术方案，所述细菌质粒复制模块包括细菌的自主复制元件Ori及其筛选标记
氨苄(Amp)；所述酵母质粒复制模块包括酵母的自主复制序列2μOri及营养缺陷型筛选标记URA3；所述丝状真菌复制模块包括丝状真菌Ori及筛选标记，所述删选标记为潮霉素或苯菌灵。
[0007] 作为本申请的优选技术方案，所述表达模块含有强启动子序列、目标基因、终止子；表达模块为一个或多个。
[0008] 本发明的细菌质粒复制模块、酵母质粒复制模块和丝状真菌复制模块可从已有质粒或者基因组上通过PCR扩增获得，如细菌辅助模块和酵母辅助模块可以pCRCT质粒为模板进行扩增获得，细菌模块和丝状真菌模块可以pCT74质粒为模板扩增获得，且各片段间具有首尾相连接的同源臂约20-50bp，可组装成一个完整的质粒。
[0009] 作为本申请的优选技术方案，将PCR扩增所得的细菌质粒复制模块、酵母质粒复制模块和丝状真菌复制模块各100-300ng加入至酵母的感受态中轻轻混匀后，将其
混合液小心转至电转杯中电转；结束后加入1mL新鲜的YPD培养基，30℃250rpm孵育1h，之后将酵母细胞涂布于筛选平板上，30℃培养2-3天。
[0010] 作为本申请的优选技术方案，还包括，将组装正确的质粒从酵母中提取后，转化入大肠杆菌进行富集，随后从大肠杆菌中提取质粒，进行酶切或测序验证。
[0011] 作为本申请的优选技术方案，质粒丝状真菌的转化实验通过PEG介导的原生质粒转化。
[0012] 作为本申请的优选技术方案，所述细菌为大肠杆菌，大肠杆菌所用培养基为普通的LB培养基(LB培养基/升：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g
氯化钠，固体培养基需加20g琼脂,121℃,高压
蒸汽灭菌30min)；酵母菌所用培养基为SC-URA培养基(SC-URA培养基/600mL：1g YNB，3g
硫酸铵，0.414g CMS-URA，550mL蒸馏水，115℃高压蒸汽30min，待冷却后加入50mL过滤除菌的24％
葡萄糖溶液)；丝状真菌所用培养基为PDA培养基，可添加真菌类抗生素，用于抗性筛选。
[0013] 本发明中各片段共转化酵母所使用的方法为电转化技术，所构建的载体转化丝状真菌采用的方法为原生质体转化技术。
[0014] 本发明所使用的方法同样适用于其他类型载体的构建，仅需具备各菌相应的复制辅助模块即可。
[0015] 本发明基于酿酒酵母高效的同源重组机制所发明的丝状真菌表达载体构建方法，可用于非模式丝状真菌自身启动子强弱的快速鉴定、关键酶基因表达、次级代谢产物生物合成、
内生菌与植物的相互作用研究等，但不限于此，而且该载体不仅限于拟茎点霉，也可为其他模式及非模式真菌基因表达研究使用。
[0016] 有益效果
[0017] 本发明提供的快速构建丝状真菌表达载体的方法，与
现有技术相比，具有以下有益效果：本方法快速、准确性高、无需使用限制性内切酶、可用于多片段和长片段载体的构建或替换，弥补了现有丝状真菌载体构建过程中限制性内切酶选择难及不适用于多片段或长片段的缺陷。
附图说明
[0018] 图1为丝状真菌载体构建原理；
[0019] 图2为组装质粒的构建谱图及酶切验证，其中，2A为构建谱图，2B为酶切验证结果；
[0020] 图3为
荧光检测丝状真菌表达载体中mCherry基因的表达情况，其中3A为DIC通道，3B为DsRed荧光通道。
具体实施方式
[0021] 以下结合
实施例对本发明做进一步详细说明。所用试剂或者仪器设备未注明生产厂商的，均视为可以通过市场购买的常规产品。本发明涉及到的
微生物是酿酒酵母(BY4741)、大肠杆菌(DH5α)、丝状真菌拟茎点霉(Phomopsis liquidambari)，但丝状真菌不限于拟茎点霉，可为其他模式及非模式真菌。
[0022] 实施例1：大肠杆菌复制模块、酵母复制模块及丝状真菌复制模块的获取[0023] 所用培养基为：LB培养基(1L)：10g蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，固体培养基需加20g琼脂。
[0024] 采用限制性内切酶SalI
水解质粒pCT74，获得丝状真菌表达载体的骨架结构，该骨架结构含有大肠杆菌复制模块(复制起始点Ori及Amp抗性筛选标记基因)和丝状真菌复制模块(潮霉素抗性基因及复制起始元件)，且被SalI限制性内切酶切掉的HygR部分以pCT74为模板进行克隆。酵母质粒复制模块中酵母的自主复制序列2μOri及营养缺陷型筛选标记URA3的克隆均以pCRCT质粒为模板进行扩增，启动子、目标基因、终止子序列以pCT74为模板进行PCR扩增，所用引物序列如表3所示，且所组装片段首尾含有20-50bp的同源臂，如图1所示。酶切法获得骨架片段的反应体系如表1，酵母模块的PCR扩增体系如表2。
[0025] 表1获取骨架片段酶切反应体系
[0026]
[0027] 表2 PCR反应体系
[0028]
[0029] 表3载体构建过程中所用引物
[0030]
[0031] 实施例2：各片段共转化酵母
[0032] 所用培养基为：SC-URA培养基(600mL)：1g YNB，3g硫酸铵，0.414g CMS-URA，550mL单蒸水，高压蒸汽灭菌(115℃，30min)；加入50mL 24％的葡萄糖溶液(过滤除菌)。
[0033] YPD培养基(1L)：10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g葡萄糖，固体培养基需加20g琼脂。
[0034] 酵母感受态细胞的制作：(1)挑取酵母单克隆于2mL YPD培养基中，30℃250rpm过夜培养。(2)测定菌液OD600nm，吸取部分菌液至新鲜的YPD培养基中(使溶液OD600nm＝0.2)继续培养4-5h后细胞OD600nm达0.8，4℃4000rpm离心5min，去上清。(3)用5mL冷的无菌水重悬洗涤细胞，4℃4000rpm离心10min，去上清。(4)加入1mL冷的无菌水重悬细胞，4℃4000rpm离心10min，去上清。(5)加入1mL冷的1M山梨醇，洗涤细胞，4℃7000rpm离心30s。(6)去上清，并用
300μL冷冻的山梨醇重悬细胞，分装(50μL一管)。
[0035] 酵母电转：(1)将线性化pCT74载体骨架、细菌质粒复制模块、酵母质粒复制模块和丝状真菌复制模块(各100ng)与50μL的酵母感受态细胞混匀进行电转(1.5KV,5-6ms)后，立即加入1mL YPD，30℃250rpm，孵育1h。(2)7000rpm离心30S，去除YPD培养基，并加入1mL 1M山梨醇(室温)洗涤细胞2-3次，最终用100μL菌液涂板(SC-URA)，30℃培养2-3天。
[0036] 实施例3：酵母组装质粒的提取与富集
[0037] 所用试剂为：酵母破壁缓冲液：2％Triton X-100，1％SDS，100mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)，1mmol/L Na2EDTA。
[0038] TE缓冲液：10mmol/L Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH 8.0。
[0039] 酵母转化子质粒的提取：(1)随机挑选10个SC-URA平板上的单克隆，每个单克隆接入10mL的SC-URA液体培养基中，30℃过夜培养(500μL的菌液+500μL 50％的甘油，冻于-80°
冰箱保种)。(2)将剩余的酵母菌液13000rpm离心1min，弃上清后加入1.2mL酵母破壁缓冲液悬浮酵母菌。(3)将悬浮液分装到盛有玻璃珠的1.5mL EP管中(每管大约0.3g)，每管200μL，涡旋振荡5min后，经过反复地液氮速冻、95℃沸水浴菌体各1min(约3～5次)，裂解菌体。(4)12000rpm离心2min后，将上清液转移至新的EP管中，加入0.1倍体积的3mol/L的
醋酸钠溶液，吹打混匀；再加入大于2倍体积的无水
乙醇混吹打混匀后，置于-80℃冰箱30min。(5)
13000rpm离心5min，弃上清液，用70％的无水乙醇洗涤沉淀两次，吹干沉淀，用25μL TE缓冲液溶解质粒，并加入0.5μL 10mg/mL的RNaseA，37℃温浴30min后，-20℃保存。
[0040] 质粒富集：(1)将提取的酵母质粒通过化学转化的方法转入大肠杆菌中。(2)37℃过夜培养。(3)挑取单克隆接入含筛选标记的LB培养基中，37℃摇床培养12h。(4)提取大肠杆菌质粒。
[0041] 实施例4：酵母组装质粒的正确性验证
[0042] 采用BamHI与SalI限制性内切酶酶切法验证，验证目标片段是否正确组装成正确的载体，酶切体系如表4所示，构建载体及酶切结果如附图2所示。酶切结果如图2B所示，pCT74空载质粒对照组，pCU01为所组装载体，pCT74质粒被切成4条片段，大小分别为：403bp、1003bp、1427bp、2900bp；pCU01质粒被切成2条片段，大小分别为：1056bp、6995bp，与预期片段相符。再采用测序法验证序列的正确性，由测序结果可知，序列正确，质粒成功组装完成。
[0043] 表4酶切验证体系
[0044]
[0045] 实施例5：丝状真菌表达载体的原生质体转化
[0046] 所用试剂为：STC：54.651g山梨醇，12.5mL 1M CaCl2，2.5mL 1M Tris-HCl定容至250mL。
[0047] PTC：100g PEG-4000，12.5mL 1M CaCl2，2.5mL 1M Tris-HCl，定容至250mL。
[0048] 丝状真菌表达载体的原生质体制备：(1)分别称取0.02g溶菌酶、
纤维素酶置于无菌三
角瓶中，加入10mL 0.8M氯化钠溶液(灭菌)使酶溶解，并用0.22μm
过滤器过滤除菌。(2)过滤丝状真菌拟茎点霉菌丝，并用0.6M
硫酸镁溶液(灭菌)清洗两次后置于酶解液中。(4)将酶解溶液置于28℃80rpm摇床，酶解12-13h。
[0049] 丝状真菌表达载体的原生质体转化：(1)将酶解液转到10mL离心管中，3000rpm离心10min后，镜检上清中是否包含原生质体。(2)弃上清，向菌体中加入3mL STC，轻轻混匀后分装至2个2mL的离心管中，5000rpm离心10min。(3)小心吸取上层原生质体置于新的离心管中，加入适量的STC溶液重悬菌体，调节菌体浓度为1×107-1×108。(4)向2个1.5mL新的离心管中分别加入20μL PTC，分别标记实验组与对照组(对照组不加质粒)。(5)在上述实验组离心管中加入3-5μg质粒及80μL感受态，轻轻混匀后冰浴30min，对照组只加入感受态细胞。(6)向上述混合液中加入900μL的PTC，混匀后加入至10mL离心管中室温(20℃)放置20min。
(7)向10mL离心管中各加入20μL潮霉素及10mL上层培养基，颠倒混匀后倒平板。(8)28℃培养2-3天。
[0050] 实施例6：报告基因红色荧光蛋白在丝状真菌中的表达
[0051] 采用荧光
显微镜(仪器型号AXio Imager A1，Zeiss)分析报告基因红色荧光蛋白在丝状真菌中的表达观察，荧光检测丝状真菌表达载体中mCherry基因的表达情况，如图3所示。结果表明，在酵母中构建成功的载体，可成功在丝状真菌中表达荧光蛋白。
[0052] 本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的
权利要求为保护范围。
