一种基于毛细管电泳的细胞内的5-氟胞嘧啶和5-氟尿嘧啶的
检测方法
技术领域
[0001] 本
发明属于细胞检测领域，特别涉及一种基于毛细管电泳的细胞内的5-氟胞嘧啶和5-氟尿嘧啶的检测方法。
背景技术
[0002] 5-氟尿嘧啶(5-FU)是尿嘧啶的同类物，尿嘧啶是核糖核苷酸的一个组分。5-氟尿嘧啶是以抗
代谢物而起作用，在细胞内转化为有效的氟尿嘧啶核苷酸后，通过阻断脱
氧核糖尿苷酸受细胞内胸苷酸合成酶的作用转化为胸苷酸，而干扰DNA的合成，同时对RNA的合成也有一定抑制作用。它在被转换成核苷酸后，被活跃分裂的组织及
肿瘤所优先摄取。临床上用于多种肿瘤，如消化道肿瘤、
乳腺癌、卵巢癌、绒毛膜上皮癌、
宫颈癌、膀胱癌、肝癌、
皮肤癌等的有效
治疗，尤其对消化道癌及其他实体瘤有良好疗效。
[0003] 5-氟胞嘧啶(5-FC)为
抑菌剂，高浓度时具杀菌作用。其作用机制在于药物通过
真菌细胞的渗透酶系统进入细胞内，在真菌细胞内所具有的胞嘧啶脱
氨酶的作用下转化为氟尿嘧啶。替代尿嘧啶进入真菌的核糖核酸中，从而阻断核酸的合成，导致细胞的凋亡。
[0004] 胞嘧啶脱氨酶是存在于大肠杆菌和真菌中的一种代谢酶，
哺乳动物类细胞不含该酶，此酶若在哺乳动物细胞中表达可将原药5-氟胞嘧啶代谢为5-氟尿嘧啶从而导致细胞自杀性死亡。肿瘤治疗中的自杀基因疗法，即将编码胞嘧啶脱氨酶的基因
转染肿瘤细胞，在外源施加5-氟胞嘧啶的情况下，将一定量的5-氟胞嘧啶转化为5-氟尿嘧啶，以降低直接给予5-氟尿嘧啶所发生的毒
副作用。
[0005] 目前，对细胞外
碱基进行分离，尤其是对嘌呤碱基研究得比较多，而对于从细胞内提取物中分离5-氟胞嘧啶和5-氟尿嘧啶的研究尚未进行。
发明内容
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种基于毛细管电泳的细胞内的5-氟胞嘧啶和5-氟尿嘧啶的检测方法，本发明分离效率高，样品用量少，分离时间短，分析成本低等特点，达到对细胞内的5-氟胞嘧啶和5-氟尿嘧啶的定性和定量检测，该方法有别于高效液相色谱的分离方法。
[0007] 本发明的一种基于毛细管电泳的细胞内的5-氟胞嘧啶和5-氟尿嘧啶的检测方法，包括：
[0008] (1)用携带自杀基因FCY1的质粒转染细胞，并在培养基中添加5-氟胞嘧啶和/或5-氟尿嘧啶进行培养，然后收集细胞代谢提取物；
[0009] (2)采用毛细管电泳法对细胞代谢提取物中5-氟胞嘧啶和/或5-氟尿嘧啶进行定性和定量检测，其中检测条件为：吸收
波长200-220nm，浓度为30-90mM，pH 8.5-10.5 的
硼酸盐缓冲液，分离
温度采用25-35℃，分离
电压20-30kv，采用压
力进样，进样压力为0.5-1.5psi，进样时间10-20s。
[0010] 步骤(1)中自杀基因FCY1能够编码胞嘧啶脱氨酶，胞嘧啶脱氨酶能够将5-FC转化为5-FU，而哺乳动物细胞不含有能够编码胞嘧啶脱氨酶的基因；将自杀基因FCY1转入哺乳动物细胞中，并施加5-FC进行培养，构成了自杀基因系统CD/5-FC。
[0011] 所述步骤(1)中培养基为含有10％血清、1％双抗(青霉素、
链霉素)的DMEM培养基。所述步骤(1)中收集细胞代谢提取物为：收集细胞后，用细胞计数板计数，取细胞量为 1×
107个细胞加入四倍体积的淬灭液，4℃保存，离心，分离上清液和沉淀；细胞沉淀加入 1ml提取液，枪头混匀后，
冰浴10min，然后离心取上清。
[0012] 所述淬灭液为0.9g/L的NaCl溶液；提取液为体积百分浓度为50％的乙腈。
[0013] 优选所述步骤(2)中毛细管电泳的检测条件为：最佳条件吸收波长210nm，浓度为60mM， pH 9.5的硼酸盐缓冲液，分离温度采用30℃，分离电压25kv，采用压力进样，进样压力为1.0psi，进样时间15s。
[0014] 毛细管电泳检测条件的优化，吸收波长的选择：5-FC和5-FU的最大吸收波长在200～220 nm之间，为获得较均衡的灵敏度，选择210nm作为检测波长。
[0015] 毛细管电泳检测条件的优化，缓冲溶液浓度的选择：设计了30mM，60mM和90mM三个浓度的硼酸盐缓冲液，为了获得短的迁移时间和好的分离效果，实验中选择浓度为60mM 的硼酸盐缓冲溶液作为为最佳实验浓度。
[0016] 步骤(2)中毛细管电泳检测条件的优化，缓冲溶液pH值的选择：pH为8.5时，细胞提取物的5-FC和5-FU分离效果不好，pH为10.5时，5-FU拖尾严重，结合迁移时间和分离度随pH变化情况的考察，选择缓冲溶液的pH值为9.5。
[0017] 步骤(2)中毛细管电泳检测条件的优化，分离电压的选择：比较20kV，25kV，30kV，分离电压高，迁移时间减小，分离效率降低，本文采用25kV作为最佳分离电压。
[0018] 步骤(2)中毛细管电泳检测条件的优化，分离温度的选择：温度的影响在25～35℃范围内，温度升高迁移时间减少，但高的温度并不一定能带来好的分离效率，为得到高的分离效率，采用30℃作为最佳分离温度。
[0019] 步骤(2)中毛细管电泳检测条件的优化，进样条件的选择：进样压力和进样时间的增加， 5-FC和5-FU与细胞提取物的峰面积都增加，然而分离效果变差，因此采用压力进样1.0psi，进样时间15s。
[0020] 步骤(2)中毛细管电泳对5-氟胞嘧啶、5-氟尿嘧啶的定量检测方程为：5-氟胞嘧啶5-FC 的工作曲线方程为：Y＝620.76x+719.5；5-氟尿嘧啶5-FU的工作曲线为：Y＝272.31x+
858.61，
[0021] 其中y是峰面积，x是碱基浓度。
[0022] 步骤(2)对毛细管电泳对5-氟胞嘧啶、5-氟尿嘧啶的定量检测的检测线，5-氟胞嘧啶5-FC 为1.33μM，5-氟尿嘧啶5-FU为2.04μM。
[0023] 根据优化后的毛细管电泳方法对细胞代谢物中5-FC和5-FU的定性定量分析，在培养基中未添加5-FC的293T细胞，提取物中没有检测到5-FC。培养基中添加5-FC的293T细胞检测到了5-FC，但没有检测到5-FU。培养基中添加5-FC的转染FCY1基因的293T细胞提取物中检测到了5-FC和5-FU。并且5-FU的量为25.8μM。
[0024] 有益效果
[0025] 高效液相色谱的方法检测5-FU中，存在柱效低，成本高，分离效果差，分离时间长，和检测器不灵敏等缺点，而本发明分离效率高，样品用量少，分离时间短，分析成本低等特点，达到对细胞内的5-氟胞嘧啶和5-氟尿嘧啶的定性和定量检测，该方法有有效克服了高效液相色谱分离方法的缺点；
[0026] 本发明应用优化的毛细管电泳方法对携带自杀基因FCY1细胞模型的代谢提取物中5-FC 和5-FU进行定性定量分析。
附图说明
[0027] 图1为5-FC和5-FU的吸收波长；其中(a)为两种碱基吸收波长的三维图，(b)为两种碱基在波长为210nm处的吸收谱图；
[0028] 图2为缓冲溶液不同浓度的毛细管电泳谱图；其中(a)为30mM，(b)为60mM，(c)为90mM；图3为缓冲溶液不同pH值的毛细管电泳谱图；其中(a)pH8.5，(b)pH9.5，(c)pH10.5；
[0029] 图4为不同分离电压的毛细管电泳谱图；其中(a)20kV，(b)25kV，(c)30kV；
[0030] 图5为不同温度的毛细管电泳谱图；其中(a)25℃，(b)30℃，(c)35℃；
[0031] 图6为不同进样压力的毛细管电泳谱图；其中(a)0.5psi，(b)1.0psi，(c)1.5psi；
[0032] 图7为不同进样时间的毛细管电泳谱图；其中(a)10s，(b)15s，(c)20s；
[0033] 图8优化条件下，5-FC和5-FU与细胞提取物的毛细管电泳谱图；
[0034] 图9为细胞提取物中5-FC和5-FU的检测；其中(a)293T，(b)5-FC(500μM)+293T，(c)5-FC (500μM)+293T(FCY1)。
[0035] 注：图1-7和图9的附图中的1和2，其中1标示5-FC，2标示5-FU。
具体实施方式
[0036] 下面结合具体
实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或
修改，这些等价形式同样落于本
申请所附
权利要求书所限定的范围。
[0037] 实施例1
[0038] 仪器
[0039] PA800Plus型毛细管电泳仪(Beckman Coulter Instruments,Fullerton,CA,USA)，PDA检测器，应用32Krarat Station
软件进行控制。
石英毛细管有效长度44cm,毛细管内径50μm， 0.22μm聚醚砜滤
膜过滤器(上海安谱实验科技股份有限公司)。
[0040] 2、细胞培养
[0041] 人肾上皮细胞系293T于实验室保存和培养；DMEM干粉、胎
牛血清、胰酶(含EDTA) 购自Gibco公司；转染
试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；细胞培养于10％血清、 1％双抗(青霉素、链霉素)的DMEM培养基中。细胞置于5％CO2、37℃
培养箱内培养，每 2～3天传代一次，取对数生长期细胞用于实验。
[0043] 按细胞浓度为3×105个/孔293T细胞接种在六孔培养板内，当细胞
覆盖率达90％左右时, 按照脂质体Lipofectamine2000说明的方法将携带有编码胞嘧啶脱氨酶(CD)的FCY1基因的质粒进行细胞转染。在培养基中添加5-FC，使其达到500μmol/L的目标浓度。
[0044] 4、细胞代谢物提取
[0045] 收集细胞取出后，用细胞计数板计数，取细胞量为1×107个细胞加入四倍体积的淬灭液 (0.9g/LNaCl)，4℃保存，离心(1000g，1min，0℃)，分离上清液和沉淀；细胞沉淀加入1ml 提取液(50％(v/v)乙腈，4℃)，枪头混匀后，冰浴10min，然后离心(20000g，10min，0℃) 取上清，-80℃冷冻保存待测。
[0046] 5、确定最佳分离条件
[0047] (1)标准品的溶液配置与样品检测：配置一定浓度的5-氟胞嘧啶和5-氟尿嘧啶标准溶液。进样前，先开机预热20min，进行毛细管活化，活化步骤：
水冲洗毛细管5min-甲醇冲洗毛细管10min-水冲洗毛细管5min-Hcl(1M)冲洗毛细管10min-水冲洗毛细管5min-NaOH(1M) 冲洗毛细管10min-缓冲液冲洗毛细管10min。标准品，缓冲溶液及未进行转染的293T的细胞提取物均用0.22μm聚醚砜滤膜
过滤器过滤，样品采用压力进样，紫外检测。
[0048] (2)吸收波长的选择：根据5-FC和5-FU两种标准溶液混合后的毛细管电泳检测结果，如图1，其中1标示5-FC，2标示5-FU，以下图均为此标示方法。5-FC和5-FU在200～300nm 范围内均有吸收.最大吸收波长在200～220nm之间，为获得较均衡的灵敏度.本文选择210 nm作为检测波长。
[0049] (3)缓冲溶液浓度的选择：实验中将5-FC和5-FU的标准溶液加入到200μL细胞提取物中，使5-FC和5-FU的终浓度为100μM，实验采用硼酸缓冲液，实验设计了30mM，60mM和90mM 三个浓度的硼酸盐缓冲液。缓冲溶液浓度对物质分离的影响见图2，当硼酸盐缓冲液浓度为 30mM时(图2，a)，5-FC和5-FU与细胞提取物的迁移时间最短，但是分离效果差，有重叠；增大浓度至60mM和90mM时(图2，b和c)，由于减弱了溶质间的相互作用，降低了样品扩散，使谱峰变得敏锐，相邻两组分的分离度增大，但90mM的缓冲溶液浓度，压缩了双电层.使Zeta电位减小，
电渗流降低，从而迁移速度变小，迁移时间增加，因此，为了获得短的迁移时间和好的分离效果，实验中选择硼酸盐缓冲溶液的浓度为60mM为最佳实验浓度。
[0050] (4)缓冲溶液pH值的选择：图3为缓冲溶液不同pH值的毛细管电泳谱图，其中(a)pH8.5， (b)Ph9.5，(c)pH10.5。5-FC和5-FU的迁移时间随pH值增大而增加。这是由于5-FC和 5-FU在碱性条件下发生电离，带负电荷，其电泳方向与电渗流相反，并随pH升高其电离程度增大，因此造成碱基在毛细管中的迁移速度减小，迁移时间变长。当pH为10.5时，5-FU 拖尾严重。但是当pH为8.5时，虽然出峰时间大大缩短，但是5-FC和5-FU与细胞提取物的分离效果不好。同时结合迁移时间和分离度随pH变化情况的考察，选择缓冲溶液的pH值为 9.5。
[0051] (5)电压对分离的影响：电压的影响在20～30kV范围内试验了电压对迁移时间的影响，实验结果如图4，其中(a)20kV，(b)25kV，(c)30kV。电压升高，迁移时间迅速减小，并对提高分离效率有利。但这并不意味着电压越高越好，在20～30kV范围内，塔板数随电压升高而增加至某一电压值。此后，随电压的进一步升高。
焦耳热也随之增加，塔板数反而减少。本文采用25kV作为最佳分析电压。
[0052] (6)温度对分离的影响：温度的影响在25～35℃范围内试验了温度对分离的影响，如图5，其中(a)25℃，(b)30℃，(c)35℃。温度升高将导致溶液
粘度变小，使迁移速度加快，迁移时间减少。但高的温度并不一定能带来好的分离效率如图5中(c)。为得到高的分离效率，本文采用30℃作为最佳分离温度。
[0053] (7)进样条件的影响：对于进样条件包括进样压力和进样时间进行了优化，如图6和图7。其中图6为进样压力的影响：(a)0.5psi，(b)1.0psi，(c)1.5psi，图7为进样时间的影响：(a) 10s，(b)15s，(c)20s。在毛细管电泳中，随着进样压力和进样时间的增加，5-FC和5-FU 与细胞提取物的峰面积都增加，然而随着进样压力和时间的增加，逐渐出现物质重叠，致使分离效果变差。因此本文采用进样压力1.0psi，进样时间15s。
[0054] 根据实验结果，确定最佳条件吸收波长210nm，浓度为60MM，pH 9.5的硼酸盐缓冲液，分离温度采用30℃，分离电压25kv。采用压力进样，进样压力为1.0psi，进样时间15s。
[0055] 6、工作曲线及捡测限
[0056] 在优化条件下，5-FC和5-FU的电泳谱图见图8。从图中可以看出，5-FC和5-FU在15min 内达到完全分离。表1给出了碱基的工作曲线方程及
检测限。
[0057]
[0058] 表1
[0059] 7、细胞内5-FC和5-FU的分离和定量测定
[0060] 取预处理后的细胞，根据优化后的毛细管电泳方法进行分析，细胞内5-FC和5-FU的毛细管电泳检测结果如图9，其中(a)293T，(b)5-FC(500μM)+293T，(c)5-FC(500μM)+293T(FCY1)。在培养基中未添加5-FC的293T细胞，提取物中没有检测到5-FC。培养基中添加5-FC的293T细胞检测到了5-FC，但没有检测到5-FU。培养基中添加5-FC的转染FCY1基因的293T细胞提取物中检测到了5-FC和5-FU。对检测到的5-FU结果进行分析，如表2。通过实验检测，证明转染FCY1基因的293T细胞，能够使目的基因表达，并将无毒的5-FC药物转化为5-FU，发挥抑制
细胞增殖的作用。
[0061] 表2为转染FCY1基因的细胞内将5-FC转变为5-FU的量的测定：
[0062]样品 5-FU(μM)N＝3 标准差(％) 回收率(％)
5-FC+HeLa(FCY1) 25.8 2.1 96
[0063] 表2 。
