技术领域
[0001] 本
发明涉及ー种
植物离体培养与快速繁殖的方法，特别是一种鱼腥草地上茎组织培养进行快速繁殖的方法。
背景技术
[0002] 鱼腥草学名蕺菜，属三白草科蕺菜属，是宿根性多年生草本植物，原产我国，主要分布于我国中部、东南及西南部各省区，东起台湾、西南至
云南、西藏、北达陕西、甘肃，尤以四川、湖北、湖南、江苏等省居多。以嫩茎叶和地下茎作蔬菜食用，全株可鲜用或晒干入药，已被国家卫生部正式确定为“既是药品，又是食品”的极具开发潜カ的资源之一。
[0003] 鱼腥草历来为野生植物，从上世纪80年代初开始进行人工栽培，以
无性繁殖为主，通常采用地下茎繁殖。但不同来源和不同时期的鱼腥草品系在产量和品质上的差异较 大，利用组织培养技术进行鱼腥草的快速繁殖培养，既可培育大量的鱼腥草优质种苗，做到生产周年化和标准化，满足生产的需要；又可解决鱼腥草的种性退化问题，
加速优良种苗的产业化发展。
[0004] 根据大量资料统计，Tsuzuki等用鱼腥草叶诱导出愈伤组织和植株，移入地中栽培直至成熟。Handique等用鱼腥草茎节作外植体在MS+6-BA的培养基上培养获得丛生芽，获得的芽在MS+IAA的培养基上生根，有根的小植株被成功地移栽到大田。袁艺等得出适于鱼腥草侧芽分化生长的最佳培养基为MS+6-BA I. 0-2. 0mg/L+NAA0. 1-0. 5mg/L，适宜鱼腥草生根的最佳培养基为MS+NAA1. 0mg/L+6-BA0. 25mg/L。吴卫等的鱼腥草快速繁殖体系结果表明，鱼腥草快速繁殖的外植体以地上茎节和茎尖较适宜，其中，MS+1. 0mg/L6-BA培养基则对茎尖愈伤组织诱导作用较佳；MS+0. 5-1. 0mg/L6-BA+0. 2mg/LNAA培养基对地上茎节丛生芽的诱导速度快，数目多；生根培养基则以MS+0.2mg/LIAA最好。龚伟等的结果表明，初代培养以 MS+6-BA1. 0mg/L+NAA0. 05mg/L 为最佳，30d 侧芽诱导率可达 66. 7% ；MS+6-BA2. Omg/L+2, 4-DO. 2mg/L+NAA0. 2mg/L对芽苗的继代增殖效果最好，40d芽苗的增殖倍数可达7. 4，且芽苗较高；以沙和蛭石（I ：1)为基质瓶外生根效果最好，30d芽苗生根率可达84%。纵观以上组织培养方面的研究，其所选的外植体多祥化、接种的时间也各异，且进行鱼腥草离体组织培养时很易污染的问题普遍存在，极大地限制了效果。
发明内容
[0005] 本发明的目的是针对
现有技术的不足，提供一种简单易行的、快速繁殖的、且有效降低污染率问题的鱼腥草地上茎节组织培养方法。
[0006] 一种鱼腥草地上茎组织培养快速繁殖的方法，包括如下步骤：
[0007] (I)消毒处理：首先，剪下帯节的鱼腥草植株地上茎用清
水冲洗干净，先将茎切割成5-lOcm长带有1-2个
腋芽的茎段，用0. 1%升汞进行第一次消毒处理12min ;然后将茎段用
链霉素和青霉素钠的
混合液浸泡24h，混合液中链霉素和青霉素钠的浓度均为0. 5g/L ；70%酒精浸泡30s后,再在0. 1%升萊中进行第二次消毒处理IOmin ;最后无菌水冲洗30s即可；
[0008] (2)不定芽诱导培养：在无菌条件下将消毒好的带有1-2个腋芽的茎段接种到不定芽诱导培养基上诱导不定芽；培养基为MS+0. 5mg/L NAA+2. Omg/L 6_BA ;培养条件为
温度 25±2°C、湿度 80-95%、光照时间 12_14h/d、光照强度 2000_3000Lx ；
[0009] (3)増殖培养：将诱导出的不定芽接种到增殖培养基中进行扩繁增殖，培养基为MS+0. lmg/L NAA+1. Omg/L 6-BA ;培养温度 25±2°C、湿度 85_95%、光照时间 12_14h/d、光照强度 2000-3000Lx ；
[0010] (4)生根培养：将增殖培养得到的单株芽转入生根培养基中进行生根培养；培养基为 MS+NAAO. 5mg/L+IBAl. Omg/L ;培养温度 25±2°C、湿度 85_95%、光照时间 12_14h/d、光照强度 2000-3000Lx ；
[0011] (5)炼苗与移栽。
[0012] 上述方法中也可以将步骤（3)増殖培养中脱离丛生状态，转向增高生长的苗直接按照步骤（4)进行生根培养；或者将其进行切段繁殖培养，切段时切割成5-lOcm长带有1-2个腋芽的茎段；切段繁殖培养基为MS+1. Omg/L 6-BA+O. lmg/L NAA+0. 5mg/L GA3 ;培养温度25±2°C、湿度85-95%、光照时间12_14h/d、光照强度2000_3000Lx ;再按照步骤（4)进行生根培养。
[0013] 步骤（5)的炼苗与移栽过程具体为：苗高10-15cm时进行炼苗，炼苗前首先揭开培养器皿的封ロ，再继续培养3-4d后将鱼腥草苗从培养器皿中取出，洗净根部附着的培养基，移入装有
河沙：蛭石=I: I的盆中，前期适当遮荫并保持湿度在85-95%，以后逐步降低至75%，7天后于自然光照条件下培养即可。
[0014] 本发明采用的链霉素是ー种
氨基糖苷类抗生素，对结核分枝杆菌和多种革兰氏阴性菌(如大肠杆菌、沙
门氏菌、布鲁氏菌、巴氏杆菌、志贺氏痢疾杆菌等）有抗菌作用；青霉素钠是ー种抗生素类药，具有抗菌作用强、疗效高及毒性低等优点，主要用于链球菌、
肺炎球菌、脑膜炎球菌感染等。本发明将两者合理配比形成组合溶液消毒；并以0. 1%升汞12min —链霉素和青霉素钠混合液浸泡24h — 70%酒精浸泡30s — 0. 1%升汞IOmin的处理方式效果最好，污染率可降低至0%。
[0015] 采用的赤霉素GA3能改变某些作物雌、雄花比例，诱导单性结实，加速果实生长，促进座果；打破
种子休眠，提早种子发芽，加快茎的伸长及有些作物的抽苔；扩大叶面积，カロ快幼枝生长，有利于代谢产物在韧皮部内积累，活化形成层；抑制成熟和衰老，控制侧芽休眠及
块茎的形成。本发明就是通过适当浓度的GA3来延长不定芽的长度；在切段繁殖时用了 GA3。
[0016] 本发明诱导培养基的组成配比是：MS+0. 5mg/L NAA+2. Omg/L 6-BA的诱导效果最好，诱导培养15d后的诱导率高达96. 65% ；
[0017] 本方面增殖培养基的组成配比是：MS+0. lmg/L NAA+1. Omg/L 6-BA的增殖效果最好，增殖培养IOd后的增殖率达4. 98倍；
[0018] 本发明切段繁殖培养的组成配比是：在MS+l.Omg/L 6-BA+O. lmg/L NAA+0. 5mg/LGA3，切段繁殖培养IOd后的苗长伸长可达2. 56倍；
[0019] 本发明生根培养基的组成配比是：MS+NAA0. 5mg/L+IBAl. Omg/L ;生根培养15d后的生根率可达89. 36%。[0020] 本发明炼苗与移栽的培养以河沙：蛭石=I: I的基质获得成活的鱼腥草植株多。
[0021] 本发明的积极效果是：利用组织培养繁殖改变了鱼腥草品种退化现象，保持了原品种的优良种性，确保种苗纯度；可实现エ厂化育苗、高效率生产；可人为的控制培养生长田间，不受自然条件的影响，取材量小，培养材料经济，生长周期短，繁殖系数大，管理方便，利于自动化生产和产业化生产。同时，本发明解决了鱼腥草初代接种时，污染率高的问题；地上茎培养成苗率高，程序简单实用，有效解决了鱼腥草试管苗的繁殖周期缓慢、生长缓慢的问题；繁殖系数达4. 98倍，快繁生产周期50d，试管苗中加入GA3可获得长度高的増殖芽丛，便于增殖；同时，本发明解决了规模化生产成本偏高的问题。
附图说明
[0022] 图I为鱼腥草地上茎节的消毒处理；
[0023] 图2为鱼腥草地上茎节的不定芽诱导培养；
[0024] 图3为鱼腥草地上茎节的增殖培养；
[0025] 图4为鱼腥草地上茎节的切段繁殖培养；
[0026] 图5为鱼腥草地上茎节的生根培养；
[0027] 图6为鱼腥草移栽培养。
具体实施方式
[0028] 以下结合
实施例进ー步说明本发明，而非限制本发明。
[0029] 实施例I
[0030] 消毒处理：首先，田间选择健康幼嫩的鱼腥草植株，剪下带节的地上茎用清水冲洗干净，用0. 1%升汞进行第一次消毒处理12min ;然后将茎段用链霉素和青霉素钠的混合液浸泡24h，混合液中链霉素和青霉素钠的浓度均为0. 5g/L ;70%酒精浸泡30s后再在0. 1%升汞中进行第二次消毒处理IOmin ;最后无菌水冲洗30s，将地上茎取出放置在消毒好的吸水纸上，污染率可降低至0% (图I);
[0031] 不定芽诱导培养：在无菌条件下将灭菌好的地上5-lOcm长茎段(带有1-2个腋芽）接种到不定芽诱导培养基上进行诱导培养；培养基配方：MS+0. 5mg/L NAA+2. Omg/L 6-BA ；在温度（25±2)で、湿度85-95%、光照时间12_14h/d、光照强度2000_3000Lx的培养条件下培养14d后，即可转入增殖培养基（图2);诱导培养15d后的诱导率高达96. 65%。
[0032] 増殖培养：将诱导出的不定芽接种到增殖培养基中进行扩繁增殖，培养基配方为MS+0. lmg/L NAA+1. 0mg/L6-BA ;在培养室内通过40d的增殖培养，不定芽逐渐分
化成丛生芽，每个芽点可分化出3-4个芽，此时可进行继代繁殖，将芽丛从基部切开，重新接种到继代增殖培养基中；经过7-10d后，又可形成3-4个芽，如此反复进行；芽丛逐渐增多，繁殖体系基部建立起来；培养温度（25±2)で、湿度85-95%、光照时间12_14h/d、光照强度2000-3000LX (图3);增殖培养IOd后的增殖率达4. 98倍。
[0033] 切段繁殖培养：在培养芽丛的过程中，有的芽从逐渐脱离丛生状态，转向增高生长，如果延长培养时间而不转接，少量可形成根系，此时应将这种苗分离出来単独生根或者切段繁殖培养后再生根；切段繁殖培养时将高7-lOcm的小苗，用
剪刀切成茎节茎段，切段时切割成5-lOcm长带有1-2个腋芽的茎段，转入切段繁殖培养基中培养；培养基配方MS+1. 0mg/L6-BA+0. lmg/L NAA+0. 5mg/L GA3, 30d后，又萌发成一株小苗，这样反复进行，可以大量获得这样的小苗，切段繁殖体系建立起来；培养温度（25±2)で、湿度85-95%、光照时间12-14h/d、光照强度2000-3000LX (图4);切段繁殖培养IOd后的苗长伸长可达2. 56倍。
[0034] 生根培养：选取生长势强、健壮的増殖得到的鱼腥草单株芽或者单株苗或者经过切段繁殖培养得到的单株小苗转入生根培养基中进行生根培养；培养基配方MS+NAAO. 5mg/L+IBAl. Omg/L ；15d后有89. 36%的植株长出根，待苗长15_20cm时，即可炼苗移栽；培养温度（25 ±2)で、湿度85-95%、光照时间12_14h/d、光照强度2000_3000Lx (图5)。
[0035] 炼苗与移栽：苗高10-15cm时炼苗，炼苗前首先揭开培养器皿的封ロ，再继续培养3-4d后将鱼腥草苗从培养器皿中取出，洗浄根部附着的培养基，移入装有河沙：蛭石=I: I的盆中，前期适当遮荫并保持湿度在85-95%，逐步降低至75%，7天后于自然光照条件下培 养，得成活鱼腥草植株（图6)。
