使用游离酶和过表达酶的微生物促进植物健康的方法
阅读：657发布：2020-05-14
专利汇可以提供使用游离酶和过表达酶的微生物促进植物健康的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且提供了用于使用游离酶或过表达酶的重组 微 生物 刺激 植物 生长和/或促进植物健康的方法。还提供了用游离酶或过表达酶的重组微生物包被的植物 种子 。提供了包含 肥料 和酶或过表达酶的重组微生物的组合物。还提供了具有ACC脱 氨 酶活性的修饰酶、表达修饰酶的重组微生物、用修饰酶或重组 微生物处理 的植物种子，以及用于使用修饰酶或重组微生物刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。，下面是使用游离酶和过表达酶的微生物促进植物健康的方法专利的具体信息内容。
1.一种用于刺激植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括将游离酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或者植物或植物种子周围的区域，其中所述酶选自酸性磷酸酶、甘露聚糖酶、磷脂酶、非纤维素分解的葡聚糖酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、ACC脱氨酶及其任何组合。
2.一种用于刺激植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括将游离酶施用于植物或植物种子，其中所述酶包含葡聚糖酶，并且其中将所述酶施用于所述植物种子包括：(a)在种植时将所述酶施用于所述植物种子；或(b)用所述酶包被所述植物种子。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述方法包括：用包含所述酶和农业上可接受的载体的种子包被制剂包被所述植物种子。
4.一种用于刺激植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括将游离酶施用于植物或植物种子，其中所述酶包含植酸酶。
5.一种用于刺激植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括将肥料和游离酶施用于植物生长培养基、植物或植物种子周围的区域或施用于植物或植物种子，其中所述游离酶包含植酸酶。
6.根据权利要求1–5中任一项所述的方法，其中，所述方法包括将所述酶施用于所述植物生长培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述植物生长培养基包含肥料。
8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述植物生长培养基基本由肥料组成。
9.根据权利要求1–5中任一项所述的方法，其中，所述方法包括将所述酶施用于所述植物种子。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，将所述酶施用于所述植物种子包括：(a)在种植时将所述酶施用于所述植物种子；或(b)用所述酶包被所述植物种子。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，所述方法包括用包含所述酶和农业上可接受的载体的种子包被制剂包被所述植物种子。
12.根据权利要求1–11中任一项所述的方法，其中，所述方法还包括将肥料、生物刺激素或其组合施用于植物生长培养基、植物、植物种子或者植物或植物种子周围的区域。
13.一种包含肥料和酶或扩展蛋白的组合物，其中，所述酶选自酸性磷酸酶、甘露聚糖酶、磷脂酶、葡聚糖酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、植酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中，所述酶包含游离酶。
15.根据权利要求13或14所述的组合物，其中，所述组合物还包含农业上可接受的载体、另外的农用化学品或其组合。
16.一种用游离酶处理的植物种子，其中，所述酶选自酸性磷酸酶、甘露聚糖酶、磷脂酶、非纤维素分解的葡聚糖酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、果胶酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、植酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合。
17.根据权利要求16所述的植物种子，其中，用所述酶包被所述植物种子。
18.根据权利要求16或17所述的植物种子，其中，用包含所述酶和农业上可接受的载体的种子包被制剂包被所述植物种子。
19.一种用游离酶处理的植物种子，其中，所述酶包含葡聚糖酶。
20.根据权利要求16–19中任一项所述的植物种子，其中，还用肥料、生物刺激素或其组合进一步处理或包被所述种子。
21.根据权利要求5–12中任一项所述的方法、根据权利要求20所述的种子或根据权利要求13–15中任一项所述的组合物，其中，所述肥料包含氮、磷酸盐、钾、锌、铁、硒、硼、铜或其任何组合。
22.根据权利要求21所述的方法、种子或组合物，其中，所述磷酸盐包含磷酸二氢铵、磷酸氢二铵、正磷酸盐、正多磷酸盐或其任何组合；或其中所述钾包含乙酸钾。
23.根据权利要求1–12、21和22中任一项所述的方法、根据权利要求16–22中任一项所述的种子或根据权利要求13–15、21和22中任一项所述的组合物，其中，所述酶或扩展蛋白包含含有所述酶或扩展蛋白的粗细胞提取物。
24.根据权利要求1–12、21和22中任一项所述的方法、根据权利要求16–22中任一项所述的种子或根据权利要求13–15、21和22中任一项所述的组合物，其中，所述酶或扩展蛋白包含部分纯化的酶或扩展蛋白。
25.根据权利要求1、2、21和22中任一项所述的方法、根据权利要求16–22中任一项所述的种子或根据权利要求13–15、21和22中任一项所述的组合物，其中，所述酶或扩展蛋白包含基本上纯化的酶或扩展蛋白。
26.根据权利要求1–12和21–25中任一项所述的方法、根据权利要求16–25中任一项所述的种子或根据权利要求13–15和21–25中任一项所述的组合物，其中，所述酶或扩展蛋白包含固定在基质或支持物上的酶或扩展蛋白。
27.根据权利要求26所述的方法、种子或组合物，其中，所述基质或支持物包含木炭、生物炭、纳米碳、琼脂糖、海藻酸盐、纤维素、纤维素衍生物、二氧化硅、塑料、不锈钢、玻璃、聚苯乙烯、陶瓷、白云石、粘土、硅藻土、滑石粉、聚合物、树胶、水分散性材料或其任何组合。
28.根据权利要求26或27所述的方法、种子或组合物，其中，将所述酶或扩展蛋白固定在所述基质或支持物上导致与在相同条件下相同的非固定化酶或扩展蛋白的释放速率相比，所述酶或扩展蛋白更缓慢地释放到环境中或所述植物或所述植物种子上。
29.根据权利要求5–12和21–28中任一项所述的方法、根据权利要求20–28中任一项所述的种子或根据权利要求13–15和21–28中任一项所述的组合物，其中，所述肥料包含液体或干燥肥料。
30.根据权利要求5–12和21–28中任一项所述的方法、根据权利要求20–29中任一项所述的种子或根据权利要求13–15和21–29中任一项所述的组合物，其中，所述肥料包括微量元素肥料材料，且所述微量元素肥料材料包含硼酸、硼酸盐、硼釉料、硫酸铜、铜釉料、铜螯合物、四硼酸钠十水合物、硫酸铁、氧化铁、硫酸铁铵、铁釉料、铁螯合物、硫酸锰、氧化锰、锰螯合物、氯化锰、锰釉料、钼酸钠、钼酸、硫酸锌、氧化锌、碳酸锌、锌釉料、磷酸锌、锌螯合物或其任何组合。
31.根据权利要求5–12和21–30中任一项所述的方法、根据权利要求20–30中任一项所述的种子或根据权利要求13–15和21–30中任一项所述的组合物，其中，所述肥料包含硫酸铵、硝酸铵、硫酸硝酸铵、氯化铵、硫酸氢铵、多硫化铵、硫代硫酸铵、氨水、无水氨、多磷酸铵、硫酸铝、硝酸钙、硝酸钙铵、硫酸钙、煅烧菱镁矿、方解石灰石、氧化钙、硝酸钙、白云石灰岩、熟石灰、碳酸钙、磷酸二铵、磷酸一铵、硝酸镁、硫酸镁、硝酸钾、氯化钾、硫酸钾镁、硫酸钾、硝酸钠、镁质石灰石、氧化镁、尿素、尿素-甲醛、尿素硝酸铵、硫包覆尿素、聚合物包覆尿素、异丁烯二脲、K2SO4–2MgSO4、钾盐镁矾、钾石盐岩、硫镁矾、泻盐、元素硫、泥灰、磨碎的牡蛎壳、鱼粉、油饼、鱼肥、血粉、磷酸岩、超级磷酸盐、矿渣、骨粉、木灰、粪肥、蝙蝠鸟粪、泥炭藓、堆肥、绿沙、棉籽粕、羽毛粉、蟹粉、鱼乳液、腐殖酸或其任何组合。
使用游离酶和过表达酶的微生物促进植物健康的方法
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2016年3月16日提交的美国临时申请序列号62/309,426的权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
[0003] 本发明提供了使用游离酶或过表达酶的重组微生物刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。还提供了用游离酶或过表达酶的重组微生物处理的植物种子。提供了包含肥料和酶或过表达酶的重组微生物的组合物。还提供了具有ACC脱氨酶活性的修饰酶、表达修饰酶的重组微生物、用修饰酶或重组微生物处理的植物种子以及使用修饰酶或重组微生物刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。
背景技术
[0004] 在植物根部周围的区域内是称为根际的区域。在根际中，细菌、真菌和其它生物竞争营养物质并结合植物的根结构。有害和有益的细菌和真菌都可以占据根际。细菌、真菌和植物的根系都会受到根际酶的作用的影响。增加土壤或用某些酶处理植物将对有益土壤细菌和真菌的总体种群产生有益影响，为植物生长创造更健康的整体土壤环境，改善植物生长，并为植物提供针对某些细菌和真菌病原体的保护。植物根部周围的环境(根际)是细菌、真菌、营养物和根的独特混合物，其质量不同于天然土壤。这些生物之间的共生关系是独特的，并且可以通过包含外源蛋白质来更好地改变。
[0005] 因此，本领域需要一种有效地将酶和其它蛋白质递送至植物的方法。此外，本领域需要增强植物对酶的响应并为种植者提供益处。
发明内容
[0006] 本发明提供了酶。该酶包含编码具有1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACC脱氨酶)活性的酶的氨基酸序列和信号肽。当酶在微生物中表达时，信号肽导致酶的分泌。还提供了表达该酶的重组微生物。还提供了包含酶或重组微生物和农业上可接受的载体的制剂。还提供了用所述酶、重组微生物或制剂处理的植物种子。
[0007] 提供了具有ACC脱氨酶活性的酶。该酶的氨基酸序列相对于来自芽孢杆菌属细菌的野生型D-半胱氨酸脱巯基酶或ACC脱氨酶的序列包含至少一个氨基酸取代。与ACC脱氨酶相比，与在相同条件下野生型D-半胱氨酸脱巯基酶或ACC脱氨酶的ACC脱氨酶活性相比，氨基酸取代导致ACC脱氨酶活性增加。还提供了表达酶的重组微生物。还提供了包含酶或重组微生物和农业上可接受的载体的制剂。还提供了用酶、重组微生物或制剂处理的植物种子。
[0008] 提供了一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将任何具有ACC脱氨酶活性的酶或包含这种酶和农业上可接受的载体的制剂施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0009] 提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将任何表达具有ACC脱氨酶活性的酶的任何重组微生物或包含这类重组微生物和农业上可接受的载体的制剂施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0010] 提供了又一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将游离酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、非纤维素分解的葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合。
[0011] 提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将两种或更多种游离酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。酶独立地选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、植酸酶、酸性磷酸酶、甘露聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶和ACC脱氨酶。
[0012] 提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将游离酶施用于植物或植物种子。酶包含葡聚糖酶。将酶施用于植物种子包括：(a)将酶在种植时施用于植物种子；或(b)用酶包被植物种子。
[0013] 提供了又一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将游离酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。酶包含葡聚糖酶。该方法还包括将扩展蛋白施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0014] 提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将游离酶施用于植物或植物种子。酶包含植酸酶。
[0015] 提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将肥料和游离酶施用于植物生长培养基、植物或植物种子周围的区域或施用于植物或植物种子。游离酶包含植酸酶。
[0016] 提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将重组微生物施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与在相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶、蛋白酶、植酸酶、酸性磷酸酶及其任何组合。所述酶或扩展蛋白在重组微生物的营养生长期间表达。
[0017] 提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将重组微生物施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与在相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶、植酸酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白还包含信号肽，其导致所述酶或扩展蛋白分泌。
[0018] 提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将重组微生物施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与在相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、甘露聚糖酶、果胶酶、酸性磷酸酶及其任何组合。酶或扩展蛋白不结合至重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
[0019] 提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将重组微生物施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与在相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、甘露聚糖酶、果胶酶、酸性磷酸酶及其任何组合。酶或扩展蛋白不是融合蛋白的组成部分。
[0020] 提供了经处理的植物种子。用游离酶处理植物种子。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、植酸酶、酸性磷酸酶、非纤维素分解的葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合。
[0021] 提供了经处理的植物种子。用两种或更多种游离酶处理植物种子，其中酶独立地选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶、蛋白酶、植酸酶、酸性磷酸酶、葡聚糖酶和ACC脱氨酶。
[0022] 提供了包被的植物种子。用游离酶包被植物种子。酶包含葡聚糖酶。
[0023] 提供了经处理的植物种子。用游离酶和扩展蛋白处理植物种子。酶包含葡聚糖酶。
[0024] 提供了植物种子。用重组维生素包被植物种子。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与在相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、甘露聚糖酶、果胶酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白在重组微生物的营养生长期间表达。
[0025] 提供了另一种植物种子。用重组微生物包被植物种子。重组维生素表达酶或扩展蛋白，其中酶的表达与在相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶、植酸酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白还包含信号肽，其导致酶或扩展蛋白分泌。
[0026] 提供了另一种植物种子。用重组微生物包被植物种子。重组维生素表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与在相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶、植酸酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白不结合至重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
[0027] 提供了另一种植物种子。用重组微生物包被植物种子。重组维生素表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与在相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶、植酸酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白不是融合蛋白的组成部分。
[0028] 提供了组合物。该组合物包含肥料和酶或扩展蛋白。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、植酸酶、葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合。
[0029] 提供了另一种组合物。该组合物包含肥料和重组微生物。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与在相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、植酸酶、葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白在重组微生物营养生长期间表达。
[0030] 提供了另一种组合物。该组合物包含肥料和重组微生物。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与在相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、植酸酶、葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白还包含信号肽，其导致酶或扩展蛋白分泌。
[0031] 提供了另一种组合物。该组合物包含肥料和重组微生物。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与在相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、植酸酶、葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白不结合至重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
[0032] 提供了另一种组合物。该组合物包含肥料和重组微生物。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与在相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、植酸酶、葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白不是融合蛋白的组成部分。
[0034] 定义
[0035] 当本文使用冠词“一”，“一个”，“一种”，“该”和“所述”时，除非另有说明，否则它们表示“至少一个”或“一个或多个”。
[0036] 如本文所用，术语“蜡状芽孢杆菌家族成员”是指能够产生外孢壁的任何芽孢杆菌属种类。因此，细菌的蜡状芽孢杆菌家族包括种类炭疽芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、撒氏芽孢杆菌(Bacillus samanii)、盖氏芽孢杆菌(Bacillus gaemokensis)、韦氏芽孢杆菌(Bacillus weihenstephensis)和托式芽孢杆菌(Bacillus toyoiensis)。蜡状芽孢杆菌家族成员在本领域中也称作“广义蜡状芽孢杆菌”。
[0037] 术语“组合物”和“制剂”在本文中可以互换使用，以指两种或更多种化学或生物材料的混合物(例如，酶和农业上可接受的载体的混合物或重组微生物和农业上可接受的载体的混合物)。
[0038] 术语“包含”、“包括”和“具有”预期为包含性的并且是指可能存在除列出要素之外的其它要素。
[0039] 本文所用的术语“叶状”在酶或重组微生物施用于植物方面是指酶或重组微生物施用于植物的一个或多个地上部分，包括植物的茎、叶、果实、花或其它暴露的地上部分。
[0040] 如本文所用的术语“游离酶”是指基本上不含完整细胞的酶制剂。术语“游离酶”包括但不限于含有酶，部分纯化的，基本上纯化的或纯化的酶的粗细胞提取物。游离酶可以任选地固定在化学基质或载体上以允许控制释放酶。游离酶制剂优选不包括与蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁结合的酶。游离酶也优选不包括与完整蜡状芽孢家族成员孢子的外孢壁结合的酶。
[0041] 如本文所用的术语“融合蛋白”是指具有多肽序列的蛋白质，所述多肽序列包含衍生自两种或更多种分开的蛋白质的序列。融合蛋白可以通过将编码第一多肽的全部或部分的核酸分子与编码第二多肽的全部或部分的核酸分子连接在一起以产生核酸序列来产生，所述核酸序列在表达时产生单一多肽，其具有衍生自每种原始蛋白质的功能特性。
[0042] 如本文所用的术语“发芽率”是指在特定时间段内发芽的种子数。例如，发芽率为85％表明在给定时间内100个种子中的85个发芽。
[0043] 如本文所用的术语“葡聚糖酶”是指能够水解糖苷键的任何酶。本文所用的术语“非纤维素分解的葡聚糖酶”是指任何葡聚糖酶，其主要酶活性不涉及纤维素或纤维素亚单元作为底物。非纤维素分解的葡聚糖酶优选不能使用纤维素作为底物。
[0044] 本文所用的术语“固定化”是指将酶固定在基质或支持物上是指酶与基质或支持物的结合，使得酶在一段受控时间内维持在基质或支持物上或从支持物释放，而不是以不受控的方式消散到环境中。
[0045] 术语“天然序列”、“天然氨基酸序列”、“野生型序列”和“野生型氨基酸序列”在本文中可以互换使用以指如天然存在蛋白质中存在的氨基酸序列。
[0046] 本文所用的关于重组微生物的术语“过表达”是指重组微生物已经被修饰，使得重组微生物表达蛋白质(例如酶)的水平与在相同条件下相同种类的野生型微生物的相同蛋白质的表达水平相比增加。
[0047] “植物生长培养基”包括能够支持植物生长的任何材料。
[0048] 术语“促进植物生长”和“刺激植物生长”在本文中可互换使用，并且是指增强或增加至少一种植物的高度，重量，叶子大小，根大小，果实大小或茎大小的能力，和/或增加植物蛋白质产量和/或提高作物产量的能力。
[0049] 术语“促进植物健康”是指对植物健康的任何有益影响，包括但不限于增加的发芽率，增加的同步发芽，对病原体的易感性降低，对环境胁迫的易感性降低(例如干旱，洪水，热，冷冻，盐，重金属，低pH，高pH或其任何组合)，提高作物产量，增加根瘤和增加养分吸收和/或营养含量(例如增加糖摄取或糖含量或增加蛋白质摄取或蛋白质含量)。
[0050] 术语“根际”可与“根区”互换使用，以表示在植物根部周围并受其影响的土壤区段。
[0051] 如本文所用，术语“部分纯化的”是指酶(例如细胞裂解物)的粗制剂已经历至少去除一些非酶组分的程序(例如废物蛋白，死亡细胞材料，过量的水和/或不需要的细胞碎片)。在部分纯化的酶制剂中，酶优选包含制剂中总蛋白质含量的至少1％，更优选制剂中总蛋白质含量的至少3％，甚至更优选制剂中总蛋白质含量的大于5％。
[0052] 如本文所用，术语“基本上纯化的”是指酶制剂已经历除去大量非酶组分的程序(例如废物蛋白，死细胞材料，过量的水，和/或不需要的细胞碎片)。在基本上纯化的酶制剂中，酶优选包含制剂中总蛋白质含量的大于30％，更优选制剂中总蛋白质含量的大于约40％，甚至更优选制剂中的总蛋白质含量的大于50％。
[0053] 如本文所用的术语“协同有效量”是指第一物质(例如第一酶)的量，其与第二物质(例如第二酶)组合使用时产生大于当单独使用时相应的第一和第二物质中每一种的生物效应的总和的生物效应。
具体实施方式
[0054] 本发明通常涉及刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将游离酶、扩展蛋白和过表达酶的重组细菌施用于植物种子，植物，植物种子或植物种子周围的区域。本发明还涉及用游离酶或过表达酶的重组细菌处理或包被的种子。本发明还涉及包含肥料和酶或过表达酶的重组细菌的组合物。游离酶或过表达酶的重组细菌将酶递送至植物以允许酶活性短暂爆发的用途，其转而又为植物提供了安全短暂的影响，有限的残余材料保持在可收获的植物材料上。或者，在需要更长时间效果的情况下，可以将游离酶固定在基质或支持物上，以提供酶的受控释放。
[0055] I.酶和扩展蛋白序列
[0056] 为了便于参考，野生型和修饰的ACC脱氨酶的示例性序列，以及可与本文所述的方法、种子和组合物一起使用的其它酶和扩展蛋白的序列如下所示。
[0057] A.D-半胱氨酸脱巯基酶和ACC脱氨酶
[0058] 为了便于参考，下面的表1中提供了示例性D-半胱氨酸脱巯基酶和1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACC脱氨酶)核苷酸序列的描述，以及它们的SEQ ID NO。下表2提供了表1中列出的核苷酸序列的相应氨基酸序列。如下文更详细解释的，与在相同条件下野生型酶的酶的ACC脱氨酶活性相比，野生型D-半胱氨酸脱巯基酶或ACC脱氨酶中某些氨基酸的突变可导致酶具有增加的ACC脱氨酶活性。
[0059] 在表1中，SEQ ID NO.1-3和111是野生型酶的核苷酸序列，其表现出ACC脱氨酶和D-半胱氨酸脱巯基酶活性，且SEQ ID NO.4-6和112是编码这些酶的相应形式的核苷酸序列，其具有相对于野生型序列的两个氨基酸取代，导致ACC脱氨酶活性增加。因此，例如，SEQ ID NO：1提供了野生型酶的核苷酸序列，且SEQ ID NO：4提供了相同酶的核苷酸序列，其中核苷酸序列已被改变以编码相对于SEQ ID NO：1编码的酶具有两个氨基酸取代的酶。类似地，SEQ ID NO：2提供野生型酶的核苷酸序列，且SEQ ID NO：5提供相同酶的核苷酸序列，其中核苷酸序列已被改变以编码相对于SEQ ID NO：2编码的酶具有两个氨基酸取代的酶。同样，SEQ ID NO：3是野生型序列，且SEQ ID NO：6提供相应的改变序列。
[0060] 在表2中，SEQ ID NO.7-9和113是野生型酶的氨基酸序列，其表现出ACC脱氨酶和D-半胱氨酸脱巯基酶活性，且SEQ ID NO.10-12和114是这些酶的相应形式的氨基酸序列，其具有相对于野生型序列的两个氨基酸取代，其导致酶活性增加。因此，SEQ ID NO：7是野生型序列，SEQ ID NO：10提供了相对于野生型序列具有两个氨基酸取代的相同酶的氨基酸序列。SEQ ID NO.8和11、9和12以及113和114以相同的方式彼此相关。取代的氨基酸如表2中的SEQ ID NO.10-12和114所示并且用粗体和加下划线的文字表示。
[0061] 表1.d-半胱氨酸脱巯基酶和ACC脱氨酶的核苷酸序列
[0062]
[0063] 表2.d-半胱氨酸脱巯基酶和ACC脱氨酶的氨基酸序列
[0064]
[0065]
[0066]
[0067] B.磷脂酶
[0068] 为便于参考，示例性磷脂酶氨基酸序列的描述与其SEQ ID NO如下表3中所示。
[0069] 表3.磷脂酶的氨基酸序列
[0070]
[0071] SEQ ID NO.13、14和15的磷脂酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO.13、14和15的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽序列MKKKVLALAAAITLVAPLQSVAFA(SEQ ID NO:49)。该信号肽不包括在SEQ ID NO.13、14或15中。然而，SEQ ID NO：49的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO.13、14和15中的任一个的磷脂酶的氨基末端或本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0072] SEQ ID NO:16的脂肪酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：16的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MKGKLLKGVLSLGVGLGALYSGTSAQAE(SEQ ID NO:50)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：16中。SEQ ID NO：50的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：16的磷脂酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0073] SEQ ID NO:17的脂肪酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：17的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MKKKVLALAAAITVVAPLQSVAFA(SEQ ID NO:51)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：17中。SEQ ID NO：51的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：17的磷脂酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0074] SEQ ID NO:18的脂肪酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：18的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MKRKICKALICATLATSLWAGASTKVYAW(SEQ ID NO:52)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：18中。SEQ ID NO：52的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：18的磷脂酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0075] SEQ ID NO:19的脂肪酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：19的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MLAGPLAAALPARATTGTPAFLHGVASGD(SEQ ID NO:53)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：19中。SEQ ID NO：53的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：19的磷脂酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0076] SEQ ID NO:115的脂肪酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：115的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MKKKVLALAAAITLVAPLQNVAFA(SEQ ID NO:135)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：115中。SEQ ID NO：135的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：115的磷脂酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0077] C.脂肪酶
[0078] 为便于参考，示例性脂肪酶氨基酸序列的描述与其SEQ ID NO如下表4中所示。
[0079] 表4.脂肪酶的氨基酸序列
[0080]
[0081] SEQ ID NO:21的脂肪酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：21的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MKFVKRRIIALVTILMLSVTSLFALQPSAKA(SEQ ID NO:54)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：21中。然而，SEQ ID NO：54的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：21的磷脂酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0082] SEQ ID NO:118的脂肪酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：118的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MARTMRSRVVAGAVACAMSIAPFAGTTAVMTLATTHAAMAATAP(SEQ ID NO:137)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：118中。然而，SEQ ID NO：137的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：118的磷脂酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0083] SEQ ID NO:119的脂肪酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：119的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MGIFDYKNLGTEGSKTLFADAMA(SEQ ID NO:138)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：119中。然而，SEQ ID NO：138的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：119的磷脂酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0084] D.木聚糖酶
[0085] 为便于参考，示例性木聚糖酶氨基酸序列的描述与其SEQ ID NO如下表5中所示。
[0086] 表5.木聚糖酶的氨基酸序列
[0087]
[0088] SEQ ID NO:22的木聚糖酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：22的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MCENLEMLNLSLAKTYKDYFKIGAAVTA(SEQ ID NO:55)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：22中。然而，SEQ ID NO：55的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：22的木聚糖酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0089] SEQ ID NO:23的木聚糖酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：23的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MFKFKKNFLVGLSAALMSISLFSATASA(SEQ ID NO:56)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：23中。然而，SEQ ID NO：56的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：23的木聚糖酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0090] SEQ ID NO:24的木聚糖酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：24的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MRKKCSVCLWILVLLLSCLSGKSAYA(SEQ ID NO:57)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：24中。然而，SEQ ID NO：57的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：24的木聚糖酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0091] SEQ ID NO:25的木聚糖酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：25的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MKLKKKMLTLLLTASMSFGLFGATSSA(SEQ ID NO:58)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：25中。然而，SEQ ID NO：58的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：25的木聚糖酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0092] E.木糖苷酶
[0093] 为便于参考，示例性木糖苷酶氨基酸序列的描述与其SEQ ID NO如下表6中所示。
[0094] 表6.木糖苷酶的氨基酸序列
[0095]
[0096] F.内酯酶
[0097] 为便于参考，示例性内酯酶氨基酸序列的描述与其SEQ ID NO如下表7中所示。
[0098] 表7.内酯酶的氨基酸序列
[0100] G.脱乙酰壳多糖酶
[0101] 为便于参考，示例性脱乙酰壳多糖酶氨基酸序列的描述与其SEQ ID NO如下表8中所示。
[0102] 表8.脱乙酰壳多糖酶的氨基酸序列
[0103]
[0104] SEQ ID NO:29的脱乙酰壳多糖酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：29的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MKISMQKADFWKKAAISLLVFTMFFTLMMSETVFA(SEQ ID NO:59)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：29中。然而，SEQ ID NO：59的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：29的脱乙酰壳多糖酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0105] SEQ ID NO:124的脱乙酰壳多糖酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：124的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MHSQHRTARIALAVVLTAIPASLATAGVGYASTQASTAVK(SEQ ID NO:139)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：124中。然而，SEQ ID NO：139的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：124的脱乙酰壳多糖酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0106] H.葡聚糖酶
[0107] 为便于参考，示例性葡聚糖酶氨基酸序列的描述与其SEQ ID NO如下表9中所示。
[0108] 表9.葡聚糖酶的氨基酸序列
[0109]
[0110]
[0111] SEQ ID NO:42的葡聚糖酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：42的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MKRSISIFITCLLITLLTMGGMIASPASA(SEQ ID NO:60)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：42中。然而，SEQ ID NO：60的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：42的葡聚糖酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0112] SEQ ID NO:43的葡聚糖酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：43的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MPYLKRVLLLLVTGLFMSLFAVTATASA(SEQ ID NO:61)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：43中。然而，SEQ ID NO：61的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：43的葡聚糖酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0113] SEQ ID NO:44的葡聚糖酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：44的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MKRSQTSEKRYRQRVLSLFLAVVMLASIGLLPTSKVQA(SEQ ID NO:62)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：44中。然而，SEQ ID NO：62的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：44的葡聚糖酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0114] SEQ ID NO:45的葡聚糖酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：45的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MKPSHFTEKRFMKKVLGLFLVVVMLASVGVLPTSKVQA(SEQ ID NO:63)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：45中。然而，SEQ ID NO：63的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：45的葡聚糖酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0115] SEQ ID NO:125的葡聚糖酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：125的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MFKKWKKFGISSLALVLVAAVAFTGWSAKASA(SEQ ID NO:140)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：125中。然而，SEQ ID NO：140的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：125的葡聚糖酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0116] I.蛋白酶
[0117] 为便于参考，示例性蛋白酶氨基酸序列的描述与其SEQ ID NO如下表10中所示。
[0118] 表10.蛋白酶的氨基酸序列
[0119]
[0120] SEQ ID NO:47的蛋白酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：47的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MKKGIIRFLLVSFVLFFALSTGITGVQA(SEQ ID NO:64)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：47中。然而，SEQ ID NO：64的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：47的蛋白酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0121] SEQ ID NO:127的蛋白酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：127的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MVVFSKTAALVLGLSTAVSA(SEQ ID NO:141)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：127中。然而，SEQ ID NO：141的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：127的蛋白酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0122] J.甘露聚糖酶
[0123] 为便于参考，示例性甘露聚糖酶氨基酸序列的描述与其SEQ ID NO如下表11中所示。
[0124] 表11.甘露聚糖酶的氨基酸序列
[0125]酶 氨基酸序列的SEQ ID NO.
甘露聚糖酶、芽孢杆菌属 128
甘露聚糖酶、芽孢杆菌属 128
[0126] SEQ ID NO:128的甘露聚糖酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：128的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MAKLQKGTILTVIAALMFVILGSAAPKA(SEQ ID NO:142)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：128中。然而，SEQ ID NO：142的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：128的甘露聚糖酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0127] K.果胶酶
[0128] 为便于参考，示例性果胶酶氨基酸序列的描述与其SEQ ID NO如下表12中所示。
[0129] 表12.果胶酶的氨基酸序列
[0130]酶(SEQ ID NO) 氨基酸序列的SEQ ID NO.
果胶酶、日本曲霉 129
果胶酶、日本曲霉 129
[0131] SEQ ID NO:129的果胶酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：129的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MPSAKPLFCLATLAGAALAAP(SEQ ID NO:143)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：129中。然而，SEQ ID NO：143的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：129的果胶酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0132] L.酸性磷酸酶
[0133] 为便于参考，示例性酸性磷酸酶氨基酸序列的描述与其SEQ ID NO如下表13中所示。
[0134] 表13.酸性磷酸酶的氨基酸序列
[0135]酶 氨基酸序列的SEQ ID NO.
酸性磷酸酶、小麦 130
酸性磷酸酶、小麦 131
酸性磷酸酶、小麦 130
酸性磷酸酶、小麦 131
[0136] SEQ ID NO:130的酸性磷酸酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：130的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MARGSMAAVLAVLAVAALRCAPAAA(SEQ ID NO:144)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：130中。然而，SEQ ID NO：144的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：130的酸性磷酸酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0137] SEQ ID NO:131的酸性磷酸酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：131的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MRGLGFAALSLHVLLCLANGVSSRRTSSYV(SEQ ID NO:145)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：131中。然而，SEQ ID NO：145的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：131的酸性磷酸酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0138] M.植酸酶
[0139] 为便于参考，示例性植酸酶氨基酸序列的描述与其SEQ ID NO如下表14中所示。
[0140] 表14.植酸酶的氨基酸序列
[0141]酶 氨基酸序列的SEQ ID NO.
植酸酶，小麦 132
植酸酶，小麦 133
植酸酶，小麦 134
植酸酶，小麦 132
植酸酶，小麦 133
植酸酶，小麦 134
[0142] SEQ ID NO:132的植酸酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：132的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MWWGSLRLLLLLAAAVAA(SEQ ID NO:146)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：132中。然而，SEQ ID NO：146的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：132的植酸酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0143] SEQ ID NO:133的植酸酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：133的第一个氨基酸之前在序列的氨基末端的信号肽MWWGSLRLLLLLAAAVAA(SEQ ID NO:146)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：133中。然而，SEQ ID NO：146的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：133的植酸酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0144] SEQ ID NO:134的植酸酶的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：134的第一个氨基酸之前在序列的氨基末端的信号肽MGIWRGSLPLLLLAA(SEQ ID NO:147)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：134中。然而，SEQ ID NO：147的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：134的植酸酶的氨基末端或如本文所述的任何其它酶或扩展蛋白的氨基末端。
[0145] N.扩展蛋白
[0146] 为便于参考，示例性扩展蛋白氨基酸序列的描述与其SEQ ID NO如下表15中所示。
[0147] 表15.扩展蛋白的氨基酸序列
[0148]
[0149] SEQ ID NO:74的扩展蛋白的天然氨基酸序列包括紧接在SEQ ID NO：74的第一个氨基酸之前的序列的氨基末端的信号肽MKKIMSAFVGMVLLTIFCFSPQASA(SEQ ID NO:68)。该信号肽不包括在SEQ ID NO：74中。然而，SEQ ID NO：74的信号肽或另一种信号肽可任选地包含在SEQ ID NO：74的蛋白酶的氨基末端、本文所述的任何酶的氨基末端或另一种扩展蛋白的氨基末端。
[0150] O.增加酶活性的突变
[0151] 在本文所述的任何酶中，包括游离酶和由重组微生物表达的酶，相对于相同酶的野生型序列的序列，该酶可包含至少一个氨基酸取代，并且其中与相同条件下野生型酶的酶活性相比，氨基酸取代导致酶活性增加。
[0152] II.具有ACC脱氨酶活性的修饰酶
[0153] 提供了修饰的1-氨基环丙烷-1-羧酸酯(ACC)脱氨酶。ACC脱氨酶和D-半胱氨酸脱巯基酶(DCD)通常具有相似的氨基酸序列并且可以具有重叠的酶活性，其能够作用于1-氨基环丙烷-1-羧酸酯(ACC)和D-半胱氨酸作为底物。一些酶仅具有这些活性中的一种，而其它酶能够作为ACC脱氨酶和D-半胱氨酸脱巯基酶起作用。ACC脱氨酶将ACC切割成氨和α-酮丁酸，而D-半胱氨酸脱巯基酶将D-半胱氨酸转化为丙酮酸、H2S和氨。ACC是乙烯的直接前体，如果以高水平存在，它可能在植物中引起不期望的作用。
[0154] 因此，具有增加的ACC脱氨酶活性的酶将有益于在农业中使用以降低ACC水平从而降低乙烯水平。ACC脱氨酶在植物生长培养基，植物，植物种子或植物或植物种子周围的区域中的应用可刺激植物生长，促进植物健康(例如通过增加养分吸收)和缓慢的果实成熟。这些影响转而导致产量增加，季节早期活力和植物对早季胁迫的抵抗力。ACC脱氨酶还可以保护植物免于病原体和非生物胁迫。
[0155] 如下文更详细解释的，可以在表现出D-半胱氨酸脱巯基酶和/或ACC脱氨酶活性的酶中进行突变，以增加酶的ACC脱氨酶活性。此外，具有ACC脱氨酶活性的酶可以被修饰为包括当在微生物中表达时导致酶分泌的信号肽，从而允许更容易地生产和纯化酶。这样的修饰(突变和添加信号肽)可以单独使用或彼此组合使用。所有植物都产生ACC并响应乙烯，因此这种修饰的ACC脱氨酶具有广泛的适用性。
[0156] 以上在表2中提供了三种野生型酶的氨基酸序列作为SEQ ID NO.7–9和113。具有两个导致ACC脱氨酶活性增加的氨基酸取代的这些野生型酶的相应形式的序列在上文表2中作为SEQ ID NO.10–12和114提供。
[0157] 天然存在的ACC脱氨酶不是分泌蛋白。发现ACC脱氨酶存在于许多类型的微生物中，包括拟杆菌门，硬壁菌门和放线细菌门的细菌以及假单胞菌属，芽孢杆菌属，根瘤菌属，短根瘤菌属的细菌以及许多其它细菌。然而，在这些细菌中发现的ACC脱氨酶是细胞内的并且从它们定殖的宿主植物中有限地暴露于底物ACC。
[0158] 本文提供了修饰的ACC脱氨酶，其包含信号肽，其导致ACC脱氨酶从其表达的微生物中分泌。该ACC脱氨酶可以在微生物中表达，然后可以将其应用于植物生长培养基，植物，植物种子或植物或植物种子周围的区域。ACC脱氨酶由微生物分泌，其中它与其底物接触。因此，分泌的ACC脱氨酶能够刺激植物的生长和/或促进植物的健康。
[0159] 提供了酶。酶包含编码具有1-氨基环丙烷-1-羧酸酯脱氨酶(ACC脱氨酶)活性的酶的氨基酸序列和酶在微生物中表达时导致酶的分泌的信号肽。
[0160] 具有ACC脱氨酶活性的酶可以包含来自芽孢杆菌属细菌的酶。
[0161] 此外或可选地，一种或多种氨基酸取代可以被导入ACC脱氨酶的氨基酸序列以增加酶活性。
[0162] 提供了具有ACC脱氨酶活性的酶。该酶的氨基酸序列相对于来自芽孢杆菌属细菌的野生型D-半胱氨酸脱巯基酶或ACC脱氨酶的序列包含至少一种氨基酸取代。该氨基酸取代导致与相同条件下野生型D-半胱氨酸脱巯基酶或ACC脱氨酶的ACC脱氨酶活性相比ACC脱氨酶活性增加。
[0163] 包含至少一种氨基酸取代的酶还可以包含信号肽，当该酶在微生物中表达时，其导致酶的分泌。
[0164] 对于具有ACC脱氨酶活性的任何酶，表达酶的微生物可以包含芽孢杆菌属细菌，假单胞菌属细菌，根瘤菌属细菌，类芽孢杆菌属细菌，赖氨酸杆菌属细菌，副球菌属细菌，中间根瘤菌属细菌，短根瘤菌属细菌，不动杆菌属细菌，节杆菌属细菌，固氮菌属细菌，固氮螺菌属细菌，粉红色色素兼性甲基营养细菌，菌根真菌，球囊霉属真菌，木霉属真菌，克吕沃尔菌属真菌，胶霉属真菌或其任何组合。
[0165] 例如，微生物可以包含芽孢杆菌属细菌，赖氨酸芽孢杆菌属细菌，假单胞菌属细菌，类芽孢杆菌属细菌或其任何组合。
[0166] 对于具有ACC脱氨酶活性的任何酶，该酶可以包含苏云金芽孢杆菌酶或假蕈状芽孢杆菌酶。
[0167] 酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–9和113中的任一个具有至少70％的同一性，其中酶具有ACC脱氨酶活性。
[0168] 酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–9和113中的任一个具有至少75％的同一性，其中酶具有ACC脱氨酶活性。
[0169] 酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–9和113中的任一个具有至少80％的同一性，其中酶具有ACC脱氨酶活性。
[0170] 酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–9和113中的任一个具有至少85％的同一性，其中酶具有ACC脱氨酶活性。
[0171] 酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–9和113中的任一个具有至少90％的同一性，其中酶具有ACC脱氨酶活性。
[0172] 酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–9和113中的任一个具有至少95％的同一性，其中酶具有ACC脱氨酶活性。
[0173] 酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–9和113中的任一个具有至少98％的同一性，其中酶具有ACC脱氨酶活性。
[0174] 酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–9和113中的任一个具有至少99％的同一性，其中酶具有ACC脱氨酶活性。
[0175] 酶相对于野生型D-半胱氨酸脱巯基酶或ACC脱氨酶的序列可以包含两种氨基酸取代，其中所述氨基酸取代导致与相同条件下野生型酶的ACC脱氨酶活性相比ACC脱氨酶活性增加。
[0176] 例如，酶的氨基酸序列可以包含SEQ ID NO:7的位置290处的苏氨酸残基被谷氨酸残基取代和SEQ ID NO:7的位置317处的丝氨酸残基被亮氨酸残基取代。
[0177] 酶的氨基酸序列可以包含SEQ ID NO:8的位置290处的苏氨酸残基被谷氨酸残基取代和SEQ ID NO:8的位置317处的丝氨酸残基被亮氨酸残基取代。
[0178] 酶的氨基酸序列可以包含SEQ ID NO:9的位置290处的苏氨酸残基被谷氨酸残基取代和SEQ ID NO:9的位置317处的丝氨酸残基被亮氨酸残基取代。
[0179] 酶的氨基酸序列可以包含SEQ ID NO:113的位置290处的苏氨酸残基被谷氨酸残基取代和SEQ ID NO:113的位置317处的丝氨酸残基被亮氨酸残基取代。
[0180] 酶可以包含SEQ ID NO.10、11、12或14中的任一个。
[0181] 如果具有ACC脱氨酶活性的酶包含信号肽，但相对于野生型D-半胱氨酸脱巯基酶或ACC脱氨酶的序列不含任何氨基酸取代，则ACC脱氨酶包含与SEQ ID NO.7–9和113中的任一个具有100％同一性的氨基酸序列。
[0182] 可以用于修饰具有ACC脱氨酶活性的酶的信号肽如下XII部分中进一步描述。
[0183] III.表达具有ACC脱氨酶活性的修饰酶的重组细菌和包含修饰酶或表达修饰酶的重组细菌的制剂
[0184] 还提供了表达上面第II部分中所述的任何酶的重组微生物。
[0185] 在上面第II部分中所述的表达酶的任何重组微生物中，酶的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶的表达水平相比优选增加。
[0186] 可以用于表达酶的合适微生物如下面第XIII部分中所述。
[0187] 还提供了包含农业上可接受的载体和上面第II部分中所述的任何修饰酶或表达任何修饰酶的重组微生物的制剂。可以用于这类制剂的适合的载体和另外的制剂成分如下文第XVI部分中所述。
[0188] IV.刺激植物生长和/或促进植物健康的方法
[0189] 提供了一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。如下文更详细描述的，该方法包括将酶、扩展蛋白或表达酶或扩展蛋白的重组微生物酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0190] 施用酶或扩展蛋白或重组细菌优选导致酶或扩展蛋白向植物生长培养基、植物种子或植物或植物种子植物的区域的递送水平高于实际上可以在植物生长培养基、植物种子或植物或植物种子周围区域中发现的酶或扩展蛋白的水平。
[0191] A.具有ACC脱氨酶活性的修饰酶
[0192] 提供了一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将上面第II部分中所述的具有ACC脱氨酶活性的任何酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。或者，该方法可以包括将包含农业上可接受的载体和上面第II部分中所述的具有ACC脱氨酶活性的任何酶的制剂施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0193] 提供了一种刺激植物生长和/或促进植物健康的另一种方法。该方法包括将上面第III部分中所述的表达具有ACC脱氨酶活性的酶的重组微生物施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。或者，该方法可以包括将包含农业上可接受的载体和上面第III部分中所述的表达具有ACC脱氨酶活性的酶的重组微生物的制剂施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0194] 例如，该方法可以包括将上面第II部分中所述的具有ACC脱氨酶活性的任何酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0195] 该方法可以包括将游离酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0196] 该方法可以包括将上述第III部分中所述的任何重组微生物施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0197] 例如，可以通过根质量增加、植物高度增加、产量增加、结瘤增加、改变成成枯萎、种子发芽改变和果实催熟延迟的测量值测试在该部分或本文另外部分中所述的具有ACC脱氨酶活性的任何酶对植物的作用。
[0198] B.磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶、酸性磷酸酶、植酸酶、ACC脱氨酶和扩展蛋白
[0199] 1.游离酶
[0200] 如下文更详细描述的，提供了一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法，其涉及磷脂酶、脂肪酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶、酸性磷酸酶、植酸酶、ACC脱氨酶、和/或扩展蛋白和/或表达这类酶或扩展蛋白的重组细菌的用途。
[0201] 提供了一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将游离酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、非纤维素分解的葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合。
[0202] 酶优选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、植酸酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合。
[0203] 提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将两种或更多种游离酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。酶独立地选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、植酸酶、酸性磷酸酶、甘露聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶和ACC脱氨酶。
[0204] 提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将游离酶施用于植物或植物种子。酶包含葡聚糖酶。将酶施用于植物种子包括：(a)将酶在种植时施用于植物种子；或(b)用酶包被植物种子。
[0205] 在包括将游离酶施用于植物或植物种子的方法中，其中酶包含葡聚糖酶，该方法可以包括用包含酶和农业上可接受的载体的种子包被制剂包被植物种子。
[0206] 在包括将游离酶施用于植物或植物种子的方法中，其中酶包含葡聚糖酶，该方法还可以包括将酶或扩展蛋白施用于植物生长培养基或植物或植物种子周围的区域。例如，该方法可以包括将酶或扩展蛋白施用于植物生长培养基。该方法可以包括将酶和扩展蛋白施用于植物生长培养基。
[0207] 还提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将游离酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。酶包含葡聚糖酶。该方法还包括将扩展蛋白施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0208] 在包括施用游离酶和扩展蛋白、施用酶或扩展蛋白于植物种子的方法中，其包括：(a)将酶或扩展蛋白在种植时施用于植物种子；或(b)用酶或扩展蛋白包被植物种子。例如该方法可以包括用包含农业上可接受的载体和酶、扩展蛋白或酶和扩展蛋白两者的种子包被制剂包被植物种子。
[0209] 提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将游离酶施用于植物或植物种子。酶包含植酸酶。
[0210] 提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将肥料和游离酶施用于植物生长培养基、植物或植物种子周围的区域或施用于植物或植物种子。游离酶包含植酸酶。
[0211] 2.重组微生物
[0212] 提供了一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将重组微生物施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与在相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶、蛋白酶、植酸酶、酸性磷酸酶及其任何组合。酶或扩展蛋白在重组微生物营养生长期间被表达。
[0213] 提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将重组微生物施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与在相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶、植酸酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白还包含信号肽，其导致酶或扩展蛋白分泌。
[0214] 提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将重组微生物施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与在相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、甘露聚糖酶、果胶酶、酸性磷酸酶及其任何组合。酶或扩展蛋白不结合至重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
[0215] 还提供了另一种刺激植物生长和/或促进植物健康的方法。该方法包括将重组微生物施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与在相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、甘露聚糖酶、果胶酶、酸性磷酸酶及其任何组合。酶或扩展蛋白不是融合蛋白的组成部分。
[0216] 在任何方法中，酶或扩展蛋白可以在重组微生物的营养生长期间被表达。
[0217] 如果酶或扩展蛋白在重组微生物营养生长期间被表达，则重组微生物可以为产芽孢微生物。
[0218] 在任何方法除了其中酶不是融合蛋白的组成部分的方法中，酶或扩展蛋白可以进一步包含信号肽，其导致酶或扩展蛋白的分泌。适合的信号肽描述在下面第XII部分中。
[0219] 在任何方法中，酶或扩展蛋白适合地不与重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁结合。
[0220] 在任何方法中，酶或蛋白质适合地不与完整蜡状芽孢杆菌家族成员孢子的外孢壁结合。
[0221] 在任何方法除了涉及使用信号肽的方法中，酶或扩展蛋白适合地不是融合蛋白的组成部分。
[0222] C.酶、扩展蛋白和/或重组微生物递送至植物的途径
[0223] 在本文所述的任何方法中，该方法可包括将酶或重组微生物应用于植物生长培养基。例如，酶或重组微生物可以在犁沟中施用或可以包括在土壤改良剂中。或者或另外，酶或重组微生物可以在施用于植物生长培养基之前浸渍到干燥颗粒，蛭石或其它基质，塑料聚合物，泥炭苔或盆栽混合物上。酶或重组微生物也可以通过水源，滴灌线施用于植物生长培养基，播种液施用于土壤或广播干燥施用于土壤。
[0224] 植物生长培养基可包含肥料或基本上由肥料组成。然后将肥料和酶或重组微生物的混合物施用于土壤或另一种植物生长培养基，使用标准施肥方法，包括在沟施肥，2×2施肥，播撒施肥，肥料浸渍，滴灌线，追肥应用等。
[0225] 在本文所述的任何方法中，该方法可以包括将酶、扩展蛋白或重组微生物施用于植物。
[0226] 在本文所述的任何方法中，该方法可以包括将酶、扩展蛋白或重组微生物施用于植物根。
[0227] 在本文所述的任何方法中，该方法可以包括将酶、扩展蛋白或重组微生物施用于叶。
[0228] 在本文所述的任何方法中，该方法可以包括将酶、扩展蛋白或重组微生物施用于植物种子。
[0229] 如果该方法包括将酶、扩展蛋白或重组微生物施用于植物种子，将酶、扩展蛋白或重组微生物施用于植物种子可以包括：(a)将酶、扩展蛋白或重组微生物在种植时施用于植物种子；或(b)用酶、扩展蛋白或重组微生物包被植物种子。
[0230] 例如，该方法可以包括用种子包被制剂包被植物种子，所述种子包被制剂包含：农业上可接受的载体和酶、扩展蛋白、重组微生物或其组合。
[0231] V.植物种子
[0232] 还提供了用酶、扩展蛋白或表达酶或扩展蛋白的重组微生物处理的植物种子。
[0233] A.用具有ACC脱氨酶活性的修饰酶处理的植物种子
[0234] 提供了经处理的植物种子。用上面第II部分中所述的具有ACC脱氨酶活性的任何酶处理植物种子。或者，用上面第II部分中所述的包含具有ACC脱氨酶活性的任何酶和农业上可接受的载体的制剂处理植物种子。
[0235] 提供了另一种植物种子，用上面第III部分中所述的表达具有ACC脱氨酶活性的任何重组微生物处理植物种子。或者，用上面第III部分中所述的包含表达具有ACC脱氨酶活性的酶的任何重组微生物的制剂处理植物种子。
[0236] B.用酶或重组微生物处理的植物种子
[0237] 提供了用酶、扩展蛋白或重组细菌处理的植物种子。
[0238] 1.游离酶
[0239] 提供了经处理的植物种子。用游离酶处理植物种子。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、植酸酶、酸性磷酸酶、非纤维素分解的葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合。
[0240] 酶优选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、植酸酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合。
[0241] 提供了另一种经处理的植物种子，用两种或更多种游离酶处理植物种子，其中酶独立地选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶、蛋白酶、植酸酶、酸性磷酸酶、葡聚糖酶和ACC脱氨酶。
[0242] 提供了经处理的植物种子。用游离酶和扩展蛋白处理植物种子。酶包含葡聚糖酶。
[0243] 提供了包被的植物种子。用游离酶包被植物种子。酶包含葡聚糖酶。
[0244] 2.重组微生物
[0245] 提供了植物种子。用重组微生物包被植物种子。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、甘露聚糖酶、果胶酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白在重组微生物营养生长期间被表达。
[0246] 提供了另一种植物种子。用重组微生物包被植物种子。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶、植酸酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白还包含导致酶或扩展蛋白分泌的信号肽。
[0247] 提供了另一种植物种子。用重组微生物包被植物种子。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶、植酸酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白不结合至重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
[0248] 提供了另一种植物种子。用重组微生物包被植物种子。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶、植酸酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白不是融合蛋白的组成部分。
[0249] 在任何种子中，酶或扩展蛋白可以在重组微生物营养生长其被表达。
[0250] 如果酶或扩展蛋白在重组微生物营养生长期间被表达，则重组微生物可以是产芽孢微生物。
[0251] 在任何种子除了其中酶不是融合蛋白的组成部分的种子中，酶或扩展蛋白还可以包含导致酶或扩展蛋白分泌的信号肽。适合的信号肽如下面第XII部分中所述。
[0252] 在任何种子中，酶或扩展蛋白适合地不与重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁结合。
[0253] 在任何种子中，酶或扩展蛋白适合地不与完整蜡状芽孢杆菌家族成员孢子的外孢壁结合。
[0254] 在任何种子除了涉及使用信号肽的种子中，酶或扩展蛋白适合地不是融合蛋白的组成部分。
[0255] C.包被的植物种子
[0256] 对于任何植物种子，可以用酶、重组微生物、扩展蛋白或其任何组合包被植物种子。
[0257] 例如，用酶和扩展蛋白包被植物种子。
[0258] 可以用种子包被制剂包被任何植物种子，所述种子包被制剂包含酶、重组微生物、扩展蛋白或任何其组合和农业上可接受的载体。
[0259] VI.组合物
[0260] 提供了包含肥料和酶或扩展蛋白或过表达酶或扩展蛋白的重组微生物。
[0261] A.酶
[0262] 提供了组合物。该组合物包含肥料和酶或扩展蛋白。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、植酸酶、葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合。
[0263] 酶优选包含压力酶。
[0264] B.重组微生物
[0265] 提供了组合物。该组合物包含肥料和重组微生物。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶、植酸酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白在重组微生物营养生长期间被表达。
[0266] 提供了另一种组合物。该组合物包含肥料和重组微生物。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、植酸酶、葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白还包含导致酶或扩展蛋白分泌的信号肽。
[0267] 提供了另一种组合物。该组合物包含肥料和重组微生物。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、植酸酶、葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白不结合至重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
[0268] 提供了另一种组合物。该组合物包含肥料和重组微生物。重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加。酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、植酸酶、葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合。酶或扩展蛋白不是融合蛋白的组成部分。
[0269] 在任何组合物中，酶或扩展蛋白可以在重组微生物营养生长期间被表达。
[0270] 如果酶或扩展蛋白在重组微生物营养生长期间被表达，则重组微生物可以是产芽孢微生物。
[0271] 在任何组合物除了其中酶不是融合蛋白的组成部分的组合物中，酶或扩展蛋白还可以包含导致酶或扩展蛋白分泌的信号肽。适合的信号肽如下面第XII部分中所述。
[0272] 在任何组合物中，酶或扩展蛋白适合地不与重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁结合。
[0273] 在任何组合物中，酶或扩展蛋白适合地不与完整蜡状芽孢杆菌家族成员孢子的外孢壁结合。
[0274] 在任何组合物除了涉及使用信号肽的组合物中，酶或扩展蛋白适合地不是融合蛋白的组成部分。
[0275] C.载体和另外的农业化学品
[0276] 在任何组合物中，该组合物还可以包含农业上可接受的载体、另外的农用化学品以及肥料或其组合。适合的载体和农用化学品描述在下面第XVI部分中。
[0277] VII.与方法、植物种子或组合物一起使用的酶和扩展蛋白
[0278] 适用于与所述方法、种子和组合物一起使用的磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、葡聚糖酶、扩展蛋白、植酸酶、酸性磷酸酶、果胶酶、甘露聚糖酶和ACC脱氨酶如下所述。
[0279] A.磷脂酶
[0280] 酶可以包含磷脂酶。
[0281] 磷脂酶可用于本文所述的任何植物生长刺激或植物健康促进目的，但特别是用于刺激植物生长，增加养分吸收和/或增加根发育和结瘤。增加根瘤的结瘤增强了植物与固氮微生物在土壤中形成共生关系的能力，从而增加了氮的吸收和提高了生长速度。这些影响还导致对环境压力的敏感性降低，例如干旱。
[0283] 如果酶包含磷脂酶，则磷脂酶可以包含磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D、磷脂酶E或其任何组合。
[0284] 例如，磷脂酶可以包含磷脂酶A、磷脂酶C、磷脂酶D或其任何组合。
[0285] 当磷脂酶包含磷脂酶A时，磷脂酶A可以包含磷脂酶A1、磷脂酶A2或其组合。
[0286] 磷脂酶A2可以包含IIA组磷脂酶A2、IIC组磷脂酶A2、IID组磷脂酶A2、IIE组磷脂酶A2、IIF组磷脂酶A2、III组磷脂酶A2、IVA组磷脂酶A2、IVB组磷脂酶A2、IVC组磷脂酶A2、IVD组磷脂酶A2、IVE组磷脂酶A2、VIF组磷脂酶A2、V组磷脂酶A2、VI组磷脂酶A2、VII组磷脂酶A2、X组磷脂酶A2、XIIA组磷脂酶A2、XIIB组磷脂酶A2、XV组磷脂酶A2、XVI组磷脂酶A2或其任何组合。
[0287] 当磷脂酶包含磷脂酶B时，磷脂酶B可以包含磷脂酶B1.
[0288] 当磷脂酶包含磷脂酶C时，磷脂酶C可以包含磷脂酶Cβ1、磷脂酶Cβ2、磷脂酶Cβ3、磷脂酶Cβ4、磷脂酶Cδ1、磷脂酶Cδ3、磷脂酶Cδ4、磷脂酶Cε1、磷脂酶Cγ1、磷脂酶Cγ2、磷脂酶Cη1、磷脂酶Cη2、磷脂酶Cξ1或其任何组合。
[0289] 当磷脂酶包含磷脂酶D时，磷脂酶D可以包含磷脂酶D1、磷脂酶D2、磷脂酶D成员3、磷脂酶D成员4、磷脂酶D成员5、磷脂酶D成员6或其任何组合。
[0290] 磷脂酶可包含1-烷基-2-乙酰基甘油磷酸酯酶，磷脂酰肌醇脱酰酶，磷酸肌醇磷脂酶C，鞘磷脂磷酸二酯酶，鞘磷脂磷酸二酯酶D，烷基甘油磷酸乙醇胺磷酸二酯酶，变体表面糖蛋白磷脂酶C，糖基磷脂酰肌醇磷脂酶D，N-乙酰基磷脂酰乙醇胺水解磷脂酶D，磷脂酰肌醇二酰基甘油裂解酶，糖基磷脂酰肌醇二酰基甘油裂解酶，含有马铃薯糖蛋白样磷脂酶结构域的蛋白2(PNPLA2)，含有马铃薯糖蛋白样磷脂酶结构域的蛋白3(PNPLA3)或其任何组合。
[0291] 磷脂酶可包含链霉菌属磷脂酶(例如色褐链霉菌磷脂酶例如色褐链霉菌磷磷脂酶D)，芽孢杆菌属磷脂酶(例如蜡状芽孢杆菌磷脂酶例如蜡状芽孢杆菌磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C或蜡状芽孢杆菌磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C或苏云金芽孢杆菌磷脂酶)，梭菌属磷脂酶(例如产气荚膜梭菌磷脂酶例如产气荚膜梭菌磷脂酶C)或其任何组合。
[0292] 磷脂酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.13–19和115–117中的任一个具有至少70％的同一性。
[0293] 磷脂酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.13–19和115–117中的任一个具有至少75％的同一性。
[0294] 磷脂酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.13–19和115–117中的任一个具有至少80％的同一性。
[0295] 磷脂酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.13–19和115–117中的任一个具有至少85％的同一性。
[0296] 磷脂酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.13–19和115–117中的任一个具有至少90％的同一性。
[0297] 磷脂酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.13–19和115–117中的任一个具有至少95％的同一性。
[0298] 磷脂酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.13–19和115–117中的任一个具有至少98％的同一性。
[0299] 磷脂酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.13–19和115–117中的任一个具有至少99％的同一性。
[0300] 磷脂酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.13–19和115–117中的任一个具有100％的同一性。
[0301] 如果磷脂酶包含蜡状芽孢杆菌磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C(例如SEQ ID NO:115)，则方法还可以包含将甘露聚糖酶(例如SEQ ID NO:128)或木糖葡聚糖酶(例如SEQ ID NO:125)施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0302] 如果磷脂酶包含蜡状芽孢杆菌磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C(例如SEQ ID NO:115)，则还可以用甘露聚糖酶(例如SEQ ID NO:128)或木糖葡聚糖酶(例如SEQ ID NO:125)处理种子。
[0303] 如果磷脂酶包含蜡状芽孢杆菌磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C(例如SEQ ID NO:115)，则组合物还可以包含甘露聚糖酶(例如SEQ ID NO:128)或木糖葡聚糖酶(例如SEQ ID NO:125)。
[0304] 蜡状芽孢杆菌磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C和甘露聚糖酶可以以协同作用的有效量存在于方法中，种子上或组合物中。
[0305] 蜡状芽孢杆菌磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C和木糖葡聚糖酶可以以协同作用有效量存在于方法中，种子上或组合物中。
[0306] B.脂肪酶
[0307] 酶可以包含脂肪酶。
[0308] 脂肪酶是对脂质具有特异活性的酶，其裂解较大脂质分子(例如甘油三酯)的脂肪酸链。脂肪酶可用于本文所述的任何植物生长刺激或植物健康促进目的，但特别适合刺激植物生长和增强营养摄取。这些影响转而导致作物产量增加，季节活力提高，植物对早季胁迫的敏感性降低。
[0309] 脂肪酶可以包含羧基酯脂肪酶、二酰甘油脂肪酶α、二酰甘油脂肪酶β、脂肪酶A、肝脂肪酶、激素敏感性脂肪酶、胃脂肪酶、内皮脂肪酶、成员H脂肪酶、脂肪酶家族成员I、脂肪酶家族成员J、脂肪酶家族成员K、脂肪酶家族成员M、脂肪酶家族成员N、脂蛋白脂肪酶、单酸甘油酯脂肪酶、胰腺脂肪酶-相关蛋白2、胰腺脂肪酶-相关蛋白3、酰基甘油脂肪酶、半乳糖脂肪酶、脂蛋白脂肪酶或其任何组合。
[0310] 脂肪酶可以包含枯草芽孢杆菌脂肪酶、苏云金芽孢杆菌脂肪酶、蜡状芽孢杆菌脂肪酶、克劳氏芽孢杆菌脂肪酶、洋葱伯霍尔德杆菌脂肪酶、嗜热脂肪伯霍尔德菌脂肪酶、假单胞菌属脂肪酶或其任何组合。
[0311] 脂肪酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:20、21和118–120具有至少70％的同一性。
[0312] 脂肪酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:20、21和118–120具有至少75％的同一性。
[0313] 脂肪酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:20、21和118–120具有至少80％的同一性。
[0314] 脂肪酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:20、21和118–120具有至少85％的同一性。
[0315] 脂肪酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:20、21和118–120具有至少90％的同一性。
[0316] 脂肪酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:20、21和118–120具有至少95％的同一性。
[0317] 脂肪酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:20、21和118–120具有至少98％的同一性。
[0318] 脂肪酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:20、21和118–120具有至少99％的同一性。
[0319] 脂肪酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:20、21和118–120具有100％的同一性。
[0320] C.木聚糖酶
[0321] 酶可以包含木聚糖酶。
[0322] 木聚糖酶作用于植物和土壤中发现的多糖木聚糖，即普通糖。木聚糖酶可用作种子处理，递送至植物生长培养基(例如通过犁沟施用或作为土壤改良剂)或作为叶面处理施用于植物上以产生可以由植物吸收的较小糖链或用于喂养周围的微生物组。
[0323] 如果酶包含木聚糖酶，则木聚糖酶可以包含β-木聚糖酶。
[0324] 例如，β-木聚糖酶可以包含葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内-1,4-β-木聚糖酶、外-1,4-β-木聚糖酶、内-1,4-β-木聚糖酶或其任何组合。
[0325] 木聚糖酶可以包含热解纤维素菌属木聚糖酶(例如极端嗜热纤维素降解菌木聚糖酶)、芽孢杆菌属木聚糖酶(例如枯草芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌木聚糖酶)、新丽鞭毛菌木聚糖酶(例如帕氏新考玛脂霉木聚糖酶)、嗜热真菌木聚糖酶(例如嗜热棉毛菌木聚糖酶)或其任何组合。
[0326] 木聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.22–25、121和122中的任一个具有至少70％的同一性。
[0327] 木聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.22–25、121和122中的任一个具有至少75％的同一性。
[0328] 木聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.22–25、121和122中的任一个具有至少80％的同一性。
[0329] 木聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.22–25、121和122中的任一个具有至少85％的同一性。
[0330] 木聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.22–25、121和122中的任一个具有至少90％的同一性。
[0331] 木聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.22–25、121和122中的任一个具有至少95％的同一性。
[0332] 木聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.22–25、121和122中的任一个具有至少98％的同一性。
[0333] 木聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.22–25、121和122中的任一个具有至少99％的同一性。
[0334] 木聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.22–25、121和122中的任一个具有100％的同一性。
[0335] D.木糖苷酶
[0336] 酶可以包含木糖苷酶。
[0337] 木糖苷酶从木聚糖的较短片段切割单个木糖分子，所述木聚糖是在植物和土壤中发现的常见多糖。木糖苷酶可用作种子处理，递送至植物生长培养基(例如通过犁沟施用或作为土壤改良剂)或作为叶面处理施用于植物上以产生较小的糖链，可以通过植物或用于喂养周围的微生物组。
[0338] 例如，木糖苷酶可以包含极端嗜热纤维素降解菌木糖苷酶、短小芽孢杆菌木糖苷酶或其组合。
[0339] 木糖苷酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:26或123具有至少70％的同一性。
[0340] 木糖苷酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:26或123具有至少75％的同一性。
[0341] 木糖苷酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:26或123具有至少80％的同一性。
[0342] 木糖苷酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:26或123具有至少85％的同一性。
[0343] 木糖苷酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:26或123具有至少90％的同一性。
[0344] 木糖苷酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:26或123具有至少95％的同一性。
[0345] 木糖苷酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:26或123具有至少98％的同一性。
[0346] 木糖苷酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:26或123具有至少99％的同一性。
[0347] 木糖苷酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:26或123具有100％的同一性。
[0348] E.内酯酶
[0349] 酶可以包含内酯酶。
[0350] 内酯酶可用于本文所述的任何植物生长刺激或植物健康促进目的，但特别是用于降低植物对病原体的易感性。内酯酶也被描述为酰基-高丝氨酸内酯酶，并且是由某些细菌种类产生的金属酶。例如，内酯酶可见于假单胞菌和芽孢杆菌属细菌中的拟杆菌门，硬壁菌门，放线细菌门和其它细菌。内酯酶靶向并灭活酰化高丝氨酸内酯。内酯酶水解小激素样分子的酯键，通常称为高丝氨酸内酯。在这些内酯键的水解中，内酯酶起到防止这些高丝氨酸内酯与其转录调节的靶标结合从而干扰群体感应的作用。然而，从土壤或植物定殖的天然细菌分泌的内酯酶是有限的和可诱导的，因此需要向植物环境提供更高水平的内酯酶。
[0351] 表达内酯酶的游离内酯酶或重组细菌可以施用于植物(例如叶面或作为种子处理)或植物生长培养基，以降低环境中内酯的水平。不受任何特定理论的束缚，据信内酯水平的这种降低可以转而导致植物疾病的减少，以及植物生长和发育的二次增加。
[0352] 当在重组微生物中表达时，向内酯酶添加分泌信号将允许微生物将内酯酶分泌到环境中。适合的分泌信号在下面第XII部分中进一步描述。
[0353] 如果酶包含内酯酶，则内酯酶可以包含1,4-内酯酶、2-吡喃酮-4,6-二羧酸酯内酯酶、3-氧代己二酸酯烯醇-内酯酶、放线菌素内酯酶、脱氧柠檬酸盐A-环-内酯酶、葡糖醛酸内酯酶、L-鼠李糖-1,4-内酯酶、柠檬碱-D-环-内酯酶、类固醇-内酯酶、三乙酸酯-内酯酶、木糖-1,4-内酯酶或其任何组合。
[0354] 内酯酶可以包含芽孢杆菌属内酯酶(例如苏云金芽孢杆菌内酯酶、假蕈状芽孢杆菌内酯酶或其组合)、土壤杆菌属内酯酶、红球菌属内酯酶、链霉菌属内酯酶、节杆菌属内酯酶、鞘氨醇单胞菌属内酯酶、假单胞菌属内酯酶、克雷伯菌属内酯酶或其任何组合。
[0355] 内酯酶具有包含AiiA。
[0356] 内酯酶优选对细菌内酯高丝氨酸信号传导分子具有特异性。
[0357] 内酯酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:27或28具有至少70％的同一性。
[0358] 内酯酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:27或28具有至少75％的同一性。
[0359] 内酯酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:27或28具有至少80％的同一性。
[0360] 内酯酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:27或28具有至少85％的同一性。
[0361] 内酯酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:27或28具有至少90％的同一性。
[0362] 内酯酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:27或28具有至少95％的同一性。
[0363] 内酯酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:27或28具有至少98％的同一性。
[0364] 内酯酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:27或28具有至少99％的同一性。
[0365] 内酯酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:27或28具有100％的同一性。
[0366] F.脱乙酰壳多糖酶
[0367] 酶可以包含脱乙酰壳多糖酶。
[0368] 脱乙酰壳多糖酶可用于本文所述的任何植物生长刺激或植物健康促进目的，但特别是用于增加营养摄取和增加植物生长。这转而导致作物产量增加，季节早期活力改善和对季节早期胁迫的敏感性降低。脱乙酰壳多糖酶也可用于保护植物免于病原体。
[0369] 脱乙酰壳多糖酶可以包含外-1,4-β-D-氨基葡糖苷酶、内-1,4-β-d-氨基葡糖苷酶或其组合。
[0370] 脱乙酰壳多糖酶可以包含枯草芽孢杆菌脱乙酰壳多糖酶、链霉菌属脱乙酰壳多糖酶或其任何组合。
[0371] 脱乙酰壳多糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:29或124具有至少70％的同一性。
[0372] 脱乙酰壳多糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:29或124具有至少75％的同一性。
[0373] 脱乙酰壳多糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:29或124具有至少80％的同一性。
[0374] 脱乙酰壳多糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:29或124具有至少85％的同一性。
[0375] 脱乙酰壳多糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:29或124具有至少90％的同一性。
[0376] 脱乙酰壳多糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:29或124具有至少95％的同一性。
[0377] 脱乙酰壳多糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:29或124具有至少98％的同一性。
[0378] 脱乙酰壳多糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:29或124具有至少99％的同一性。
[0379] 脱乙酰壳多糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:29或124具有100％的同一性。
[0380] G.蛋白酶
[0381] 酶可以包含蛋白酶。
[0382] 蛋白酶可用于本文所述的任何植物生长刺激或植物健康促进目的，但特别可用于增加营养摄取和刺激植物生长。这转而导致作物产量增加，季节早期活力提高和对季节早期胁迫的敏感性降低。蛋白酶也可用于保护植物免于病原体。
[0383] 蛋白酶可以包含枯草杆菌蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白水解酶、肽酶、内肽酶、外肽酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、羧化酶、丝氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬酰胺蛋白酶、组氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或其任何组合。
[0384] 例如，蛋白酶可以包含半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、天冬酰胺蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或其任何组合。
[0385] 例如，蛋白酶可以包含金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、组氨酸蛋白酶或其任何组合。
[0386] 蛋白酶优选不由甲硫氨酸氨肽酶组成。
[0387] 蛋白酶优选不包含甲硫氨酸氨肽酶。
[0388] 蛋白酶可以包含芽孢杆菌属蛋白酶(例如枯草芽孢杆菌蛋白酶)、曲霉菌属蛋白酶或其组合。
[0389] 蛋白酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.46–48和127中的任一个具有至少70％的同一性。
[0390] 蛋白酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.46–48和127中的任一个具有至少75％的同一性。
[0391] 蛋白酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.46–48和127中的任一个具有至少80％的同一性。
[0392] 蛋白酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.46–48和127中的任一个具有至少85％的同一性。
[0393] 蛋白酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.46–48和127中的任一个具有至少90％的同一性。
[0394] 蛋白酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.46–48和127中的任一个具有至少95％的同一性。
[0395] 蛋白酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.46–48和127中的任一个具有至少98％的同一性。
[0396] 蛋白酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.46–48和127中的任一个具有至少99％的同一性。
[0397] 蛋白酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.46–48和127中的任一个具有100％的同一性。
[0398] H.葡聚糖酶
[0399] 酶可以包含葡聚糖酶。
[0400] 葡聚糖酶可用于本文所述的任何植物生长刺激或植物健康促进目的，但特别可用于增加营养摄取和刺激植物生长。这转而导致作物产量增加，季节早期活力提高和对季节早期胁迫的敏感性降低。葡聚糖酶还可用于保护植物免于病原体，并降低植物对环境胁迫的敏感性。
[0401] 葡聚糖酶使用水来破坏各个葡萄糖分子葡聚糖之间的化学键，所述葡萄糖是长链多糖。葡聚糖可以分为两种类型，α葡聚糖，去主要由葡萄糖分子的α链组成；和β葡聚糖，其主要由葡萄糖分子的β-链组成。常见的α葡聚糖包括葡聚糖，糖原，普鲁兰和淀粉。α葡聚糖通常包括α1,4；α1,6和/或α1,3葡聚糖和分支的组合。特异于切割α键的葡聚糖酶称为α-葡聚糖酶。β葡聚糖酶特异于葡聚糖之间的β键。常见的β-葡聚糖包括纤维素，昆布多糖，地衣多糖，酵母聚糖。Β葡聚糖常见于葡萄糖分子之间的b1,3；b1,4和/或b1,6键。葡聚糖酶可以是“外切”或“内切”，取决于多糖裂解的位置。α-，β-，外切-和内切-葡聚糖酶都有效刺激植物生长。
[0402] 葡聚糖酶可以包含内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或其组合。
[0403] 葡聚糖酶包含α-葡聚糖酶、β-葡聚糖酶或其组合。
[0404] 如果葡聚糖酶包含α-葡聚糖酶，则α-葡聚糖酶可以包含淀粉酶、α-1,4-葡聚糖酶、α-1,6-葡聚糖酶或其任何组合。
[0405] 如果葡聚糖酶包含β-葡聚糖酶，则β-葡聚糖酶可以包含内-β-葡聚糖酶、外-β-葡聚糖酶或其组合。
[0406] β-葡聚糖酶可以包含β-1,3-葡聚糖酶、β1,3/1,4葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶或其任何组合。
[0407] 例如，β-葡聚糖酶可以包含β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶或其组合。
[0408] β-1,3-葡聚糖酶可以包含β-1,3-内切葡聚糖酶。
[0409] β-1,4-葡聚糖酶可以包含β-1,4-内切葡聚糖酶。
[0410] 葡聚糖酶可以包含纤维素酶，糖苷水解酶，木葡聚糖：木糖葡萄糖转移酶，环庚葡聚糖酶，寡聚葡聚糖β-葡糖苷酶，环己糖葡萄糖酶，木糖葡聚糖酶，纤维素1,4-β-纤维二糖苷酶，葡聚糖内-1,3-β-D-葡糖苷酶，环麦芽糖糊精酶，葡聚糖1,3-β-葡糖苷酶，葡聚糖内-1,3-α-葡萄糖苷酶，内-1,3(4)-β-葡聚糖酶，外-β-1,4-葡聚糖酶，苔聚糖酶，昆布多糖酶，葡聚糖1,4-β-葡糖苷酶，葡聚糖内-1,6-β-葡糖苷酶，葡聚糖1,3-α-葡糖苷酶，淀粉果糖酶，昆布多糖酶或其任何组合。
[0411] 葡聚糖酶可以包含非纤维素分解的葡聚糖酶。
[0412] 在任何方法、种子或组合物中，其中葡聚糖酶包含非纤维素分解的葡聚糖酶，非纤维素分解的葡聚糖酶可以包含木糖葡聚糖酶、苔聚糖酶、淀粉酶、淀粉葡聚糖酶、淀粉葡糖苷酶、昆布多糖酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、β-1,3/1,4-葡聚糖酶、α-1,4-葡聚糖酶、α1,6-葡聚糖酶或其任何组合。
[0413] 如果葡聚糖酶包含木糖葡聚糖酶，则木糖葡聚糖酶可以包含木糖葡聚糖-特异性内-β-1,4-葡聚糖酶、木糖葡聚糖-特异性外-β-1,4-葡聚糖酶或其组合。
[0414] 木糖葡聚糖酶可以包含类芽孢杆菌属葡聚糖酶。
[0415] 如果葡聚糖酶包含木糖葡聚糖酶(例如SEQ ID NO:125)，则该方法还可以包含将甘露聚糖酶(例如SEQ ID NO:128)施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0416] 如果葡聚糖酶包含木糖葡聚糖酶(例如SEQ ID NO:125)，则还可以用甘露聚糖酶(例如SEQ ID NO:128)处理种子。
[0417] 如果葡聚糖酶包含木糖葡聚糖酶(例如SEQ ID NO:125)，则该组合物还可以包含甘露聚糖酶(例如SEQ ID NO:128)。
[0418] 木糖葡聚糖酶和甘露聚糖酶可以以协同作用有效量存在于方法中、种子上或组合物中。
[0419] 葡聚糖酶可以包含纤维素酶.
[0420] 葡聚糖酶可以包含内切纤维素酶、外切维素酶或其组合。
[0421] 葡聚糖酶可以包含热酸菌葡聚糖酶、木霉属葡聚糖酶、曲霉菌属葡聚糖酶、类芽孢杆菌属葡聚糖酶、白玉蜗牛葡聚糖酶、芽孢杆菌属葡聚糖酶或其任何组合。
[0422] 例如，葡聚糖酶可以包含环状芽孢杆菌葡聚糖酶、枯草芽孢杆菌葡聚糖酶(例如枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶或枯草芽孢杆菌β-葡糖苷酶)、苏云金芽孢杆菌葡聚糖酶(例如苏云金芽孢杆菌内切葡聚糖酶或苏云金芽孢杆菌β-糖苷酶)、蜡状芽孢杆菌葡聚糖酶(例如蜡状芽孢杆菌内切葡聚糖酶或蜡状芽孢杆菌β-糖苷酶)、里氏木霉葡聚糖酶(例如里氏木霉纤维素酶或里氏木霉β-1,4-内切葡聚糖酶)、克劳氏芽孢杆菌葡聚糖酶(例如克劳氏芽孢杆菌内切葡聚糖酶或克劳氏芽孢杆菌β-糖苷酶)、白玉蜗牛葡聚糖酶(例如白玉蜗牛β-1,3内切葡聚糖酶)、解纤维热酸菌葡聚糖酶(例如解纤维热酸菌β-1,4内切葡聚糖酶)或其任何组合。
[0423] 葡聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.30–45、125和126中的任一个具有至少70％的同一性。
[0424] 葡聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.30–45、125和126中的任一个具有至少75％的同一性。
[0425] 葡聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.30–45、125和126中的任一个具有至少80％的同一性。
[0426] 葡聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.30–45、125和126中的任一个具有至少85％的同一性。
[0427] 葡聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.30–45、125和126中的任一个具有至少90％的同一性。
[0428] 葡聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.30–45、125和126中的任一个具有至少95％的同一性。
[0429] 葡聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.30–45、125和126中的任一个具有至少98％的同一性。
[0430] 葡聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.30–45、125和126中的任一个具有至少99％的同一性。
[0431] 葡聚糖酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.30–45、125和126中的任一个具有100％的同一性。
[0432] 当葡聚糖酶在制剂中施用或其中种子用包含葡聚糖酶的种子包被制剂包被时，该制剂可适当地包含另外的农业化学品和/或微生物接种剂。例如，该制剂可适当地包含杀真菌剂，杀虫剂，杀线虫剂，肥料，植物激素，细菌接种物，真菌接种物或其任何组合。特定杀菌剂，杀虫剂，杀线虫剂，肥料，植物激素，细菌接种物和真菌接种物在下面的XVI部分中描述。
[0433] I.植酸酶
[0434] 酶可以包含植酸酶.
[0435] 植物酶作用于土壤中的植酸，即用于植物生长的游离磷酸盐源。植酸酶从植酸中去除选择的磷酸盐，并且释放的磷酸盐可以被附近的植物吸收。
[0436] 如果酶包含植酸酶，则植酸酶可以包含小麦植酸酶。
[0437] 植酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.132–134中的任一个具有至少70％的同一性。
[0438] 植酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.132–134中的任一个具有至少75％的同一性。
[0439] 植酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.132–134中的任一个具有至少80％的同一性。
[0440] 植酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.132–134中的任一个具有至少85％的同一性。
[0441] 植酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.132–134中的任一个具有至少90％的同一性。
[0442] 植酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.132–134中的任一个具有至少95％的同一性。
[0443] 植酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.132–134中的任一个具有至少98％的同一性。
[0444] 植酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.132–134中的任一个具有至少99％的同一性。
[0445] 植酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.132–134中的任一个具有100％的同一性。
[0446] 植酸酶可以包含含有SEQ ID NO.132、133和134的植酸酶混合物。
[0447] J.酸性磷酸酶
[0448] 酶可以包含酸性磷酸酶。
[0449] 酸性磷酸酶对土壤中的磷酸盐的不溶和溶解性较低的形式起作用并且释放它们被植物吸收。
[0450] 如果酶包含酸性磷酸酶，则酸性磷酸酶可以包含小麦酸性磷酸酶.
[0451] 酸性磷酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:130或131具有至少70％的同一性。
[0452] 酸性磷酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:130或131具有至少75％的同一性。
[0453] 酸性磷酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:130或131具有至少80％的同一性。
[0454] 酸性磷酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:130或131具有至少85％的同一性。
[0455] 酸性磷酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:130或131具有至少90％的同一性。
[0456] 酸性磷酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:130或131具有至少95％的同一性。
[0457] 酸性磷酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:130或131具有至少98％的同一性。
[0458] 酸性磷酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:130或131具有至少99％的同一性。
[0459] 酸性磷酸酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:130或131具有100％的同一性。
[0460] 酸性磷酸酶可以包含含有SEQ ID NO.130和131的酸性磷酸酶混合物。
[0461] 在本文所述的任何涉及使用酸性磷酸酶的方法中，该方法还可以包括将第二酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物种子周围的区域。
[0462] 在本文所述的用酸性磷酸酶处理或包被的植物种子中，该种子可以用第二酶进一步处理或包被。
[0463] 包含酸性磷酸酶的本文所述的任何组合物还具有包含第二酶。
[0464] 第二酶可以包含脂肪酶、磷脂酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、苔聚糖酶或其任何组合。脂肪酶、磷脂酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶或苔聚糖酶可以包含本文所述的脂肪酶、磷脂酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶或苔聚糖酶中的任一个。
[0465] K.果胶酶
[0466] 酶可以包含果胶酶。
[0468] 如果酶包含果胶酶，则果胶酶可以包含果胶酶。
[0469] 例如，果胶酶可以包含日本曲霉菌果胶酶。
[0470] 果胶酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:129具有至少70％的同一性。
[0471] 果胶酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:129具有至少75％的同一性。
[0472] 果胶酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:129具有至少80％的同一性。
[0473] 果胶酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:129具有至少85％的同一性。
[0474] 果胶酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:129具有至少90％的同一性。
[0475] 果胶酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:129具有至少95％的同一性。
[0476] 果胶酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:129具有至少98％的同一性。
[0477] 果胶酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:129具有至少99％的同一性。
[0478] 果胶酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:129具有100％的同一性。
[0479] L.甘露聚糖酶
[0480] 酶可以包含甘露聚糖酶。
[0481] 甘露聚糖酶作用于葡甘露聚糖和相关多糖以释放少量糖。植物将少量糖作为碳源吸收，并且也可以喂养植物周围的固有微生物。
[0482] 如果酶包含甘露聚糖酶，则甘露聚糖酶可以包含芽孢杆菌属甘露聚糖酶。
[0483] 甘露聚糖酶可以包含氨基序列，其与SEQ ID NO:128具有至少70％的同一性。
[0484] 甘露聚糖酶可以包含氨基序列，其与SEQ ID NO:128具有至少75％的同一性。
[0485] 甘露聚糖酶可以包含氨基序列，其与SEQ ID NO:128具有至少80％的同一性。
[0486] 甘露聚糖酶可以包含氨基序列，其与SEQ ID NO:128具有至少85％的同一性。
[0487] 甘露聚糖酶可以包含氨基序列，其与SEQ ID NO:128具有至少90％的同一性。
[0488] 甘露聚糖酶可以包含氨基序列，其与SEQ ID NO:128具有至少95％的同一性。
[0489] 甘露聚糖酶可以包含氨基序列，其与SEQ ID NO:128具有至少98％的同一性。
[0490] 甘露聚糖酶可以包含氨基序列，其与SEQ ID NO:128具有至少99％的同一性。
[0491] 甘露聚糖酶可以包含氨基序列，其与SEQ ID NO:128具有100％的同一性。
[0492] M.ACC脱氨酶
[0493] 酶可以包含ACC脱氨酶。
[0494] ACC脱氨酶可以包含上面第II部分中所述的酶中的任一个。
[0495] ACC脱氨酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–12、113和114中的任一个具有至少70％的同一性。
[0496] ACC脱氨酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–12、113和114中的任一个具有至少75％的同一性。
[0497] ACC脱氨酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–12、113和114中的任一个具有至少80％的同一性。
[0498] ACC脱氨酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–12、113和114中的任一个具有至少85％的同一性。
[0499] ACC脱氨酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–12、113和114中的任一个具有至少90％的同一性。
[0500] ACC脱氨酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–12、113和114中的任一个具有至少95％的同一性。
[0501] ACC脱氨酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–12、113和114中的任一个具有至少98％的同一性。
[0502] ACC脱氨酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–12、113和114中的任一个具有至少99％的同一性。
[0503] ACC脱氨酶可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–12、113和114中的任一个具有100％的同一性。
[0504] N.扩展蛋白
[0505] 扩展蛋白有助于植物壁在植物生长期间膨胀。因此，扩展蛋白别适用于刺激本文所述植物生长的任何方法。
[0506] 扩展蛋白可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:74具有至少70％的同一性。
[0507] 扩展蛋白可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:74具有至少75％的同一性。
[0508] 扩展蛋白可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:74具有至少80％的同一性。
[0509] 扩展蛋白可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:74具有至少85％的同一性。
[0510] 扩展蛋白可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:74具有至少90％的同一性。
[0511] 扩展蛋白可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:74具有至少95％的同一性。
[0512] 扩展蛋白可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:74具有至少98％的同一性。
[0513] 扩展蛋白可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:74具有至少99％的同一性。
[0514] 扩展蛋白可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:74具有100％的同一性。
[0516] 在本文所述的任何方法中，该方法还可以包括将肥料、生物刺激素或其组合施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0517] 对于本文所述的任何植物种子，还可以用肥料、生物刺激素或其组合处理或包被植物种子。
[0519] 例如，肥料可以包含12％氨氮和58％可利用磷酸盐。
[0520] 可以使用如下面第XVI部分中所述的其它肥料。
[0521] 生物刺激素可以包含赤霉酸、吲哚-3-丁酸、激动素、生长素、生长素同源物或衍生物或其任何组合。
[0522] 在涉及使用肥料和/或生物刺激素的任何方法或种子中，酶适合地包含酸性磷酸酶、磷脂酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶或其任何组合。酸性磷酸酶、磷脂酶、甘露聚糖酶或葡聚糖酶可以包含本文所述的酸性磷酸酶、磷脂酶、甘露聚糖酶或葡聚糖酶中的任一个。
[0523] IX.酶制剂
[0524] 在涉及使用游离酶和/或扩展蛋白的本文所述的任何方法、种子或组合物中，酶或扩展蛋白可以包含粗细胞过提取物，其包含酶或扩展蛋白、部分纯化的酶或扩展蛋白或基本上纯化的酶或扩展蛋白。
[0525] 在涉及使用游离酶和/或扩展蛋白的本文所述的任何方法、种子或组合物中，酶或扩展蛋白优选不含结合至蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁的酶或扩展蛋白。
[0526] 在涉及使用游离酶和/或扩展蛋白的本文所述的任何方法、种子或组合物中，酶或扩展蛋白优选不与完整蜡状芽孢杆菌家族成员孢子的外孢壁结合。
[0527] X.酶和/或扩展蛋白的固定化
[0528] 在本文所述包括使用游离酶和/或扩展蛋白的任何方法、种子或组合物中，酶或扩展蛋白可以包含固定在基质或支持物上的酶或扩展蛋白。
[0529] 基质或支持物可以包含木炭，生物炭，纳米碳，琼脂糖，藻酸盐，纤维素，纤维素衍生物，二氧化硅，塑料，不锈钢，玻璃，聚苯乙烯，陶瓷，白云石，粘土，硅藻土，滑石粉，聚合物，树胶，水分散性材料或其任何组合。
[0530] 与在相同条件下相同的非固定化酶或扩展蛋白的释放速率相比，酶或扩展蛋白在基质或支持物上的固定优选导致所述酶或扩展蛋白较慢地释放到环境中或植物或植物种子上。
[0531] XI.制备游离酶的方法
[0532] 游离酶可通过本领域通常已知的许多标准生物化学和分子生物学方法制备。例如，可以使用聚合酶链反应(PCR)从染色体DNA扩增编码酶的基因，并将其克隆入适合的载体(例如质粒载体)中。载体适当地包含多个克隆位点，其中可以容易地插入编码融合蛋白的DNA分子。载体还适当地含有选择标记，例如抗生素抗性基因，使得可以容易地鉴定和分离转化、转染或与载体成对的细菌。当载体是质粒时，质粒也适当地包含复制起点。或者，编码酶蛋白的DNA可以整合到微生物宿主的染色体DNA中。
[0533] 然后可以培养宿主并且从培养物中收获酶。可以使用采用细胞提取物或可以使用标准生化技术部分或基本上纯化酶。
[0534] 然后可以培养宿主并从培养物中收获酶。可以使用粗细胞提取物，或者可以使用标准生物化学技术部分或基本纯化酶。用于大规模生产酶的适合的宿主包括、但不限于芽孢杆菌属种类(例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、梭状杆菌、蜡状芽孢杆菌或蕈状芽孢杆菌)、大肠杆菌、黑色曲霉、木曲霉、链霉菌属的种类、克雷伯菌属种类、毛霉属种类、根霉菌属种类、被孢霉菌属种类、克鲁维酵母属种类、假丝酵母属种类、产黄青霉、木霉属种类、酿酒酵母、毕赤氏酵母、多形汉森酵母、乳克鲁维酵母、解脂耶氏酵母、粟酒裂殖酵母和产阮假丝酵母。
[0536] 或者，酶可以通过筛选微生物和选择表达高水平酶的微生物来产生。这可以通过在含有酶底物作为微生物的营养源的营养培养基中的初始选择，富集和/或筛选来完成。通常使用差异营养培养基进行另外的选择，所述差异营养培养基具有指示物以证明由所鉴定的微生物产生的酶的酶水平和活性。可以突变这些微生物并筛选产生这些酶水平增加的分离物。这些微生物可用于大批量和连续发酵方法中以产生和分泌足够量的酶。优化发酵过程和条件通常可以增加微生物的输出量。
[0537] 还可以使用真核细胞系以高水平产生酶，其中许多细胞系可以被改造以分泌高水平的酶，具有不同水平的关键翻译后修饰和宿主酶产生问题的减少的优点。这些也可以扩展到更大的细胞培养生产规模的容器和酶，如上所述进行纯化和处理。用于产生酶的适合的真核细胞系的实例包括但不限于：源自昆虫的昆虫细胞，例如家蚕，蝙蝠蛾，草地贪夜蛾，粉纹夜蛾或黑腹果蝇；和源自脊椎动物的脊椎动物细胞系，例如小鼠，大鼠，仓鼠，人或狗。
[0538] 其它潜在的酶来源包括细胞-游离蛋白表达载体，包括源自动物，细菌，真菌和植物来源的载体。
[0539] 转基因生物如植物，家兔，小鼠，鸡或青蛙也可用于生产重组酶。例如，可以将植物改造成过表达酶，然后可以从植物中收集酶并纯化或用作粗提取物。这种生产系统允许酶的低成本表达并提供递送至植物的材料来源。这些方法具有额外的优点，即易于按比例放大并且耗费最少。
[0540] 在这些生产系统的每一个中，可以通过遗传改造和制剂的方法提高所需酶的产量和质量。例如，基因工程可能涉及创建高水平表达盒和生产系统，从生产微生物中去除蛋白酶和降解基因，优化酶的热稳定性和长期储存稳定性以及提高酶或生产微生物的能力以将成熟酶分泌到培养基中，便于收集和使用。另外，表达菌株可用于诱导点突变，其可导致产生足够或增加的酶水平的能力增加。在一些情况下，还可以使用生产微生物并将其递送至植物种子，植物周围附近，植物根部或植物附近，以在植物上原位获得所需效果。
[0541] 酶的其它来源包括从动物，植物，昆虫，海藻或其它生物提取物中提取。以这种方式产生和/或纯化的工业规模酶的常见来源包括猪和牛内部组织，例如皱胃，肝脏，粘膜，胰腺，以及植物来源，例如番木瓜。另一个实例是从大麦中纯化葡聚糖酶。
[0542] 许多商业来源的酶来自具有高水平靶酶的组织，其可以原样使用或以纯化形式用于农业用途。
[0543] XII.信号肽
[0544] 任何信号肽可用于修饰本文所述的任何酶，使得酶将从表达它的宿主微生物中分泌。所用信号肽的类型主要取决于宿主微生物的特性，因为不同微生物的分泌机制在识别特定信号肽的能力方面会有所不同。下面在表16中提供了示例性的信号肽序列，以及在自然界中发现信号肽的细菌物种。信号肽将导致它们在发现它们的细菌属中与其相关的蛋白质的分泌以及密切相关的属。例如，来自苏云金芽孢杆菌的信号序列将导致芽孢杆菌属的细菌以及类芽孢杆菌属和赖氨酸杆菌属的细菌中的蛋白质分泌。
[0545] 为了便于参考，描述了用于示例性信号肽的氨基酸序列，其可以添加到本文所述的任何酶或扩展蛋白中，以引起酶或扩展蛋白的分泌。表达它的微生物如下表16所示。下表16中列出的任何信号肽可以在本文所述的任何酶或扩展蛋白的氨基末端添加，以引起酶或扩展蛋白的分泌。
[0546] 表16.信号肽的氨基酸序列
[0547]
[0548]
[0549] 例如，信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–73、135和137–147中的任一个具有至少70％的同一性。
[0550] 例如，信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–73、135和137–147中的任一个具有至少75％的同一性。
[0551] 例如，信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–73、135和137–147中的任一个具有至少80％的同一性。
[0552] 例如，信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–73、135和137–147中的任一个具有至少85％的同一性。
[0553] 例如，信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–73、135和137–147中的任一个具有至少90％的同一性。
[0554] 例如，信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–73、135和137–147中的任一个具有至少95％的同一性。
[0555] 例如，信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–73、135和137–147中的任一个具有至少98％的同一性。
[0556] 例如，信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–73、135和137–147中的任一个具有至少99％的同一性.
[0557] 例如，信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–73、135和137–147中的任一个具有100％的同一性。
[0558] 适用于芽孢杆菌属细菌、类芽孢杆菌属细菌或赖氨酸杆菌属细菌的信号肽如SEQ ID NO.49–51、54、56–73、135、139、140和142中所示。
[0559] 因此，例如，信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–51、54、56–73、135、139、140和142中的任一个具有至少70％的同一性。
[0560] 信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–51、54、56–73、135、139、140和142中的任一个具有至少75％的同一性。
[0561] 信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–51、54、56–73、135、139、140和142中的任一个具有至少80％的同一性。
[0562] 信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–51、54、56–73、135、139、140和142中的任一个具有至少85％的同一性。
[0563] 信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–51、54、56–73、135、139、140和142中的任一个具有至少90％的同一性。
[0564] 信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–51、54、56–73、135、139、140和142中的任一个具有至少95％的同一性。
[0565] 信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–51、54、56–73、135、139、140和142中的任一个具有至少98％的同一性.
[0566] 信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–51、54、56–73、135、139、140和142中的任一个具有至少99％的同一性。
[0567] 信号肽可以包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–51、54、56–73、135、139、140和142中的任一个具有100％的同一性。
[0568] 因此，例如，当信号肽包含与SEQ ID NO.49–51、54、56–73、135、139、140和142中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列时，其中适当表达酶或扩展蛋白的微生物包含芽孢杆菌属细菌、类芽孢杆菌属细菌、赖氨酸杆菌属细菌、假单胞菌属细菌或其任何组合。
[0569] 例如，微生物可以包含蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、阿耶波多芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、尼氏芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、长赖氨酸芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌、梭形赖氨酸芽孢杆菌或其任何组合。
[0570] 微生物优选包含苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、长赖氨酸芽孢杆菌、梭形赖氨酸芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌或其任何组合。
[0571] 信号肽优选存在于所述酶或扩展蛋白的氨基末端上。
[0572] XIII.重组微生物
[0573] 重组维生素、包含重组微生物的制剂和组合物、用于使用重组微生物的方法和用重组微生物处理的种子如上文所述。
[0574] 在本文所述的任何重组微生物、制剂、组合物、方法或种子中，所述酶或扩展蛋白可以中组成型启动子控制下表达。
[0575] 在本文所述的任何重组微生物、制剂、组合物、方法或种子中，所述酶或扩展蛋白可以中诱导型启动子控制下表达。
[0576] 在本文所述的任何重组微生物、制剂、组合物、方法或种子中，所述重组微生物可以包含芽孢杆菌属细菌、类芽孢杆菌属细菌、赖氨酸杆菌属细菌、曲霉属细菌、球囊霉属细菌、假单胞菌属细菌、节杆菌属细菌、副球菌属细菌、根瘤菌属细菌、短根瘤菌属细菌、固氮螺菌属细菌、肠杆菌属细菌、埃希氏菌属细菌或其任何组合。
[0577] 如果重组微生物包含重组产芽孢微生物，则该重组产芽孢微生物可以包含芽孢杆菌属细菌、类芽孢杆菌属细菌、赖氨酸杆菌属细菌、曲霉属细菌、球囊霉属真菌或其任何组合。
[0578] 对于本文所述的任何重组微生物、制剂、组合物、方法或种子，所述重组微生物适合地包含芽孢杆菌属细菌、类芽孢杆菌属细菌、赖氨酸杆菌属细菌或其任何组合。
[0579] 例如，重组微生物可以包含蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、阿耶波多芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、尼氏芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌或其任何组合。
[0580] 重组微生物适合地包含苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、长赖氨酸芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌,纺锤形赖氨酸芽孢杆菌或其组合。
[0581] 对于本文所述的任何重组微生物、制剂、组合物、方法或种子，重组微生物可以包含促进植物生长的细菌菌株、细菌内寄生菌菌株或促进植物生长和内寄生菌的菌株。
[0582] 菌株可以产生杀昆虫毒素(例如Cry毒素)，产生杀真菌化合物(例如β-1,3-葡聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶、溶细胞酶或其组合)，产生杀线虫化合物(例如Cry毒素)，产生杀菌化合物，对一种或多种抗生素产生抗性，包含一种或多种可自由复制的质粒，结合植物根，定殖植物根，形成生物被膜，溶解营养物，分泌有机酸或其组合。
[0583] 例如，菌株可以包括：
[0584] (a)阿耶波多芽孢杆菌CAP53(NRRL No.B-50819),
[0585] (b)阿耶波多芽孢杆菌CAP56(NRRL No.B-50817),
[0586] (c)弯曲芽孢杆菌BT054(NRRL No.B-50816),
[0587] (d)孔氏副球菌NC35(NRRL No.B-50820),
[0588] (e)蕈状芽孢杆菌BT155(NRRL No.B-50921),
[0589] (f)阴沟肠杆菌CAP12(NRRL No.B-50822),
[0590] (g)尼氏芽孢杆菌BOBA57(NRRL No.NRRL B-50821),
[0591] (h)蕈状芽孢杆菌EE118(NRRL No.B-50918),
[0592] (i)枯草芽孢杆菌EE148(NRRL No.B-50927),
[0593] (j)粪产碱菌EE107(NRRL No.B-50920),
[0594] (k)蕈状芽孢杆菌EE141(NRRL NO.B-50916),
[0595] (l)蕈状芽孢杆菌BT46-3(NRRL No.B-50922),
[0596] (m)蜡状芽孢杆菌家族成员EE128(NRRL No.B-50917),
[0597] (n)马赛类芽孢杆菌BT23(NRRL No.B-50923),
[0598] (o)蜡状芽孢杆菌家族成员EE349(NRRL No.B-50928),
[0599] (p)枯草芽孢杆菌EE218(NRRL No.B-50926),
[0600] (q)巨大芽孢杆菌EE281(NRRL No.B-50925),
[0601] (r)蜡状芽孢杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)；
[0602] (s)假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120),
[0603] (t)蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL B-67121),
[0604] (u)短小芽孢杆菌EE-B00143(NRRL B-67123),
[0605] (v)苏云金芽孢杆菌EE-B00184(NRRL B-67122),
[0606] (w)蕈状芽孢杆菌EE116(NRRL No.B-50919),
[0607] (x)蜡状芽孢杆菌家族成员EE417(NRRL No.B-50974),
[0608] (y)枯草芽孢杆菌EE442(NRRL No.B-50975),
[0609] (z)枯草芽孢杆菌EE443(NRRL No.B-50976),
[0610] (aa)蜡状芽孢杆菌家族成员EE444(NRRL No.B-50977),
[0611] (bb)枯草芽孢杆菌EE405(NRRL No.B-50978),
[0612] (cc)蜡状芽孢杆菌家族成员EE439(NRRL No.B-50979),
[0613] (dd)巨大芽孢杆菌EE385(NRRL No.B-50980),
[0614] (ee)蜡状芽孢杆菌家族成员EE387(NRRL No.B-50981),
[0615] (ff)环状芽孢杆菌EE388(NRRL No.B-50982),
[0616] (gg)苏云金芽孢杆菌EE319(NRRL No.B-50983),
[0617] (hh)蜡状芽孢杆菌家族成员EE377(NRRL No.B-67119),
[0618] (ii)蕈状芽孢杆菌EE363(NRRL No.B-67121),
[0619] (jj)假蕈状芽孢杆菌EE366(NRRL No.B-67120)；
[0620] (kk)苏云金芽孢杆菌BT013A(NRRL No.B-50924)；
[0621] 或其组合。
[0622] 已经将这些菌株各自保藏在United States Department of Agriculture(USDA)Agricultural Research Service(ARS)，地址为1815 North University Street,Peoria,Illinois 61604 U.S.A.，并且鉴定为圆括号内提供的NRRL保藏号。菌株(a)–(d)、(f)和(g)于2013年3月11日保藏。菌株(e)、(h)–(q)、(w)和(kk)于2014年3月10日保藏。菌株(x)–(ff)于2014年9月10日保藏。菌株(gg)于2014年9月17日保藏。菌株(r)–(v)、(hh)、(ii)和(jj)于2015年8月19日保藏。苏云金芽孢杆菌BT013A也称作苏云金芽孢杆菌4Q7。
[0624] 表17.部分16S核糖体RNA序列
[0625]
[0626]
[0627] 内寄生菌微生物可以用于酶的表达。尽管根围的许多微生物与植物具有共生关系，但是仅这些微生物的少部分能够被摄入植物并且以内寄生菌方式生长。已从玉米幼苗中分离出几种蜡状芽孢杆菌家族成员菌株和几种非蜡状芽孢杆菌家族成员细菌菌株，并且发现它们具有在植物中以内寄生菌方式生长的能力。另外的内寄生菌微生物也可能是有用的，包括但不限于来自如下属的细菌内生菌：纤维单胞菌、棍状杆菌、短小杆菌、假单胞菌、类芽孢杆菌、肠杆菌、芽孢杆菌、克雷白菌、结杆菌属、赖氨酸杆菌、成团泛菌、放线菌、糖酵母、产碱菌和小细菌。还可以使用真菌内生菌，包括来自如下属的内生菌：Neotyphodium、Gliocadium、Acremonium lolii、麦角菌、子囊菌、Idriella、Xylariaceous、子囊菌、半知菌、曲霉菌、拟茎点霉、Wardomyces、镰刀菌、Dreschrella、盘多毛孢菌、弯孢菌、腐质霉、多节孢菌和青霉菌。
[0628] 许多微生物可以在植物附近定殖，生活在其附近，生活在其上或变得内生于植物。这些微生物将为植物，种子，植物附近或植物生长培养基提供靶酶的有用递送机制。选择可以定殖根或内生的微生物可以进行筛选，重组修饰以表达或过表达商业上产生的酶，并施用于种子，植物或植物周围以使该菌株原位产生靶酶(在工厂内或附近)。这些微生物也可以通过点突变或通过遗传改造来强化，以表达更高或新的靶酶以使植物受益。可以通过突变宿主微生物并通过酶测定或使用鉴定高表达酶的菌株的选择性培养基选择具有更高酶表达水平的突变体来筛选点突变。作为酶的有益生产者以及定殖者/内生菌物种的常见菌株包括：土壤芽孢杆菌、鲇泽芽孢杆菌、乳白芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌，蜡状芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，内寄生芽孢杆菌，内源嗜血芽孢杆菌，库斯塔克杆菌，乳酸芽孢杆菌，乳病杆菌，坚强芽孢杆菌，乳杆菌，水母芽孢杆菌，侧孢芽孢杆菌，缓病芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，巨大芽孢杆菌，Bacillus metiens，纳豆芽孢杆菌，黑芽孢杆菌，甲虫芽孢杆菌，短小芽孢杆菌，暹罗芽孢杆菌，球形芽孢杆菌，枯草芽孢杆菌，苏云金芽孢杆菌，Bacillus unifagellatu，其它芽孢杆菌属种类或其组合，与Bacillus Genus in Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology,第1版(1986)的类别中列出的那些，其在此通过引用整体地并入。其它可能的菌株可以包括但不限于：纤维单胞菌属、棍状杆菌属、短小杆菌属、假单胞菌属、类芽孢杆菌属、肠杆菌属、芽孢杆菌属、克雷白菌属、节杆菌属、赖氨酸杆菌属、成团泛菌、放线菌属、糖酵母属、根瘤菌属、短根瘤菌属、假丝酵母属、链霉菌属、产碱菌属、着色菌目、根瘤菌属、段根瘤菌属、Rhodospiralles、根瘤菌目、根瘤菌科和小细菌属。
[0629] 对于本文所述的任何方法或种子，重组微生物可以包含本文所述重组微生物的任何两种或更多种的混合物。
[0630] 对于本文所述的任何重组微生物、制剂、方法或种子，可以使重组微生物失活。失活产生不能复制的微生物。使微生物失活可能是有利的，例如，因为这允许将微生物递送至植物或植物生长培养基，同时减少或消除活微生物可能对植物或环境的有害作用。可以通过任何物理或化学方式使重组微生物失活，例如，通过热处理、γ照射、x-射线照射、UV-A照射、UV-B照射或用溶剂处理，例如戊二醛、甲醛、过氧化氢、乙酸、漂白剂、氯仿或苯酚或任何其组合。
[0631] XIV.用于制备重组微生物的方法
[0632] 可以使用本领域公知的标准分子生物学方法制备重组微生物。例如，可以通过聚合酶链反应(PCR)扩增编码酶的基因。如果使用信号序列，则可以使编码酶的基因连接至编码信号序列的DNA。然后可以将基因克隆入任何适合的载体，例如质粒载体。该载体适合地包含易于插入编码融合蛋白的DNA分子的多克隆位点。该载体还适合地包含选择标记，例如抗生素抗性基因，使得易于鉴定和分离用载体转化、转染或成对的细菌。如果载体是质粒，则该质粒还适合地包含复制起点。或者，可以将编码所述酶或扩展蛋白的DNA整合入微生物宿主的染色体DNA。
[0633] XV.对植物的作用
[0634] 在本文所述的任何方法中，在酶、扩展蛋白或微生物存在下生长的植物可以展示出比在相同条件下酶、扩展蛋白或微生物不存在下生长的植物增加的生长。
[0635] 对于本文所述的任何种子，从用游离酶、扩展蛋白或微生物处理的种子生长的植物可以展示出比在相同条件下从未用游离酶、扩展蛋白或微生物处理的种子生长的植物增加的生长。
[0636] 对于本文所述的任何方法或种子，已经施用酶或微生物的种子可以展示出比在相同条件下未施用酶或微生物的种子增加的发芽率。
[0637] 在本文所述的任何方法中，在酶、扩展蛋白或微生物存在下生长的植物可以展示出比在相同条件下酶、扩展蛋白或微生物不存在下生长的植物增加的营养物摄取。
[0638] 对于本文所述的任何种子，从用游离酶、扩展蛋白或微生物处理的种子生长的植物可以展示出比在相同条件下从未用游离酶、扩展蛋白或微生物处理的种子生长的植物增加的营养物摄取。
[0639] 在本文所述的任何方法中，在酶或微生物存在下生长的植物可以展示出比在相同条件下酶或微生物不存在下生长的植物对病原体降低的易感性。
[0640] 对于本文所述的任何种子，从用游离酶或微生物处理的种子生长的植物可以展示出比在相同条件下从未用游离酶或微生物处理的种子生长的植物对病原体降低的易感性。
[0641] 在本文所述的任何方法中，在酶或微生物存在下生长的植物可以展示出比在相同条件下酶或微生物不存在下生长的植物对环境应激降低的易感性。
[0642] 对于本文所述的任何种子，从用游离酶或微生物处理的种子生长的植物可以展示出比在相同条件下从未用游离酶或微生物处理的种子生长的植物对环境应激降低的易感性。
[0643] 例如，植物可以表现出对干旱、洪水、热、寒冷、盐、重金属、低pH、高pH或其任何组合的敏感性降低。
[0644] 在本文所述的任何方法中，在酶、扩展蛋白或微生物存在下生长的植物可以展示出比在相同条件下酶、扩展蛋白或微生物不存在下生长的植物增加的营养物含量。
[0645] 对于本文所述的任何种子，用游离酶、扩展蛋白或微生物处理的种子或从用游离酶、扩展蛋白或微生物处理的种子生长的微生物或植物可以展示出比在相同条件下未用游离酶、扩展蛋白或微生物处理的种子或从未用游离酶、扩展蛋白或微生物处理的种子生长的植物增加的营养物含量。
[0646] 例如，营养物可以包含多糖、蛋白质、植酸、磷酸盐、磷脂或其任何组合。
[0647] 在本文所述的任何方法中，在酶或微生物存在下生长的植物可以展示出比在相同条件下酶或微生物不存在下生长的植物增加的根结瘤。
[0648] 对于本文所述的任何种子，从用游离酶或微生物处理的种子生长的植物可以展示出比在相同条件下从未用游离酶或微生物处理的种子生长的植物增加的根结瘤。
[0649] 在本文所述的任何方法中，在酶或微生物存在下生长的植物可以展示出比在相同条件下酶或微生物不存在下生长的植物减慢的果实催熟。
[0650] 对于本文所述的任何种子，从用游离酶或微生物处理的种子生长的植物可以展示出比在相同条件下从未用游离酶或微生物处理的种子生长的植物减慢的果实催熟。
[0651] 在本文所述的任何方法中，在酶、扩展蛋白或微生物存在下生长的植物可以展示出比在相同条件下酶、扩展蛋白或微生物不存在下生长的植物更高的作物产量。
[0652] 对于本文所述的任何种子，从用游离酶或微生物处理的种子生长的植物可以展示出比在相同条件下从未用游离酶或微生物处理的种子生长的植物更高的作物产量。
[0653] 在本文所述的任何方法中，在酶或微生物存在下生长的植物可以展示出比在相同条件下酶或微生物不存在下生长的植物改变的叶枯萎。
[0654] 对于本文所述的任何种子，从用游离酶或微生物处理的种子生长的植物可以展示出比在相同条件下从未用游离酶或微生物处理的种子生长的植物改变的叶枯萎。
[0655] 减慢的叶枯萎可以导致季节中更高水平的光合作用较晚，由此导致更多的光合产物，更多谷粒充满和更大谷粒和/或增加的产量。
[0656] XVI.农用化学品的制剂、组合物和共同施用
[0657] 在本文所述的任何方法中，该方法可以包括将所述酶、扩展蛋白或微生物以包含农业上可接受的载体的制剂施用。
[0658] 对于本文所述的任何种子，可以用包含游离酶、扩展蛋白或重组微生物和农业上可接受的载体的制剂包被种子。
[0659] 本文所述的任何组合物可以包含农业上可接受的载体。
[0661] 添加剂可以包含油、树胶、树脂、粘土、聚乙二醇、萜烯、粘性有机物、脂肪酸酯、硫酸化醇、磺酸烷基酯、石油磺酸盐、硫酸乙醇、烷基丁烷酸钠、硫代丁烷二酸钠的聚酯、苯乙腈衍生物、蛋白质材料(例如乳品、面粉、大豆粉、血液、白蛋白、明胶、紫花苜蓿粉、酵母提取物或其任何组合)或其任何组合。
[0662] 增稠剂可以包含聚乙二醇的长链烷基磺酸酯、聚氧乙烯油酸酯或其任何组合。
[0663] 表面活性剂可以包含重石油、重石油蒸馏物、多元醇脂肪酸酯、聚乙氧基化脂肪酸酯、芳基烷基聚乙二醇、烷基胺乙酸酯、烷基芳基磺酸酯、多元醇、磷酸烷基酯或其任何组合。
[0664] 表面活性剂可以包含非离子表面活性剂。
[0667] 制剂或组合物可以包含种子包被制剂或组合物、施用于植物或施用于植物生长培养基的液体制剂或组合物或施用于植物或施用于植物生长培养基的固体制剂或组合物。
[0668] 种子包被制剂或组合物可以包含施用于种子的水或油基溶液或施用于种子的粉状或粒状制剂。
[0669] 施用于植物或施用于植物生长培养基的液体制剂或组合物可以包含浓缩制剂或组合物随时可用的制剂或组合物。
[0670] 施用于植物或施用于植物生长培养基的固体制剂或组合物可以包含粒状制剂或组合物或粉状试剂。
[0671] 制剂或组合物还可以包含农用化学品。
[0672] 或者或另外，本文所述的任何方法还可以包含将农用化学品施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0673] 本文所述的任何植物种子还可以用农用化学品处理或包被。
[0674] 农用化学品可以包含肥料、微量元素肥料材料、杀虫剂，杀线虫剂，除草剂、植物生长改良剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀软体动物药、杀藻剂、细菌接种物、真菌接种物、植物激素或其任何组合。
[0675] 细菌接种物可以包含细菌的促进植物生长的菌株、细菌的内生菌菌株或促进植物生长且是内生菌的细菌菌株。
[0676] 细菌的促进植物生长的菌株可以产生杀昆虫毒素(例如Cry毒素)，产生杀真菌化合物(例如β-1,3-葡聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶、溶细胞酶或其组合)，产生杀线虫化合物(例如Cry毒素)，产生杀菌化合物，对一种或多种抗生素产生抗性，包含一种或多种可自由复制的质粒，结合植物根，定殖植物根，形成生物被膜，溶解营养物，分泌有机酸或其组合。
[0677] 促进植物生长的细菌菌株可以包含阿耶波多芽孢杆菌CAP53(NRRL No.B-50819)、阿耶波多芽孢杆菌CAP56(NRRL No.B-50817)、弯曲芽孢杆菌BT054(NRRL No.B-50816)、孔氏副球菌NC35(NRRL No.B-50820)、蕈状芽孢杆菌BT155(NRRL No.B-50921)、阴沟肠杆菌CAP12(NRRL No.B-50822)、尼氏芽孢杆菌BOBA57(NRRL No.NRRL B-50821)、蕈状芽孢杆菌EE118(NRRL No.B-50918)、枯草芽孢杆菌EE148(NRRL No.B-50927)、粪产杆菌EE107(NRRL No.B-50920)、蕈状芽孢杆菌EE141(NRRL NO.B-50916)、蕈状芽孢杆菌BT46-3(NRRL No.B-50922)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE128(NRRL No.B-50917)、马赛类芽孢杆菌BT23(NRRL No.B-50923)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE349(NRRL No.B-50928)、枯草芽孢杆菌EE218(NRRL No.B-50926)、巨大芽孢杆菌EE281(NRRL No.B-50925)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)；假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120),蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL B-67121)、短小芽孢杆菌EE-B00143(NRRL B-67123)、或苏云金芽孢杆菌EE-B00184(NRRL B-67122)、蕈状芽孢杆菌EE116(NRRL No.B-50919)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE417(NRRL No.B-50974)、枯草芽孢杆菌EE442(NRRL No.B-50975)、枯草芽孢杆菌EE443(NRRL No.B-50976)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE444(NRRL No.B-50977)、枯草芽孢杆菌EE405(NRRL No.B-50978)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE439(NRRL No.B-50979)、巨大芽孢杆菌EE385(NRRL No.B-50980)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE387(NRRL No.B-50981)、环状芽孢杆菌EE388(NRRL No.B-50982)、苏云金芽孢杆菌EE319(NRRL No.B-50983)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE377(NRRL No.B-67119)、蕈状芽孢杆菌EE363(NRRL No.B-67121)、假蕈状芽孢杆菌EE366(NRRL No.B-67120)、苏云金芽孢杆菌BT013A(NRRL No.B-50924)或其任何组合。
[0678] 农用化学品可以包含肥料。
[0679] 肥料可以包含液体肥料或干燥肥料。
[0680] 农用化学品可以包含微量元素肥料材料，微量元素肥料材料包含硼酸、硼酸盐、硼釉料、硫酸铜、铜釉料、铜螯合物、四硼酸钠十水合物、硫酸铁、氧化铁、硫酸铁铵、铁釉料、铁螯合物、硫酸锰、氧化锰、锰螯合物、氯化锰、锰釉料、钼酸钠、钼酸、硫酸锌、氧化锌、碳酸锌、锌釉料、磷酸锌、锌螯合物或其任何组合。
[0682] 农用化学品可以包含除草剂，除草剂包含氯苯氧基化合物、硝基苯酚化合物、硝基甲酚化合物、二吡啶基化合物、乙酰胺、脂肪族酸、酰基苯胺、苯甲酰胺、苯甲酸、苯甲酸衍生物、茴香酸、茴香酸衍生物、苄腈、苯并噻二嗪酮二氧化物、硫代氨基甲酸酯、氨基甲酸酯、苯氨基甲酸酯、氯吡啶基化合物、氯己烯酮衍生物、二硝基氨基苯衍生物、氟二硝基甲苯胺化合物、异恶唑烷酮、烟酸、异丙基胺、异丙基胺衍生物、恶二唑啉酮、磷酸酯、邻苯二甲酸酯、吡啶甲酸化合物、三嗪、三唑、尿嘧啶、脲衍生物、草藻灭、氯酸钠或其任何组合。
[0683] 农用化学品可以包含杀真菌剂，所述杀真菌剂包含取代的苯、硫代氨基甲酸、乙烯双二硫代氨基甲酸酯、硫代邻苯二甲酰胺、铜化合物、有机汞化合物、有机锡化合物、镉化合物、敌菌灵、苯菌灵、环己酰胺、多果定、土菌灵、异菌脲、甲霜灵、硫胺酚、嗪氨灵或其任何组合。
[0684] 农用化学品可以包含真菌接种物，所述真菌接种物包含球囊霉科真菌接种物、尖叉藻科真菌接种物、巨孢囊霉科真菌接种物、无梗囊霉科科真菌接种物、囊孢菌科真菌接种物、内养囊霉科真菌接种物、海桐科真菌接种物、多孢囊霉科真菌接种物、类球囊霉科真菌接种物、原囊霉科真菌接种物、地管囊霉科真菌接种物、两性囊霉科真菌接种物、盾巨囊霉科真菌接种物、齿藓科真菌接种物、草履虫科真菌接种物、担子菌门真菌接种物、子囊菌门真菌接种物、接合菌门真菌接种物或其任何组合。
[0685] 农用化学品可以包含细菌接种物，所述细菌接种物包含根瘤菌属细菌接种物、短根瘤菌属细菌接种物、中间根瘤菌属细菌接种物、固氮根瘤菌属细菌接种物、异根瘤菌属细菌接种物、大豆根瘤菌属属细菌接种物、克罗非菌属细菌接种物、固氮菌属细菌接种物、假单胞菌属细菌接种物、固氮螺菌属细菌接种物、芽孢杆菌属细菌接种物、链霉菌属细菌接种物、类芽孢杆菌属细菌接种物、副球菌属细菌接种物、肠杆菌属细菌接种物、属细菌接种物、分枝杆菌属细菌接种物、木霉属细菌接种物、胶霉属细菌接种物、球囊霉属细菌接种物、克雷伯菌属细菌接种物或其任何组合。
[0686] 农用化学品可以包含有效量的根瘤菌。根瘤菌可以包含短根瘤菌属细菌(例如日本短根瘤菌)、根瘤菌属细菌(例如菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌或其组合)或其组合。
[0687] 农用化学品可以包含杀真菌剂，且杀真菌剂包含杀螟丹、氨丙膦酸、氨丙膦酸钾、胺扑灭、敌菌灵、阿扎康唑、腈嘧菊酯、苯霜灵、麦锈灵、苯菌灵、苄烯酸、苄烯酸异丁酯、双丙氨磷、乐杀螨、联苯、联苯三唑醇、杀稻瘟菌素-S、啶酰菌胺、糠菌唑、磺嘧菌灵、丁硫丹、多硫化钙、卡巴西霉素、敌菌丹、克菌丹、苯并咪唑氨甲酸甲酯、香芹酮、喹甲硫酯、灭瘟唑、解草唑、氯苯甲醚、氯化苦、百菌清、乙菌利、氯氮平、硫杂灵、霜脲氰、环丙唑醇、嘧菌环胺、酯菌胺、咪菌威、双氯酚、苄氯三唑醇、抑菌灵、哒菌清、氯硝胺、乙霉威、二甲嘧酚、烯酰吗啉、醚菌胺、烯唑醇、烯唑醇-M、消螨普、二苯胺、双吡硫翁、灭菌磷、二氰蒽醌、十二环吗啉、多果定、肼菌酮、稻瘟光、环氧康那唑、乙环唑、乙菌定、土菌灵、恶唑酮菌、咪菌腈、乐必耕、分菌氰唑、甲呋酰胺、种衣酯、拌种咯、苯锈啶、丁苯吗啉、醋酸三苯锡、毒菌锡、福美铁、嘧菌腙、氟啶胺、氟联苯菌、氟氯菌核利、氟喹唑、呋嘧醇、氟硅唑、磺菌胺、氟酰胺、粉唑醇、灭菌丹、三乙膦酸铝、乙胜酸钠、四氯苯酞、麦穗宁、呋霜灵、福拉比、呋喃西林、呋菌唑、呋菌唑-顺式、茂谷乐、双胍辛胺、六氯苯、己唑、恶霉灵、烯菌灵、亚胺唑、培福朗、烷苯磺酸盐、双胍辛胺乙酸盐、霜霉威、异稻瘟净(IBP)、异菌脲、伊鲁霉素、稻瘟灵、异戊酮、春雷霉素、苯氧菊酯，铜制剂例如：氢氧化铜、环烷酸铜、氧氯化铜、硫酸铜、氧化铜、喹啉铜和波尔多液、代森锰铜、代森锰锌、代森锰、嘧菌腙、嘧菌胺、灭锈胺、叶菌唑、磺菌威、灭菌胺、代森联、噻菌胺、灭粉霉素、灭克落、甲菌利、二甲基二硫代氨基甲酸镍、酞菌酯、氟苯嘧啶醇、甲呋酰胺、恶霜灵、草铵膦、奥索利酸、氧化萎锈灵、氧铁蛋白、多效唑、稻瘟酯、配那唑、纹枯脲、氯瘟磷、多马霉素、粉病灵、多抗霉素、多氧霉素、烯丙苯噻唑、丙氯灵、腐霉利、霜霉威、丙醇钠、丙环唑、丙森锌、噻硫康唑、定菌磷、消斑肟、二甲嘧菌胺、咯喹酮、氯吡呋醚、喹康唑、五氯硝苯(PCNB)、硫和硫制剂、戊唑醇、酞枯酸、四氯硝基苯、四环素、氟醚唑、噻苯哒唑、噻菌腈、噻氟菌胺、硫芬酯、硫氰苯甲酰胺、甲基立枯磷、对甲抑菌灵、三唑酮、三唑醇、丁基三唑、咪唑嗪、水杨菌胺、三环唑、二甲十三烷吗啉、布洛芬、粉锈胺、嗪氨灵、烯效唑、有效霉素A、伐菌唑灵、伏立康唑、氰菌胺、乙硫锌、福美锌且还有Dagger G、OK-8705、OK-8801、a-(1,1-二甲基乙基)-(3-(2-苯氧基乙基)-1H-1,2,4-三唑-1-乙醇、a-(2,4-二氯苯基)-[3-氟-3-丙基-1H-1,2,4-三唑-1-乙醇、a-(2,4-二氯苯基)-[3-甲氧基-a-甲基-1H-1,2,4-三唑-1-乙醇、a-(5-甲基-1,3-二恶烷-5-基)-[3-[[4-(三氟甲基)-苯基]-亚甲基]-1H-1,2,4-三唑-1-乙醇、(5RS,6RS)-6-羟基-2,2,7,7-四甲基-5-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-3-辛酮、(E)-a-(甲氧基亚氨基)-N-甲基-2-苯氧基-苯基乙酰胺、氨基甲酸{2-甲基-1-[[[1-(4-甲基苯基)-乙基]-氨基]-羰基]-丙基}1-异丙酯、1-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-乙酮-O-(苯基甲基)-肟、1-(2-甲基-1-萘基)-1H-吡咯-2,5-二酮、1-(3,5-二氯苯基)-3-(2-丙烯基)-2,5-吡咯烷二酮、1-[(二碘甲基)-磺酰基]-4-甲基-苯、1-[[2-(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-2-基]-甲基]-1H-咪唑、1-[[2-(4-氯苯基)-3-苯基环氧乙烷基]-甲基]-1H-1,2,
4-三唑、1-[1-[2-[(2,4-二氯苯基)-甲氧基]-苯基]-乙烯基]-1H-咪唑、1-甲基-5-壬基-2-(苯基甲基)-3-吡咯烷酮、2',6'-二溴-2-甲基-4'-三氟甲氧基-4'-三氟-甲基-1,3-噻唑-甲酰胺、2,2-二氯-N-[1-(4-氯苯基)-乙基]-1-乙基-3-甲基-环丙烷羧酰胺、2,6-二氯-5-(甲硫基)-4-嘧啶基-硫代氰酸酯、2,6-二氯-N-(4-三氟甲基苄基)-苯甲酰胺、2,6-二氯-N-[[4-(三氟甲基)-苯基]-甲基]-苯甲酰胺、2-(2,3,3-三碘-2-丙烯基)-2H-四唑、2-[(1-甲基乙基)-磺酰基]-5-(三氯甲基)-1,3,4-噻二唑、2-[[6-脱氧-4-O-(4-0-甲基-(3-D-吡喃葡糖基)-a-D-吡喃葡糖基]-氨基]-4-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲腈、2-氨基丁烷、2-溴-2-(溴甲基)-戊二腈、2-氯-N-(2,3-二氢-1,1,3-三甲基-1H-茚-4-基)-3-吡啶甲酰胺、2-氯-N-(2,6-二甲基苯基)-N-(异硫氰酸酯基甲基)-乙酰胺、2-苯基苯酚(OPP)、3,4-二氯-1-[4-(二氟甲氧基)-苯基]-吡咯-2,5-二酮、3,5-二氯-N-[氰基[(1-甲基-2-丙炔基)-氧基]-甲基]-苯甲酰胺、3-(1,1-二甲基丙基-1-氧代-1H-茚-2-甲腈、3-[2-(4-氯苯基)-5-乙氧基-3-异恶唑烷基]-吡啶、4-氯-2-氰基-N,N-二甲基-5-(4-甲基苯基)-1H-咪唑-1-磺酰胺、4-甲基-四唑并[1,5-a]喹唑啉-5(4H)-酮、8-(1,1-二甲基乙基)-N-乙基-N-丙基-1,4-二氧杂螺[4,5]癸烷-2-甲胺、8-羟基喹啉硫酸盐、9H-呫吨-2-[(苯基氨基)-羰基]-9-甲酰肼、双-(1-甲基乙基)-3-甲基-4-[(3-甲基苯甲酰基)-氧基]-2,5-噻吩二甲酸酯、顺式-1-(4-氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-环庚醇、顺式-4-[3-[4-(1,1-二甲基丙基)-苯基-2-甲基丙基]-2,6-二甲基-吗啉盐酸盐、[(4-氯苯基)-偶氮]-氰基乙酸乙酯、碳酸氢钾、甲烷四硫醇-钠盐、1-(2,3-二氢-2,2-二甲基-茚-1-基)-1H-咪唑-5-甲酸甲酯、N-(2,6-二甲基苯基)-N-(5-异恶唑基羰基)-DL-丙氨酸甲酯、N-(氯乙酰基)-N-(2,6-二甲基苯基)-DL-丙氨酸甲酯、N-(2,3-二氯-4-羟基苯基)-1-甲基-环己烷甲酰胺、N-(2,6-二甲基苯基)-2-甲氧基-N-(四氢-2-氧代-3-呋喃基)-乙酰胺、N-(2,6-二甲基苯基)-2-甲氧基-N-(四氢-2-氧代-3-噻吩基)-乙酰胺、N-(2-氯-4-硝基苯基)-4-甲基-3-硝基-苯磺酰胺、N-(4-环己基苯基)-1,4,5,6-四氢-2-嘧啶胺、N-(4-己基苯基)-1,4,5,6-四氢-2-嘧啶胺、N-(5-氯-2-甲基苯基)-2-甲氧基-N-(2-氧代-3-恶唑烷基)-乙酰胺、N-(6-甲氧基)-3-吡啶基)-环丙烷甲酰胺、N-[2,2,2-三氯-1-[(氯乙酰基)-氨基]-乙基]-苯甲酰胺、N-[3-氯-4,
5-双(2-丙炔基氧基)-苯基]-N'-甲氧基-甲酰亚胺、N-甲酰基-N-羟基-DL-丙氨酸-钠盐、0,
0-二乙基[2-(二丙基氨基)-2-氧代乙基]-乙基磷酰氨基硫代酸酯、0-甲基S-苯基苯基丙基磷酰氨基硫代酸酯、S-1,2,3-苯并噻二唑-7-甲硫代酸甲酯和螺[2H]-1-苯并吡喃-2,1'(3'H)-异苯并呋喃]-3'-酮、N-三氯甲基)硫代-4-环己烷-1,2-二甲酰亚胺、四甲基硫代过氧二碳酸二酰胺、N-(2,6-二甲基苯基)-N-(甲氧基乙酰基)-DL-丙氨酸甲酯、4-(2,2-二氟-1,3-苯并间二氧杂戊烯-4-基)-1-H-吡咯-3-甲腈或其任何组合。
4-三唑、1-[1-[2-[(2,4-二氯苯基)-甲氧基]-苯基]-乙烯基]-1H-咪唑、1-甲基-5-壬基-2-(苯基甲基)-3-吡咯烷酮、2',6'-二溴-2-甲基-4'-三氟甲氧基-4'-三氟-甲基-1,3-噻唑-甲酰胺、2,2-二氯-N-[1-(4-氯苯基)-乙基]-1-乙基-3-甲基-环丙烷羧酰胺、2,6-二氯-5-(甲硫基)-4-嘧啶基-硫代氰酸酯、2,6-二氯-N-(4-三氟甲基苄基)-苯甲酰胺、2,6-二氯-N-[[4-(三氟甲基)-苯基]-甲基]-苯甲酰胺、2-(2,3,3-三碘-2-丙烯基)-2H-四唑、2-[(1-甲基乙基)-磺酰基]-5-(三氯甲基)-1,3,4-噻二唑、2-[[6-脱氧-4-O-(4-0-甲基-(3-D-吡喃葡糖基)-a-D-吡喃葡糖基]-氨基]-4-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲腈、2-氨基丁烷、2-溴-2-(溴甲基)-戊二腈、2-氯-N-(2,3-二氢-1,1,3-三甲基-1H-茚-4-基)-3-吡啶甲酰胺、2-氯-N-(2,6-二甲基苯基)-N-(异硫氰酸酯基甲基)-乙酰胺、2-苯基苯酚(OPP)、3,4-二氯-1-[4-(二氟甲氧基)-苯基]-吡咯-2,5-二酮、3,5-二氯-N-[氰基[(1-甲基-2-丙炔基)-氧基]-甲基]-苯甲酰胺、3-(1,1-二甲基丙基-1-氧代-1H-茚-2-甲腈、3-[2-(4-氯苯基)-5-乙氧基-3-异恶唑烷基]-吡啶、4-氯-2-氰基-N,N-二甲基-5-(4-甲基苯基)-1H-咪唑-1-磺酰胺、4-甲基-四唑并[1,5-a]喹唑啉-5(4H)-酮、8-(1,1-二甲基乙基)-N-乙基-N-丙基-1,4-二氧杂螺[4,5]癸烷-2-甲胺、8-羟基喹啉硫酸盐、9H-呫吨-2-[(苯基氨基)-羰基]-9-甲酰肼、双-(1-甲基乙基)-3-甲基-4-[(3-甲基苯甲酰基)-氧基]-2,5-噻吩二甲酸酯、顺式-1-(4-氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-环庚醇、顺式-4-[3-[4-(1,1-二甲基丙基)-苯基-2-甲基丙基]-2,6-二甲基-吗啉盐酸盐、[(4-氯苯基)-偶氮]-氰基乙酸乙酯、碳酸氢钾、甲烷四硫醇-钠盐、1-(2,3-二氢-2,2-二甲基-茚-1-基)-1H-咪唑-5-甲酸甲酯、N-(2,6-二甲基苯基)-N-(5-异恶唑基羰基)-DL-丙氨酸甲酯、N-(氯乙酰基)-N-(2,6-二甲基苯基)-DL-丙氨酸甲酯、N-(2,3-二氯-4-羟基苯基)-1-甲基-环己烷甲酰胺、N-(2,6-二甲基苯基)-2-甲氧基-N-(四氢-2-氧代-3-呋喃基)-乙酰胺、N-(2,6-二甲基苯基)-2-甲氧基-N-(四氢-2-氧代-3-噻吩基)-乙酰胺、N-(2-氯-4-硝基苯基)-4-甲基-3-硝基-苯磺酰胺、N-(4-环己基苯基)-1,4,5,6-四氢-2-嘧啶胺、N-(4-己基苯基)-1,4,5,6-四氢-2-嘧啶胺、N-(5-氯-2-甲基苯基)-2-甲氧基-N-(2-氧代-3-恶唑烷基)-乙酰胺、N-(6-甲氧基)-3-吡啶基)-环丙烷甲酰胺、N-[2,2,2-三氯-1-[(氯乙酰基)-氨基]-乙基]-苯甲酰胺、N-[3-氯-4,
5-双(2-丙炔基氧基)-苯基]-N'-甲氧基-甲酰亚胺、N-甲酰基-N-羟基-DL-丙氨酸-钠盐、0,
0-二乙基[2-(二丙基氨基)-2-氧代乙基]-乙基磷酰氨基硫代酸酯、0-甲基S-苯基苯基丙基磷酰氨基硫代酸酯、S-1,2,3-苯并噻二唑-7-甲硫代酸甲酯和螺[2H]-1-苯并吡喃-2,1'(3'H)-异苯并呋喃]-3'-酮、N-三氯甲基)硫代-4-环己烷-1,2-二甲酰亚胺、四甲基硫代过氧二碳酸二酰胺、N-(2,6-二甲基苯基)-N-(甲氧基乙酰基)-DL-丙氨酸甲酯、4-(2,2-二氟-1,3-苯并间二氧杂戊烯-4-基)-1-H-吡咯-3-甲腈或其任何组合。
[0688] 农用化学品可以包含芽孢杆菌属细菌接种物，且芽孢杆菌属细菌接种物包含土壤芽孢杆菌、鲇泽芽孢杆菌、白色乳杆菌(乳白芽孢杆菌)、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、内寄生芽孢杆菌、先天性芽孢杆菌、库斯塔克杆菌、栖乳芽孢杆菌、乳病杆菌、乳杆菌、侧孢芽胞杆菌、乳病芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苜蓿芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、黑芽孢杆菌、乳头状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、芽孢杆菌属种类、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、单鞭毛芽孢杆菌或其任何组合。
[0689] 农用化学品可以包含除草剂，且除草剂包含2,4-D、2,4-DB、乙草胺、三氟羧草醚、甲草胺、莠灭净、阿特拉嗪、氯氨吡啶酸、氟草胺、硫氰菊胺、地散磷、苯达松、苯草酮、溴苯腈、丁草敌、唑草酮、氯嘧磺隆、氯磺隆、烯草酮、异恶松、二氯吡啶酸、氯酯磺草胺、环草敌、DCPA、甜菜安、麦草畏、敌草腈、二氯苯氧基丙酸、双氯磺草胺、二氟吡隆、二甲吩草胺、敌草快、敌草隆、DSMA、草藻灭、EPTC、丁氟消草、乙氧呋草磺、恶唑禾草灵、二氢吡啶-P、氟唑磺隆、氟噻草胺、唑嘧磺草胺、氟胺草酯、丙炔氟草胺、氟草隆、氟草烟、除豆莠、甲酰胺基嘧磺隆、草铵膦、草甘膦、氯吡嘧磺隆、环嗪酮、咪草酯、甲氧咪草烟、甲基咪草烟甲基咪草烟、灭草喹、咪草烟、异恶草胺、异恶唑草酮、乳氟草灵、利谷隆、MCPA、MCPB、甲基磺草酮、丙草胺-s、嗪草酮、甲磺隆、禾草敌、MSMA、草萘胺、西力特、烟嘧黄隆、达草灭、氨磺乐灵、恶草酮、乙氧氟草醚、百草枯、壬酸、二甲戊灵、甜菜宁、毒莠定、氟嘧黄隆、氨氟乐灵、扑草净、拿草特、敌稗、氟磺隆、保泰松钙、嘧硫草醚、二氯喹啉酸、喹禾灵、五嘧磺隆、稀乐定、环草隆、西玛津、甲磺草胺、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、丁唑隆、特草定、噻唑烟酸、阔叶散、禾草丹、三甲苯草酮、野麦畏、醚苯黄隆、苯磺隆、定草酯、氟乐灵、氟胺磺隆或其任何组合。
[0690] 农用化学品可以包含肥料，且肥料包含硫酸铵、硝酸铵、硫酸硝酸铵、氯化铵、硫酸氢铵、多硫化铵、硫代硫酸铵、氨水、无水氨、多磷酸铵、硫酸铝、硝酸钙、硝酸钙铵、硫酸钙、煅烧菱镁矿、方解石灰石、氧化钙、硝酸钙、白云石灰岩、熟石灰、碳酸钙、磷酸二铵、磷酸一铵、硝酸镁、硫酸镁、硝酸钾、氯化钾、硫酸钾镁、硫酸钾、硝酸钠、镁质石灰石、氧化镁、尿素、尿素-甲醛、尿素硝酸铵、硫包覆尿素、聚合物包覆尿素、异丁烯二脲、K2SO4–2MgSO4、钾盐镁矾、钾石盐岩、硫镁矾、泻盐、元素硫、泥灰、磨碎的牡蛎壳、鱼粉、油饼、鱼肥、血粉、磷酸岩、超级磷酸盐、矿渣、骨粉、木灰、粪肥、蝙蝠鸟粪、泥炭藓、堆肥、绿沙、棉籽粕、羽毛粉、蟹粉、鱼乳液、腐殖酸或其任何组合。
[0691] 农用化学品可以包含植物激素，且植物激素包含赤霉素、生长素、激动素或其任何组合。
[0692] 酶可以以许多方式配制。制剂酶产品的共同目标包括延长保质期，保护产品免于微生物和增强酶活性。通过冷冻干燥，喷雾干燥或除去酶产品的液体方面，可以冻干酶产品以延长大多数酶的保质期。液体和冻干产品通常用添加剂膨胀，例如缓冲剂，稳定剂，抗微生物剂和体积添加剂。酶通常可以封装或颗粒化，以使最终产品更安全和更容易使用。颗粒状产品可以具有增强的保质期并且具有很少的暴露于颗粒外表面的酶活性。酶也可以附着在有机或无机平台上，例如塑料珠，白云石，粘土，木炭，生物炭，纳米粒子，藻酸盐，硅珠有助于粘合它们并使它们易于使用。通常，酶固定在基质上以允许酶产物的更长活性和保质期。常见的基质包括碳，纳米碳，琼脂糖，藻酸盐，纤维素和纤维素材料，二氧化硅，塑料，不锈钢，玻璃，聚苯乙烯和陶瓷。
[0694] XVII.植物生长培养基
[0695] 在涉及植物生长培养基应用的本文所述的任何方法中，植物生长培养基可以包含土壤、水、水溶液、砂、砂石、多糖、覆盖物、堆肥、泥炭藓、麦秆、圆木、粘土、大豆粉、酵母提取物或其组合。
[0696] 植物生长培养基可以包含肥料或主要由肥料组成。
[0697] 此外，植物生长培养基中可以补充用于酶的底物。
[0698] 底物可以包含色氨酸、腺苷一磷酸、腺苷二磷酸、腺苷三磷酸(例如腺苷-3-三磷酸)、多磷酸盐、蛋白质粉、三偏磷酸盐、纤维素、甲基纤维素、壳多糖、脱乙酰壳多糖、纤维素衍生物、磷酸盐、脂肪、蜡、磷脂、植酸或其任何组合。
[0699] XVIII.植物
[0700] 在涉及植物的任何上述方法中，植物是双子叶植物、单子叶植物或裸子植物。
[0701] 同样，对于本文所述的任何种子，种子可以是双子叶植物、单子叶植物或裸子植物的种子。
[0702] 例如，如果植物是双子叶植物或种子是双子叶植物种子，则双子叶植物可以选自豆，豌豆，番茄，辣椒，南瓜，苜蓿，杏仁，茴香，苹果，杏，arracha，朝鲜蓟，鳄梨，班巴拉花生，甜菜，佛手柑，黑胡椒，黑荆，黑莓，蓝莓，苦橙，bok-choi，巴西坚果，面包果，西兰花，蚕豆，抱子甘蓝，荞麦，卷心菜，亚麻荠，大白菜，可可，哈密瓜，葛缕子，卡通，角豆，胡萝卜，腰果，木薯，蓖麻子，花椰菜，芹菜，芹菜，樱桃，板栗，鹰嘴豆，菊苣，辣椒，菊花，肉桂，香橼，克莱门汀，丁香，三叶草，咖啡，可乐坚果，菜子，玉米，棉花，棉籽，豇豆，两节荠属，蔓越莓，水芹，黄瓜，醋栗，番荔枝，鼓槌树，地球豌豆，茄子，莴苣，茴香，胡芦巴，无花果，榛子，亚麻，天竺葵，醋栗，葫芦，葡萄，葡萄柚，番石榴，大麻，大麻，指甲花，跃点，马豆，辣根，靛蓝，茉莉花，耶路撒冷朝鲜蓟，黄麻，羽衣甘蓝，木棉，洋麻，大头菜，金橘，薰衣草，柠檬，小扁豆，胡枝子，莴苣，石灰，甘草，荔枝，枇杷，羽扇豆，澳洲坚果，梅斯，普通话，饲用甜菜，芒果，枸杞子，甜瓜，薄荷，桑椹，芥末，油桃，尼日尔种子，肉豆蔻，秋葵，橄榄，鸦片，橙，木瓜，欧洲防风草，豌豆，桃，花生，梨，山核桃，柿子，鸽子豌豆，开心果，车前草，李子，石榴，柚子，罂粟种子，马铃薯，甘薯，西梅，南瓜，雀斑，木瓜，金鸡纳属树，奎奴亚藜，萝卜，苎麻，油菜籽，覆盆子，丽莎，大黄，玫瑰，橡胶，大头菜，红花，红豆杉，婆罗门参，赤铁科常青树，萨摩，鸦葱属，芝麻，乳木果，大豆，菠菜，南瓜，草莓，糖用甜菜，甘蔗，向日葵，甘蓝，甜椒，橘子，茶，埃塞俄比亚画眉草，烟草，番茄，三叶草，桐树，萝卜，梵天花属，紫云英，核桃，西瓜，马黛茶，冬菇，牧羊人的钱包，花园水芹，花椒，豆瓣菜，pennycress，八角，月桂树，月桂树，决明子，jamun，莳萝，罗望子，薄荷，牛至，迷迭香，鼠尾草，刺番荔枝，琉璃草，calophyll嗯，苦瓜，kukui坚果，大溪地板栗，罗勒，越橘，芙蓉，百香果，星苹果，黄樟，仙人掌，圣约翰草，珍珠菜，山楂，香菜，咖喱植物，猕猴桃，百里香，西葫芦，ulluco，豆薯，水迹叶，多刺的猴子橙，黄色的mombin，杨桃，苋菜，芥末，日本辣椒，黄梅，mashua，中国香椿，新西兰菠菜，凉亭菠菜，ugu，艾菊，鹅肠菜，jocote，马来苹果，paracress，苦菜，中国土豆，马欧芹，树篱芥末，坎皮恩，玛瑙，cassod tree，蓟，伯内特，星猕猴桃，盐蓟，欧洲海蓬子，栗色，银蕾丝蕨，羽衣甘蓝，报春花，cowslip，马齿苋，knotgrass，terebinth，树生菜，野生槟榔，西非辣椒，yerba圣诞老人，龙蒿，欧芹，山萝卜，土地水芹，burnet虎耳草，honeyherb，款冬，紫苏，水胡椒，紫苏，苦豆，oca，甘榜，中国芹菜，柠檬罗勒，泰国罗勒，水含羞草，香根芹，卷心菜树，辣木，mauka，鸵鸟蕨，稻田草，黄色锯莴苣，独活草，胡椒草，玛咖，葫芦，风信子豆，水菠菜，猫耳，fishwort，冲绳菠菜，莲花sweetjuice，英勇士兵，culantro，芝麻菜，朝鲜蓟，caigua，mitsuba，chipilin，samphire，mampat，ebolo，常春藤葫芦，白菜蓟，海芥兰，驱虫苋，huauzontle，埃塞俄比亚芥末，magenta spreen,good king henry,epazole,lamb’s quarters，centella plumed cockscomb，刺山柑，rapini，napa cabbage，mizuna，中国开胃菜，开兰，芥末绿党，马拉巴尔菠菜，甜菜，棉花糖，攀爬篱笆，中国黄麻，辣椒粉，胭脂树种子，留兰香，savory，马郁兰，小茴香，洋甘菊，柠檬香蜂草，多香果，越桔，番荔枝，云莓，布达佩斯，火龙果，榴莲，接骨木，费约果，木菠萝，海南蒲桃，大枣，酸浆，紫色山竹，红毛丹，红醋栗，黑醋栗，salal berry，小蜜柑，ugli fruit，azuki bean，黑豆，黑眼豆，borlotti bean，普通豆，绿豆，菜豆，利马豆，绿豆，海军豆，斑豆，亚麻豆，mangetout，snappea，broccoflower，calabrese，荨麻，甜椒，raddichio，白萝卜，白萝卜，skirret，tatsoi，西兰花，黑萝卜，牛蒡根，蚕豆，broccoli raab，扁豆属，羽扇豆，胖大海，天鹅绒豆，有翼豆类，山药豆，mulga，铁草，伞灌木，tjuntjula，wakalpulka，witchetty bush，wiry wattle，chia，山毛榉坚果，桐树，药西瓜，蜜果，Maya nut,mongongo,ogbono nut,paradise nut和cempedak。
[0703] 如果植物是单子叶植物或种子是单子叶植物种子，则单子叶植物可以选自玉米，小麦，燕麦，水稻，大麦，小米，香蕉，洋葱，大蒜，芦笋，黑麦草，小米，马唐属植物，raishan，尼帕草，姜黄，藏红花，高良姜，韭菜，小豆蔻，椰枣，菠萝，葱，韭菜，葱，菱角，ramp，薏仁，竹子，鸭脚稗，洁净无根萍，剑叶象耳，大溪地菠菜，蕉麻，槟榔，狼尾草属，槟榔，扫帚小米，扫帚高粱，香茅，椰子，cocoyam，玉米，芋，蜀黍，硬粒小麦，edo，fique，formio，姜，果园草，西班牙草，苏丹草，几内亚玉米，马尼拉麻，龙舌兰纤维，杂交玉米，高梁，柠檬草，龙舌兰，芦苇小米，手指小米，谷子，日本小米，黄米，新西兰亚麻，燕麦，油棕，棕榈扇贝，西米棕榈，红顶，剑麻，高粱，拼小麦，甜玉米，甜高粱，芋头，埃塞俄比亚画眉草，猫尾草，小黑麦，香草，小麦和山药。
[0704] 如果植物是裸子植物或种子是裸子植物种子，则裸子植物可以选自南洋杉科、波温苏铁科、三尖杉科、柏科、苏铁科、麻黄科、银杏科、买麻藤科、松科、罗汉松科、红豆杉科、杉科、百岁叶科和泽米科。
[0705] 本文所述的植物和植物种子可以包括转基因植物或植物种子，例如转基因谷物(小麦，水稻)，玉米，大豆，马铃薯，棉花，烟草，油菜和水果植物(苹果，梨，柑橘类水果和葡萄的果实。优选的转基因植物包括玉米，大豆，马铃薯，棉花，烟草和油料种子。
[0706] 适合的转基因植物和种子的特征可以在于，该植物的毒素形成，尤其是来自苏云金芽孢杆菌遗传材料(例如基因CryIA(a)、CryIA(b)、CryIA(c)、CryIIA、CryIIΙΑ、CryIIΙΒ2、Cry9c、Cry2Ab、Cry3Bb、CryIF或其组合)。植物中毒素的形成增加植物对昆虫、蜘蛛、线虫和腹足纲和螺的抗性(下文称作"Bt植物")。Bt植物，例如商购自商品名YIELD(例如玉米、棉花、大豆)、 (例如玉米)、 (例如玉米)、
(棉花)、 (棉花)和 (马铃薯)玉米变种、棉花变种、大
豆变种和马铃薯变种。除草剂抗性植物包括如下商品名下的植物：Roundup (草甘膦抗性，例如玉米、棉花、大豆)， (例如玉米)，Liberty (草铵膦抗性，
例如油料种子)， (具有咪唑啉酮抗性)和 (磺酰脲抗性，例如玉米)。
(棉花)、 (棉花)和 (马铃薯)玉米变种、棉花变种、大
豆变种和马铃薯变种。除草剂抗性植物包括如下商品名下的植物：Roundup (草甘膦抗性，例如玉米、棉花、大豆)， (例如玉米)，Liberty (草铵膦抗性，
例如油料种子)， (具有咪唑啉酮抗性)和 (磺酰脲抗性，例如玉米)。
[0707] 如本文所述的植物种子可以是遗传修饰的(例如任何导致转基因植物或植物部分的种子，其表达除草剂耐受性，对环境因素的耐受性，例如水胁迫，干旱，病毒和氮产生或对细菌，真菌或昆虫毒素的抗性)。适合的转基因种子包括油菜作物，蔬菜，水果，树木，纤维作物，油料作物，块茎作物，咖啡，花卉，豆类，谷物以及单子叶和双子叶植物的其它植物。优选地，遗传修饰的种子包括花生，烟草，草，小麦，大麦，黑麦，高粱，稻，油菜籽，甜菜，向日葵，番茄，胡椒，豆，莴苣，马铃薯和胡萝卜。最优选地，遗传修饰的种子包括棉花，大豆和玉米(甜，田，种子或爆米花)。
[0708] 可以根据本发明处理的特别有用的转基因植物是含有转化事件或转化事件组合的植物，其在实施例中列出来自各种国家或地区管理机构的数据库(参见实施例http//gmoinfo.jrc.it/gmp_browse.aspx和http://www.agbios.com/dbase.php)。已经详细描述了本发明，显而易见的是，在不脱离所附权利要求限定的本发明的范围的情况下，可以进行修改和变化。
[0709] 实施例
[0710] 提供下列非限制性实施例是以进一步说明本发明。
[0711] 实施例1:玉米上的游离内切葡聚糖酶，温室
[0712] 将解纤维热酸菌的β-1,4内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:30；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为E2164)在柠檬酸酶稀释缓冲液中稀释至12.5至1600mU/mL的浓度。通过在理想温度和条件下降解1μMol/min/mL的底物的酶的量确定内切葡聚糖酶活性的U(单位或国际单位)。对于每次处理组，将含有草甘膦抗性性状的市售杂交BECK’S 6626RR玉米的18个种子在没有种子处理的情况下置于50mL锥形管中。将每个锥形管涡旋，并将18μL的酶溶液添加至每个馆中至终浓度为0、12.5μU、25μU、50μU、100μU、200μU、400μU、
800μU或1600μU/内切酶的种子将锥形管再次涡旋20秒以在每个种子上获得均匀的涂层。使种子干燥5分钟，然后以深度为2.54cm种植到含有商业表土的39.7cm3盆中，每盆2个种子。
种植后，将50mL室温的水添加到每个盆以使其发芽。将盆保持在人工照明植物生长室中，其具有13/11小时照明/白天循环，并且在21℃白天/15℃夜间温度范围内。根据需要对植物进行浇水，并在3天的周期内随机化以避免室内任何凉的地方。在14天结束时，测量每次处理的玉米植物的高度，并针对仅用水包被的种子的对照植物的高度进行校准。
800μU或1600μU/内切酶的种子将锥形管再次涡旋20秒以在每个种子上获得均匀的涂层。使种子干燥5分钟，然后以深度为2.54cm种植到含有商业表土的39.7cm3盆中，每盆2个种子。
种植后，将50mL室温的水添加到每个盆以使其发芽。将盆保持在人工照明植物生长室中，其具有13/11小时照明/白天循环，并且在21℃白天/15℃夜间温度范围内。根据需要对植物进行浇水，并在3天的周期内随机化以避免室内任何凉的地方。在14天结束时，测量每次处理的玉米植物的高度，并针对仅用水包被的种子的对照植物的高度进行校准。
[0713] 该实验重复三次，并且取多个实验的平均值。从表18中可以看出，内切葡聚糖酶作为种子处理对BECK'S 6626RR(具有草甘膦抗性的玉米杂交种)的主要作用是在酶活为100-1600μU/种子的范围内。在这些值下，对玉米生长具有显著且可再现的效果。低于50μU/种子的值对该杂交种的玉米生长速率具有低得多的影响。这些酶处理作为对作物的单独处理非常有效。
[0714] 表18.β-1,4内切葡聚糖酶处理作为种子处理的高度效应
[0715]
[0716] 实施例2:玉米上的游离内切葡聚糖酶，温室
[0717] 将解纤维热酸菌的β-1,4内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:30；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为E2164)在柠檬酸酶稀释缓冲液中稀释至50至1200mU/mL的浓度。通过在理想温度和条件下降解1μMol/min/mL的底物的酶的量确定内切葡聚糖酶活性的U。将含有HERCULEX玉米螟(昆虫保护性状)和草甘膦抗性性状的商业杂交BECK’S 5140HR玉米的18个种子在没有种子处理的情况下置于50mL锥形管中。将每个锥形管涡旋，并将18μL的酶溶液添加至每个馆中至终浓度为0、50μU、100μU、200μU、400μU、600μU、800μU或1200μU/内切酶的种子将锥形管再次涡旋20秒以在每个种子上获得均匀的涂层。使种子干燥5分3
钟，然后以深度为2.54cm种植到含有商业表土的39.7cm 盆中，每盆2个种子。种植后，将
50mL室温的水添加到每个盆以使其发芽。将盆保持在人工照明植物生长室中，其具有13/11小时照明/白天循环，并且在21℃白天/15℃夜间温度范围内。根据需要对植物进行浇水，并在3天的周期内随机化以避免室内任何凉的点。在14天结束时，测量每次处理的玉米植物的高度，并针对仅用水种子包被的对照植物的高度进行校准。每个试验重复3次。
钟，然后以深度为2.54cm种植到含有商业表土的39.7cm 盆中，每盆2个种子。种植后，将
50mL室温的水添加到每个盆以使其发芽。将盆保持在人工照明植物生长室中，其具有13/11小时照明/白天循环，并且在21℃白天/15℃夜间温度范围内。根据需要对植物进行浇水，并在3天的周期内随机化以避免室内任何凉的点。在14天结束时，测量每次处理的玉米植物的高度，并针对仅用水种子包被的对照植物的高度进行校准。每个试验重复3次。
[0718] 从表19中可以看出，内切葡聚糖酶作为种子处理对BECK’S 5140HR的主要作用是在酶活为600-1200μU/种子的范围内。在这些值下，对玉米生长具有显著且可再现的效果。低于400μU/种子的值对该杂交种的玉米生长速率具有较低的影响。这些酶处理作为对作物的单独处理非常有效。
[0719] 表19.β-1,4内切葡聚糖酶处理作为种子处理的高度效应
[0720]
[0721] 实施例3:玉米上的葡聚糖酶和磷脂酶，田地
[0722] 将解纤维热酸菌的β-1,4内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:30；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为E2164)、白玉蜗牛的β-1,3-d-葡聚糖酶(SEQ ID NO:126；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为67138)、里氏木霉的β-1,4内切葡聚糖酶“纤维素酶”(SEQ ID NO:36；可从Worthington Biochemical Corp.,Lakewood,NJ商购获得，商品名为ATCC26921)和米曲霉的外切-β-1,3-葡聚糖酶(SEQ ID NO:41；可从Megazyme,Chicago,IL商购获得，商品名为E-EXG5AO)在柠檬酸酶稀释缓冲液中稀释至活性为12.5至1600mU/mL(对于热酸菌β-1,4内切葡聚糖酶和木霉β-1,4内切葡聚糖酶)或252mU/mL(对于蜗牛β-1,3-d-葡聚糖酶)的浓度。该分组含有几种纤维素酶(纤维素分解葡聚糖酶)和非纤维素分解葡聚糖酶活性，分别包括β-1,4-内切葡聚糖酶和β-1,3-d-葡聚糖酶活性。
通过在理想温度和条件下降解1μMol/min/mL的底物的酶的量确定酶活的U。将蜡状芽孢杆菌的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(SEQ ID NO:116；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为P5524)、蜡状芽孢杆菌的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(SEQ ID NO:115；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为P6621)、产气荚膜梭菌的磷脂酶C(SEQ ID NO:18；可从Sigma-Aldrich,St.Louis,MO商购获得，商品名为P7633)和褐色链霉菌的磷脂酶D(SEQ ID NO:19；可从Sigma-Aldrich,St.Louis,MO商购获得，商品名为P0065)在柠檬酸酶稀释缓冲液中稀释至活性为2.5U/mL(对于芽孢杆菌磷脂酰胆碱磷脂酶C、梭菌磷脂酶C和链霉菌磷脂酶D)或100U/mL(对于芽孢杆菌磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C)的终浓度。这些磷脂酶中的每一种具有针对磷脂和针对磷脂不同切割位点的不同的具体活性。在没有种子处理的情况下使用市售杂交BECK’S 6175YE玉米的种子，其含有HERCULEX(根虫和玉米螟保护性状)、MON810(包含玉米螟抗性性状)、草铵膦抗性性状和草甘膦抗性性状。将种子以每次处理400个种子置于分批处理器中。每批加入400μL溶液，最终酶浓度为600μU/种子(热酸菌β-
1,4-内切葡聚糖酶和木霉β-1,4-内切葡聚糖酶)、252μU/种子(蜗牛β-1,3-d-葡聚糖酶)、
100μU/种子(磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C)或2.5μU/种子(芽孢杆菌磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C和磷脂酶C和D包被的种子)。使每批混合20秒以在每个种子上获得均匀的涂层。另外，这些种子用商品包装的丙硫菌唑、戊苯磺酸、甲霜灵和噻虫胺(EVERGOL Energy/PONCHO Seed Treatment，可从Bayer CropScience商购获得)(“基质”)包被。每个试验重复3次。使种子干燥3周，然后在相距10.16cm、深度为3.81cm的9.14m行中种植到天然土壤中。在种植后2周测量植物的高度，并针对对照植物的高度进行校准，所述对照植物是仅用含有基质的水包被的种子。结果显示于下表16中。
通过在理想温度和条件下降解1μMol/min/mL的底物的酶的量确定酶活的U。将蜡状芽孢杆菌的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(SEQ ID NO:116；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为P5524)、蜡状芽孢杆菌的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(SEQ ID NO:115；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为P6621)、产气荚膜梭菌的磷脂酶C(SEQ ID NO:18；可从Sigma-Aldrich,St.Louis,MO商购获得，商品名为P7633)和褐色链霉菌的磷脂酶D(SEQ ID NO:19；可从Sigma-Aldrich,St.Louis,MO商购获得，商品名为P0065)在柠檬酸酶稀释缓冲液中稀释至活性为2.5U/mL(对于芽孢杆菌磷脂酰胆碱磷脂酶C、梭菌磷脂酶C和链霉菌磷脂酶D)或100U/mL(对于芽孢杆菌磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C)的终浓度。这些磷脂酶中的每一种具有针对磷脂和针对磷脂不同切割位点的不同的具体活性。在没有种子处理的情况下使用市售杂交BECK’S 6175YE玉米的种子，其含有HERCULEX(根虫和玉米螟保护性状)、MON810(包含玉米螟抗性性状)、草铵膦抗性性状和草甘膦抗性性状。将种子以每次处理400个种子置于分批处理器中。每批加入400μL溶液，最终酶浓度为600μU/种子(热酸菌β-
1,4-内切葡聚糖酶和木霉β-1,4-内切葡聚糖酶)、252μU/种子(蜗牛β-1,3-d-葡聚糖酶)、
100μU/种子(磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C)或2.5μU/种子(芽孢杆菌磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C和磷脂酶C和D包被的种子)。使每批混合20秒以在每个种子上获得均匀的涂层。另外，这些种子用商品包装的丙硫菌唑、戊苯磺酸、甲霜灵和噻虫胺(EVERGOL Energy/PONCHO Seed Treatment，可从Bayer CropScience商购获得)(“基质”)包被。每个试验重复3次。使种子干燥3周，然后在相距10.16cm、深度为3.81cm的9.14m行中种植到天然土壤中。在种植后2周测量植物的高度，并针对对照植物的高度进行校准，所述对照植物是仅用含有基质的水包被的种子。结果显示于下表16中。
[0723] 表20.葡聚糖酶和磷脂酶处理作为种子处理的高度效应
[0724]
[0725]
[0726] 将β-1,3-外切葡聚糖酶(米曲霉；SEQ ID NO:41；可从Megazyme,Chicago,IL商购获得，商品名为E-EXG5AO)、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(蜡状芽孢杆菌；SEQ ID NO:116；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为P6621)、磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)；SEQ ID NO:115；可从Sigma-Aldrich,St.Louis,MO商购获得，商品名为P5542)和磷脂酶D(褐色链霉菌；SEQ ID NO:19；可从Sigma-Aldrich,St.Louis,MO商购获得，商品名为P0065)在水中稀释至182mU/mL(对于β-1,3-外切葡聚糖酶)、100U/mL(对于磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C)或2.5U/mL(对于磷脂酰胆碱磷脂酶C和链霉菌磷脂酶D)。将酶作为种子处理施加于玉米(BECK’S 5828YH)(其含有HERCULEX性状(根虫和玉米螟保护性状)、草铵膦抗性性状和草甘膦抗性性状)，使用上述同样的方法、种植并使其生长至收获。基于含有丙硫菌唑、戊苯吡菌胺、甲霜灵和噻虫胺(“基质”)的基质的种子处理完成种子处理并如该实施例的上述章节所述进行处理。将处理过的作物的产量(量化为蒲式耳/英亩(Bu/Ac)或公吨/公顷(MT/ha))与水处理种子生长的作物进行比较并进行校准。每次处理独立进行至少4次。与未接受种子处理的对照玉米植物相比，使用这些游离酶的玉米种子处理导致玉米产量增加。β-1,3-外切葡聚糖酶使作物产量增加约4％，磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C使作物产量增加约3％，而磷脂酶D使作物产量增加约2％。对于用这三种游离酶处理的种子生长的玉米植物，每穗的平均重量也增加。结果显示于下表21中。
[0727] 表21.作为增加玉米产量的种子处理施用的葡聚糖酶和磷脂酶
[0728]
[0729]
[0730] 在该试验中测试的磷脂酶和葡聚糖酶中，β-1,3-外切葡聚糖酶和蜡状芽孢杆菌磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和链霉菌磷脂酶D具有最好的植物反应。这些酶处理对于多种杂交和性状包装起作用。
[0731] 实施例4：玉米上的葡聚糖酶，田地
[0732] 将解纤维热酸菌的β-1,4内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:30；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为E2164)在柠檬酸酶稀释缓冲液中稀释至活性为200mU/ml至450mU/mL的浓度。通过在理想温度和条件下降解1μMol/min/mL的底物的酶的量确定内切葡聚糖酶活性的U。在没有种子处理的情况下将市售杂交BECK’S 6175YE玉米的150个种子(其含有HERCULEX(根虫和玉米螟保护性状)、MON810(玉米螟抗性性状)、草铵膦抗性性状和草甘膦抗性性状)置于50mL锥形管中，每个50个种子。将50μL的酶加入每个管，其中250μL的含有丙硫菌唑、戊苯吡菌胺、甲霜灵和噻虫胺(EVERGOL Energy/PONCHO Seed Treatment)(“基质”)的浆液。这导致最终酶浓度为200μU/种子和450μU/种子。将管涡旋20秒以在每个种子上获得均匀的涂层。使种子干燥3周，然后在相距10.16cm、深度为3.81cm的9.14m行中种植到天然土壤中。在种植后2周测量植物的高度，并将结果针对对照植物的高度进行校准，所述对照植物是仅用含有基质(丙硫菌唑、戊苯吡菌胺、甲霜灵和噻虫胺)处理的水包被的种子。
[0733] 将试验重复三次，并且取多个实验的平均值。下表22中的数据显示，在种植后2周，两种浓度的β-1,4-内切葡聚糖酶的玉米生长速率均增加。在这些浓度下，对玉米生长具有显著且可再现的效果。这些酶处理基于对作物和多种杂交和性状包装的基质处理都能很好地作为一揽子方案起作用。
[0734] 表22.内切葡聚糖酶处理作物种子处理的高度效应
[0735]
[0736] 实施例5:玉米上的磷脂酶，温室，高范围
[0737] 将蜡状芽孢杆菌的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(SEQ ID NO:115；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为P6621)、产气荚膜梭菌的磷脂酶C(SEQ ID NO:18；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为P7633)和褐色链霉菌的磷脂酶D(SEQ ID NO:19；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为P0065)在100mM tris缓冲液、pH 7.0中稀释至100U/ml至450U/mL的浓度。对于每次处理组，将含有草甘膦抗性性状的市售杂交BECK’S 6626RR玉米的18个种子在没有种子处理的情况下置于50mL锥形管中。将每个锥形管涡旋，并将18μL的酶溶液添加至每个管，磷脂酶的最终酶浓度为100mU/mL、200mU/mL或450mU/mL/种子，并再次涡旋20秒以在每个种子上获得均匀的涂层。使种子干燥5分钟，然后将种子以深度为2.54cm种植到含有商业表土的42.24in3(692.19cm3)盆中，每盆2个种子。种植后，将50mL室温的水添加到每个盆以使其发芽。将盆保持在人工照明植物生长室中，其具有13/11小时照明/白天循环，并且在21℃白天/15℃夜间温度范围内。根据需要对植物进行浇水，并在3天的周期内倒换以避免室内任何凉的点。在14天结束时，测量每次处理的玉米植物的高度，并针对仅用水包被的种子的对照植物的高度进行校准。一式三份进行实验。
[0738] 在表23中可以显著看出，磷脂酶C和D酶的效果在100mU/种子或低于100mU/种子的值下是最佳的。在这些值下，对玉米生长具有显著且可再现的效果。等于或高于200mU/种子的值对玉米生长是有害的。这对于磷脂酶C和D酶二者都是这样。
[0739] 表23.磷脂酶处理作物种子处理的高度效应
[0740]
[0741] 实施例6:2015大豆产量,内切葡聚糖酶和磷脂酶
[0742] 将解纤维热酸菌的β-1,4内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:30；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为E2164)、白玉蜗牛的β-1,3-d-葡聚糖酶(SEQ ID NO:126；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为67138)和里氏木霉的β-1,4内切葡聚糖酶“纤维素酶”(SEQ ID NO:36；可从Worthington Biochemical Corp.,Lakewood,NJ商购获得)在水中稀释至活性为1600mU/mL(对于两种β-1,4内切葡聚糖酶)或252mU/mL(对于β-
1,3-d-葡聚糖酶)的浓度。该分组含有几种纤维素分解和非纤维素分解葡聚糖酶活性，包括β-1,4-内切葡聚糖酶和β-1,3-d-葡聚糖酶活性。将蜡状芽孢杆菌的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(SEQ ID NO:115；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为P6621)、产气荚膜梭菌的磷脂酶C(SEQ ID NO:18；可从Sigma-Aldrich,St.Louis,MO商购获得，商品名为P7633)和蜡状芽孢杆菌的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(SEQ ID NO:116；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为P5524)在水至活性为2.5U/mL(对于芽孢杆菌磷脂酰胆碱磷脂酶C和梭菌磷脂酶C)或100U/mL(对于芽孢杆菌磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C)的终浓度。这些磷脂酶中的每一种具有针对磷脂和针对磷脂不同切割位点的不同的具体活性。将市售杂交BECK’S 294NR大豆(其含有线虫抗性性状(SCN-SB)和草甘膦抗性性状(ROUNDUP READY 1))的720个种子与甲霜灵和噻虫胺基质种子处理包装(“基质”)置于漆罐中并用市售种子处理(基质)包被。将每批混合，并向每批加入720μL的溶液以获得在下表24中所列出的最终酶浓度。使种子干燥3周，然后在相距6.35cm、深度为3.81cm的9.14m行中种植到天然土壤中。收获植物并在收获时测量产量。每次处理重复4次并在田间种植4次。结果在下表24中显示为相对于对照(基质)处理的重量百分比。
1,3-d-葡聚糖酶)的浓度。该分组含有几种纤维素分解和非纤维素分解葡聚糖酶活性，包括β-1,4-内切葡聚糖酶和β-1,3-d-葡聚糖酶活性。将蜡状芽孢杆菌的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C(SEQ ID NO:115；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为P6621)、产气荚膜梭菌的磷脂酶C(SEQ ID NO:18；可从Sigma-Aldrich,St.Louis,MO商购获得，商品名为P7633)和蜡状芽孢杆菌的磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(SEQ ID NO:116；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为P5524)在水至活性为2.5U/mL(对于芽孢杆菌磷脂酰胆碱磷脂酶C和梭菌磷脂酶C)或100U/mL(对于芽孢杆菌磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C)的终浓度。这些磷脂酶中的每一种具有针对磷脂和针对磷脂不同切割位点的不同的具体活性。将市售杂交BECK’S 294NR大豆(其含有线虫抗性性状(SCN-SB)和草甘膦抗性性状(ROUNDUP READY 1))的720个种子与甲霜灵和噻虫胺基质种子处理包装(“基质”)置于漆罐中并用市售种子处理(基质)包被。将每批混合，并向每批加入720μL的溶液以获得在下表24中所列出的最终酶浓度。使种子干燥3周，然后在相距6.35cm、深度为3.81cm的9.14m行中种植到天然土壤中。收获植物并在收获时测量产量。每次处理重复4次并在田间种植4次。结果在下表24中显示为相对于对照(基质)处理的重量百分比。
[0743] 表24.作为对照百分比的产量增加
[0744]
[0745] 如在表24中可以观察到的，全部三种葡聚糖酶导致大豆以及来自蜡状芽孢杆菌的PC-PLC和PI-PLC的产量显著增加。
[0746] 实施例7:2015玉米产量,内切葡聚糖酶
[0747] 将解纤维热酸菌的β-1,4内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:30；可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购获得，商品名为E2164)在柠檬酸酶稀释缓冲液中稀释至活性为250和600mU/mL的浓度。将市售杂交BECK’S 5828YH玉米的种子与丙硫菌唑、戊苯吡菌胺、甲霜灵和噻虫胺(EVERGOL Energy/PONCHO)基质种子处理包装(“基质”)置于种子处理器中，每个
250个种子。将每批混合，并向每个管加入250μL的溶液，内切葡聚糖酶包被的种子的最终酶浓度为200或600μU/种子。将每批再次混合20秒以在每个种子上获得均匀的涂层。使种子干燥3周，然后在相距6.35cm、深度为3.81cm的9.14m行中种植到天然土壤中。收获植物并在收获时测量产量。每次处理重复4次。结果在下表25中显示为收获重量相对于对照处理收获物重量的百分比(校准)。
250个种子。将每批混合，并向每个管加入250μL的溶液，内切葡聚糖酶包被的种子的最终酶浓度为200或600μU/种子。将每批再次混合20秒以在每个种子上获得均匀的涂层。使种子干燥3周，然后在相距6.35cm、深度为3.81cm的9.14m行中种植到天然土壤中。收获植物并在收获时测量产量。每次处理重复4次。结果在下表25中显示为收获重量相对于对照处理收获物重量的百分比(校准)。
[0748] 表25.作为对照百分比的产量增加
[0749]
[0750] 如在表25中可以观察到的，热酸菌β-1,4内切葡聚糖酶的两种比率(rate)都导致玉米产量的增加。
[0751] 实施例8:促进植物生长的细菌菌株的分离和鉴定
[0752] 收集来自最健康和最具抗性的马铃薯，黄色西葫芦，番茄和极豆植物的根际土壤样品，用无菌水稀释，并铺在营养物琼脂平板上。选择具有高生长速率并能够传代和繁殖的细菌分离物用于进一步研究。所选菌株在基本培养基(KH2PO4 3g，Na2HPO4 6g，NH4Cl 1g，NaCl 0.50g，MgSO4 7H2O 0.15g，CaCl2 2H2O 0.013g，和葡萄糖1g，每L干重)中生长。将所选菌株的过夜培养物(30℃)离心，倾析出培养基，并重悬于等量的蒸馏水中。将每次处理的10个球生菜种子种植在1cm深的已被筛分除去大的碎片的壤土表土(Columbia，MO)中。将种子接种于4cm盆中种植，其中0.5μl重悬的细菌在水中混合到10ml的H2O中。10ml的H2O足以将细菌输送到3in3(49.16cm3)的土壤中，并使土壤饱和以使种子适当发芽。植物在65-75°F(18-24℃)之间的温度下生长，每天光照11小时，每3天浇水5ml。一周后，收集植物高度和叶片直径以及植物的总体健康状况。根际分离物的初步筛选导致从四种植物的根际获得超过200种不同的细菌和真菌物种。表26中描述了一些细菌物种。通过适当的细菌鉴定表示所鉴定的菌株。其他菌株用未知鉴定号表示。结果接近对照的接种剂(+/-2％)未包括在表中。
[0753] 表26
[0754]细菌接种物 平均高度(cm) 对比 SEM
未接种 1.8 对照 .07
孔氏副球菌NC35 2 111.1％ .05
阿耶波多芽孢杆菌CAP53 3.65 202.8％ .45
弯曲芽孢杆菌BT054 2.45 136.1％ .11
蕈状芽孢杆菌菌株BT155 2.17 120.4％ .21
阿耶波多芽孢杆菌CAP56 2.1 116.7％ .20
尼氏芽孢杆菌BOBA57 2.8 155.6％ .03
阴沟肠杆菌CAP12 2.4 133.3％ .41
未知8 1.77 77.8％ .65
未知122 1.9 105.6％ .11
未知15 1.4 77.8％ .41
未知39 1.8 100.0％ .20
未知401 2 111.1％ .21
未知402 1.53 85.2％ .27
未知41 1.45 80.6％ .31
未知42 1.4 77.8％ .15
未知44 2.2 133.3％ .08
未知51 1.83 102.9％ .21
未接种 1.8 对照 .07
孔氏副球菌NC35 2 111.1％ .05
阿耶波多芽孢杆菌CAP53 3.65 202.8％ .45
弯曲芽孢杆菌BT054 2.45 136.1％ .11
蕈状芽孢杆菌菌株BT155 2.17 120.4％ .21
阿耶波多芽孢杆菌CAP56 2.1 116.7％ .20
尼氏芽孢杆菌BOBA57 2.8 155.6％ .03
阴沟肠杆菌CAP12 2.4 133.3％ .41
未知8 1.77 77.8％ .65
未知122 1.9 105.6％ .11
未知15 1.4 77.8％ .41
未知39 1.8 100.0％ .20
未知401 2 111.1％ .21
未知402 1.53 85.2％ .27
未知41 1.45 80.6％ .31
未知42 1.4 77.8％ .15
未知44 2.2 133.3％ .08
未知51 1.83 102.9％ .21
[0755] 在初始生菜试验中对整体植物健康和植物高度产生最大影响的细菌菌株进行进一步鉴定。将细菌菌株在37℃下在Luria Bertani肉汤中培养过夜，并将过夜培养物在离心机中离心。倾析培养基，使用Qiagen细菌染色体DNA分离试剂盒对剩余的细菌沉淀进行染色体DNA分离。使用引物E338F 5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3'(SEQ ID NO：108)，E1099R A 5'-GGG TTG CGC TCG TTG C-3'(SEQ ID NO：109)和E1099R B 5'-GGG TTG CGC TCG TTA C-3'(SEQ ID NO：110)对染色体DNA进行16S rRNA编码区的PCR扩增。使用Promega PCR纯化试剂盒纯化PCR扩增子，将得到的扩增子稀释并送至University of Missouri DNA Core进行DNA测序。将DNA序列与NCBI BLAST数据库中的细菌分离物和属和物种进行比较，通过与已知菌株的直接比较来鉴定。表26中列出了最常鉴定的物种。在许多情况下，16S rRNA DNA序列仅能够描绘所选细菌菌株的属。在没有直接鉴定的情况下，使用本领域标准方法进行额外的生物化学分析以区分菌种和菌株水平，并列于表27中。
[0756] 表27
[0757]
[0758] 实施例9:额外促进植物生长的细菌菌株的分离和鉴定
[0759] 收集来自Gas,Kansas附近田间的土壤样品，用无菌水稀释，并铺在营养琼脂平板上。选择具有高生长速率并能够传代和繁殖的细菌分离物用于进一步研究。所选菌株在基本培养基(KH2PO4 3g，Na2HPO4 6g，NH4Cl 1g，NaCl 0.50g，MgSO4 7H2O 0.15g，CaCl2 2H2O 0.013g，和葡萄糖1g，每L干重)中生长。将所选菌株的过夜培养物(30℃)离心，倾析出培养基，并重悬于等量的蒸馏水中。用与单独的水混合的商业种子聚合物(每种子总共1.6μl)或含有选择的细菌菌株的商业种子聚合物(每种子总共1.6μl)包被玉米种子。将包被种子种植在已被筛分除去大的碎片的壤土表土(Columbia，MO)的3英寸(7.62cm)直径盆中。植物在
18–24℃(65–75°F)之间的温度下生长，每天光照11小时，并且种植时和每3天浇水50ml。两周后，收集植物高度和叶片直径以及植物的总体健康状况。对于发芽测定和确定3天根长度，如上所述包被种子并均匀地分散在每个纸巾10个种子上。将纸巾用10ml水润湿，卷起，置于小塑料袋中并在30℃孵育或置于27-30℃(80-85°F)的发芽热垫上。3天后记录根测量值。根际分离物的初步筛选导致根际获得超过100种不同的细菌和真菌物种。表28中描述了一些细菌物种。通过适当的细菌鉴定表示所鉴定的菌株。
18–24℃(65–75°F)之间的温度下生长，每天光照11小时，并且种植时和每3天浇水50ml。两周后，收集植物高度和叶片直径以及植物的总体健康状况。对于发芽测定和确定3天根长度，如上所述包被种子并均匀地分散在每个纸巾10个种子上。将纸巾用10ml水润湿，卷起，置于小塑料袋中并在30℃孵育或置于27-30℃(80-85°F)的发芽热垫上。3天后记录根测量值。根际分离物的初步筛选导致根际获得超过100种不同的细菌和真菌物种。表28中描述了一些细菌物种。通过适当的细菌鉴定表示所鉴定的菌株。
[0760] 表28
[0761]
[0762] 表28中描述了对植物健康产生最大影响的细菌菌株。将细菌菌株在37℃下在Luria Bertani肉汤中培养过夜，并将过夜培养物在离心机中离心。倾析培养基，使用Qiagen细菌染色体DNA分离试剂盒对剩余的细菌沉淀进行染色体DNA分离。使用引物E338F 5'-ACT CCT ACG GGA GGC AGC AGT-3'(SEQ ID NO：108)，E1099R A5'-GGG TTG CGC TCG TTG C-3'(SEQ ID NO：109)和E1099R B 5'-GGG TTG CGC TCG TTA C-3'(SEQ ID NO：110)对染色体DNA进行16S rRNA编码区的PCR扩增。使用Promega PCR纯化试剂盒纯化PCR扩增子，将得到的扩增子稀释并送至University of Missouri DNA Core进行DNA测序。将DNA序列与NCBI BLAST数据库中的细菌分离物和属和物种进行比较，通过与已知菌株的直接比较来鉴定。表28中列出了最常鉴定的物种。在许多情况下，16S rRNA DNA序列仅能够描绘所选细菌菌株的属。在没有直接鉴定的情况下，使用本领域标准方法进行另外的生物化学分析以区分菌种和菌株水平的菌株，并且分化的菌株列于表29中。
[0763] 表29
[0764]
[0765] wk＝弱生长或低生长
[0766] 实施例10:促进植物生长的细菌菌株对紫花苜蓿的测试
[0767] 所选菌株在基本培养基(KH2PO4 3g,Na2HPO4 6g,NH4Cl 1g,NaCl 0.50g,MgSO4 7H2O 0.15g,CaCl2 2H2O 0.013g,和葡萄糖1g,每L干重)中生长。将所选菌株的过夜培养物(30℃)离心，倾析出培养基，并细菌重悬于等量的蒸馏水中。将每次处理的ZEBA包被的10个紫花苜蓿种子种植在0.6cm深的已被筛分除去大的碎片的壤土表土(Columbia，MO)中。ZEBA是一种超吸收性玉米淀粉基聚合物，用作保湿种子涂层。将种子接种种植，其中0.5μl重悬的细菌在水中混合到10ml的H2O中。10ml的H2O足以将细菌输送到3in3(49.16cm3)的土壤中，并使土壤饱和以使种子适当发芽。植物在65-75°F(18-24℃)之间的温度下生长，每天光照
11小时，每3天浇水5ml。使紫花苜蓿生长1周以分析在所述条件下植物的出苗和初始生长。
表30列出了由其适当的细菌鉴定所表示的鉴定菌株和最终高度数据。
11小时，每3天浇水5ml。使紫花苜蓿生长1周以分析在所述条件下植物的出苗和初始生长。
表30列出了由其适当的细菌鉴定所表示的鉴定菌株和最终高度数据。
[0768] 表30
[0769]细菌接种物 平均高度(cm) 比较 SEM
未接种 4.82 – .008
阿耶波多芽孢杆菌CAP56 4.85 101.20％ .016
尼氏芽孢杆菌BOBA57 4.86 101.70％ .021
阴沟肠杆菌CAP12 5.6 116.23％ .020
未接种 4.82 – .008
阿耶波多芽孢杆菌CAP56 4.85 101.20％ .016
尼氏芽孢杆菌BOBA57 4.86 101.70％ .021
阴沟肠杆菌CAP12 5.6 116.23％ .020
[0770] 实施例11:促进植物生长的细菌菌株对黄瓜的测试
[0771] 所选菌株在基本培养基(KH2PO4 3g,Na2HPO4 6g,NH4Cl 1g,NaCl 0.50g,MgSO4 7H2O 0.15g,CaCl2 2H2O 0.013g,和葡萄糖1g,每L干重)中生长。将所选菌株的过夜培养物(30℃)离心，倾析出培养基，并重悬于等量的蒸馏水中。将每次处理的10个黄瓜种子种植在
1cm深的已被筛分除去大的碎片的壤土表土(Columbia，MO)中。将种子接种种植，其中0.5μl重悬的细菌在水中混合到10ml的H2O中。10ml的H2O足以将细菌输送到3in3(49.16cm3)的土壤中，并使土壤饱和以使种子适当发芽。植物在65-75°F(18-24℃)之间的温度下生长，每天光照11小时，每3天浇水5ml。使黄瓜生长2周以分析在所述条件下植物的出苗和初始生长。
表31列出了由其适当的细菌鉴定所表示的鉴定菌株和最终高度数据。
1cm深的已被筛分除去大的碎片的壤土表土(Columbia，MO)中。将种子接种种植，其中0.5μl重悬的细菌在水中混合到10ml的H2O中。10ml的H2O足以将细菌输送到3in3(49.16cm3)的土壤中，并使土壤饱和以使种子适当发芽。植物在65-75°F(18-24℃)之间的温度下生长，每天光照11小时，每3天浇水5ml。使黄瓜生长2周以分析在所述条件下植物的出苗和初始生长。
表31列出了由其适当的细菌鉴定所表示的鉴定菌株和最终高度数据。
[0772] 表31
[0773]
[0774]
[0775] 实施例12:促进植物生长的细菌菌株对黄色南瓜的测试
[0776] 所选菌株在基本培养基(KH2PO4 3g,Na2HPO4 6g,NH4Cl 1g,NaCl 0.50g,MgSO4 7H2O 0.15g,CaCl2 2H2O 0.013g,和葡萄糖1g,每L干重)中生长。将所选菌株的过夜培养物(30℃)离心，倾析出培养基，并重悬于等量的蒸馏水中。将每次处理的10个黄瓜种子种植在
1cm深的已被筛分除去大的碎片的壤土表土(Columbia，MO)中。将种子接种种植，其中0.5μl重悬的细菌在水中混合到10ml的H2O中。10ml的H2O足以将细菌输送到3in3(49.16cm3)的土壤中，并使土壤饱和以使种子适当发芽。植物在65-75°F(18-24℃)之间的温度下生长，每天光照11小时，每3天浇水5ml。使黄瓜生长2周以分析在所述条件下植物的出苗和初始生长。
表31列出了由其适当的细菌鉴定所表示的鉴定菌株和最终高度数据。
1cm深的已被筛分除去大的碎片的壤土表土(Columbia，MO)中。将种子接种种植，其中0.5μl重悬的细菌在水中混合到10ml的H2O中。10ml的H2O足以将细菌输送到3in3(49.16cm3)的土壤中，并使土壤饱和以使种子适当发芽。植物在65-75°F(18-24℃)之间的温度下生长，每天光照11小时，每3天浇水5ml。使黄瓜生长2周以分析在所述条件下植物的出苗和初始生长。
表31列出了由其适当的细菌鉴定所表示的鉴定菌株和最终高度数据。
[0777] 表32
[0778]
[0779] 实施例13:促进植物生长的细菌菌株对黑麦草的测试
[0780] 所选菌株在基本培养基(KH2PO4 3g,Na2HPO4 6g,NH4Cl 1g,NaCl 0.50g,MgSO4 7H2O 0.15g,CaCl2 2H2O 0.013g,和葡萄糖1g,每L干重)中生长。将所选菌株的过夜培养物(30℃)离心，倾析出培养基，并重悬于等量的蒸馏水中。将每次处理的30个黑麦草种子种植在0.3cm深的已被筛分除去大的碎片的壤土表土(Columbia，MO)中。将种子接种种植，其中
0.5μl重悬的细菌在水中混合到10ml的H2O中。10ml的H2O足以将细菌输送到3in3(49.16cm3)的土壤中，并使土壤饱和以使种子适当发芽。植物在65-75°F(18-24℃)之间的温度下生长，每天光照11小时，每3天浇水5ml。使黑麦草生长1.5周以分析在所述条件下植物的出苗和初始生长。表33列出了由其适当的细菌鉴定所表示的鉴定菌株和高度数据。
0.5μl重悬的细菌在水中混合到10ml的H2O中。10ml的H2O足以将细菌输送到3in3(49.16cm3)的土壤中，并使土壤饱和以使种子适当发芽。植物在65-75°F(18-24℃)之间的温度下生长，每天光照11小时，每3天浇水5ml。使黑麦草生长1.5周以分析在所述条件下植物的出苗和初始生长。表33列出了由其适当的细菌鉴定所表示的鉴定菌株和高度数据。
[0781] 表33
[0782]细菌接种物 平均高度(cm) 比较 SEM
未接种 1.61 – .023
阿耶波多芽孢杆菌CAP53 2.01 124.70％ .012
弯曲芽孢杆菌BT054 2.21 137.30％ .034
蕈状芽孢杆菌BT155 2.29 142.20％ .049
阿耶波多芽孢杆菌CAP56 2.19 136.00％ .009
尼氏芽孢杆菌BOBA57 2.29 142.40％ .045
阴沟肠杆菌CAP12 1.98 122.50％ .015
未接种 1.61 – .023
阿耶波多芽孢杆菌CAP53 2.01 124.70％ .012
弯曲芽孢杆菌BT054 2.21 137.30％ .034
蕈状芽孢杆菌BT155 2.29 142.20％ .049
阿耶波多芽孢杆菌CAP56 2.19 136.00％ .009
尼氏芽孢杆菌BOBA57 2.29 142.40％ .045
阴沟肠杆菌CAP12 1.98 122.50％ .015
[0783] 实施例14:促进植物生长的细菌菌株对玉米的测试
[0784] 所选菌株在基本培养基(KH2PO4 3g,Na2HPO4 6g,NH4Cl 1g,NaCl 0.50g,MgSO4 7H2O 0.15g,CaCl2 2H2O 0.013g,和葡萄糖1g,每L干重)中生长。将所选菌株的过夜培养物(30℃)离心，倾析出培养基，并重悬于等量的蒸馏水中。将每次处理的10个玉米种子种植在
2.5cm深的已被筛分除去大的碎片的壤土表土(Columbia，MO)中。将种子接种种植，其中0.5μl重悬的细菌在水中混合到10ml的H2O中。10ml的H2O足以将细菌输送到3in3(49.16cm3)的土壤中，并使土壤饱和以使种子适当发芽。植物在65-75°F(18-24℃)之间的温度下生长，每天光照11小时，每3天浇水5ml。使玉米生长2周以分析在所述条件下植物的出苗和初始生长。表34列出了由其适当的细菌鉴定所表示的鉴定菌株和最终高度数据。
2.5cm深的已被筛分除去大的碎片的壤土表土(Columbia，MO)中。将种子接种种植，其中0.5μl重悬的细菌在水中混合到10ml的H2O中。10ml的H2O足以将细菌输送到3in3(49.16cm3)的土壤中，并使土壤饱和以使种子适当发芽。植物在65-75°F(18-24℃)之间的温度下生长，每天光照11小时，每3天浇水5ml。使玉米生长2周以分析在所述条件下植物的出苗和初始生长。表34列出了由其适当的细菌鉴定所表示的鉴定菌株和最终高度数据。
[0785] 表34
[0786]
[0787]
[0788] 实施例15:促进植物生长的细菌菌株对大豆的测试
[0789] 所选菌株在基本培养基(KH2PO4 3g,Na2HPO4 6g,NH4Cl 1g,NaCl 0.50g,MgSO4 7H2O 0.15g,CaCl2 2H2O 0.013g,和葡萄糖1g,每L干重，或者对于短根瘤菌或根瘤菌用酵母甘露醇培养基)中生长。将所选菌株的过夜培养物(30℃)离心，倾析出培养基，并重悬于等量的蒸馏水中。将每次处理的10个大豆种子种植在2.5cm深的已被筛分除去大的碎片的壤土表土(Columbia，MO)中。将种子接种种植，其中0.5μl重悬的细菌在水中混合到10ml的H2O中。当测试两种细菌菌株时，将0.5μl每种重悬浮的细菌混合到10ml的H2O中。10ml的H2O足以将细菌输送到3in3(49.16cm3)的土壤中，并使土壤饱和以使种子适当发芽。植物在65-75°F(18-24℃)之间的温度下生长，每天光照11小时，每3天浇水5ml。使大豆生长2周以分析在所述条件下植物的出苗和初始生长。表35列出了由其适当的细菌鉴定所表示的鉴定菌株和最终高度数据。将本发明中的细菌菌株与短根瘤菌的某个种或根瘤菌的某个种的共接种与单独的接种物相比，导致植物生长增加。
[0790] 表35
[0791]
[0792] 实施例16:具有促进植物生长属性的蜡状芽孢杆菌家族成员
[0793] 将蕈状芽孢杆菌菌株BT155、蕈状芽孢杆菌菌株EE118、蕈状芽孢杆菌菌株EE141、蕈状芽孢杆菌菌株BT46-3、蜡状芽孢杆菌家族成员菌株EE349、苏云金芽孢杆菌菌株BT013A和巨大芽孢杆菌菌株EE281在Luria Bertani肉汤中于37℃生长并且将过夜培养物旋转沉淀，将培养基倒出，并重悬于等量的蒸馏水中。将每次处理的20个玉米种子种植在2.5cm深的已被筛分除去大的碎片的壤土表土(Columbia，MO)中。将种子接种种植，其中0.5μl重悬的细菌在水中混合到50ml的H2O中。50ml的H2O足以将细菌输送到29in3(475.22cm3)的土壤中，并使土壤饱和以使种子适当发芽。植物在65–72°F之间的温度下生长，每天光照13小时，每3天浇水5ml。使幼苗生长2周以分析在所述条件下植物的出苗和初始生长。表36列出了由其适当的细菌鉴定所表示的鉴定菌株和最终高度数据。
[0794] 表36
[0795]细菌接种物 平均高度，cm,玉米 百分比 SEM,
H2O对照 11.41 100％ .123
蕈状芽孢杆菌EE118 12.43 108.9％ .207
蕈状芽孢杆菌EE141 12.84 112.5％ .231
蕈状芽孢杆菌BT46-3 11.81 103.5％ .089
苏云金芽孢杆菌BT013A 12.05 105.6％ .148
蜡状芽孢杆菌家族成员EE128 13.12 114.9％ .159
蕈状芽孢杆菌BT155 12.85 112.6％ .163
巨大芽孢杆菌EE281 11.99 105.1％ .098
H2O对照 11.41 100％ .123
蕈状芽孢杆菌EE118 12.43 108.9％ .207
蕈状芽孢杆菌EE141 12.84 112.5％ .231
蕈状芽孢杆菌BT46-3 11.81 103.5％ .089
苏云金芽孢杆菌BT013A 12.05 105.6％ .148
蜡状芽孢杆菌家族成员EE128 13.12 114.9％ .159
蕈状芽孢杆菌BT155 12.85 112.6％ .163
巨大芽孢杆菌EE281 11.99 105.1％ .098
[0796] 在所述条件下，所测试的所有植物生长促进细菌在两周时对玉米高度具有有益效果。蜡状芽孢杆菌家族成员EE128菌株在该试验中具有最大效果，使玉米高度增加超过14％。
[0797] 实施例17:内生蜡状芽孢杆菌家族细菌菌株的分离、鉴定和表征
[0798] 发现上文在前面的实施例中讨论的蜡状芽孢杆菌家族成员349具有内生生长的能力。还鉴定了几种具有内生生长能力的蜡状芽孢杆菌家族成员：蜡状芽孢杆菌家族成员EE439，苏云金芽孢杆菌EE417，蜡状芽孢杆菌EE444，苏云金芽孢杆菌EE319，苏云金芽孢杆菌EE-B00184，蕈状芽孢杆菌EE-B00363，假蕈状芽孢杆菌EE-B00366和蜡状芽孢杆菌家族成员EE-B00377。
[0799] 为了获得这些另外的蜡状芽孢杆菌家族成员，将商业杂交玉米种子种植在盆栽土壤中并使其生长。用杀真菌剂和生物接种物包被玉米种子。使植物在人工照明下生长14小时，并测定14天期间的植物生长。在实验过程中每三天对植物进行浇水。14天后，从土壤中提取植物并洗涤以除去多余的碎片。然后将植物倒置，暴露于5％漂白剂10分钟，在水中洗涤，暴露于过氧化氢(10％)10分钟，再次在水中洗涤，并用无菌剃刀刀片分开茎。将茎的分开的一半面朝下放在营养琼脂平板上两小时。两小时后，取出茎，将琼脂平板在30℃培养48小时。48小时后，检查平板的菌落形态，并将在植物内部发现的蜡状芽孢杆菌家族成员菌落挑取到营养琼脂上。然后将它们在脑心浸液肉汤中于30℃生长过夜，并以10000×g离心5分钟。除去上清液，将沉淀在-20℃下冷冻过夜。然后从每个克隆中提取染色体DNA，并使用16S rRNA引物通过PCR验证的每个菌落的身份并且扩增子被送去进行DNA测序和鉴定。在上表17中提供这些菌株的16S rRNA序列。
[0800] 实施例18:另外的内生细菌菌株(非蜡状芽孢杆菌家族成员)的分离、鉴定和表征[0801] 从玉米幼苗分离内生细菌菌株巨大芽孢杆菌EE385、芽孢杆菌的一个种EE387、环状芽孢杆菌EE388、枯草芽孢杆菌EE405、梭形赖氨酸芽孢杆菌EE442、赖氨酸芽孢杆菌的某些种EE443和短小芽孢杆菌EE-B00143。首先对两周大的玉米幼苗进行灭菌。从土壤中提取它们并洗涤以除去多余的碎片。然后将植物倒置，暴露于5％漂白剂10分钟，在水中洗涤，暴露于过氧化氢(10％)10分钟，并再次在水中洗涤。然后用无菌剃刀刀片将茎分开。将茎的分开的一半面朝下放在营养琼脂平板上两小时。两小时后，从平板取出植物的茎，然后将平板在30℃培养48小时。选择内生的芽孢杆菌菌落用于进一步分析。这些菌株在脑心浸液肉汤中在30℃生长过夜，并使用Qiagen染色体DNA试剂盒对培养物进行DNA提取。通过PCR扩增DNA以获得16S rRNA基因，将其送去进行DNA测序。使用NCBI数据库对得到的序列进行BLAST搜索以确定芽孢杆菌的种的身份。在上表17中提供了16S rRNA序列。
[0802] 将1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACC脱氨酶)作为喷雾施用于叶面以施用于玉米植物。苏云金芽孢杆菌菌株IS5056(SEQ ID NO:113)的D-半胱氨酸脱巯基酶的两个氨基酸被突变，导致ACC脱氨酶(1-氨基环丙烷-1-羧酸酯)活性的适度增加。除了其D-半胱氨酸脱巯基酶活性外，来自苏云金芽孢杆菌菌株IS5056的天然D-半胱氨酸脱巯基酶具有足够的固有ACC脱氨酶活性。然而，出于本发明实施例和实施例20的目的，来自苏云金芽孢杆菌菌株IS5056(SEQ ID NO:113)的天然D-半胱氨酸脱巯基酶将被称为“D-半胱氨酸脱巯基酶”。由于酶的突变形式(SEQ ID NO:114)具有增加的ACC脱氨酶活性，出于本实施例的目的，突变的酶将被称为“ACC脱氨酶”。具有突变的序列提供为SEQ ID NO:112(核酸)和SEQ ID NO:114(蛋白质)。在表2中，所示的两个氨基酸取代以粗体和下划线标出。使用本领域标准的PCR诱变技术，用谷氨酸残基取代SEQ ID NO:113的位置290的苏氨酸，并且用亮氨酸残基取代SEQ ID NO:113的位置317的丝氨酸残基。然后将编码d-半胱氨酸脱氨酶(SEQ ID NO:
111)和ACC脱氨酶(SEQ ID NO:112)的基因克隆到在BclA孢子形成启动子的控制下的革兰氏阳性pBC载体(天然存在的质粒pBC16的小型化版本)中。然后将载体转化到苏云金芽孢杆菌中。在释放细胞内容物(包括酶)的基本培养基中孢子形成后，通过过滤除去所有细胞，并将剩余的活性酶部分施用于植物。使用标准二硝基苯酚肼测定法定量ACC脱氨酶活性(Li等人，A colorimetric assay of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate(ACC)based on ninhydrin reaction for rapid screening of bacteria containing ACC deaminase,Lett Appl.Microbiol.53(2):178–85(2011)。
111)和ACC脱氨酶(SEQ ID NO:112)的基因克隆到在BclA孢子形成启动子的控制下的革兰氏阳性pBC载体(天然存在的质粒pBC16的小型化版本)中。然后将载体转化到苏云金芽孢杆菌中。在释放细胞内容物(包括酶)的基本培养基中孢子形成后，通过过滤除去所有细胞，并将剩余的活性酶部分施用于植物。使用标准二硝基苯酚肼测定法定量ACC脱氨酶活性(Li等人，A colorimetric assay of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate(ACC)based on ninhydrin reaction for rapid screening of bacteria containing ACC deaminase,Lett Appl.Microbiol.53(2):178–85(2011)。
[0803] 野生型酶(SEQ ID NO:113)和具有两个点突变的酶(SEQ ID NO:114)作为游离酶提供，使用叶面递送至2周大的玉米(BECK’S 5828YH,V2至V3发育阶段)和4周大的大豆植物(BECK’S 297NR,V2至V3发育阶段)。BECK’s 5828 YH玉米含有HERCULEX(根虫抗性和玉米螟抗性性状)、草铵膦抗性性状和草甘膦抗性性状。BECK'S 297NR大豆含有线虫抗性性状(SCN-SB)和草甘膦抗性性状。
[0804] 使用D-半胱氨酸脱巯基酶和ACC脱氨酶的叶面施用单独处理每个试验的16株重复植物，并与单独的表面活性剂对照(Control)进行比较。将叶面施用的d-半胱氨酸脱巯酶(SEQ ID NO:113)和ACC脱氨酶(SEQ ID NO:114)酶的活性标准化为相同的蛋白质含量，并使用一致的使用速率作为含有0.1％非离子表面活性剂(NIS)(ALLIGARE SURFACE，Alligare LLC)的叶面喷雾施用，其用于以10ml/株植物的速率将酶递送至玉米和大豆植物。ACC脱氨酶活性的活性在本文中描述为1mU等于在30℃的1nmol产物/mg蛋白质/小时。用于该测定的D-半胱氨酸脱巯基酶的初始活性为500mU/ml，ACC脱氨酶的活性为2,124mU/ml。稀释至10ml/株植物后，酶的递送量为2.5体积％，其中每株植物最终活性为12.5mU/ml(D-半胱氨酸脱巯基酶)和53.1mU/ml(ACC脱氨酶)的最终浓度。ALLIGARE SURFACE表面活性剂含有烷基聚氧乙烯、乙二醇衍生物、保湿剂和配方助剂的共混物。
[0805] 叶面施用后两周，从玉米或大豆植物收获根，用水冲洗，轻轻吸干以除去任何过量的水，测定新鲜根重(克)。将每次处理的新鲜根重针对仅用仅含有基本培养基和0.1％非离子表面活性剂的载体处理的对照植物进行校准。结果显示于下表37和38中。
[0806] 如表37中所示，与仅用非离子表面活性剂处理(*p值＝0.015)处理的植物相比，在玉米中叶面施用ACC脱氨酶导致新鲜根质量显著(约12％)增加。相比之下，接受D-半胱氨酸脱巯基酶的玉米植物的平均新鲜根质量与仅接受表面活性剂处理的对照植物的平均新鲜根质量相当。
[0807] 在用D-半胱氨酸脱巯基酶处理的大豆植物(表38)中，叶面施用后2周根质量略有增加。相比之下，ACC脱氨酶处理的大豆植物的根质量平均比对照增加12％。
[0808] 本研究同时观察单子叶植物玉米和双子叶植物大豆，证明叶面施用ACC脱氨酶(以及在较小程度上，D-半胱氨酸脱巯基酶)可直接导致叶面处理的植物根质量相比于对照处理增加。
[0809] 表37.与对照植物相比叶面施用ACC脱氨酶处理的玉米植物的平均根质量
[0810]
[0811] 表38.与对照植物相比叶面施用ACC脱氨酶处理的大豆植物的平均根质量
[0812]
[0813]
[0814] ACC脱氨酶(SEQ ID NO：114)也作为杂交水稻种子周围区域的犁沟(土壤施用)处理施用，其也导致植物生长增加。如上所述，以上述初始浓度产生和纯化ACC脱氨酶(SEQ ID NO：114)，并且对于每2.5加仑水/Ac(23.4升/公顷)以8fl oz/Ac(584.2ml/公顷)的速率递送酶。在水中稀释后，对于D-半胱氨酸脱巯基酶产生6.25mU/ml的最终活性，对于ACC脱氨酶产生52.1mU/ml的最终活性。产物直接以1ml/种子的速率施用于种子顶部，并在种子被松散的土壤覆盖之前在土壤中干燥。结果显示在下表39中。对于使用水稻杂交种的犁沟处理，观察到针对对照校准的2个试验(每个36株植物)的平均高度增加约131％。该研究表明，游离酶ACC脱氨酶的外源犁沟施用通过增加植物高度直接影响植物生长和活力。
[0815] 表39.当作为犁沟处理施用时ACC脱氨酶提供促进生长特性
[0816]
[0817] 实施例20:ACC脱氨酶游离酶延迟果实催熟
[0818] 1-氨基环丙烷-1-羧酸脱氨酶(ACC脱氨酶)降解1-氨基环丙烷-1-羧酸酯(ACC)，即乙烯(C2H4)的天然前体，其刺激和调节果实成熟。痕量水平的乙烯在植物的整个生命过程中通过刺激或调节果实的成熟、花朵的开放以及果实和叶子的脱落或破碎而起作用。乙烯是一种重要的天然植物激素，用于农业以使得果实成熟(Lin等人，Recent advances in ethylene research,Journal of Experimental Botany 60:3311–3336(2009))。乙烯诱导的成熟的特征在于加速的色变(颜料的积累)并且伴随着外皮或果皮以及外果层内部的果肉区域的软化。为了确定游离ACC脱氨酶或D-半胱氨酸巯基酶对果实的应用是否可以延迟果实成熟，将两种酶施用于未成熟的芒果果实。
[0819] ACC脱氨酶和D-半胱氨酸巯基酶得到表征并具有上文实施例19中描述的活性。表达实施例19中描述的具有两个氨基酸突变的ACC脱氨酶(SEQ ID NO:114)和天然的D-半胱氨酸脱巯基酶(SEQ ID NO:113)和使用实施例19中描述的方法将其提供为游离酶。如上实施例19中所述，天然D-半胱氨酸脱巯基酶(SEQ ID NO:113)具有D-半胱氨酸脱巯基酶和ACC脱氨酶活性。
[0820] 将未成熟的芒果果实(市售品种，Keitt)用ACC脱氨酶或D-半胱氨酸脱巯基酶处理，并与用水(对照)或没有酶(表达菌株没有任何表达的酶)的单独的滤液对照处理的芒果果实进行比较。每个处理组使用四个水果。使用1mL游离酶(相当于滤液中10μg/ml的最终蛋白质浓度)完全润湿芒果果实的外层。对于该测定，在施用D-半胱氨酸脱巯基酶时施用于果实的估计的ACC脱氨酶活性为500mU/ml，ACC脱氨酶的活性为2124mU/ml。也使用1mL体积将两种对照处理(仅滤液或水)施用于芒果果实。然后将芒果果实放入密封的塑料袋中过夜。第二天，用纸巾除去多余的液体，将水果吸干。然后将干燥的芒果果实放入密封的棕色袋中(不同的处理使用分开的袋子)以增强4天的成熟反应。成熟反应按照1-5的等级进行软化和颜色变化评分，其中1为最不成熟(坚实，绿色或无颜色改变/变化)和5为最成熟(软化，颜色从绿色变为黄色/粉色的着色)，在这些低分和高分之间有不同程度的成熟(2-4)。然后将软化和色变两者的成熟反应组合以产生1-10的等级的“完全成熟反应”，其用于判断处理的有效性。
[0821] 数据在下表40中提供，并且代表每个处理组中果实的平均分数。将ACC脱氨酶和D-半胱氨酸脱巯基酶作为游离酶处理施用于芒果果实导致与4天后的水或滤液单独对照处理相比延迟成熟。ACC脱氨酶或D-半胱氨酸脱巯基酶的游离酶处理在施用于芒果时基于软化和颜色变化在整体成熟响应中产生类似的效果。这些结果表明，两种类型的酶都可以用作水果洗/淋处理，以延缓果实成熟，并可用于其它经济上重要的水果，以防止其它应激加速成熟或果实损失。
[0822] 表40.ACC脱氨酶和D-半胱氨酸脱巯基酶游离酶导致芒果果树延迟成熟
[0823]
[0824]
[0825] 实施例21:大豆种子上的葡聚糖酶和磷脂酶,田地
[0826] 将β-1,4-内切葡聚糖酶(热酸菌；SEQ ID NO:30),β-1,3-D-葡聚糖酶(白玉蜗牛；SEQ ID NO:126)、磷脂酰肌醇-特异性磷脂酶C(蜡状芽孢杆菌；SEQ ID NO:116)和磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C(蜡状芽孢杆菌；SEQ ID NO:115)作为游离酶施用于大豆种子(BECK’S
294NR)。游离酶在水中稀释至下表41中列出的浓度(μU/种子或mU/种子)。内切葡聚糖酶或磷脂酶活性的单位(U)通过在理想温度和条件下分解1μmol/min/mL底物(1U＝1μmol底物/分钟)所需的酶量来确定。每个种子接受处理的最终活性所需的酶溶液量(1μL/种子)，并与种子处理甲霜灵和噻虫胺混合。将种子完全干燥，然后在田间种植，以接近种植深度和行距(1.5至2英寸(3.8厘米至5厘米)深的标准做法，以确保正常的根发育和平均每英亩150000株植物(每公顷370658株植物)，行宽为30英寸(76.2厘米)，种子间距为每英尺约7至8个种子(每米26个种子))。肥料按土壤试验的推荐施用。除草剂用于杂草控制并在必要时补充培养。
294NR)。游离酶在水中稀释至下表41中列出的浓度(μU/种子或mU/种子)。内切葡聚糖酶或磷脂酶活性的单位(U)通过在理想温度和条件下分解1μmol/min/mL底物(1U＝1μmol底物/分钟)所需的酶量来确定。每个种子接受处理的最终活性所需的酶溶液量(1μL/种子)，并与种子处理甲霜灵和噻虫胺混合。将种子完全干燥，然后在田间种植，以接近种植深度和行距(1.5至2英寸(3.8厘米至5厘米)深的标准做法，以确保正常的根发育和平均每英亩150000株植物(每公顷370658株植物)，行宽为30英寸(76.2厘米)，种子间距为每英尺约7至8个种子(每米26个种子))。肥料按土壤试验的推荐施用。除草剂用于杂草控制并在必要时补充培养。
[0827] 进行三次重复试验，每次试验由600个种子组成。在播种后约六个月测量大豆产量，并在下表41中报告为蒲式耳/英亩(Bu/Ac)或公吨/公顷(MT/ha)相对于对照(仅水)的绝对变化和与对照校准的产量百分比。与对照(水处理的)种子相比，施用内切葡聚糖酶或磷脂酶(β-1,4-内切葡聚糖酶(解热酸菌属)、β-1,3-D-葡聚糖酶(白玉蜗牛)、磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(蜡状芽孢杆菌)和磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C(蜡状芽孢杆菌))作为种子处理均导致增加的产量。在所测试的酶中，磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C(蜡状芽孢杆菌)提供了比对照产量最大的增加，导致与未处理的对照种子相比超过8Bu/Ac(超过0.5MT/ha)增加或产量增加145％(见表41)。
[0828] 表41.葡聚糖酶和磷脂酶作为种子处理施用以增加大豆产量
[0829]
[0830]
[0831] 实施例22:玉米种子上的游离磷脂酶，温室
[0832] 将来自蜡状芽孢杆菌(SEQ ID NO：115)的磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C(PLC)在水中稀释至活性为20mU/种子至800mU/种子的浓度(如下表42中所列)。PLC酶活的单位由在理想温度和条件下分解1μmol/min/mL底物(1U＝1μmol底物/min)所需的酶量确定。
[0833] 两个重复试验由18个种子组成，将每个商业杂交BECK'S 5828YH玉米置于50mL锥形管中。将每个锥形管涡旋，每管加入18μL酶溶液，以达到最终酶浓度为每个种子施加20、50、100、200、400、600或800mU的PLC活性。将锥形管再次涡旋20秒以在每个种子上获得均匀的涂层。将种子干燥5分钟，然后以深度为2.54cm种植到含有表土的39.7cm3盆，每盆2个种子。种植后，每盆加入50mL室温水使其发芽。将盆保存在人工照明的生长室中，接收约为300μmol m-2s-1的光照水平，持续13/11照明/白天循环和21℃白天/15℃夜间温度范围。
[0834] 在每个处理组每个试验使用18株植物的2次重复试验中平均植物高度。使用PLC酶进行种子处理后植物高度的差异针对仅接受水处理的对照植物进行校准。表42中表示植物高度的变化，与对照校准的平均植物高度的百分比，并且报告了2个试验的标准偏差(STDEV)。从表42中可以看出，当与水(非酶)处理的对照植物相比较并校准时，50mU/种子至600mU/种子的PLC酶活导致玉米植物的高度(cm)显著增加。
[0835] 表42.磷脂酶C(PLC)作为种子处理施用以玉米以促进生长
[0836]
[0837]
[0838] 在第二个实验中，测定实现最佳生长所需的磷脂酶D的效价。将来自燕麦食酸菌的磷脂酶D(PLD)(SEQ ID NO：117)在水中稀释至浓度为20mU/种子至800mU/种子。PLD酶活的单位通过在理想温度和条件下分解1μmol/min/mL底物(1U＝1μmol底物/min)所需的酶量来确定。每个酶活水平每个试验使用18株植物进行两次重复试验。对于两个试验中的每个处理组，将商业玉米杂交种(BECK'S 5828 YH)的18个种子置于50mL锥形管中。将每个锥形管涡旋并向每个管中加入18μL酶溶液，以使每个PLD种子的最终酶浓度达到20、50、100、200、400、600或800mU。使用1μl体积将PLD的效价范围从20mU/种子至800mU/种子施加于玉米种子以确定促进生长的最佳PLD种子处理。将锥形管再次涡旋20秒以在每个种子上获得均匀涂层。将种子干燥5分钟，然后以深度为2.54cm铺在含有表土的39.7cm3盆中，每盆2个种子。
种植后，向每个盆中加入50mL室温水以使其发芽。将盆保持在人工照明生长室中，接收约
300μmol m-2s-1的光照水平，持续13/11照明/白天周期和21℃白天/15℃夜间温度范围。
种植后，向每个盆中加入50mL室温水以使其发芽。将盆保持在人工照明生长室中，接收约
300μmol m-2s-1的光照水平，持续13/11照明/白天周期和21℃白天/15℃夜间温度范围。
[0839] 在2次重复试验中平均植物高度(以cm计)，每次处理每次试验使用18株植物。将由PLD处理的种子产生的植物的高度与对照校准，并且表示针对非酶处理(水)对照植物校准的平均植物高度的百分比，并且报告在下表43中，其带有2次试验的标准偏差(STDEV)。
[0840] 从表43中可以看出，施用于玉米种子的磷脂酶D在测试的每个酶活性水平下对植物生长具有积极作用。在每种情况下，与对照植物相比，用PLD作为种子处理的植物具有增加的高度。
[0841] 表43.磷脂酶D(PLD)作为种子处理施用于玉米以促进生长
[0842]
[0843]
[0844] 实施例23:玉米和大豆上游离磷脂酶和木糖葡聚糖酶,叶面,温室
[0845] 使用表44(下文)中所述的酶浓度将游离木糖葡聚糖酶(SEQ ID NO：125；类芽孢杆菌属)和磷脂酶D(SEQ ID NO：117；燕麦食酸菌)作为叶面处理使用喷雾瓶并递送10ml/植物、使用0.1％非离子表面活性剂(ALLIGARE SURFACE)施用于2周大的杂交玉米(BECK'S 5828YH)。将平均植物高度与对照植物校准，其接受单独叶面施用的水加上表面活性剂。与对照植物相比，作为叶面喷雾施用于玉米植物的木糖葡聚糖酶和磷脂酶D处理均导致植物高度增加(表44)。向玉米植物以提供为600μU/ml的叶面使用率施用的木葡聚糖酶和以提供为200μU/ml的叶面使用率施用的磷脂酶D表现出植物生长增加最多，导致与对照植物相比分别增加106.5％和111.1％。
[0846] 表44.使用木糖葡聚糖酶和磷脂酶D作为游离酶对玉米的叶面处理促进玉米植物中生长
[0847]
[0848] 在另一个实验中，来自食酸菌属的磷脂酶D(PLD)作为种子处理施用于大豆种子(BECK'S 297NR)，使用1μL体积相当于每个种子提供600mU/种子和800mU/种子的最终活性(基于上述实施例22中对玉米所述的效价，选择这些活性用于在大豆中进行测试)。将600mU/种子和800mU/种子的PLD活性用作对大豆种子的种子处理，并对植物生长率产生积极影响。
[0849] 将处理过的种子种植在温室中并使其生长。当植物达到V2至V3发育阶段时，测量它们的总生物量、根生物量和结瘤计数。V2至V3阶段是结瘤形成的最早发育阶段。一旦根毛存在于主根或分枝根上，结瘤开始在大豆幼苗中开始。在初始根瘤菌感染后约2至3周开始固氮。大豆植物在V1至V2阶段完全形成第一片三叶面叶，并在估计的固氮峰值中测量。大豆根的有效结瘤导致每英亩更高的产量和更高质量的种子产生、蛋白质和油。
[0850] 进行两个独立实验(每个处理组每个试验18株重复植物)。将来自PLD处理的植物的数据与从水处理的对照种子生长的对照植物校准。
[0851] 与使用未经接受PLD游离酶的水处理对照种子生长的植物相比，使用800mU/大豆种子作为种子处理施用的PLD导致总生物量和根生物量显著增加(表45)。
[0852] PLD处理还增加了植物根的结瘤计数。与未处理的对照相比，具有600mU或800mU PLD活性的两种种子处理均导致结瘤增加，其中800mU处理使大豆植物根上的结瘤数几乎翻倍。
[0853] 表45.磷脂酶D处理作为大豆种子处理的生物量效应
[0854]
[0855] 实施例24:玉米上的游离酶，田地
[0856] 将游离木糖葡聚糖酶、木聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶、苔聚糖酶、木糖苷酶、蛋白酶和脂肪酶在水中稀释至下表46中列出的活性水平。用1μL游离酶溶液/种子处理杂交玉米(BECK'S 5828 YH)种子，以获得每个种子的活性(1U＝1μmol底物/分钟)，如下表46所示。将种子完全干燥并在每次处理中以4个重复的24'(7.3m)行种植，种子间距为1.72个种子/英尺/行(5.64个种子/米/行)。使用用于玉米种植的常规或保护性耕作方法制备每个位置的田间苗床。施用除草剂用于杂草控制并在必要时补充培养。每次试验重复4次。对所有处理进行种子处理，包括丙硫菌唑、戊苯吡菌胺、甲霜灵和噻虫胺。
[0857] 收获后，测量每个游离酶处理的蒲式耳/英亩(Bu/Ac)或公吨/吨的绝对变化，并与未处理的对照(水)植物的产量校准(表46，下文)。对照玉米种子平均为162Bu/Ac(10.17MT/ha)。用苔聚糖酶、蛋白酶或脂肪酶进行的种子处理导致玉米产量相对于对照植物的增加最多。与对照植物相比，用苔聚糖酶处理显示出最多的产量增加，平均增加22Bu/Ac(1.39MT/ha)，相当于当针对玉米对照植物进行校准时增加114％。
[0858] 表46.使用玉米上施用的游离酶产量增加
[0859]
[0860] 在第二个实验中，通过叶面施用将游离酶(内切葡聚糖酶、外切糖酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶和植酸酶)施用于在横跨中西部的4个地点的位于V5-V8发育阶段的玉米(BECK'S Hybrid 5140HR)，其具有HERCULEX根虫性状和草甘膦抗性性状。为了均匀包被植物叶子，另外用提供终浓度为0.1％的非离子表面活性剂(ALLIGARE SURFACE)处理所有酶处理和对照物。在对照植物上报告蒲式耳/英亩(Bu/Ac)的绝对变化(和以MT/ha计的等效值)，并且还报告了针对对照植物进行校准的产量(“水/表面活性剂对照”)(表47)。使用游离酶的叶面处理的结果报告为绝对产量Bu/Ac(或MT/ha)和通过4次重复与对照植物比较校准而调整后的产量(Bu/Ac或MT/ha)的产量的绝对变化(表47)。与对照(仅用水和表面活性剂处理的植物)植物相比，酶处理的阳性产量增加。用作叶面处理的植酸酶导致产量的总体增加最多(相对于对照的～24Bu/Ac(～1.51MT/ha)的绝对产量变化)。
[0861] 表47.使用作为在玉米上叶面处理的游离酶产量增加
[0862]
[0863] 实施例25:玉米种子上的脂肪酶，温室
[0864] 进行实验以确定作为玉米种子处理施用的脂肪酶是否也促进植物生长。将脂肪酶(荧光假单胞菌；SEQ ID NO：119)在水中稀释至浓度为每种子提供3000μU和6000μU脂肪酶活性。使用3000μU/种子和6000μU/种子活性向玉米种子(BECK'S玉米品种5828YH)施用脂肪酶，使用1μL酶/种子以实现每种子报告的活性。将种子干燥5分钟，然后以深度为2.54cm种3
植到含有表土的39.7cm盆中，每盆2个种子。种植后，向每个盆中加入50mL室温水以使其发芽。将盆保持在人工照明生长室中，接收约300μmol m-2s-1的光照水平，持续13/11照明/白天循环和21℃白天/15℃夜间温度范围。在2周结束时，当植物全部达到V2至V3发育阶段时，测量用脂肪酶处理的玉米植物的高度并将其与仅用水处理种子的对照植物的高度校准。
植到含有表土的39.7cm盆中，每盆2个种子。种植后，向每个盆中加入50mL室温水以使其发芽。将盆保持在人工照明生长室中，接收约300μmol m-2s-1的光照水平，持续13/11照明/白天循环和21℃白天/15℃夜间温度范围。在2周结束时，当植物全部达到V2至V3发育阶段时，测量用脂肪酶处理的玉米植物的高度并将其与仅用水处理种子的对照植物的高度校准。
[0865] 将实验重复两次，每个处理组18株植物(每个处理组3个重复)，并且将多个实验的值平均并在表48中与标准偏差(STDEV)一起报告。脂肪酶作为游离酶应用，每个种子使用3000μU和6000μU的活性，导致植物高度的平均增加分别约为106％和103％。
[0866] 表48.脂肪酶处理作为玉米种子处理的高度效应
[0867]
[0868] 实施例26:玉米上的脂肪酶或磷脂酶，温室犁沟
[0869] 作为犁沟处理施用的脂肪酶(洋葱伯霍尔德杆菌)用于确定将脂肪酶作为游离酶应用于玉米种子周围的区域是否会导致对玉米植物的早期的正增长益处。将脂肪酶(洋葱伯霍尔德杆菌，SEQ ID NO：118)在水中稀释至下表49中列出的活性水平。将玉米种子(BECK'S 6626RR)以深度为2.54cm种植到含有表土的39.7cm3盆中，每盆2个种子。在种植之后但在覆盖种子之前，在种子周围的每个犁沟区域施加1μL体积的脂肪酶，其活性范围为2μU至200μU。用β-1,4-内切葡聚糖酶(解纤维热酸菌；SEQ ID NO：30)代替处理种子子集，在沟中以1000μU的活性施用于种子周围的区域。将盆保持在人工照明生长室中，接收约300μmol m-2s-1的光照水平，持续13/11照明/白天循环和21℃白天/15℃夜间温度范围。大约两周后，当植物达到V2至V3发育阶段时，测量它们的高度并针对仅接受水的对照植物进行校准。用脂肪酶处理的植物进一步与接受β-1,4-内切葡聚糖酶(热酸菌)的植物进行比较。
[0870] 重复实验总共两次试验(每个处理组每次试验18株植物)。通过标准偏差(STDEV)报告两次试验中处理的与对照校准的平均植物高度(表49)。与作为犁沟处理的其它脂肪酶活性相比，使用每个种子20μU作为玉米犁沟处理施用的脂肪酶导致植物高度的增加最多。用作游离酶犁沟处理的β-1,4-内切葡聚糖酶也导致植物高度的正变化并且就玉米植物报告了生长促进作用。在种子周围以20μU/面积(每毫升水中体积)施用的脂肪酶与接受β-1,
4-内切葡聚糖酶的犁沟处理的种子相差无几。
4-内切葡聚糖酶的犁沟处理的种子相差无几。
[0871] 表49.β-1,4-内切葡聚糖酶植物犁沟处理施用于玉米种子植物周围的区域以促进生长的脂肪酶递增和效应
[0872]
[0873] 在第二个实验中，将来自蜡状芽孢杆菌的磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C(SEQ ID NO：115)与含有12％氨氮和58％可用磷酸盐(来源于磷酸单铵)的肥料(SF)使用如上所述的直接犁沟方法一起施用于玉米种子(BECK'S 5828 YH)。将酶以8fl oz/Ac(584.2ml/公顷)的施用速率或约1200mU施用于种子周围的区域。该处理导致对3次重复试验平均的植物高度的平均增加，其与单独使用水和肥料处理的对照校准为105％。结果显示在下表50中。
[0874] 表50.使用犁沟处理使用游离酶磷脂酶C对玉米的植物高度
[0875]
[0876] 实施例27:南瓜和玉米上酸性磷酸酶，犁沟中
[0877] 测试了酸性磷酸酶(单独或与脂肪酶、β-木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、苔聚糖酶或木聚糖酶组合)对植物生长的影响。将包含酸性磷酸酶的游离酶(小麦，两种不同同种型的混合物，其序列由SEQ ID NO.130和131提供，可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购，产品号P3627)单独或与脂肪酶(荧光假单胞菌，SEQ ID NO：119)、β-木聚糖酶(帕氏新考玛脂霉，SEQ ID NO：122)、果胶酶(曲霉菌属，SEQ ID NO：129)、甘露聚糖酶(芽孢杆菌属的某个种，SEQ ID NO：128)、苔聚糖酶(枯草芽孢杆菌，SEQ ID NO：43)或木聚糖酶(嗜热棉毛菌，SEQ ID NO：121)组合以表51中列出的活性水平使用，与实施例26中所述的方法相同，使用直接犁沟施用到南瓜种子周围的区域(大陆杂交南瓜，可从Park Seed商购获得，产品05298)。对含有种子处理(福美双)和与含有12％氨氮和58％可用磷酸盐的肥料(SF)一起提供的南瓜种子提供酶处理。使用在下表51中以每ml体积的活性单位列出的施用使用率施用犁沟酶和肥料单独处理，并以每种子1ml递送至种子周围的土壤。测定2个试验的植物高度，每个试验测量18株植物。数据报告于下表51中，并提供与对照种子(肥料单独对照)相比接受犁沟游离酶处理的南瓜种子的植物高度变化百分比。与对照植物相比，单独的酸性磷酸酶游离酶处理显示植物高度平均增加49.6％。与水和肥料处理的南瓜相比，接受游离酶犁沟处理的南瓜种子包含酸性磷酸酶与酶脂肪酶、β-木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、苔聚糖酶或木聚糖酶组合，具有增加的植物高度。与酸性磷酸酶与其它酶(脂肪酶、β-木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、苔聚糖酶或木聚糖酶)组合相比，单独使用酸性磷酸酶的犁沟处理导致总体生长的平均百分比增加最多，如植物高度的增加所表示的。
[0878] 表51.使用施用酸性磷酸酶和游离酶而施用的南瓜的犁沟处理的植物高度改变[0879]
[0880] 测试了酸性磷酸酶(单独或与脂肪酶、β-木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、苔聚糖酶或木聚糖酶组合)对植物生长的影响。将包含酸性磷酸酶的游离酶(小麦，两种不同同种型的混合物，其序列由SEQ ID NO.130和131提供，可从Sigma-Aldrich，St.Louis MO商购，产品号P3627)单独或与脂肪酶(荧光假单胞菌，SEQ ID NO：119)、β-木聚糖酶(帕氏新考玛脂霉，SEQ ID NO：122)、果胶酶(曲霉菌属，SEQ ID NO：129)、甘露聚糖酶(芽孢杆菌属的某个种，SEQ ID NO：128)、苔聚糖酶(枯草芽孢杆菌，SEQ ID NO：43)或木聚糖酶(嗜热棉毛菌，SEQ ID NO：121)组合以表51中列出的活性水平使用，与实施例26中所述的方法相同，使用直接犁沟施用到南瓜种子周围的区域(大陆杂交南瓜，可从Park Seed商购获得，产品05298)。对含有种子处理(福美双)和与含有12％氨氮和58％可用磷酸盐的肥料(SF)一起提供的南瓜种子提供酶处理。使用在下表51中以每ml体积的活性单位列出的施用使用率施用犁沟酶和肥料单独处理，并以每种子1ml递送至种子周围的土壤。测定2个试验的植物高度，每个试验测量18株植物。数据报告于下表51中，并提供与对照种子(肥料单独对照)相比接受犁沟游离酶处理的南瓜种子的植物高度变化百分比。与对照植物相比，单独的酸性磷酸酶游离酶处理显示植物高度平均增加49.6％。与水和肥料处理的南瓜相比，接受游离酶犁沟处理的南瓜种子包含酸性磷酸酶与酶脂肪酶、β-木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、苔聚糖酶或木聚糖酶组合，具有增加的植物高度。与酸性磷酸酶与其它酶(脂肪酶、β-木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、苔聚糖酶或木聚糖酶)组合相比，单独使用酸性磷酸酶的犁沟处理导致总体生长的平均百分比增加最多，如植物高度的增加所表示的。
[0881] 表52.使用酸性磷酸酶、磷脂酶C和β-1,4-内切葡聚糖酶与生物刺激素组合施用应用的玉米的犁沟处理的植物高度改变
[0882]
[0883] 使用直接犁沟应用将包含酸性磷酸酶(小麦，两种不同同种型的混合物，其具有本文由SEQ ID NO.130和131提供的序列)或磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C(蜡状芽孢杆菌；SEQ ID NO：115)的游离酶施用于杂交玉米种子(BECK'S 5828 YH)周围区域。用酶的犁沟处理与激素生物刺激素(CYTOPLEX，可从Miller Chemical&Fertilzier，LLC商购)处理(其含有海洋植物提取物、激活素、赤霉酸和吲哚-3-丁酸)组合结合。使用2、4和8Fl.oz/种子区域(59.14、118.29和236.59ml/种子区域)的施用使用速率施加犁沟处理。确定2个试验的植物高度，每个试验测量18株植物。数据在下表53中报告为与对照种子(单独的生物刺激素)相比，使用酸性磷酸酶或磷脂酶C酶接受犁沟处理的玉米种子的植物高度变化百分比。与对照植物相比，使用率2、4和8Fl.oz(59.14、118.29和236.59ml)/施用的种子区域(约150mU/ml、300mU/ml和600mU/ml/种子区域)的酸性磷酸酶游离酶处理增加了植物高度，其中在使用
4Fl.oz(118.29ml)的施用导致相对于300mU/ml的使用率的对照植物增加8.3％。与使用生物刺激素单独对照生长的玉米相比，使用每种子区域2和4Fl.oz(59.14和118.29ml)的使用率(分别约为每种子区域150和300mU)用磷脂酶C生长的玉米的犁沟处理导致植物高度增加。对于植物生长，优选使用4Fl.oz(118.29ml)的使用率，导致植物高度比单独的生物刺激素对照增加11.4％。与仅用水处理相比，仅生物刺激素对照导致玉米植物生长速度较慢。
4Fl.oz(118.29ml)的施用导致相对于300mU/ml的使用率的对照植物增加8.3％。与使用生物刺激素单独对照生长的玉米相比，使用每种子区域2和4Fl.oz(59.14和118.29ml)的使用率(分别约为每种子区域150和300mU)用磷脂酶C生长的玉米的犁沟处理导致植物高度增加。对于植物生长，优选使用4Fl.oz(118.29ml)的使用率，导致植物高度比单独的生物刺激素对照增加11.4％。与仅用水处理相比，仅生物刺激素对照导致玉米植物生长速度较慢。
[0884] 表53.使用酸性磷酸酶或磷脂酶C与生物刺激素组合施用施加的对玉米的犁沟处理的植物高度改变
[0885]
[0886]
[0887] 实施例28:玉米上的蛋白酶或木糖苷酶，犁沟
[0888] 将蛋白酶A(赛托曲霉；SEQ ID NO：127)和木糖苷酶(短小芽孢杆菌；SEQ ID NO：123)作为犁沟游离酶处理施用于玉米，并且检查对植物高度和生长的影响。对于蛋白酶A和木糖苷酶，如实施例26中所述使用类似的方法用于用玉米进行的脂肪酶犁沟处理。在种植玉米之后但在用松散的土壤覆盖种子之前，将犁沟处理(每种子1ml)施用于玉米种子(BECK'S 5828 YH)周围的区域。使用蛋白酶A和木糖苷酶的犁沟处理以1μL体积递送，相当于蛋白酶的428μU/种子区域活性和木糖苷酶的714μU/种子区域(每ml)活性。当与对照植物(仅水处理)校准时，蛋白酶A和木糖苷酶两者均导致植物高度增加。结果显示在下表54中。
[0889] 表54.使用用蛋白酶A或木糖苷酶处理的玉米的犁沟处理的植物高度
[0890]
[0891] 实施例29:玉米和大豆种子上的木聚糖酶或木糖苷酶，温室
[0892] 将游离酶作为种子处理施用于玉米和大豆。将源自嗜热棉毛菌(SEQ ID NO：121)或帕氏新考玛脂霉(SEQ ID NO：122)和源自短小芽孢杆菌的木聚糖酶(SEQ ID NO：123)施用于玉米(BECK'S 5828 NR)和大豆(BECK'S 297 NR)种子，在锥形管中使用相当于每个种子600μU的活性用于木聚糖酶(嗜热棉毛菌；帕氏新考玛脂霉)和每个种子714μU用于木糖苷酶(短小芽孢杆菌)的2μL体积。用β-1,4-内切葡聚糖酶(解纤维热酸菌；SEQ ID NO：30)以1000μU活性/种子处理两个分开组的玉米和大豆种子。如实施例1中所述，使种子在包被后种植并在商业表土中种植。在14天结束时，对于两个重复的玉米试验和对于一个的大豆试验(每个试验中12株植物)确定了与水对照相比植物高度的平均百分比变化。将平均株高(cm)的变化与对照植物以及从用β-1,4-内切葡聚糖酶(热酸菌)处理的种子生长的玉米和大豆植物进行比较，这导致作为玉米和大豆的种子处理施用时植物生长增加。针对水对照处理校准的植物高度的平均百分比变化在下表55中报告，其中在玉米和大豆中进行的2次试验的平均值的标准偏差(STDEV)。
[0893] 与对照植物相比，木聚糖酶(嗜热棉毛菌；帕氏新考玛脂霉)作为种子处理以600μU/种子的活性施用于玉米和大豆种子，导致植物的高度增加。应用于玉米种子的木聚糖酶(嗜热棉毛菌)处理导致玉米植株高度平均增加9％，而大豆平均增加12％。施用于玉米种子的β-木聚糖酶(帕氏新考玛脂霉)处理导致玉米的植物高度平均增加4％。木糖苷酶(短小芽孢杆菌)作为种子处理以714μU/种子施用于玉米和大豆种子，与对照植物相比，玉米和大豆植物均增加约9-11％。木聚糖酶和木糖苷酶处理作为游离酶处理施用于玉米和大豆种子对玉米和大豆植物的植物高度的正面影响与β-1,4-内切葡聚糖酶(热酸菌)相当或更好。两周后，测量植物高度并将针对仅接受肥料处理的植物进行校准。
[0894] 表55.使用内-1,4-β-木聚糖酶、内切葡聚糖酶和木糖苷酶作为种子处理来处理的玉米和大豆
[0895]
[0896] 实施例30:用于玉米和大豆上种子处理和犁沟处理的游离酶和活性递增
[0897] 用水各自稀释苔聚糖酶(枯草芽孢杆菌，作为产品E-LICHN购自Megazyme；SEQ ID NO:43)、木糖葡聚糖酶(类芽孢杆菌属种类，作为产品E-XEGP购自Megazyme；SEQ ID NO:125)、β-木聚糖酶(嗜热脂肪芽孢杆菌，作为产品E-XYNBS购自Megazyme；SEQ ID NO:25)、甘露聚糖酶(芽孢杆菌属种类，作为产品E-BMABS购自Megazyme；SEQ ID NO:128)、脂肪酶(嗜热脂肪伯克霍尔德氏菌，作为产品534641购自Sigma-Aldrich；SEQ ID NO:120)、果胶酶(日本曲霉，作为产品P3026购自Sigma-Aldrich；SEQ ID NO:129)和β-1,4-内切葡聚糖酶(解纤维热酸菌，作为产品E2164购自Sigma-Aldrich；SEQ ID NO:30)以得到如下表56中列出的活性水平。这些制剂的等分部分(1μL)用于处理本实施例和实施例31中下述实验中的种子。
[0898] 表56.用于测定作为用于玉米和大豆种子的种子处理以促进植物中生长的最佳活性的酶的滴定
[0899]酶 生物体的来源 递增使用率(μU活性)
水对照 – 0μU
苔聚糖酶 枯草芽孢杆菌 400μU
苔聚糖酶 枯草芽孢杆菌 500μU
苔聚糖酶 枯草芽孢杆菌 600μU
苔聚糖酶 枯草芽孢杆菌 700μU
苔聚糖酶 枯草芽孢杆菌 800μU
苔聚糖酶 枯草芽孢杆菌 900μU
木糖葡聚糖酶 类芽孢杆菌属种类 500μU
木糖葡聚糖酶 类芽孢杆菌属种类 600μU
木糖葡聚糖酶 类芽孢杆菌属种类 1500μU
木糖葡聚糖酶 类芽孢杆菌属种类 3000μU
木糖葡聚糖酶 类芽孢杆菌属种类 4000μU
β-木聚糖酶 嗜热脂肪孢杆菌 50μU
β-木聚糖酶 嗜热脂肪孢杆菌 300μU
β-木聚糖酶 嗜热脂肪孢杆菌 500μU
β-木聚糖酶 嗜热脂肪孢杆菌 1500μU
β-木聚糖酶 嗜热脂肪孢杆菌 3000μU
β-木聚糖酶 嗜热脂肪孢杆菌 5000μU
甘露聚糖酶 芽孢杆菌属种类 60μU
甘露聚糖酶 芽孢杆菌属种类 300μU
甘露聚糖酶 芽孢杆菌属种类 600μU
甘露聚糖酶 芽孢杆菌属种类 1200μU
甘露聚糖酶 芽孢杆菌属种类 3000μU
甘露聚糖酶 芽孢杆菌属种类 6000μU
脂肪酶 嗜热脂肪伯霍尔德菌 2μU
脂肪酶 嗜热脂肪伯霍尔德菌 5μU
脂肪酶 嗜热脂肪伯霍尔德菌 10μU
脂肪酶 嗜热脂肪伯霍尔德菌 20μU
脂肪酶 嗜热脂肪伯霍尔德菌 50μU
脂肪酶 嗜热脂肪伯霍尔德菌 200μU
果胶酶 日本曲霉 60μU
果胶酶 日本曲霉 300μU
果胶酶 日本曲霉 600μU
果胶酶 日本曲霉 1200μU
果胶酶 日本曲霉 3000μU
果胶酶 日本曲霉 6000μU
β-1,4-内切葡聚糖酶 解纤维热酸菌 1000μU
水对照 – 0μU
苔聚糖酶 枯草芽孢杆菌 400μU
苔聚糖酶 枯草芽孢杆菌 500μU
苔聚糖酶 枯草芽孢杆菌 600μU
苔聚糖酶 枯草芽孢杆菌 700μU
苔聚糖酶 枯草芽孢杆菌 800μU
苔聚糖酶 枯草芽孢杆菌 900μU
木糖葡聚糖酶 类芽孢杆菌属种类 500μU
木糖葡聚糖酶 类芽孢杆菌属种类 600μU
木糖葡聚糖酶 类芽孢杆菌属种类 1500μU
木糖葡聚糖酶 类芽孢杆菌属种类 3000μU
木糖葡聚糖酶 类芽孢杆菌属种类 4000μU
β-木聚糖酶 嗜热脂肪孢杆菌 50μU
β-木聚糖酶 嗜热脂肪孢杆菌 300μU
β-木聚糖酶 嗜热脂肪孢杆菌 500μU
β-木聚糖酶 嗜热脂肪孢杆菌 1500μU
β-木聚糖酶 嗜热脂肪孢杆菌 3000μU
β-木聚糖酶 嗜热脂肪孢杆菌 5000μU
甘露聚糖酶 芽孢杆菌属种类 60μU
甘露聚糖酶 芽孢杆菌属种类 300μU
甘露聚糖酶 芽孢杆菌属种类 600μU
甘露聚糖酶 芽孢杆菌属种类 1200μU
甘露聚糖酶 芽孢杆菌属种类 3000μU
甘露聚糖酶 芽孢杆菌属种类 6000μU
脂肪酶 嗜热脂肪伯霍尔德菌 2μU
脂肪酶 嗜热脂肪伯霍尔德菌 5μU
脂肪酶 嗜热脂肪伯霍尔德菌 10μU
脂肪酶 嗜热脂肪伯霍尔德菌 20μU
脂肪酶 嗜热脂肪伯霍尔德菌 50μU
脂肪酶 嗜热脂肪伯霍尔德菌 200μU
果胶酶 日本曲霉 60μU
果胶酶 日本曲霉 300μU
果胶酶 日本曲霉 600μU
果胶酶 日本曲霉 1200μU
果胶酶 日本曲霉 3000μU
果胶酶 日本曲霉 6000μU
β-1,4-内切葡聚糖酶 解纤维热酸菌 1000μU
[0900] 测试六种游离酶(苔聚糖酶、木糖葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、脂肪酶和果胶酶)的效价以确定当用作促进玉米(BECK'S 5828 YH)和大豆(BECK'S 297NR)生长的种子处理时的最佳活性。被确定为最适合用作六种酶的种子处理的效价活性列于下表57中(列为每种子的游离酶活性)。在实施例29中描述的受控生长环境中，在相同的环境条件下进行实验。确定用作应用于玉米或大豆种子的种子处理的六种酶的平均植物高度的百分比变化(下表57)。将六种酶中的每一种的平均株高针对从接受水控处理的种子生长的植物的平均株高进行校准，并记录为百分比变化(表57)。此外，将应用于玉米种子的游离酶处理与用β-1,4-内切葡聚糖酶游离酶处理进行比较，因为该酶在玉米植物上作为种子处理剂时已被证明可促进生长(见上文实施例1-4、7、26和29)。
[0901] 与从非酶处理的种子生长的对照植物相比，当用作其优化活性水平的种子处理时玉米和大豆，所有六种游离酶(苔聚糖酶、木糖葡聚糖酶、β-木聚糖酶、甘露聚糖酶、脂肪酶和果胶酶)增加了植物高度。结果显示在下表57中。与对照植物校准后，施用于玉米种子的β-1,4-内切葡聚糖酶游离酶导致玉米的植株高度增加。当考虑玉米和大豆植物品种时，与对照植物校准后，甘露聚糖酶导致植物高度的增加最大(玉米增加107％，大豆增加110％)。
[0902] 表57.植物种子处理施用于玉米和大豆植物的游离酶的高度效应
[0903]
[0904] 测定四种相同酶(在上表56中列出的苔聚糖酶、木糖葡聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶)的效价以确定作为犁沟处理施用于玉米(BECK'S 5828YH)的用于促进植物生长的最佳活性。每种酶的效价针对生长潜力进行了优化(表58)，并且在种植完成之前使用每种种子1ml水直接施用于种子周围的区域并用土壤覆盖种子。种植后两周，测量植物高度并将针对未接受酶处理但仅接受水对照的植物高度进行校准。以三次试验重复该实验，每次试验18株植物，并且在试验中平均测量以产生平均玉米植物高度的百分比变化(与对照相比)。表
58中报告了四种游离酶：苔聚糖酶、木糖葡聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶的数据。与仅含水对照相比，游离酶苔聚糖酶、木糖葡聚糖酶和果胶酶在玉米种子周围区域作为犁沟处理施用时，所有玉米都增加了高度。
58中报告了四种游离酶：苔聚糖酶、木糖葡聚糖酶、甘露聚糖酶和果胶酶的数据。与仅含水对照相比，游离酶苔聚糖酶、木糖葡聚糖酶和果胶酶在玉米种子周围区域作为犁沟处理施用时，所有玉米都增加了高度。
[0905] 表58.游离酶作为玉米种子周围的犁沟处理施用的游离酶的高度效应
[0906]
[0907] 测定相同的六种游离酶(在表56中列出的苔聚糖酶、木糖葡聚糖酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、脂肪酶和果胶酶)的效价以确定用作种子处理施用于大豆(BECK'S 297 NR)的最佳活性。在下表59中报告了每种酶的活性(μU/种子)。进行了三次试验，每次试验有18株植物，并测量了总生物量、枝条生物量、根生物量和结瘤的变化。在如上实施例6中所述的受控生长环境中，在相同的环境条件下进行实验。在一些实验中，用β-1,4-内切葡聚糖酶(1000μU/种子)处理另外的种子组。总生物量、枝条生物量、根生物量和结瘤的变化在下表59中报告为与未接受游离酶(水处理对照)处理的大豆种子校准的变化百分比(％)。
[0908] 表59.作为种子处理施用的用于促进达到植物中生长的游离酶
[0909]
[0910]
[0911] 实施例31:作为增加西葫芦产量的种子处理使用的游离酶
[0912] 上述实施例30中描述的苔聚糖酶、木糖葡聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶游离酶)和β-1,4-内切葡聚糖酶(解纤维热酸菌，SEQ ID NO：30)作为种子处理以最佳速率施用，使用1μL体积的具有以μU/种子报告的活性(表60)的酶通过测定效价系列测定并施用于西葫芦种子(Spineless Beauty，可从Park Seed商购获得)。用苔聚糖酶、木糖葡聚糖酶、木聚糖酶、脂肪酶和β-1,4-内切葡聚糖酶的游离酶处理种子的总产量在表60中报告为针对对照校准的收获的西葫芦的总重量，并在8月份完成的两次收获(Columbia，Missouri)的平均值。使用苔聚糖酶(700μU/种子)、木聚糖酶(3000μU/种子)和脂肪酶(50μU/种子)应用于西葫芦种子的游离酶处理均显示与对照处理相比的正产量增加。使用苔聚糖酶、木聚糖酶和脂肪酶的游离酶种子处理对于西葫芦植物的总可收获产量的增加，显示了与β-1,4-内切葡聚糖酶(1000μU)相似的总产量优势。
[0913] 表60.表:使用游离酶的西葫芦种子处理后的西葫芦产量
[0914]处理 作为占对照百分比的总产量
苔聚糖酶700μU 113％
木糖葡聚糖酶3000μU 89％
β-木聚糖酶300μU 118％
脂肪酶50μU 130％
β-1,4-内切葡聚糖酶1000μU 132％
苔聚糖酶700μU 113％
木糖葡聚糖酶3000μU 89％
β-木聚糖酶300μU 118％
脂肪酶50μU 130％
β-1,4-内切葡聚糖酶1000μU 132％
[0915] 实施例32:多种酶对玉米的协同作用，犁沟
[0916] 将甘露聚糖酶(芽孢杆菌属；SEQ ID NO:128)、木糖葡聚糖酶(类芽孢杆菌属,SEQ ID NO:125)、磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C(蜡状芽孢杆菌,SEQ ID NO:115)和木糖苷酶(短小芽孢杆菌；SEQ ID NO:123)作为犁沟游离酶处理施用于玉米(BECK'S 5828YH)，并检测对植物高度和生长的影响。表61中描述了酶处理，包括酶的组合。对于所有游离酶，使用如实施例26用于用玉米进行的脂肪酶犁沟处理中所述类似的方法。简而言之，在种植玉米之后但在用松散的土壤覆盖种子之前，将犁沟处理应用于玉米种子周围的区域。每次处理以每种子1ml的体积施用，其包括酶和含有正多磷酸盐和乙酸钾的肥料。以活性为300mU/种子区域(甘露聚糖酶和磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C)、500mU/种子区域(木糖葡聚糖酶)和活性为714mU种子区域(/ml)(木糖苷酶)的比率递送使用每种酶的犁沟处理。将酶以每种子区域
1ml的体积递送至种子，其含有酶和肥料。每次处理使用54个种子，分成3个重复，每个重复
18株植物。大约两周后，测量植物高度并针对仅用肥料处理的对照植物进行校准。
1ml的体积递送至种子，其含有酶和肥料。每次处理使用54个种子，分成3个重复，每个重复
18株植物。大约两周后，测量植物高度并针对仅用肥料处理的对照植物进行校准。
[0917] 结果显示在下表61中。单独的甘露聚糖酶或木糖葡聚糖酶没有导致显著的高度增加。单独施用磷脂酶C和木糖苷酶均导致植物高度的增加。令人惊讶的是，与单独的任一处理相比，磷脂酶C和甘露聚糖酶或木糖葡聚糖酶的组合导致植物高度的协同增加。甘露聚糖酶和木糖葡聚糖酶的组合也比单独的任一种酶更有效。
[0918] 表61.使用用游离甘露聚糖酶、木糖葡聚糖酶、木糖苷酶、磷脂酶C或其组合处理的玉米的犁沟处理的植物高度
[0919]
[0920]
[0921] 实施例33:多种酶对南瓜的累加作用，犁沟
[0922] 将甘露聚糖酶(芽孢杆菌属；SEQ ID NO:128)、苔聚糖酶(枯草芽孢杆菌,SEQ ID NO:43)、酸性磷酸酶(小麦，具有本文提供的序列SEQ ID NO.130和131的两种不同同种型的混合物)、果胶酶(日本曲霉,SEQ ID NO:129)、β-木聚糖酶(Neocallismastix patriciarum,SEQ ID NO:122)和β-木聚糖酶(嗜热脂肪芽孢杆菌,SEQ ID NO:25)作为犁沟游离酶处理施用于Ambassador杂交南瓜(可从Park Seed商购获得，产品05298)，并检查对植物高度和生长的影响。对于所有游离酶，使用如实施例26中用于用玉米进行的脂肪酶犁沟处理所述类似的方法。简言之，在种植南瓜之后但在用松散的土壤覆盖种子之前，将犁沟处理应用于南瓜种子周围的区域。每次处理以每种子1ml的体积施用，其包括酶和含有磷酸单铵的肥料。以活性300mU/种子区域(甘露聚糖酶)、600mU/种子区域(苔聚糖酶)、30mU/种子区域(果胶酶)、35μU/种子区域(酸性磷酸酶)和1500mU/种子区域(β-木聚糖酶)的比率递送使用每种酶的犁沟处理。将酶以每种子区域1ml的体积递送至种子，其含有酶和肥料。两周后，测量植物高度并将其与仅接受肥料处理的植物校准。
[0923] 结果显示在下表62中。单独的酸性磷酸酶导致相对于单独肥料对照的高度的增加，并且当苔聚糖酶与酸性磷酸酶一起施用时，该效果稍好。当用木聚糖酶中的任一种、果胶酶或甘露聚糖酶进一步增强肥料/酸性磷酸酶组合时，观察到大的增加。这些非纤维素分解的碳水化合物水解酶与酸性磷酸酶组合作为土壤传递机制增加了显著的植物高度。
[0924] 表62.使用用游离甘露聚糖酶、木聚糖酶、酸性磷酸酶、果胶酶、苔聚糖酶或其组合处理的南瓜的犁沟处理的植物高度
[0925]
[0926] 实施方式
[0927] 为了进一步示例，下文举出了本公开另外的非限制性实施方式。
[0928] 实施方式1是酶，其包含编码具有1-氨基环丙烷-1-羧酸酯脱氨酶(ACC脱氨酶)活性的酶的氨基酸序列和当酶在微生物中表达时导致酶的分泌的信号肽。
[0929] 实施方式2是实施方式1的酶，其中具有ACC脱氨酶活性的酶包含来自芽孢杆菌属细菌的酶。
[0930] 实施方式3是具有ACC脱氨酶活性的酶，其中酶的氨基酸序列相对于来自芽孢杆菌属细菌的野生型D-半胱氨酸脱巯基酶或ACC脱氨酶的序列包含至少一种氨基酸取代，并且其中该氨基酸取代导致与相同条件下野生型D-半胱氨酸脱巯基酶或ACC脱氨酶的ACC脱氨酶活性相比ACC脱氨酶活性增加。
[0931] 实施方式4是实施方式3的酶，其中酶还包含信号肽，其当酶在微生物中表达时导致酶的分泌。
[0932] 实施方式5是实施方式1、2和4中任一个的酶，其中微生物包含芽孢杆菌属细菌，假单胞菌属细菌，根瘤菌属细菌，类芽孢杆菌属细菌，赖氨酸杆菌属细菌，副球菌属细菌，中间根瘤菌属细菌，短根瘤菌属细菌，固氮菌属细菌，节杆菌属细菌，固氮菌属细菌，固氮螺菌属细菌，粉红色色素兼性甲基营养细菌，菌根真菌，球囊霉属真菌，木霉属真菌，克吕沃尔菌属真菌，胶霉属真菌或其任何组合。
[0933] 实施方式6是实施方式5的酶，其中微生物包含芽孢杆菌属细菌，赖氨酸杆菌属细菌，假单胞菌属细菌，类芽孢杆菌属细菌或其任何组合。
[0934] 实施方式7是实施方式1–6中任一个的酶，其中酶包含苏云金芽孢杆菌酶或假蕈状芽孢杆菌酶。
[0935] 实施方式8是实施方式7的酶，其中酶包含与SEQ ID NO.7–9和113中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％的同一性的氨基酸序列，并且具有ACC脱氨酶活性。
[0936] 实施方式9是实施方式3–8中任一个的酶，其中酶的氨基酸序列相对于野生型D-半胱氨酸脱巯基酶或ACC脱氨酶的序列包含两种氨基酸取代，其中氨基酸取代导致与相同条件下野生型酶的ACC脱氨酶活性相比ACC脱氨酶活性增加。
[0937] 实施方式10是实施方式3–9中任一个的酶，其中该酶的氨基酸序列包含：
[0938] SEQ ID NO:7的位置290处的苏氨酸残基被谷氨酸残基取代，并且SEQ ID NO:7的位置317处的丝氨酸残基被亮氨酸取代；
[0939] SEQ ID NO:8的位置290位上的苏氨酸残基被谷氨酸残基取代，并且SEQ ID NO:8的位置317处的丝氨酸残基被亮氨酸取代；
[0940] SEQ ID NO:9的位置290处的苏氨酸残基被谷氨酸残基取代，并且SEQ ID NO:9的位置317处的丝氨酸残基被亮氨酸取代；或
[0941] SEQ ID NO:113的位置290处的苏氨酸残基被谷氨酸残基取代，并且SEQ ID NO:223的位置317处的丝氨酸残基被亮氨酸取代。
[0942] 实施方式11是实施方式3–10中任一个的酶，其中酶包含SEQ ID NO:10、11、12或114或由其组成。
[0943] 实施方式12是实施方式1或2的酶，其中酶包含与SEQ ID NO.7–9和113中的任一个具有100％同一性的氨基酸序列。
[0944] 实施方式13是表达实施方式1–12中任一个的酶的重组微生物。
[0945] 实施方式14是实施方式13的重组微生物，其中酶的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物的酶表达水平相比增加。
[0946] 实施方式15是制剂，其包含实施方式1–12中任一个的酶或实施方式13或14的重组微生物和农业上可接受的载体。
[0947] 实施方式16是用实施方式1–12中任一个的酶、实施方式13或14的重组微生物或实施方式15的制剂处理的植物种子。
[0948] 实施方式17是用于刺激植物生长和/或促进植物健康的方法，包括将实施方式1–12中任一个的酶、实施方式13或14的重组微生物或实施方式15的制剂施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0949] 实施方式18是实施方式17的方法，其中该方法包括将实施方式1–12中任一个的酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0950] 实施方式19是实施方式17或18的方法，其中该方法包括将游离酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0951] 实施方式20是实施方式17–19中任一个的方法，其中该方法包括将实施方式13或14的重组微生物施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或组合物种子周围的区域。
[0952] 实施方式21是用于刺激植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括将游离酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域，其中酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、非纤维素分解的葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合。
[0953] 实施方式22是用于刺激植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括将两种或更多种游离酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域，其中酶独立地选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、植酸酶、酸性磷酸酶、甘露聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶和ACC脱氨酶。
[0954] 实施方式23是用于刺激植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括将游离酶施用于植物或植物种子，其中酶包含葡聚糖酶，并且其中将酶施用于植物种子包括：(a)将酶在种植时施用于植物种子；或(b)用酶包被植物种子。
[0955] 实施方式24是实施方式23的方法，其中该方法包括用包含酶和农业上可接受的载体的种子包被制剂包被植物种子。
[0956] 实施方式25是实施方式23或24的方法，其中该方法还包括将酶或扩展蛋白施用于植物生长培养基或植物或植物种子周围的区域。
[0957] 实施方式26是实施方式25的方法，其中该方法还包括将所述酶或扩展蛋白施用于植物生长培养基。
[0958] 实施方式27是实施方式26的方法，其中该方法还包括将所述酶和扩展蛋白施用于植物生长培养基。
[0959] 实施方式28是用于刺激植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括将游离酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域，其中酶包含葡聚糖酶，并且该方法还包括将扩展蛋白施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[0960] 实施方式29是实施方式28的方法，其中将酶或扩展蛋白施用于植物种子包括：(a)将酶或扩展蛋白在种植时施用于植物种子；或(b)用酶或扩展蛋白包被植物种子。
[0961] 实施方式30是实施方式29的方法，其中该方法包括用种子包被制剂包被植物种子，种子包被制剂包含：
[0962] 酶、扩展蛋白或酶和扩展蛋白两者；和
[0963] 农业上可接受的载体。
[0964] 实施方式31是用于刺激植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括将游离酶施用于植物或植物种子，其中酶包含植酸酶。
[0965] 实施方式32是用于刺激植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括将肥料和游离酶施用于植物生长培养基、植物或植物种子周围的区域或施用于植物或植物种子，其中游离酶包含植酸酶。
[0966] 实施方式33是用于刺激植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括将重组微生物施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域，其中：
[0967] 重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加；
[0968] 酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶、蛋白酶、植酸酶、酸性磷酸酶及其任何组合；且
[0969] 酶或扩展蛋白在重组微生物营养生长期间被表达。
[0970] 实施方式34是用于刺激植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括将重组微生物施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域，其中：
[0971] 重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加；
[0972] 酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶、植酸酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合；且[0973] 酶或扩展蛋白还包含导致酶或扩展蛋白分泌的信号肽。
[0974] 实施方式35是用于刺激植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括
[0975] 将重组微生物施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域，其中：
[0976] 重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加；
[0977] 酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、甘露聚糖酶、果胶酶、酸性磷酸酶及其任何组合；且
[0978] 酶或扩展蛋白不结合至重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
[0979] 实施方式36是用于刺激植物生长和/或促进植物健康的方法，其包括
[0980] 将重组微生物施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域，其中：
[0981] 重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加；
[0982] 酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、甘露聚糖酶、果胶酶、酸性磷酸酶及其任何组合；且
[0983] 酶或扩展蛋白不是融合蛋白的组成部分。
[0984] 实施方式37是用重组微生物包被的植物种子，其中：
[0985] 重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加；
[0986] 酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、植酸酶、甘露聚糖酶、果胶酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合；且[0987] 酶或扩展蛋白在重组微生物营养生长期间被表达。
[0988] 实施方式38是用重组微生物包被的植物种子，其中：
[0989] 重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加；
[0990] 酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶、植酸酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合；且[0991] 酶或扩展蛋白还包含导致酶或扩展蛋白分泌的信号肽。
[0992] 实施方式39是用重组微生物包被的植物种子，其中：
[0993] 重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加；
[0994] 酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶、植酸酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合；且[0995] 酶或扩展蛋白不结合至重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
[0996] 实施方式40是用重组微生物包被的植物种子，其中：
[0997] 重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加；
[0998] 酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、果胶酶、植酸酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合；且[0999] 酶或扩展蛋白不是融合蛋白的组成部分。
[1000] 实施方式41是组合物，其包含肥料和酶或扩展蛋白，其中酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、植酸酶、葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合。
[1001] 实施方式42是实施方式41的组合物，其中酶包含游离酶。
[1002] 实施方式43是包含肥料和重组微生物的组合物，其中：
[1003] 重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加；
[1004] 酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、植酸酶、葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合；且[1005] 酶或扩展蛋白在重组微生物营养生长期间被表达。
[1006] 实施方式44是包含肥料和重组微生物的组合物，其中：
[1007] 重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加；
[1008] 酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、植酸酶、葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合；且[1009] 酶或扩展蛋白还包含导致所述酶或扩展蛋白分泌的信号肽。
[1010] 实施方式45是包含肥料和重组微生物的组合物，其中：
[1011] 重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加；
[1012] 酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、植酸酶、葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合；且[1013] 酶或扩展蛋白不结合至重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
[1014] 实施方式46是包含肥料和重组微生物的组合物，其中：
[1015] 重组微生物表达酶或扩展蛋白，其中所述酶或扩展蛋白的表达与相同条件下相同种类的野生型微生物中酶或扩展蛋白的表达水平相比增加；
[1016] 酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、甘露聚糖酶、果胶酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、酸性磷酸酶、植酸酶、葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合；且[1017] 酶或扩展蛋白不是融合蛋白的组成部分。
[1018] 实施方式47是实施方式41–46中任一个的组合物，其中该组合物还包含农业上可接受的载体、另外的农用化学品或其组合。
[1019] 实施方式48是实施方式34–36中任一个的方法、实施方式38–40中任一个的种子或实施方式44–47中任一个的组合物，其中酶或扩展蛋白在重组微生物营养生长期间被表达。
[1020] 实施方式49是实施方式33或48的方法、实施方式37或48的种子或实施方式43、47和48中任一个的组合物，其中重组微生物包含重组产芽孢微生物。
[1021] 实施方式50是实施方式33、35、48和49中任一个的方法、实施方式37、39、48和49中任一个的种子或实施方式43和45–49中任一个的组合物，其中酶或扩展蛋白还包含导致酶或扩展蛋白分泌的信号肽。
[1022] 实施方式51是实施方式1、2和4–12中任一个的酶、实施方式13或14的重组微生物、实施方式15的制剂、实施方式17–20、34和50中任一个的方法、实施方式16、38和50中任一个的种子或实施方式44、47和50中任一个的组合物，其中信号肽包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–73,135和137–147中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
[1023] 实施方式52是实施方式51的酶、重组微生物、制剂、方法、种子或组合物，其中信号肽包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.49–51、54、56–73、135、139、140和142中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。
[1024] 实施方式53是实施方式1、2、4–12、51和52中任一个的酶、实施方式13、14、51和52中任一个的重组微生物、实施方式17–20、34和50–52中任一个的方法、实施方式16、38和50–52中任一个的种子或实施方式44、47和50–52中任一个的组合物，其中信号肽存在于酶或扩展蛋白的氨基末端上。
[1025] 实施方式54是实施方式52或53的酶、重组微生物、制剂、方法、种子或组合物，其中微生物包含芽孢杆菌属细菌、类芽孢杆菌属细菌、赖氨酸杆菌属细菌、假单胞菌属细菌或其任何组合。
[1026] 实施方式55是实施方式54的酶、重组微生物、制剂、方法、种子或组合物，其中微生物包含蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、阿耶波多芽孢杆菌,解淀粉芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、尼氏芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌属、长赖氨酸芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌或其任何组合。
[1027] 实施方式56是实施方式55的酶、重组微生物、制剂、方法、种子或组合物，其中微生物包含苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、长赖氨酸芽孢杆菌、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌或其任何组合。
[1028] 实施方式57是实施方式33、34、36和48–56中任一个的方法或实施方式37、38、40和48–56中任一个的种子或实施方式43、44和46–56中任一个的组合物，其中酶或扩展蛋白不结合至重组蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁。
[1029] 实施方式58是实施方式35或57的方法、实施方式39或57的种子或实施方式45或57的组合物，其中酶或扩展蛋白不与完整蜡状芽孢杆菌家族成员孢子的外孢壁结合。
[1030] 实施方式59是实施方式33、35、48、49、57和58中任一个的方法,实施方式37、39、48、49、57和58中任一个的种子或实施方式43、45、47–49、57和58中任一个的组合物，其中酶或扩展蛋白不是融合蛋白的组成部分。
[1031] 实施方式60是实施方式17–22、25–30、32–36和48–59中任一个的方法，其中该方法包括将酶、扩展蛋白或重组微生物施用于植物生长培养基。
[1032] 实施方式61是实施方式60的方法，其中植物生长培养基包含肥料。
[1033] 实施方式62是实施方式60的方法，其中植物生长培养基主要由肥料组成。
[1034] 实施方式63是实施方式17–36和48–62中任一个的方法，其中该方法包括将酶、扩展蛋白或重组微生物施用于植物。
[1035] 实施方式64是实施方式63的方法，其中该方法包括将酶、扩展蛋白或重组微生物施用于植物根。
[1036] 实施方式65是实施方式63或64的方法，其中该方包含将酶、扩展蛋白或重组微生物施用于叶。
[1037] 实施方式66是实施方式17–36和48–65中任一个的方法，其中该方法包括将酶、扩展蛋白或重组微生物施用于植物种子。
[1038] 实施方式67是实施方式66的方法，其中将酶、扩展蛋白或重组微生物施用于植物种子包括：(a)将酶、扩展蛋白或重组微生物在种植时施用于植物种子；或(b)用将酶、扩展蛋白或重组微生物施用于包被植物种子。
[1039] 实施方式68是实施方式67的方法，其中该方法包括用种子包被制剂包被植物种子，种子包被制剂包含：
[1040] 酶、扩展蛋白、重组微生物或其组合；和
[1041] 农业上可接受的载体。
[1042] 实施方式69是用游离酶处理的植物种子，其中酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、植酸酶、酸性磷酸酶、非纤维素分解的葡聚糖酶、ACC脱氨酶及其任何组合。
[1043] 实施方式70是实施方式21和60–68中任一个的方法或实施方式69的植物种子，其中酶选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶、果胶酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、蛋白酶、植酸酶、酸性磷酸酶、ACC脱氨酶及其任何组合。
[1044] 实施方式71是用两种或更多种游离酶处理的植物种子，其中酶独立地选自磷脂酶、脂肪酶、木聚糖酶、木糖苷酶、内酯酶、脱乙酰壳多糖酶、甘露聚糖酶、果胶酶、蛋白酶、植酸酶、酸性磷酸酶、葡聚糖酶和ACC脱氨酶。
[1045] 实施方式72是用游离酶包被的植物种子，其中酶包含葡聚糖酶。
[1046] 实施方式73是用游离酶和扩展蛋白处理的植物种子，其中酶包含葡聚糖酶。
[1047] 实施方式74是实施方式16、69–71和73中任一个的植物种子，其中用酶、重组微生物、扩展蛋白或其任何组合包被植物种子。
[1048] 实施方式75是实施方式74的植物种子，其中用酶和扩展蛋白包被植物种子。
[1049] 实施方式76是实施方式72、74和75中任一个的植物种子，其中用种子包被制剂包被植物种子，种子包被制剂包含酶、重组微生物、扩展蛋白或任何其组合和农业上可接受的载体。
[1050] 实施方式77是实施方式21、22、33–36和48–68和70中任一个的方法、实施方式37–40、48–59、69–71和74–76中任一个的种子或实施方式51–59中任一个的组合物，其中酶包含磷脂酶。
[1051] 实施方式78是实施方式77的方法、种子或组合物，其中磷脂酶包含磷脂酶A、磷脂酶B、磷脂酶C、磷脂酶D、磷脂酶E或其任何组合。
[1052] 实施方式79是实施方式78的方法、种子或组合物，其中磷脂酶包含磷脂酶A、磷脂酶C、磷脂酶D或其任何组合。
[1053] 实施方式80是实施方式7的方法、种子或组合物8，其中：
[1054] 磷脂酶包含磷脂酶A，磷脂酶A包含磷脂酶A1、磷脂酶A2或其组合；
[1055] 磷脂酶包含磷脂酶B，磷脂酶B包含磷脂酶B1；
[1056] 磷脂酶包含磷脂酶C，磷脂酶C包含磷脂酶Cβ1、磷脂酶Cβ2、磷脂酶Cβ3、磷脂酶Cβ4、磷脂酶Cδ1、磷脂酶Cδ3、磷脂酶Cδ4、磷脂酶Cε1、磷脂酶Cγ1、磷脂酶Cγ2、磷脂酶Cη1、磷脂酶Cη2、磷脂酶Cζ1或任何其组合；或
[1057] 磷脂酶包含磷脂酶D，磷脂酶D包含磷脂酶D1、磷脂酶D2、磷脂酶D成员3、磷脂酶D成员4、磷脂酶D成员5、磷脂酶D成员6或其任何组合。
[1058] 实施方式81是实施方式80的方法、种子或组合物，其中磷脂酶A包含磷脂酶A2、磷脂酶A2包含IIA组磷脂酶A2、IIC组磷脂酶A2、IID组磷脂酶A2、IIE组磷脂酶A2、IIF组磷脂酶A2、III组磷脂酶A2、IVA组磷脂酶A2、IVB组磷脂酶A2、IVC组磷脂酶A2、IVD组磷脂酶A2、IVE组磷脂酶A2、VIF组磷脂酶A2、V组磷脂酶A2、VI组磷脂酶A2、VII组磷脂酶A2、X组磷脂酶A2、XIIA组磷脂酶A2、XIIB组磷脂酶A2、XV组磷脂酶A2、XVI磷脂酶组A2或其任何组合。
[1059] 实施方式82是实施方式77的方法、种子或组合物，其中磷脂酶包含1-烷基-2-乙酰基甘油磷酸酯酶，磷脂酰肌醇脱酰酶，磷酸肌醇磷脂酶C，鞘磷脂磷酸二酯酶，鞘磷脂磷酸二酯酶D，烷基甘油磷酸乙醇胺磷酸二酯酶，变体表面糖蛋白磷脂酶C，糖基磷脂酰肌醇磷脂酶D，N-乙酰基磷脂酰乙醇胺水解磷脂酶D，磷脂酰肌醇二酰基甘油裂解酶，糖基磷脂酰肌醇二酰基甘油裂解酶，含有马铃薯糖蛋白样磷脂酶结构域的蛋白2(PNPLA2)，含有马铃薯糖蛋白样磷脂酶结构域的蛋白3(PNPLA3)或其任何组合。
[1060] 实施方式83是实施方式77–82中任一个的方法、种子或组合物，其中磷脂酶包含链霉菌属磷脂酶、芽孢杆菌属磷脂酶、梭菌属磷脂酶、食酸菌属磷脂酶或其任何组合。
[1061] 实施方式84是实施方式83的方法、种子或组合物，其中链霉菌属磷脂酶包含克罗链霉菌磷脂酶，其中芽孢杆菌属磷脂酶包含蜡状芽孢杆菌磷脂酶或苏云金芽孢杆菌磷脂酶，或其中梭菌属磷脂酶包含产气荚膜梭菌磷脂酶。
[1062] 实施方式85是实施方式83的方法、种子或组合物，其中克罗链霉菌磷脂酶包含克罗链霉菌磷脂酶D，其中蜡状芽孢杆菌磷脂酶包含蜡状芽孢杆菌磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C、蜡状芽孢杆菌磷脂酰肌醇l-特异性磷脂酶C，或其中产气荚膜梭菌磷脂酶包含产气荚膜梭菌磷脂酶C。
[1063] 实施方式86是实施方式77–85中任一个的方法、种子或组合物，其中磷脂酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.13–19和115–117中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的同一性。
[1064] 实施方式87是实施方式77的方法、种子或组合物，其中磷脂酶包含蜡状芽孢杆菌磷脂酰胆碱-特异性磷脂酶C，且其中：
[1065] 该方法还包括将甘露聚糖酶或木糖葡聚糖酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域；
[1066] 进一步用甘露聚糖酶或木糖葡聚糖酶处理种子；或
[1067] 组合物还包含甘露聚糖酶或木糖葡聚糖酶。
[1068] 实施方式88是实施方式87的方法、种子或组合物，其中磷脂酶C和甘露聚糖酶以协同作用有效量存在。
[1069] 实施方式89是实施方式87的方法、种子或组合物，其中磷脂酶C和木糖葡聚糖酶以协同作用有效量存在。
[1070] 实施方式90是实施方式21、22、33–36、48–68、70和77–89中任一个的方法、实施方式7–40、48–59、69–71和74–89中任一个的种子3或实施方式41–59和77–89中任一个的组合物，其中酶包含脂肪酶。
[1071] 实施方式91是实施方式90的方法、种子或组合物，其中脂肪酶包含羧基酯脂肪酶、二酰甘油脂肪酶α、二酰甘油脂肪酶β、脂肪酶A、肝脂肪酶、激素敏感性脂肪酶、胃脂肪酶、内皮脂肪酶、成员H脂肪酶、脂肪酶家族成员I、脂肪酶家族成员J、脂肪酶家族成员K、脂肪酶家族成员M、脂肪酶家族成员N、脂蛋白脂肪酶、单酸甘油酯脂肪酶、胰腺脂肪酶-相关蛋白2、胰腺脂肪酶-相关蛋白3、酰基甘油脂肪酶、半乳糖脂肪酶、脂蛋白脂肪酶或其任何组合。
[1072] 实施方式92是实施方式90或91的方法、种子或组合物，其中脂肪酶包含枯草芽孢杆菌脂肪酶、苏云金芽孢杆菌脂肪酶、蜡状芽孢杆菌脂肪酶、克劳氏芽孢杆菌脂肪酶、洋葱伯霍尔德杆菌脂肪酶、嗜热脂肪伯霍尔德菌脂肪酶、假单胞菌属脂肪酶或其任何组合。
[1073] 实施方式93是实施方式90–92中任一个的方法、种子或组合物，其中脂肪酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.20、21和118–120中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性或100％的同一性。
[1074] 实施方式94是实施方式21、22、33–36、48–68、70和77–93中任一个的方法、实施方式37–40、48–59、69–71和74–93中任一个的种子或实施方式41–59和77–93中任一个的组合物，其中酶包含木聚糖酶。
[1075] 实施方式95是实施方式94的方法、种子或组合物，其中木聚糖酶包含β-木聚糖酶。
[1076] 实施方式96是实施方式95的方法、种子或组合物，其中β-木聚糖酶包含葡糖醛酸阿拉伯木聚糖内-1,4-β-木聚糖酶、外-1,4-β-木聚糖酶、内-1,4-β-木聚糖酶或其任何组合。
[1077] 实施方式97是实施方式94–96中任一个的方法、种子或组合物，其中木聚糖酶包含热解纤维素菌属木聚糖酶、芽孢杆菌属木聚糖酶、新丽鞭毛菌木聚糖酶、嗜热真菌木聚糖酶或其任何组合。
[1078] 实施方式98是实施方式97的方法、种子或组合物，其中热解纤维素菌属木聚糖酶包含极端嗜热纤维素降解菌木聚糖酶，其中芽孢杆菌属木聚糖酶包含枯草芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌木聚糖酶，其中新丽鞭毛菌木聚糖酶包含帕氏新考玛脂霉木聚糖酶或其中嗜热真菌木聚糖酶包含嗜热棉毛菌木聚糖酶。
[1079] 实施方式99是实施方式94–98中任一个的方法、种子或组合物，其中木聚糖酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.22–25、121和122中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性或100％的同一性。
[1080] 实施方式100是实施方式21、22、33–36、46–68、70和77–93中任一个的方法、实施方式37–40、48–59、69–71中任一个的种子和74–93或实施方式41–59和77–93中任一个的组合物，其中酶包含木糖苷酶。
[1081] 实施方式101是实施方式100的方法、种子或组合物，其中木糖苷酶包含极端嗜热纤维素降解菌木糖苷酶、短小芽孢杆菌木糖苷酶或其组合。
[1082] 实施方式102是实施方式100或101的方法、种子或组合物，其中木糖苷酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:26或123具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性或100％的同一性。
[1083] 实施方式103是实施方式21、22、33–36、48–68、70和77–102中任一个的方法、实施方式37–40、48–49、69–71和74–102中任一个的种子或实施方式41–59和77–102中任一个的组合物，其中酶包含内酯酶。
[1084] 实施方式104是实施方式103的方法、种子或组合物，其中内酯酶包含1,4-内酯酶、2-吡喃酮-4,6-二羧酸酯内酯酶、3-氧代己二酸酯烯醇-内酯酶、放线菌素内酯酶、脱氧柠檬酸盐A-环-内酯酶、葡糖醛酸内酯酶、L-鼠李糖-1,4-内酯酶、柠檬碱-D-环-内酯酶、类固醇-内酯酶、三乙酸酯-内酯酶、木糖-1,4-内酯酶或其任何组合。
[1085] 实施方式105是实施方式103或104的方法、种子或组合物，其中内酯酶包含芽孢杆菌属内酯酶、土壤杆菌属内酯酶、红球菌属内酯酶、链霉菌属内酯酶、节杆菌属内酯酶、鞘氨醇单胞菌属内酯酶、假单胞菌属内酯酶、克雷伯菌属内酯酶或其任何组合。
[1086] 实施方式106是实施方式105的方法、种子或组合物，其中内酯酶包含苏云金芽孢杆菌内酯酶、假蕈状芽孢杆菌内酯酶或其组合。
[1087] 实施方式107是实施方式106的方法、种子或组合物，其中内酯酶包含AiiA,[1088] 实施方式108是实施方式103–107中任一个的方法、种子或组合物，其中内酯酶对血浆内酯高丝氨酸信号传导分子具有特异性。
[1089] 实施方式109是实施方式103–108中任一个的方法、种子或组合物，其中内酯酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:27或28具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性或100％的同一性。
[1090] 实施方式110是实施方式21、22、23–36、48–68、70和77–109中任一个的方法、实施方37–40、48–59、69–71和74–109中任一个的种子或实施方式41–59和77–109中任一个的组合物，其中酶包含脱乙酰壳多糖酶。
[1091] 实施方式111是实施方式110的方法、种子或组合物，其中脱乙酰壳多糖酶包含外-1,4-β-D-氨基葡糖苷酶、内-1,4-β-d-氨基葡糖苷酶或其组合。
[1092] 实施方式112是实施方式110或111的方法、种子或组合物，其中脱乙酰壳多糖酶包含枯草芽孢杆菌脱乙酰壳多糖酶、链霉菌属脱乙酰壳多糖酶或其任何组合。
[1093] 实施方式113是实施方式112的方法、种子或组合物，其中脱乙酰壳多糖酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:29或124具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性或100％的同一性。
[1094] 实施方式114是实施方21、22、23–36、48–68、70和77–113中任一个的方法、实施方式37–40、48–59、69–71和74–113中任一个的种子或实施方式41–59和77–113中任一个的组合物，其中酶包含蛋白酶。
[1095] 实施方式115是实施方式114的方法、种子或组合物，其中蛋白酶包含枯草杆菌蛋白酶、酸性蛋白酶、碱性蛋白酶、蛋白水解酶、肽酶、内肽酶、外肽酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、链霉蛋白酶、羧化酶、丝氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬酰胺蛋白酶、组氨酸蛋白酶、金属蛋白酶或其任何组合。
[1096] 实施方式116是实施方式114或115的方法、种子或组合物，其中蛋白酶包含半胱氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、天冬酰胺蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶或其任何组合。
[1097] 实施方式117是实施方式114或115的方法、种子或组合物，其中蛋白酶包含金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、组氨酸蛋白酶或其任何组合。
[1098] 实施方式118是实施方式114–117中任一个的方法、种子或组合物，其中蛋白酶不由甲硫氨酸氨肽酶组成。
[1099] 实施方式119是实施方式114–118中任一个方法、种子或组合物，其中蛋白酶不含甲硫氨酸氨肽酶。
[1100] 实施方式120是实施方式114–119中任一个的方法、种子或组合物，其中蛋白酶包含芽孢杆菌属蛋白酶、曲霉菌属蛋白酶或其组合。
[1101] 实施方式121是实施方式120的方法、种子或组合物，其中芽孢杆菌属蛋白酶包含枯草芽孢杆菌蛋白酶。
[1102] 实施方式122是实施方式114–121中任一个的方法、种子或组合物，其中蛋白酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.46–48和127中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性或100％的同一性。
[1103] 实施方式123是实施方式21–30、33–36、48–68和77–122中任一个的方法、实施方式37–40、48–59、69和71–122中任一个的种子或实施方式41–59和77–122中任一个的组合物，其中酶包含葡聚糖酶。
[1104] 实施方式124是实施方式123的方法、种子或组合物，其中葡聚糖酶包含内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶或其组合。
[1105] 实施方式125是实施方式123或124的方法、种子或组合物，其中葡聚糖酶包含α-葡聚糖酶、β-葡聚糖酶或其组合。
[1106] 实施方式126是实施方式125的方法、种子或组合物，其中葡聚糖酶包含α-葡聚糖酶、α-葡聚糖酶包含淀粉酶、α-1,4-葡聚糖酶、α-1,6-葡聚糖酶或其任何组合。
[1107] 实施方式127是实施方式125的方法、种子或组合物，其中葡聚糖酶包含β-葡聚糖酶，β-葡聚糖酶包含内-β-葡聚糖酶、外-β-葡聚糖酶或其组合。
[1108] 实施方式128是实施方式125的方法、种子或组合物，其中葡聚糖酶包含β-葡聚糖酶，β-葡聚糖酶包含β-1,3-葡聚糖酶、β1,3/1,4葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶或其任何组合。
[1109] 实施方式129是实施方式128的方法、种子或组合物，其中β-葡聚糖酶包含β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶或其组合。
[1110] 实施方式130是实施方式128或129的方法、种子或组合物，其中β-1,3-葡聚糖酶包含β-1,3-内切葡聚糖酶或其中β-1,4-葡聚糖酶包含β-1,4-内切葡聚糖酶。
[1111] 实施方式131是实施方式123–125中任一个的方法、种子或组合物，其中葡聚糖酶包含纤维素酶，糖苷水解酶，木葡聚糖：木糖葡萄糖转移酶，环庚葡聚糖酶，寡聚葡聚糖β-葡糖苷酶，环己糖葡萄糖酶，木糖葡聚糖酶，纤维素1,4-β-纤维二糖苷酶，葡聚糖内-1,3-β-D-葡糖苷酶，环麦芽糖糊精酶，葡聚糖1,3-β-葡糖苷酶，葡聚糖内-1,3-α-葡萄糖苷酶，内-1,3(4)-β-葡聚糖酶，外-β-1,4-葡聚糖酶，苔聚糖酶，昆布多糖酶，葡聚糖1,4-β-葡糖苷酶，葡聚糖内-1,6-β-葡糖苷酶，葡聚糖1,3-α-葡糖苷酶，淀粉果糖酶，昆布多糖酶或其任何组合。
[1112] 实施方式132是实施方式123的方法、种子或组合物，其中葡聚糖酶包含非纤维素分解的葡聚糖酶。
[1113] 实施方式133是实施方式21和60–68中任一个的方法、实施方式69和74–76中任一个的种子或实施方式132的方法、种子或组合物，其中非纤维素分解的葡聚糖酶包含木糖葡聚糖酶、苔聚糖酶、淀粉酶、淀粉葡聚糖酶、淀粉葡糖苷酶、昆布多糖酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、β-1,3/1,4-葡聚糖酶、α-1,4-葡聚糖酶、α1,6-葡聚糖酶或其任何组合。
[1114] 实施方式134是实施方式131或133的方法、种子或组合物，其中木糖葡聚糖酶包含木糖葡聚糖-特异性内-β-1,4-葡聚糖酶、木糖葡聚糖-特异性外-β-1,4-葡聚糖酶或其组合。
[1115] 实施方式135是实施方式133或134的方法、种子或组合物，其中木糖葡聚糖酶包含类芽孢杆菌属葡聚糖酶。
[1116] 实施方式136是实施方式133–135中任一个的方法、种子或组合物，其中葡聚糖酶包含木糖葡聚糖酶，且其中：
[1117] 该方法还包括将甘露聚糖酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域；
[1118] 进一步用甘露聚糖酶处理种子；或
[1119] 组合物还包含甘露聚糖酶。
[1120] 实施方式137是实施方式136的方法、种子或组合物，其中木糖葡聚糖酶和甘露聚糖酶以协同作用有效量存在。
[1121] 实施方式138是实施方式131的方法、种子或组合物，其中葡聚糖酶包含纤维素酶。
[1122] 实施方式139是实施方式138的方法、种子或组合物，其中葡聚糖酶包含内切纤维素酶、外切纤维素酶或其组合。
[1123] 实施方式140是实施方式123–139中任一个的方法、种子或组合物，其中葡聚糖酶包含解纤维热酸菌属葡聚糖酶、木霉属葡聚糖酶、曲霉菌属葡聚糖酶、类芽孢杆菌属葡聚糖酶、白玉蜗牛葡聚糖酶、芽孢杆菌属葡聚糖酶或其任何组合。
[1124] 实施方式141是实施方式140的方法、种子或组合物，其中葡聚糖酶包含环状芽孢杆菌葡聚糖酶、枯草芽孢杆菌葡聚糖酶、苏云金芽孢杆菌葡聚糖酶、蜡状芽孢杆菌葡聚糖酶、里氏木霉葡聚糖酶、克劳氏芽孢杆菌葡聚糖酶、白玉蜗牛葡聚糖酶、解纤维热酸菌葡聚糖酶或其任何组合。
[1125] 实施方式142是实施方式141的方法、种子或组合物，其中葡聚糖酶包含枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶、苏云金芽孢杆菌内切葡聚糖酶、蜡状芽孢杆菌内切葡聚糖酶、克劳氏芽孢杆菌内切葡聚糖酶、里氏木霉外切纤维素酶、里氏木霉β-1,4-内切葡聚糖酶、枯草芽孢杆菌β-糖苷酶、苏云金芽孢杆菌β-糖苷酶、蜡状芽孢杆菌β-糖苷酶、克劳氏芽孢杆菌β-糖苷酶、解纤维热酸菌β-1,4内切葡聚糖酶、白玉蜗牛β-1,3-内切葡聚糖酶或其任何组合。
[1126] 实施方式143是实施方式123–142中任一个的方法、种子或组合物，其中葡聚糖酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.30–45、125和126中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性或100％的同一性。
[1127] 实施方式144是实施方式25–30、33–36、48–68和77–143中任一个的方法、实施方式37–40、48–59和73–143中任一个的种子或实施方式41–59和77–143中任一个的组合物，其中扩展蛋白包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:74具有至少70％、至少75％、至少80％、至少
85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性或100％的同一性。
85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性或100％的同一性。
[1128] 实施方式145是实施方式22、31–36、48–68、70和77–144中任一个的方法、实施方式37–40、48–59、69–71和74–144中任一个的种子或实施方式41–59和77–144中任一个的组合物，其中酶包含植酸酶。
[1129] 实施方式146是实施方式145的方法、种子或组合物，其中植酸酶包含小麦植酸酶。
[1130] 实施方式147是实施方式145或146的方法、种子或组合物，其中植酸酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.132–134中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性或100％的同一性。
[1131] 实施方式148是实施方式21、22、23–36、48–68、70和77–147中任一个的方法、实施方式37–40、48–59、69、71和74–147中任一个的种子或实施方式41–59和77–147中任一个的组合物，其中酶包含酸性磷酸酶。
[1132] 实施方式149是实施方式148的方法、种子或组合物，其中酸性磷酸酶包含小麦酸性磷酸酶。
[1133] 实施方式150是实施方式148或149的方法、种子或组合物，其中酸性磷酸酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:130或131具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性或100％的同一性。
[1134] 实施方式151是实施方式148–150中任一个的方法或种子或组合物，其中酸性磷酸酶包含含有SEQ ID NO.130和131的酸性磷酸酶的混合物。
[1135] 实施方式152是实施方式148–151中任一个的方法，其中该方法还包括将第二酶施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[1136] 实施方式153是实施方式148–151中任一个的种子，其中用第二酶进一步处理或包被种子。
[1137] 实施方式154是实施方式148–151中任一个的组合物，其中该组合物还包含第二酶。
[1138] 实施方式155是实施方式152的方法、实施方式153的种子或实施方式154的组合物，其中第二酶包含脂肪酶、磷脂酶、葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶、甘露聚糖酶、苔聚糖酶或其任何组合。
[1139] 实施方式156是实施方式21、22、23–36、48–68、70、77–152和155中任一个的方法、实施方式37–40、48–59、69–71、74–151、153和155中任一个的种子或实施方式41–59、77–151、154和155中任一个的组合物，其中酶包含果胶酶。
[1140] 实施方式157是实施方式155或156的方法、种子或组合物，其中果胶酶包含果胶酶。
[1141] 实施方式158是实施方式157的方法、种子或组合物，其中果胶酶包含日本曲霉果胶酶。
[1142] 实施方式159是实施方式155–158中任一个的方法、种子或组合物，其中果胶酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:129具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性或100％的同一性。
[1143] 实施方式160是实施方式21、22、23–36、48–68、70、77–152和155–159中任一个的方法、实施方式37–40、48–59、69–71、74–151、153和155–159中任一个的种子或实施方式41–59、77–151和154–159中任一个的组合物，其中酶包含甘露聚糖酶。
[1144] 实施方式161是实施方式155或160的方法、种子或组合物，其中甘露聚糖酶包含芽孢杆菌属甘露聚糖酶。
[1145] 实施方式162是实施方式155、160和161中任一个的方法、种子或组合物，其中甘露聚糖酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO:128具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性或100％的同一性。
[1146] 实施方式163是实施方式21、22、34、48–68、70、77–152和155–162中任一个的方法、实施方式37–40、48–59、69–71、74–151、153和155–162中任一个的种子或实施方式41–59、77–151和154–162中任一个的组合物，其中酶包含ACC脱氨酶。
[1147] 实施方式164是实施方式163的方法、种子或组合物，其中ACC脱氨酶包含实施方式1–12中任一个的酶。
[1148] 实施方式165是实施方式163的方法、种子或组合物，其中ACC脱氨酶包含氨基酸序列，其与SEQ ID NO.7–12、113和114中的任一个具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％的同一性或100％的同一性。
[1149] 实施方式166是实施方式17–36、48–68、70、77–152和155–165中任一个的方法，其中该方法还包括将肥料、生物刺激素或其组合施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域。
[1150] 实施方式167是实施方式16、37–40、48–59、69–151、153和155–165中任一个的种子，其中用肥料、生物刺激素或其组合进一步处理或包被种子。
[1151] 实施方式168是实施方式32或166的方法、实施方式167的种子或实施方式41–59、77–151和154–165中任一个的组合物，其中肥料包含氮、磷酸盐、钾、锌、铁、硼、铜或其任何组合。
[1152] 实施方式169是实施方式168的方法、种子或组合物，其中磷酸盐包含磷酸单铵，磷酸二铵，正磷酸盐，正多磷酸盐或任何其组合；或其中钾包含乙酸钾。
[1153] 实施方式170是实施方式168的方法、种子或组合物，其中肥料包含12％氨氮和58％可利用磷酸盐。
[1154] 实施方式171是实施方式166和168–170中任一个的方法或实施方式167–170中任一个的种子，其中生物刺激素包含赤霉酸、吲哚-3-丁酸、激动素、生长素、生长素同源物或衍生物或其任何组合。
[1155] 实施方式172是实施方式166和168–171中任一个的方法或实施方式167–171中任一个的种子，其中酶包含酸性磷酸酶、磷脂酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶或其任何组合。
[1156] 实施方式173是实施方式17–32、60–68、70、77–152、155–166和168–172中任一个的方法、实施方式16、69–151、153、155–165和167–172中任一个的种子或实施方式41、42、47、77–151、154–165和168–170中任一个的组合物，其中酶或扩展蛋白包含粗细胞提取物，其包含酶或扩展蛋白。
[1157] 实施方式174是实施方式17–32、60–68、70、77–152、155–166和168–172中任一个的方法、实施方式16、69–151、153、155–165和167–172中任一个的种子或实施方式41、42、47、77–151、154–165和168–170中任一个的组合物，其中酶或扩展蛋白包含部分纯化的酶或扩展蛋白。
[1158] 实施方式175是实施方式17–32、60–68、70、77–152、155–166和168–172中任一个的方法、实施方式16、69–151、153、155–165和167–172中任一个的种子或实施方式41、42、47、77–151、154–165和168–170中任一个的组合物，其中酶或扩展蛋白包含基本上纯化的酶或扩展蛋白。
[1159] 实施方式176是实施方式17–32、60–68、70、77–152、155–166和168–175中任一个的方法、实施方式16、69–151、153、155–165和167–175中任一个的种子或实施方式41、42、47、77–151、154–165、168–170和173–175中任一个的组合物，其中酶或扩展蛋白不包括结合至蜡状芽孢杆菌家族成员的外孢壁的酶或扩展蛋白。
[1160] 实施方式177是实施方式176的方法、种子或组合物，其中酶或扩展蛋白不结合至完整蜡状芽孢杆菌家族成员孢子的外孢壁。
[1161] 实施方式178是实施方式17–32、60–68、70、77–152、155–166和168–177中任一个的方法、实施方式16、69–151、153、155–165和167–177中任一个的种子或实施方式41、42、47、77–151、154–165、168–170和173–177中任一个的组合物，其中酶或扩展蛋白包含固定在基质或支持物上的酶或扩展蛋白。
[1162] 实施方式179是实施方式178的方法、种子或组合物，其中基质或支持物包含木炭，生物炭，纳米碳，琼脂糖，海藻酸盐，纤维素，纤维素衍生物，二氧化硅，塑料，不锈钢，玻璃，聚苯乙烯，陶瓷，白云石，粘土，硅藻土，滑石粉，聚合物，树胶，水分散性材料或其任何组合。
[1163] 实施方式180是实施方式178或179的方法、种子或组合物，其中将酶或扩展蛋白固定在基质或支持物上导致酶或扩展蛋白与在相同条件下相同的非固定的酶或扩展蛋白的释放速率相比更缓慢地释放到环境或植物或植物种子上。
[1164] 实施方式181是实施方式13、14和51–56中任一个的重组微生物、实施方式15和51–56中任一个的制剂、实施方式17–20、33–36、48–68、70、77–152、155–166和168–172中任一个的方法、实施方式16、37–40、48–59、77–151、153、155–165和167–172中任一个的种子或实施方式34–59、77–151、154–165和168–172中任一个的组合物，其中酶或扩展蛋白在组成型启动子控制下在重组微生物中表达。
[1165] 实施方式182是实施方式13、14和51–56中任一个的重组微生物、实施方式15和51–56中任一个的制剂实施方式、实施方式7–20、33–36、48–68、70、77–152、155–166和168–172中任一个的方法、实施方式16、37–40、48–59、77–151、153、155–165和167–172中任一个的种子或实施方式34–59、77–151、154–165和168–172中任一个的组合物，其中酶或扩展蛋白在诱导型启动子控制下在重组微生物中表达。
[1166] 实施方式183是实施方式13、14、51–56、181和182中任一个的重组微生物、实施方式15、51–56、181和182中任一个的制剂、实施方式17–20、33–36、48–68、70、77–152、155–166、168–172、181和182中任一个的方法、实施方式16、37–40、48–59、77–151、153、155–165、
167–172、181和182中任一个的种子或实施方式43–59、77–151、154–165、168–172、181和182中任一个的组合物，其中重组微生物包含芽孢杆菌属细菌、类芽孢杆菌属细菌、赖氨酸杆菌属细菌、曲霉属细菌、球囊霉属细菌、假单胞菌属细菌、节杆菌属细菌、副球菌属细菌、根瘤菌属细菌、短根瘤菌属细菌、固氮螺菌属细菌、肠杆菌属细菌、埃希氏菌属细菌或其任何组合。
167–172、181和182中任一个的种子或实施方式43–59、77–151、154–165、168–172、181和182中任一个的组合物，其中重组微生物包含芽孢杆菌属细菌、类芽孢杆菌属细菌、赖氨酸杆菌属细菌、曲霉属细菌、球囊霉属细菌、假单胞菌属细菌、节杆菌属细菌、副球菌属细菌、根瘤菌属细菌、短根瘤菌属细菌、固氮螺菌属细菌、肠杆菌属细菌、埃希氏菌属细菌或其任何组合。
[1167] 实施方式184是实施方式49–51、53、57–68、70和77–152、155–166、168–172和181–183中任一个的方法或实施方式49–51、53、57–59和77–151、153、155–165、167–172和181–
183中任一个的种子或实施方式49–51、53、57–59、77–151、154–165、168–172和181–183中任一个的组合物，其中形成重组芽孢的微生物包含芽孢杆菌属细菌、类芽孢杆菌属细菌、赖氨酸杆菌属细菌、曲霉属细菌、球囊霉属真菌或其任何组合。
183中任一个的种子或实施方式49–51、53、57–59、77–151、154–165、168–172和181–183中任一个的组合物，其中形成重组芽孢的微生物包含芽孢杆菌属细菌、类芽孢杆菌属细菌、赖氨酸杆菌属细菌、曲霉属细菌、球囊霉属真菌或其任何组合。
[1168] 实施方式185是实施方式13、14、51–56和181–183中任一个的重组微生物、实施方式15、51–56和181–183中任一个的制剂、实施方式17–20、33–36、48–68、70、77–152、155–166、168–172和181–183中任一个的方法、实施方式16、37–40、48–59、77–151、153、155–165、
167–172和181–183中任一个的种子或实施方式43–59、77–151、154–165、168–172和181–183中任一个的组合物，其中重组微生物包含芽孢杆菌属细菌、类芽孢杆菌属细菌、赖氨酸杆菌属细菌或其任何组合。
167–172和181–183中任一个的种子或实施方式43–59、77–151、154–165、168–172和181–183中任一个的组合物，其中重组微生物包含芽孢杆菌属细菌、类芽孢杆菌属细菌、赖氨酸杆菌属细菌或其任何组合。
[1169] 实施方式186是实施方式185的重组微生物、制剂、方法、种子或组合物，其中重组微生物包含蕈状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、坚强芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、阿耶波多芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、弯曲芽孢杆菌、尼氏芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、长赖氨酸芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌或其任何组合。
[1170] 实施方式187是实施方式186的重组微生物、制剂、方法、种子或组合物，其中重组微生物包含苏云金芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、假蕈状芽孢杆菌、长赖氨酸芽孢杆菌、球形赖氨酸芽孢杆菌、纺锤形赖氨酸芽孢杆菌或其任何组合。
[1171] 实施方式188是实施方式13、14、51–56和181–187中任一个的重组微生物、实施方式15、51–56和181–187中任一个的制剂、实施方式17–20、33–36、48–68、70、77–152、155–166、168–172和181–187中任一个的方法、实施方式16、37–40、48–59、77–151、153、155–165、
167–172和181–187中任一个的种子或实施方式43–59、77–151、154–165、168–172和181–187中任一个的组合物，其中重组微生物包含促进植物生长的细菌菌株、细菌内生菌菌株或促进植物生长且是内生菌的细菌菌株。
167–172和181–187中任一个的种子或实施方式43–59、77–151、154–165、168–172和181–187中任一个的组合物，其中重组微生物包含促进植物生长的细菌菌株、细菌内生菌菌株或促进植物生长且是内生菌的细菌菌株。
[1172] 实施方式189是实施方式13、14、51–56和181–188中任一个的重组微生物、实施方式15、51–56和181–188中任一个的制剂、实施方式17–20、33–36、48–68、70、77–152、155–166、168–172和181–188中任一个的方法、实施方式16、37–40、48–59、77–151、153、155–165、
167–172和181–188中任一个的种子或实施方式43–59、77–151、154–165、168–172和181–188中任一个的组合物，其中重组微生物是失活的。
167–172和181–188中任一个的种子或实施方式43–59、77–151、154–165、168–172和181–188中任一个的组合物，其中重组微生物是失活的。
[1173] 实施方式190是实施方式1、2、5–8、51–56中任一个的酶、实施方式13、14、51–56、181–183和181–189中任一个的重组微生物、实施方式15、51–56、181–183和181–189中任一个的制剂、实施方式17–36、48–68、70、77–152、155–166和168–189中任一个的方法、实施方式16、37–40、48–59、69–151、153、155–165、167–189中任一个的种子或实施方式41–59、77–
151、154–165、168–172和181–189中任一个的组合物，其中酶相对于相同酶的野生型序列包含至少一种氨基酸取代，并且其中该氨基酸取代导致与在相同条件下野生型酶的酶活性相比酶活性增加。
151、154–165、168–172和181–189中任一个的组合物，其中酶相对于相同酶的野生型序列包含至少一种氨基酸取代，并且其中该氨基酸取代导致与在相同条件下野生型酶的酶活性相比酶活性增加。
[1174] 实施方式191是实施方式17–36、48–68、70、77–152、155–166和168–190中任一个的方法，其中在酶、扩展蛋白或微生物存在下生长的植物表现出比在相同条件下酶、扩展蛋白或微生物不存在下生长的植物增加的生长。
[1175] 实施方式192是实施方式17–36、48–68、70、77–152、155–166和168–191中任一个的方法，其中施用酶或微生物的种子表现出比在相同条件下未施用酶或微生物的种子增加的发芽率。
[1176] 实施方式193是实施方式17–36、48–68、70、77–152、155–166和168–192中任一个的方法，其中在酶、扩展蛋白或微生物存在下生长的植物表现出比在相同条件下酶、扩展蛋白或微生物不存在下生长的植物增加的营养物摄取。
[1177] 实施方式194是实施方式17–36、48–68、70、77–152、155–166和168–193中任一个的方法，其中在酶、扩展蛋白或微生物存在下生长的植物表现出比在相同条件下酶、扩展蛋白或微生物不存在下生长的植物对病原体降低的易感性。
[1178] 实施方式195是实施方式17–36、48–68、70、77–152、155–166和168–194中任一个的方法，其中在酶或微生物存在下生长的植物表现出比在相同条件下酶或微生物不存在下生长的植物对环境应激降低的敏感性。
[1179] 实施方式196是实施方式195的方法，其中环境应激包含干旱、洪水、热、寒冷、盐、重金属、低pH、高pH或其任何组合。
[1180] 实施方式197是实施方式17–36、48–68、70、77–152、155–166和168–196中任一个的方法，其中在酶、扩展蛋白或微生物存在下生长的植物表现出比在相同条件下酶、扩展蛋白或微生物不存在下生长的植物增加的营养物含量。
[1181] 实施方式198是实施方式197的方法，其中营养物包含多糖、蛋白质、植酸、磷酸盐、磷脂或其任何组合。
[1182] 实施方式199是实施方式17–36、48–68、70、77–152、155–166和168–198中任一个的方法，其中在酶或微生物存在下生长的植物表现出比在相同条件下酶或微生物不存在下生长的植物增加的根结化。
[1183] 实施方式200是实施方式17–36、48–68、70、77–152、155–166和168–199中任一个的方法，其中在酶或微生物存在下生长的植物表现出比在相同条件下酶或微生物不存在下生长的植物更缓慢的果实催熟。
[1184] 实施方式201是实施方式17–36、48–68、70、77–152、155–166和168–200中任一个的方法，其中在酶、扩展蛋白或微生物存在下生长的植物表现出比在相同条件下酶、扩展蛋白或微生物不存在下生长的植物更高的作物产量。
[1185] 实施方式202是实施方式17–36、48–68、70、77–152、155–166和168–201中任一个的方法，其中在酶或微生物存在下生长的植物表现出比在相同条件下酶或微生物不存在下生长的植物改变的叶枯萎。
[1186] 实施方式203是实施方式17–36、48–68、70、77–152、155–166和168–202中任一个的方法，其中该方法包括将所述酶、扩展蛋白或微生物施用于包含农业上可接受的载体的制剂中。
[1187] 实施方式204是实施方式15、51–56、181–183和185–190中任一个的制剂、实施方式24–27、30、60–68、77–152、155–166和168–203中任一个的方法或实施方式16、76–151、153、
155–165和167–190中任一个的种子或实施方式47–59、77–151、154–165、168–172和181–190中任一个的组合物，其中农业上可接受的载体包含分散剂、表面活性剂、添加剂、水、增稠剂、防粘剂、残留物分解产物、堆肥、颗粒用品、硅藻土、油、着色剂、稳定剂、防腐剂、聚合物、包衣衣料或其组合。
155–165和167–190中任一个的种子或实施方式47–59、77–151、154–165、168–172和181–190中任一个的组合物，其中农业上可接受的载体包含分散剂、表面活性剂、添加剂、水、增稠剂、防粘剂、残留物分解产物、堆肥、颗粒用品、硅藻土、油、着色剂、稳定剂、防腐剂、聚合物、包衣衣料或其组合。
[1188] 实施方式205是实施方式204的制剂、方法、种子或组合物，其中农业上可接受的载体包含添加剂，且添加剂包含油、树胶、树脂、粘土、聚乙二醇、萜烯、粘性有机物、脂肪酸酯、硫酸化醇、磺酸烷基酯、石油磺酸盐、硫酸乙醇、烷基丁烷酸钠、硫代丁烷二酸钠的聚酯、苯乙腈衍生物、蛋白质材料或其任何组合；农业上可接受的载体包含增稠剂，且增稠剂包含聚乙二醇的长链烷基磺酸酯、聚氧乙烯油酸酯或其任何组合；农业上可接受的载体包含表面活性剂，且表面活性剂包含重石油、重石油蒸馏物、多元醇脂肪酸酯、聚乙氧基化脂肪酸酯、芳基烷基聚乙二醇、烷基胺乙酸酯、烷基芳基磺酸酯、多元醇、磷酸烷基酯或其任何组合；或农业上可接受的载体包含防粘剂，且防粘剂包含钠盐、碳酸钠、硅藻土或其任何组合。
[1189] 实施方式206是实施方式204的制剂、方法、种子或组合物，其中表面活性剂包含非离子表面活性剂。
[1190] 实施方式207是实施方式205的制剂、方法、种子或组合物，其中添加剂包含蛋白质材料，且蛋白质材料包含乳品、面粉、大豆粉、血液、白蛋白、明胶、紫花苜蓿粉、酵母提取物或任何其组合；或防粘剂包含钠盐，且钠盐包含一甲基萘磺酸钠、二甲基萘磺酸钠、亚硫酸钠、硫酸钠或其任何组合。
[1191] 实施方式208是实施方式15、51–56、181–183、185–190和204–207中任一个的制剂、实施方式24–27、30、60–68、77–152、155–166和168–207中任一个的方法,实施方式16、76–151、153、155–165和167–190和204–207中任一个的种子或实施方式47–59、77–151、154–
165、168–172和181–190和204–207中任一个的组合物，其中农业上可接受的载体包含金精石、木炭、糖厂碳化压榨白泥、稻米外壳、羧甲基纤维素、泥炭、珍珠岩、细砂土、碳酸钙、面粉、淀粉、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮或其任何组合。
165、168–172和181–190和204–207中任一个的组合物，其中农业上可接受的载体包含金精石、木炭、糖厂碳化压榨白泥、稻米外壳、羧甲基纤维素、泥炭、珍珠岩、细砂土、碳酸钙、面粉、淀粉、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮或其任何组合。
[1192] 实施方式209是实施方式15、51–56、181–183、185–190和204–208中任一个的制剂、实施方式24–27、30、60–68、77–152、155–166和168–208中任一个的方法或实施方式16、76–151、153、155–165和167–190和204–208中任一个的种子或实施方式47–59、77–151、154–
165、168–172和181–190和204–208中任一个的组合物，其中制剂或组合物包含种子包被制剂或组合物；液体制剂或组合物，其施用于植物或植物生长培养基；或固体制剂或组合物，其施用于植物或植物生长培养基。
165、168–172和181–190和204–208中任一个的组合物，其中制剂或组合物包含种子包被制剂或组合物；液体制剂或组合物，其施用于植物或植物生长培养基；或固体制剂或组合物，其施用于植物或植物生长培养基。
[1193] 实施方式210是实施方式209的制剂、方法、种子或组合物，其中种子包被制剂或组合物包含施用于种子的水或油基溶液或施用于种子的粉末或颗粒制剂。
[1194] 实施方式211是实施方式209的制剂、方法、种子或组合物，其中施用于植物或植物生长培养基的液体制剂或组合物包含浓缩制剂或组合物随时可用的制剂或组合物。
[1195] 实施方式212是实施方式209的制剂、方法、种子或组合物，其中施用于植物或植物生长培养基的固体制剂或组合物包含粒状制剂或组合物或粉状试剂。
[1196] 实施方式213是实施方式15、51–56、181–183、185–190和204–212中任一个的制剂、实施方式203–212中任一个的方法或实施方式16、76–151、153、155–165和167–190和204–212中任一个的种子，其中制剂还包含农用化学品；实施方式324–27、30、60–68、77–152、
155–166和168–212中任一个的方法，其中该方法还包括将农用化学品施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域；或实施方式47–59、77–151、154–165、
168–172和181–190和204–212中任一个的组合物，其中农用化学品包含肥料、微量元素肥料材料、杀昆虫剂、杀线虫剂、除草剂、植物生长改良剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀软体动物剂、杀藻剂、细菌接种物、真菌接种物、植物激素或其任何组合。
155–166和168–212中任一个的方法，其中该方法还包括将农用化学品施用于植物生长培养基、植物、植物种子或植物或植物种子周围的区域；或实施方式47–59、77–151、154–165、
168–172和181–190和204–212中任一个的组合物，其中农用化学品包含肥料、微量元素肥料材料、杀昆虫剂、杀线虫剂、除草剂、植物生长改良剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀软体动物剂、杀藻剂、细菌接种物、真菌接种物、植物激素或其任何组合。
[1197] 实施方式214是实施方式213的制剂、方法、种子或组合物，其中细菌接种物包含促进植物生长的细菌菌株、内生菌细菌菌株或促进植物生长且是内生菌的细菌菌株。
[1198] 实施方式215是实施方式188的重组微生物、方法、种子或组合物或实施方式214的制剂、方法、种子或组合物，其中细菌菌株产生杀昆虫毒素，产生杀真菌化合物，对一种或多种抗生素产生抗性，包含一种或多种自由复制质粒，结合植物根，定殖植物根，形成生物被膜，溶解营养物，分泌有机酸或其任何组合。
[1199] 实施方式216是实施方式215的重组微生物、制剂、方法、种子或组合物，其中杀昆虫毒素包含Cry毒素；其中杀真菌化合物包含β-1,3-葡聚糖酶、脱乙酰壳多糖酶、溶细胞酶或其组合；或其中杀线虫化合物包含Cry毒素。
[1200] 实施方式217是实施方式214–216任一项的重组微生物、制剂、方法、种子或组合物，其中菌株包含阿耶波多芽孢杆菌CAP53(NRRL No.B-50819)、阿耶波多芽孢杆菌CAP56(NRRL No.B-50817)、弯曲芽孢杆菌BT054(NRRL No.B-50816)、孔氏副球菌NC35(NRRL No.B-50820)、蕈状芽孢杆菌BT155(NRRL No.B-50921)、阴沟肠杆菌CAP12(NRRL No.B-50822)、尼氏芽孢杆菌BOBA57(NRRL No.NRRL B-50821)、蕈状芽孢杆菌EE118(NRRL No.B-
50918),枯草芽孢杆菌EE148(NRRL No.B-50927)、粪产杆菌EE107(NRRL No.B-50920)、蕈状芽孢杆菌EE141(NRRL NO.B-50916)、蕈状芽孢杆菌BT46-3(NRRL No.B-50922)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE128(NRRL No.B-50917)、马赛类芽孢杆菌BT23(NRRL No.B-50923)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE349(NRRL No.B-50928)、枯草芽孢杆菌EE218(NRRL No.B-50926)、巨大芽孢杆菌EE281(NRRL No.B-50925)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)；假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120),蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL B-67121),短小芽孢杆菌EE-B00143(NRRL B-67123)或苏云金芽孢杆菌EE-B00184(NRRL B-67122)、蕈状芽孢杆菌EE116(NRRL No.B-50919)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE417(NRRL No.B-50974)、枯草芽孢杆菌EE442(NRRL No.B-50975)、枯草芽孢杆菌EE443(NRRL No.B-50976)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE444(NRRL No.B-50977)、枯草芽孢杆菌EE405(NRRL No.B-50978),蜡状芽孢杆菌家族成员EE439(NRRL No.B-50979)、巨大芽孢杆菌EE385(NRRL No.B-50980),蜡状芽孢杆菌家族成员EE387(NRRL No.B-50981)、环状芽孢杆菌EE388(NRRL No.B-50982)，苏云金芽孢杆菌EE319(NRRL No.B-50983)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE377(NRRL No.B-67119)、蕈状芽孢杆菌EE363(NRRL No.B-67121)、假蕈状芽孢杆菌EE366(NRRL No.B-67120)、苏云金芽孢杆菌BT013A(NRRL No.B-50924)或其任何组合。
50918),枯草芽孢杆菌EE148(NRRL No.B-50927)、粪产杆菌EE107(NRRL No.B-50920)、蕈状芽孢杆菌EE141(NRRL NO.B-50916)、蕈状芽孢杆菌BT46-3(NRRL No.B-50922)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE128(NRRL No.B-50917)、马赛类芽孢杆菌BT23(NRRL No.B-50923)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE349(NRRL No.B-50928)、枯草芽孢杆菌EE218(NRRL No.B-50926)、巨大芽孢杆菌EE281(NRRL No.B-50925)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE-B00377(NRRL B-67119)；假蕈状芽孢杆菌EE-B00366(NRRL B-67120),蕈状芽孢杆菌EE-B00363(NRRL B-67121),短小芽孢杆菌EE-B00143(NRRL B-67123)或苏云金芽孢杆菌EE-B00184(NRRL B-67122)、蕈状芽孢杆菌EE116(NRRL No.B-50919)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE417(NRRL No.B-50974)、枯草芽孢杆菌EE442(NRRL No.B-50975)、枯草芽孢杆菌EE443(NRRL No.B-50976)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE444(NRRL No.B-50977)、枯草芽孢杆菌EE405(NRRL No.B-50978),蜡状芽孢杆菌家族成员EE439(NRRL No.B-50979)、巨大芽孢杆菌EE385(NRRL No.B-50980),蜡状芽孢杆菌家族成员EE387(NRRL No.B-50981)、环状芽孢杆菌EE388(NRRL No.B-50982)，苏云金芽孢杆菌EE319(NRRL No.B-50983)、蜡状芽孢杆菌家族成员EE377(NRRL No.B-67119)、蕈状芽孢杆菌EE363(NRRL No.B-67121)、假蕈状芽孢杆菌EE366(NRRL No.B-67120)、苏云金芽孢杆菌BT013A(NRRL No.B-50924)或其任何组合。
[1201] 实施方式218是实施方式213–217中任一个的制剂、方法、种子或组合物，其中农用化学品包含肥料，且肥料包含液体或干燥肥料；其中农用化学品包含微量元素肥料材料，且微量元素肥料材料包含硼酸、硼酸盐、硼釉料、硫酸铜、铜螯合物、四硼酸钠十水合物、硫酸铁、氧化铁、硫酸铁铵、铁釉料、铁螯合物、硫酸锰、氧化锰、锰螯合物、氯化锰、锰釉料、钼酸钠、钼酸、硫酸锌、氧化锌、碳酸锌、锌釉料、磷酸锌、锌螯合物或其任何组合；其中农用化学品包含杀昆虫剂，且杀昆虫剂包含有机磷酸盐、氨酸甲酸盐、除虫菊素、杀螨药、邻苯二甲酸烷基酯、硼酸、硼酸盐、氟化物、硫、卤代芳族取代的脲、烃酯、基于生物学的杀昆虫剂或其任何组合；其中农用化学品包含除臭剂，且除臭剂包含氯苯氧基化合物、硝基苯酚化合物、硝基甲酚化合物、二吡啶基化合物、乙酰胺、脂肪族酸、酰基苯胺、苯甲酰胺、苯甲酸、苯甲酸衍生物、茴香酸、茴香酸衍生物、苄腈、苯并噻二嗪酮二氧化物、硫代氨基甲酸酯、氨基甲酸酯、苯氨基甲酸酯、氯吡啶基化合物、氯己烯酮衍生物、二硝基氨基苯衍生物、氟二硝基甲苯胺化合物、异恶唑烷酮、烟酸、异丙基胺、异丙基胺衍生物、恶二唑啉酮、磷酸酯、邻苯二甲酸酯、吡啶甲酸化合物、三嗪、三唑、尿嘧啶、脲衍生物、草藻灭、氯酸钠或其任何组合；其中农用化学品包含杀真菌剂，且杀真菌剂包含取代的苯、硫代氨基甲酸、乙烯双二硫代氨基甲酸酯、硫代邻苯二甲酰胺、铜化合物、有机汞化合物、有机锡化合物、镉化合物、敌菌灵、苯菌灵、环己酰胺、多果定、土菌灵、异菌脲、甲霜灵、硫胺酚、嗪氨灵或其任何组合；其中农用化学品包含真菌接种物，且真菌接种物包含球囊霉科真菌接种物、尖叉藻科真菌接种物、巨孢囊霉科真菌接种物、无梗囊霉科科真菌接种物、囊孢菌科真菌接种物、内养囊霉科真菌接种物、海桐科真菌接种物、多孢囊霉科真菌接种物、类球囊霉科真菌接种物、原囊霉科真菌接种物、地管囊霉科真菌接种物、两性囊霉科真菌接种物、盾巨囊霉科真菌接种物、齿藓科真菌接种物、草履虫科真菌接种物、担子菌门真菌接种物、子囊菌门真菌接种物、接合菌门真菌接种物或其任何组合；或其中农用化学品包含细菌接种物，且细菌接种物包含根瘤菌属细菌接种物、短根瘤菌属细菌接种物、中间根瘤菌属细菌接种物、固氮根瘤菌属细菌接种物、异根瘤菌属细菌接种物、大豆根瘤菌属属细菌接种物、克罗非菌属细菌接种物、固氮菌属细菌接种物、假单胞菌属细菌接种物、固氮螺菌属细菌接种物、芽孢杆菌属细菌接种物、链霉菌属细菌接种物、类芽孢杆菌属细菌接种物、副球菌属细菌接种物、肠杆菌属细菌接种物、属细菌接种物、分枝杆菌属细菌接种物、木霉属细菌接种物、胶霉属细菌接种物、球囊霉属细菌接种物、克雷伯菌属细菌接种物或其任何组合。
[1202] 实施方式219是实施方式32、61、62、166和168–170中任一个的方法、实施方式167–170中任一个的种子或实施方式41–59、77–151、154–165、168–172、181–190和204–218中任一个的组合物，其中肥料包含液体或干燥肥料。
[1203] 实施方式220是实施方式32、61、62、166和168–170和219中任一个的方法、实施方式167–170和219中任一个的种子或实施方式41–59、77–151、154–165、168–172、181–190和204–219中任一个的组合物，其中肥料包含微量元素肥料材料，且微量元素肥料材料包含硼酸，硼酸盐，硼釉料，硫酸铜，铜釉料，铜螯合物，四硼酸钠十水合物，硫酸铁，氧化铁，硫酸铁铵，铁釉料，铁螯合物，硫酸锰，氧化锰，锰螯合物，氯化锰，锰釉料，钼酸钠，钼酸，硫酸锌，氧化锌，碳酸锌，锌釉料，磷酸锌，锌螯合物或其任何组合。
[1204] 实施方式221是实施方式213–218中任一个的制剂、方法、种子或组合物，其中农用化学品包含杀真菌剂，且杀真菌剂包含杀螟丹、氨丙膦酸、氨丙膦酸钾、胺扑灭、敌菌灵、阿扎康唑、腈嘧菊酯、苯霜灵、麦锈灵、苯菌灵、苄烯酸、苄烯酸异丁酯、双丙氨磷、乐杀螨、联苯、联苯三唑醇、杀稻瘟菌素-S、啶酰菌胺、糠菌唑、磺嘧菌灵、丁硫丹、多硫化钙、卡巴西霉素、敌菌丹、克菌丹、苯并咪唑氨甲酸甲酯、香芹酮、喹甲硫酯、灭瘟唑、解草唑、氯苯甲醚、氯化苦、百菌清、乙菌利、氯氮平、硫杂灵、霜脲氰、环丙唑醇、嘧菌环胺、酯菌胺、咪菌威、双氯酚、苄氯三唑醇、抑菌灵、哒菌清、氯硝胺、乙霉威、二甲嘧酚、烯酰吗啉、醚菌胺、烯唑醇、烯唑醇-M、消螨普、二苯胺、双吡硫翁、灭菌磷、二氰蒽醌、十二环吗啉、多果定、肼菌酮、稻瘟光、环氧康那唑、乙环唑、乙菌定、土菌灵、恶唑酮菌、咪菌腈、乐必耕、分菌氰唑、甲呋酰胺、种衣酯、拌种咯、苯锈啶、丁苯吗啉、醋酸三苯锡、毒菌锡、福美铁、嘧菌腙、氟啶胺、氟联苯菌、氟氯菌核利、氟喹唑、呋嘧醇、氟硅唑、磺菌胺、氟酰胺、粉唑醇、灭菌丹、三乙膦酸铝、乙胜酸钠、四氯苯酞、麦穗宁、呋霜灵、福拉比、呋喃西林、呋菌唑、呋菌唑-顺式、茂谷乐、双胍辛胺、六氯苯、己唑、恶霉灵、烯菌灵、亚胺唑、培福朗、烷苯磺酸盐、双胍辛胺乙酸盐、霜霉威、异稻瘟净(IBP)、异菌脲、伊鲁霉素、稻瘟灵、异戊酮、春雷霉素、苯氧菊酯，铜制剂例如：氢氧化铜、环烷酸铜、氧氯化铜、硫酸铜、氧化铜、喹啉铜和波尔多液、代森锰铜、代森锰锌、代森锰、嘧菌腙、嘧菌胺、灭锈胺、叶菌唑、磺菌威、灭菌胺、代森联、噻菌胺、灭粉霉素、灭克落、甲菌利、二甲基二硫代氨基甲酸镍、酞菌酯、氟苯嘧啶醇、甲呋酰胺、恶霜灵、草铵膦、奥索利酸、氧化萎锈灵、氧铁蛋白、多效唑、稻瘟酯、配那唑、纹枯脲、氯瘟磷、多马霉素、粉病灵、多抗霉素、多氧霉素、烯丙苯噻唑、丙氯灵、腐霉利、霜霉威、丙醇钠、丙环唑、丙森锌、噻硫康唑、定菌磷、消斑肟、二甲嘧菌胺、咯喹酮、氯吡呋醚、喹康唑、五氯硝苯(PCNB)、硫和硫制剂、戊唑醇、酞枯酸、四氯硝基苯、四环素、氟醚唑、噻苯哒唑、噻菌腈、噻氟菌胺、硫芬酯、硫氰苯甲酰胺、甲基立枯磷、对甲抑菌灵、三唑酮、三唑醇、丁基三唑、咪唑嗪、水杨菌胺、三环唑、二甲十三烷吗啉、布洛芬、粉锈胺、嗪氨灵、烯效唑、有效霉素A、伐菌唑灵、伏立康唑、氰菌胺、乙硫锌、福美锌且还有Dagger G、OK-8705、OK-8801、a-(1,1-二甲基乙基)-(3-(2-苯氧基乙基)-1H-1,2,4-三唑-1-乙醇、a-(2,4-二氯苯基)-[3-氟-3-丙基-1H-1,2,4-三唑-
1-乙醇、a-(2,4-二氯苯基)-[3-甲氧基-a-甲基-1H-1,2,4-三唑-1-乙醇、a-(5-甲基-1,3-二恶烷-5-基)-[3-[[4-(三氟甲基)-苯基]-亚甲基]-1H-1,2,4-三唑-1-乙醇、(5RS,6RS)-
6-羟基-2,2,7,7-四甲基-5-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-3-辛酮、(E)-a-(甲氧基亚氨基)-N-甲基-2-苯氧基-苯基乙酰胺、氨基甲酸{2-甲基-1-[[[1-(4-甲基苯基)-乙基]-氨基]-羰基]-丙基}1-异丙酯、1-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-乙酮-O-(苯基甲基)-肟、1-(2-甲基-1-萘基)-1H-吡咯-2,5-二酮、1-(3,5-二氯苯基)-3-(2-丙烯基)-2,5-吡咯烷二酮、1-[(二碘甲基)-磺酰基]-4-甲基-苯、1-[[2-(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-2-基]-甲基]-1H-咪唑、1-[[2-(4-氯苯基)-3-苯基环氧乙烷基]-甲基]-1H-1,2,4-三唑、1-[1-[2-[(2,4-二氯苯基)-甲氧基]-苯基]-乙烯基]-1H-咪唑、1-甲基-5-壬基-2-(苯基甲基)-3-吡咯烷酮、2',6'-二溴-2-甲基-4'-三氟甲氧基-4'-三氟-甲基-1,3-噻唑-甲酰胺、2,2-二氯-N-[1-(4-氯苯基)-乙基]-1-乙基-3-甲基-环丙烷羧酰胺、2,6-二氯-5-(甲硫基)-4-嘧啶基-硫代氰酸酯、2,6-二氯-N-(4-三氟甲基苄基)-苯甲酰胺、2,6-二氯-N-[[4-(三氟甲基)-苯基]-甲基]-苯甲酰胺、2-(2,3,3-三碘-2-丙烯基)-2H-四唑、2-[(1-甲基乙基)-磺酰基]-
5-(三氯甲基)-1,3,4-噻二唑、2-[[6-脱氧-4-O-(4-0-甲基-(3-D-吡喃葡糖基)-a-D-吡喃葡糖基]-氨基]-4-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲腈、2-氨基丁烷、2-溴-2-(溴甲基)-戊二腈、2-氯-N-(2,3-二氢-1,1,3-三甲基-1H-茚-4-基)-3-吡啶甲酰胺、2-氯-N-(2,
6-二甲基苯基)-N-(异硫氰酸酯基甲基)-乙酰胺、2-苯基苯酚(OPP)、3,4-二氯-1-[4-(二氟甲氧基)-苯基]-吡咯-2,5-二酮、3,5-二氯-N-[氰基[(1-甲基-2-丙炔基)-氧基]-甲基]-苯甲酰胺、3-(1,1-二甲基丙基-1-氧代-1H-茚-2-甲腈、3-[2-(4-氯苯基)-5-乙氧基-3-异恶唑烷基]-吡啶、4-氯-2-氰基-N,N-二甲基-5-(4-甲基苯基)-1H-咪唑-1-磺酰胺、4-甲基-四唑并[1,5-a]喹唑啉-5(4H)-酮、8-(1,1-二甲基乙基)-N-乙基-N-丙基-1,4-二氧杂螺[4,5]癸烷-2-甲胺、8-羟基喹啉硫酸盐、9H-呫吨-2-[(苯基氨基)-羰基]-9-甲酰肼、双-(1-甲基乙基)-3-甲基-4-[(3-甲基苯甲酰基)-氧基]-2,5-噻吩二甲酸酯、顺式-1-(4-氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-环庚醇、顺式-4-[3-[4-(1,1-二甲基丙基)-苯基-2-甲基丙基]-2,
6-二甲基-吗啉盐酸盐、[(4-氯苯基)-偶氮]-氰基乙酸乙酯、碳酸氢钾、甲烷四硫醇-钠盐、
1-(2,3-二氢-2,2-二甲基-茚-1-基)-1H-咪唑-5-甲酸甲酯、N-(2,6-二甲基苯基)-N-(5-异恶唑基羰基)-DL-丙氨酸甲酯、N-(氯乙酰基)-N-(2,6-二甲基苯基)-DL-丙氨酸甲酯、N-(2,
3-二氯-4-羟基苯基)-1-甲基-环己烷甲酰胺、N-(2,6-二甲基苯基)-2-甲氧基-N-(四氢-2-氧代-3-呋喃基)-乙酰胺、N-(2,6-二甲基苯基)-2-甲氧基-N-(四氢-2-氧代-3-噻吩基)-乙酰胺、N-(2-氯-4-硝基苯基)-4-甲基-3-硝基-苯磺酰胺、N-(4-环己基苯基)-1,4,5,6-四氢-2-嘧啶胺、N-(4-己基苯基)-1,4,5,6-四氢-2-嘧啶胺、N-(5-氯-2-甲基苯基)-2-甲氧基-N-(2-氧代-3-恶唑烷基)-乙酰胺、N-(6-甲氧基)-3-吡啶基)-环丙烷甲酰胺、N-[2,2,2-三氯-1-[(氯乙酰基)-氨基]-乙基]-苯甲酰胺、N-[3-氯-4,5-双(2-丙炔基氧基)-苯基]-N'-甲氧基-甲酰亚胺、N-甲酰基-N-羟基-DL-丙氨酸-钠盐、0,0-二乙基[2-(二丙基氨基)-
2-氧代乙基]-乙基磷酰氨基硫代酸酯、0-甲基S-苯基苯基丙基磷酰氨基硫代酸酯、S-1,2,
3-苯并噻二唑-7-甲硫代酸甲酯和螺[2H]-1-苯并吡喃-2,1'(3'H)-异苯并呋喃]-3'-酮、N-三氯甲基)硫代-4-环己烷-1,2-二甲酰亚胺、四甲基硫代过氧二碳酸二酰胺、N-(2,6-二甲基苯基)-N-(甲氧基乙酰基)-DL-丙氨酸甲酯、4-(2,2-二氟-1,3-苯并间二氧杂戊烯-4-基)-1-H-吡咯-3-甲腈或其任何组合。
1-乙醇、a-(2,4-二氯苯基)-[3-甲氧基-a-甲基-1H-1,2,4-三唑-1-乙醇、a-(5-甲基-1,3-二恶烷-5-基)-[3-[[4-(三氟甲基)-苯基]-亚甲基]-1H-1,2,4-三唑-1-乙醇、(5RS,6RS)-
6-羟基-2,2,7,7-四甲基-5-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-3-辛酮、(E)-a-(甲氧基亚氨基)-N-甲基-2-苯氧基-苯基乙酰胺、氨基甲酸{2-甲基-1-[[[1-(4-甲基苯基)-乙基]-氨基]-羰基]-丙基}1-异丙酯、1-(2,4-二氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-乙酮-O-(苯基甲基)-肟、1-(2-甲基-1-萘基)-1H-吡咯-2,5-二酮、1-(3,5-二氯苯基)-3-(2-丙烯基)-2,5-吡咯烷二酮、1-[(二碘甲基)-磺酰基]-4-甲基-苯、1-[[2-(2,4-二氯苯基)-1,3-二氧戊环-2-基]-甲基]-1H-咪唑、1-[[2-(4-氯苯基)-3-苯基环氧乙烷基]-甲基]-1H-1,2,4-三唑、1-[1-[2-[(2,4-二氯苯基)-甲氧基]-苯基]-乙烯基]-1H-咪唑、1-甲基-5-壬基-2-(苯基甲基)-3-吡咯烷酮、2',6'-二溴-2-甲基-4'-三氟甲氧基-4'-三氟-甲基-1,3-噻唑-甲酰胺、2,2-二氯-N-[1-(4-氯苯基)-乙基]-1-乙基-3-甲基-环丙烷羧酰胺、2,6-二氯-5-(甲硫基)-4-嘧啶基-硫代氰酸酯、2,6-二氯-N-(4-三氟甲基苄基)-苯甲酰胺、2,6-二氯-N-[[4-(三氟甲基)-苯基]-甲基]-苯甲酰胺、2-(2,3,3-三碘-2-丙烯基)-2H-四唑、2-[(1-甲基乙基)-磺酰基]-
5-(三氯甲基)-1,3,4-噻二唑、2-[[6-脱氧-4-O-(4-0-甲基-(3-D-吡喃葡糖基)-a-D-吡喃葡糖基]-氨基]-4-甲氧基-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-甲腈、2-氨基丁烷、2-溴-2-(溴甲基)-戊二腈、2-氯-N-(2,3-二氢-1,1,3-三甲基-1H-茚-4-基)-3-吡啶甲酰胺、2-氯-N-(2,
6-二甲基苯基)-N-(异硫氰酸酯基甲基)-乙酰胺、2-苯基苯酚(OPP)、3,4-二氯-1-[4-(二氟甲氧基)-苯基]-吡咯-2,5-二酮、3,5-二氯-N-[氰基[(1-甲基-2-丙炔基)-氧基]-甲基]-苯甲酰胺、3-(1,1-二甲基丙基-1-氧代-1H-茚-2-甲腈、3-[2-(4-氯苯基)-5-乙氧基-3-异恶唑烷基]-吡啶、4-氯-2-氰基-N,N-二甲基-5-(4-甲基苯基)-1H-咪唑-1-磺酰胺、4-甲基-四唑并[1,5-a]喹唑啉-5(4H)-酮、8-(1,1-二甲基乙基)-N-乙基-N-丙基-1,4-二氧杂螺[4,5]癸烷-2-甲胺、8-羟基喹啉硫酸盐、9H-呫吨-2-[(苯基氨基)-羰基]-9-甲酰肼、双-(1-甲基乙基)-3-甲基-4-[(3-甲基苯甲酰基)-氧基]-2,5-噻吩二甲酸酯、顺式-1-(4-氯苯基)-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)-环庚醇、顺式-4-[3-[4-(1,1-二甲基丙基)-苯基-2-甲基丙基]-2,
6-二甲基-吗啉盐酸盐、[(4-氯苯基)-偶氮]-氰基乙酸乙酯、碳酸氢钾、甲烷四硫醇-钠盐、
1-(2,3-二氢-2,2-二甲基-茚-1-基)-1H-咪唑-5-甲酸甲酯、N-(2,6-二甲基苯基)-N-(5-异恶唑基羰基)-DL-丙氨酸甲酯、N-(氯乙酰基)-N-(2,6-二甲基苯基)-DL-丙氨酸甲酯、N-(2,
3-二氯-4-羟基苯基)-1-甲基-环己烷甲酰胺、N-(2,6-二甲基苯基)-2-甲氧基-N-(四氢-2-氧代-3-呋喃基)-乙酰胺、N-(2,6-二甲基苯基)-2-甲氧基-N-(四氢-2-氧代-3-噻吩基)-乙酰胺、N-(2-氯-4-硝基苯基)-4-甲基-3-硝基-苯磺酰胺、N-(4-环己基苯基)-1,4,5,6-四氢-2-嘧啶胺、N-(4-己基苯基)-1,4,5,6-四氢-2-嘧啶胺、N-(5-氯-2-甲基苯基)-2-甲氧基-N-(2-氧代-3-恶唑烷基)-乙酰胺、N-(6-甲氧基)-3-吡啶基)-环丙烷甲酰胺、N-[2,2,2-三氯-1-[(氯乙酰基)-氨基]-乙基]-苯甲酰胺、N-[3-氯-4,5-双(2-丙炔基氧基)-苯基]-N'-甲氧基-甲酰亚胺、N-甲酰基-N-羟基-DL-丙氨酸-钠盐、0,0-二乙基[2-(二丙基氨基)-
2-氧代乙基]-乙基磷酰氨基硫代酸酯、0-甲基S-苯基苯基丙基磷酰氨基硫代酸酯、S-1,2,
3-苯并噻二唑-7-甲硫代酸甲酯和螺[2H]-1-苯并吡喃-2,1'(3'H)-异苯并呋喃]-3'-酮、N-三氯甲基)硫代-4-环己烷-1,2-二甲酰亚胺、四甲基硫代过氧二碳酸二酰胺、N-(2,6-二甲基苯基)-N-(甲氧基乙酰基)-DL-丙氨酸甲酯、4-(2,2-二氟-1,3-苯并间二氧杂戊烯-4-基)-1-H-吡咯-3-甲腈或其任何组合。
[1205] 实施方式222是实施方式213–218和221中任一个的制剂、方法、种子或组合物，其中农用化学品包括芽孢杆菌属的细菌接种物，且芽孢杆菌属的细菌接种物包含土壤芽孢杆菌、鲇泽芽孢杆菌、白色乳杆菌(乳白芽孢杆菌)、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、内寄生芽孢杆菌、先天性芽孢杆菌、库斯塔克杆菌、栖乳芽孢杆菌、乳病杆菌、乳杆菌、侧孢芽胞杆菌、乳病芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苜蓿芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、黑芽孢杆菌、乳头状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、暹罗芽孢杆菌、球形芽孢杆菌、芽孢杆菌属种类、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、单鞭毛芽孢杆菌或其任何组合。
[1206] 实施方式223是实施方式213–218、221和222中任一个的制剂、方法、种子或组合物，其中农用化学品可以包含除草剂，且除草剂包含2,4-D、2,4-DB、乙草胺、三氟羧草醚、甲草胺、莠灭净、阿特拉嗪、氯氨吡啶酸、氟草胺、硫氰菊胺、地散磷、苯达松、苯草酮、溴苯腈、丁草敌、唑草酮、氯嘧磺隆、氯磺隆、烯草酮、异恶松、二氯吡啶酸、氯酯磺草胺、环草敌、DCPA、甜菜安、麦草畏、敌草腈、二氯苯氧基丙酸、双氯磺草胺、二氟吡隆、二甲吩草胺、敌草快、敌草隆、DSMA、草藻灭、EPTC、丁氟消草、乙氧呋草磺、恶唑禾草灵、二氢吡啶-P、氟唑磺隆、氟噻草胺、唑嘧磺草胺、氟胺草酯、丙炔氟草胺、氟草隆、氟草烟、除豆莠、甲酰胺基嘧磺隆、草铵膦、草甘膦、氯吡嘧磺隆、环嗪酮、咪草酯、甲氧咪草烟、甲基咪草烟甲基咪草烟、灭草喹、咪草烟、异恶草胺、异恶唑草酮、乳氟草灵、利谷隆、MCPA、MCPB、甲基磺草酮、丙草胺-s、嗪草酮、甲磺隆、禾草敌、MSMA、草萘胺、西力特、烟嘧黄隆、达草灭、氨磺乐灵、恶草酮、乙氧氟草醚、百草枯、壬酸、二甲戊灵、甜菜宁、毒莠定、氟嘧黄隆、氨氟乐灵、扑草净、拿草特、敌稗、氟磺隆、保泰松钙、嘧硫草醚、二氯喹啉酸、喹禾灵、五嘧磺隆、稀乐定、环草隆、西玛津、甲磺草胺、甲嘧磺隆、磺酰磺隆、丁唑隆、特草定、噻唑烟酸、阔叶散、禾草丹、三甲苯草酮、野麦畏、醚苯黄隆、苯磺隆、定草酯、氟乐灵、氟胺磺隆或其任何组合。
[1207] 实施方式224是实施方式32、61、62、166和168–170、219和220中任一个的方法、实施方式167–170、219和220中任一个的种子、实施方式41–59,77–151、154–165、168–172、181–190和204–220中任一个的组合物或和实施方式213–223中任一个的制剂、方法、种子或组合物，其中肥料包含硫酸铵、硝酸铵、硝酸铵、氯化铵、硫酸氢铵、多硫化铵、硫代硫酸铵、氨水、无水氨、多聚磷酸铵、硫酸铝、硝酸钙、硝酸钙铵、硫酸钙、煅烧菱镁矿、方解石灰石、氧化钙、硝酸钙、白云石灰岩、熟石灰、碳酸钙、磷酸二铵、磷酸一铵、硝酸镁、硫酸镁、硝酸钾、氯化钾、硫酸钾镁、硫酸钾、硝酸钠、镁质石灰石、氧化镁、尿素、尿素-甲醛、尿素铵硝酸盐、硫包覆尿素、聚合物包覆尿素、异丁基二脲、K2SO4–2MgSO4、钾盐镁矾、钾盐、硫镁矾、泻盐、元素硫、泥灰、磨碎的牡蛎壳、鱼粉、油饼、鱼粪肥、血粉、磷酸岩、超级磷酸盐、矿渣、骨粉、木灰、粪肥、蝙蝠鸟粪、泥炭藓、堆肥、绿沙、棉籽粕、羽毛粉、蟹粉、鱼乳液、腐殖酸或其任何组合。
[1208] 实施方式225是实施方式213–224中任一个的制剂、方法、种子或组合物，其中植物激素包含赤霉素、生长素、激动素或其任何组合。
[1209] 实施方式226是17–22、25–46、48–68、70和77–152、155–166和167–225实施方式中任一个的方法，其还包括向植物生长培养基补充用于酶的底物。
[1210] 实施方式227是实施方式226的方法，其中底物包含色氨酸、腺苷一磷酸、腺苷二磷酸、腺苷三磷酸(例如腺苷-3-三磷酸)、多磷酸盐、蛋白质粉、三偏磷酸盐、纤维素、甲基纤维素、壳多糖、脱乙酰壳多糖、纤维素衍生物、磷酸盐、脂肪、蜡、磷脂、植酸或其任何组合。
[1211] 鉴于以上所述，可以看出，实现了本发明的几个目的并获得了其它有利的结果。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种高效氯氟氰菊酯纳米农药的制备方法 | 2020-05-11 | 752 |
| 杀微生物的杂二环衍生物 | 2020-05-13 | 997 |
| 氯氟吡氧乙酸和ALS抑制剂的组合的除草杂草防治 | 2020-05-11 | 433 |
| 具有内隔室和外隔室的袋用于肥料的用途 | 2020-05-13 | 354 |
| 排放组件、液体分配仪器以及计量剂量的药物吸入器 | 2020-05-12 | 23 |
| 防潮包装 | 2020-05-13 | 555 |
| 用于包封和可扩展递送农用化学品的组合物和方法 | 2020-05-12 | 736 |
| 13-酰基化阿维菌素B2a苷元衍生物及其制备方法和用途 | 2020-05-12 | 639 |
| 一种阿维菌素B2a磷酸化修饰物及其制备方法和应用 | 2020-05-13 | 942 |
| 一种防治柑橘叶尖黄化的有机肥及制备方法和施用方法 | 2020-05-11 | 484 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
农用化学品热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈